JP2000210097A - ヒトインターロイキン−５に対する組換えモノクローナル抗体およびその可変領域を含む組換えポリペプチドおよびその発現 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ヒトI L −５に対する動物モノクローナル抗
体の可変領域を有する組換えモノクローナル抗体、モノ
クローナル抗体のＨ鎖またはＬ鎖可変領域を含むポリペ
プチド、そのＤＮＡ配列、およびそのようなポリペプチ
ドの製法を提供する。 【解決手段】 アメリカン・タイプ・カルチャー・コレ
クション受託番号ＡＴＣＣＨＢ１０９５９で寄託された
ハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体の
同定特性を有する組換えモノクローナル抗体であって、
配列番号：１により定められるＨ鎖可変領域および配列
番号：２により定められるＬ鎖可変領域を有する組換え
モノクローナル抗体。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ヒトインターロイキン
−５に対するモノクローナル抗体のＨ鎖およびＬ鎖可変
領域ならびにそれらの相補性決定領域をコードする核
酸、ならびにそのモノクローナル抗体を基礎とする結合
蛋白質に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】インターロイキン−５ (ＩＬ−５) は活
性T 細胞により分泌され、Ｂ細胞および好酸球に対して
生物学的に活性である。ＩＬ−５は胸腺依存性抗原に対
するインビトロ抗体反応においてT リンパ球を置換する
ので、以前はＴ細胞置換因子と呼ばれた [ＴＲＦ；ダッ
トン(Dutton)ら, Prog. Immunol.1:355(1971);シンプル
(Schimpl) ら,Nature 237:15 (1972)] 。それはまた、
Ｂリンパ球からＩｇＭおよびＩｇＧプラーク形成細胞へ
の分化、ならびにＢ細胞リンホーマの増殖をインビトロ
で促進するので、Ｂ細胞増殖因子ＩＩとも呼ばれた [BC
GFII；タカツ(Takatsu) ら,J. Immuno1. 124:2414(198
0)]。

【０００３】ネズミ (murlne) ＩＬ−５は 133アミノ酸
残基からなり、これには20残基のシグナル配列および 3
個の潜在N-グリコシル化部位が含まれる。Ｂ細胞増殖ア
ッセイにおいて、脱グリコシル化はネズミI L −５の生
物学的活性に影響を及ぼさない[ トラバーニール(Trave
rnier)ら,DNA 8:491(1989)] 。ヒトI L −５は 134アミ
ノ酸残基からなり、これには19残基のシグナル配列およ
び 2個の潜在N-グリコシル化部位が含まれる。両蛋白質
の構造についてはヨコタ(Yokota)[Proc.Natl.Acad.Sci.
USA 84:7388(1987)]およびキナシ(Kinashi) ら[Nature
324:70(1986)]が述べている。ヌクレオチドおよびアミ
ノ酸配列水準でのネズミＩＬ−５とヒトI L −５の相同
性の程度は、それぞれ77および70％である。

【０００４】ネズミおよびヒトI L −５は両方とも、ジ
スルフィド結合により結合したホモダイマーとして存在
する。従ってグリコシル化された組換えヒトＩＬ−５は
SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動において、非還元
性条件下では見掛けの分子量40,000ダルトン、還元性条
件下では20−22,000ダルトンで泳動する [ツジモト(Tsu
jimoto) ら, J.Blochem.106:23(1989)] 。

【０００５】ネズミI L −５のクローン化および発現に
ついては、たとえばキナシ(Kinashi) ら[Nature 324:70
(1986)] およびタカツ(Takatsu) ら[J.Immunol.134:382
(1985)] が述べている。ヒトＩＬ−５相補的ＤＮＡ（ｃ
ＤＮＡ) は、ネズミＩＬ−５ｃＤＮＡをブローブとして
用いて、アヅマ(Azuma) ら[Nucleic Acids Res.14:9149
(1986)] により単離された。

【０００６】ＩＬ−５は好酸球の維持および分化因子と
して作用することが示されている。ヒトにおいてＩＬ−
５の活性は特異的であり、主として好酸球に作用すると
思われる。ヒトI L −５は好酸球前駆細胞が成熟細胞に
なるのを誘導する。さらに培地中にヒトＩＬ−５が存在
する場合には、循環血液から単離された好酸球の生存を
延長させることができる。またヒI L −５は、培養好酸
球が脱顆粒反応し、主要塩基性蛋白質(MBP) および好酸
球由来神経毒(EDN) などの毒性蛋白質を放出するのを促
進する [キタ(Kita)ら,J.Immunol.149:629(1992)] 。

【０００７】好酸球は寄生虫を感染後に死滅させ、また
炎症性およびアレルギー性疾患において重要な役割を演
じることが示唆されている [たとえばサンダーソン(San
derson),Blood 79:3101(1992) を参照されたい] 。寄生
虫感染後に、また特定の慢性炎症組織、たとえば喘息性
肺胞において、循環白血球中の好酸球水準が上昇するこ
とが観察されている。好酸球の浸潤および好酸球からの
毒性顆粒の放出は、組織を破壊する作用を示し、また喘
息の症状を悪化させる場合がある。

【０００８】たとえばグライヒ(GIeich)ら[Adv.Immuno
l.39:177(1986)]およびフライガス(Frigas)ら [J.Aller
gy CIin.Immunol.77:527(1986)]は、高密度好酸球およ
び好酸球主要塩基性蛋白質(MBP) が気管支喘息および関
連の組織損傷に伴って生じることを示した。最近、コフ
マンら( 国際特許出願公開WO/04979号明細書) は、I L
−５に対する抗体が特定のアレルギー性疾患、たとえば
喘息に伴う好酸球増多症を予防または軽減しうることを
示した。ヒトＩＬ−５に特異的に結合してその生物学的
活性を中和するモノクローナル抗体をこの目的に用いる
ことができる。

【０００９】I L −５に対するモノクローナル抗体は実
験動物において寄生虫誘発性好酸球増多症を回復させる
顕著な効果をもつことが報告されており [シュマッヘル
(Schumacher)ら,J.Immuno1.141:1576(1988):コフマン(C
offman) ら,Science 245:308(1989)] 、これは中和抗体
がＩＬ−５に拮抗することにより好酸球増多症関連の症
状を軽減するのに臨床的に有用であろうということを示
唆する。事実、実験的に誘発された好酸球増多症を保有
するげっ菌類またはサルをTRFK、すなわちラット抗マウ
スＩＬ−５モノクローナル抗体で治療すると、循環およ
び気管支洗浄の双方において好酸球が正常水準に戻るこ
とが見出されたと報告されている。従って中和性モノク
ローナル抗体は有効なアンタゴニストとなる可能性があ
る。

【００１０】しかし大部分のモノクローナル抗体はげっ
歯類由来のものであるので、ヒトにおいて、特に長期間
にわたって療法に用いた場合、それらは免疫原となる可
能性が高くなる。この可能性を少なくするために、ヒト
I L −５に対する組換えまたは“ヒト化”抗体が求めら
れている。このような抗体は好酸球増多症に付随する状
態の治療、またはＩＬ−５の生物学的活性に起因する他
のいずれかの状態の治療に用いることができるであろ
う。

【００１１】げっ菌類抗体の免疫原性を低下させるため
の初期の努力は、マウス可変領域をヒト定常領域と融合
させたキメラ抗体を調製するものであった [リウ(L1u)
ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:3439(1987)]。しかしヒ
ト可変領域とマウス定常領域のハイブリッドを注射され
たマウスは、ヒト可変領域に対して向けられた強い抗−
抗体反応を生じることが示された。これは、ヒトの系に
おいてこのようなキメラ抗体に全げっ菌類Ｆv 領域を保
有させると、やはりヒト抗マウス抗体を産生する可能性
があることを示唆する。

【００１２】一般に可変領域のＣＤＲループが抗体分子
の結合部位を含むと考えられており、げっ菌類配列をさ
らに少なくするためにヒト枠組み構造上へのげっ菌類Ｃ
ＤＲループのグラフト (すなわちヒト化) が試みられた
[ジョーンズ(Jones) らNature 321:522(1986): ベルヘ
ーエン(Verhoeyen) ら, Science 239:1534(1988)] 。カ
バト(Kabat) ら[J.Immunol.147:1709(1991)]による研究
は、抗体可変領域の枠組み構造残基がＣＤＲループの支
持に関与していることを示した。抗原結合親和性を保守
するためにはヒト化抗体の枠組み構造支持残基を変化さ
せる必要があることも見出された。多数のヒト化抗体構
造体においてＣＤＲグラフトの採用、および枠組み構造
残基の保守が、たとえば下記により報告されている: ク
イーン(Queen) ら, Proc.Natl.Acad.Scl.USA 86:10029
(1989) 、ゴルマン(Corman)ら, Proc.Natl.Acad.Sci.US
A 88:4181(1991)、およびホジソン(Hodgson) ら, Bio/T
echnology 9:421(1991)。正確な配列情報はわずかなヒ
ト化構造体について報告されているにすぎない。

【００１３】ヒト化のためのヒト抗体配列を選ぶ際には
ヒト抗体と動物抗体との間の高度の配列同一性が重要で
あることは知られているが、従来の大部分の研究が動物
のＬおよびＨ可変配列の代わりに異なるヒト配列を用い
ていた。既知抗体の配列、またはより一般的には既知の
Ｘ線構造をもつ抗体の配列、すなわち抗体NEW およびKO
L が用いられていた。たとえばジョーンズ(Jones) ら
(前掲);ベルヘーエン(Verboeyen) ら (前掲);およびゴ
ルマン(Gorman)ら (前掲) を参照されたい。

【００１４】抗体を工学的に調製する方法については、
たとえばポスら (米国特許第4,816,397 号明細書) 、カ
ビリーら (米国特許第4,816,567 号明細書) 、ローら
(欧州特許出願公開第438310号明細書) およびウインタ
ー (欧州特許出願公開第239400号明細書) が述べてい
る。

【００１５】ヒト化モノクローナル抗体を得るには、そ
の基礎となる動物抗体の可変領域のＣＤＲループがどの
ようなものであるか知る必要があり、更にそれを大量に
調製する手段が必要であるが、ヒトI L −５に対する動
物モノクローナル抗体については、その配列およびそれ
を大量に調製する手段が未だ確立されていない。

【００１６】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、ヒトI L −
５に対する動物モノクローナル抗体の可変領域を有する
組換えモノクローナル抗体、モノクローナル抗体のＨ鎖
またはＬ鎖可変領域を含むポリペプチド、そのＤＮＡ配
列、およびそのようなポリペプチドの製法を提供するこ
とを目的とする。

【００１７】

【課題を解決するための手段】本発明は、アメリカン・
タイプ・カルチャー・コレクション受託番号ＡＴＣＣＨ
Ｂ１０９５９で寄託されたハイブリドーマにより産生さ
れるモノクローナル抗体の同定特性を有する組換えモノ
クローナル抗体であって、配列番号：１により定められ
るＨ鎖可変領域および配列番号：２により定められるＬ
鎖可変領域を有する組換えモノクローナル抗体を提供す
る。本発明はさらに、配列番号：１および配列番号：２
により定められるアミノ酸配列を有する、モノクローナ
ル抗体のＨ鎖またはＬ鎖可変領域を含むポリペプチド、
それらの可変領域からの相補性決定領域（ＣＤＲ）、な
らびにそれらの可変領域およびＣＤＲをコードする単離
されたＤＮＡを提供する。これらのＤＮＡを用いて、1
または2 以上のＣＤＲを含み、かつ抗原結合活性を保持
する、結合組成物、一本鎖結合蛋白質、ポリペプチド、
およびそれらのＣＤＲを含む細換え抗体を形成すること
ができ、これらはすべて本発明の一部である。

【００１８】図面の簡単な説明本発明は以下の記載およ
び実施例、ならびに添付の図面を参照することによって
より容易に理解されるであろう。本明細書に引用する参
考文献はすべてそれらの全体を参考として採用する。本
明細書において用いる用語“ＤＮＡ”は、標準的な５’
〜３’ホスホジエステル結合により結合したデオキシリ
ボヌクレオチドからなる分子であると定められ、比較的
小型のオリゴデオキシリボヌクレオチドおよび比較的大
型のデオキシリボ核酸の双方を含む。

【００１９】抗体はジスルフィド橋により互いに結合し
たポリペプチド鎖のアセンブリーからなる。Ｌ鎖および
Ｈ鎖と呼ばれる２種類の主ポリペプチド鎖が、抗体のす
べての主構造群 (イソタイプ) を構成する。Ｈ鎖および
Ｌ鎖はさらに、可変領域および定常領域と呼ばれるサブ
領域に分けられる。Ｈ鎖は１個の可変領域および３また
は４個の異なる定常領域からなり、Ｌ鎖は１個の可変領
域 (Ｈ鎖のものと異なる) および１個の定常領域 (Ｈ鎖
のものと異なる) からなる。Ｈ鎖およびＬ鎖の可変領域
は抗体の結合特異性に関与する。

【００２０】本明細書において用いる用語“ＣＤＲ構造
ループ”は、抗体の可変部において分子の結合部上のβ
鎖を架橋する３個のＬ鎖領域および３個のＨ鎖領域を意
味する。これらのループは特徴的な規定構造をもつ [チ
ョチア(Chothla) ら, J.Mol.B1ol.196:901(1987); チョ
チア(Chothia) ら,J.Mol.Biol.227:799(1992)]。用語
“カバトＣＤＲ" は、カバト(Kabat) ら, [Sequences o
f Proteins of Immunologlcal Interest, 第４版,1987,
米国保健福祉省, 国立衛生研究所] により定められる、
Ｈ鎖およびＬ鎖上の超可変抗体配列を意味する。本明細
書において用いる用語“Ｈ鎖可変領域”は、Ｈ鎖のアミ
ノ末端 (N-末端) アミノ酸残基から始まる長さ約110-12
5 アミノ酸残基のポリペプチドであって、そのアミノ酸
配列が本発明のモノクローナル抗体のＨ鎖のものに相当
するポリペプチドを意味する。同様に、用語“Ｌ鎖可変
領域”は、Ｌ鎖のN-末端アミノ酸残基から始まる長さ約
95-130アミノ酸残基のポリペプチドであって、そのアミ
ノ酸配列が本発明のモノクローナル抗体のＬ鎖のものに
相当するポリペプチドを意味する。

【００２１】用語Ｆａｂ、Ｆｃ，Ｆ(ab)₂ 、およびＦｖ
は、それらの標準的な免疫学的意味で用いられる [クラ
イン(K1eln),lmmunology (ジョン・ ワイリー, ニューヨ
ーク,1982); パルハム(Parham), 第14章, ワイル(Weir)
編, Immunochemistry,第４版(ブラックウェル・ サイエ
ンティフィック・ パブリッシャーズ, オックスフォー
ド,1986)] 。

【００２２】本明細書において用いる用語“モノクロー
ナル抗体”は、ヒトＩＬ−５に特異的に結合しうる均質
な免疫グロブリン集団を意味する。ヒトＩＬ−５は下記
よりなる１または２以上の抗原決定基を有すると解され
る：（１）ヒトI L −５内のペプチド一本鎖からなるペ
プチド抗原決定基；（２）そのそれぞれのアミノ酸配列
がヒトＩＬ−５ポリペプチド配列に沿ってばらばらに位
置する２以上の空間的に連続したペプチド鎖からなるコ
ンホメーショナル抗原決定基：および（３）翻訳後にヒ
トI L −５に共有結合した分子構造の全体または一部か
らなる翻訳後抗原決定基、たとえば炭水化物基など。本
発明の抗体はこれらの抗原決定基のうち１または２以上
に対して特異的である。

【００２３】本明細書において用いる用語“結合組成
物”は、２本のポリペプチド鎖、すなわち（１）作動的
に結合した (operationally associated) 場合に、ヒト
ＩＬ−５に対して高い結合親和性を有するコンホメーシ
ョンをとるもの、および（２）ヒトＩＬ−５に対して特
異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマに
由来するものからなる組成物を意味する。用語“作動的
に結合した”は、これら２本のポリペプチド鎖が、天然
抗体フラグメント、たとえばＦａｂもしくはＦｖにおけ
る結合を含めた多様な手段により、またはカルボキシル
末端に遺伝子工学的に形成されたシステイン含有ペプチ
ドリンカーその他のりンカーにより、結合するための配
置を互いにとりうることを示すものとする。

【００２４】モノクローナル抗体は、標準法、たとえば
コーフー(Kohler)ら[Nature 256:495(1975);Eur.J.Immu
nol.6:511(1976)]が述べた方法により調製することがで
きる。本質的には動物を標準法により免疫感作して、抗
体分泌性の体細胞を産生させる。次いでこれらの細胞を
骨髄腫細胞へ融合させるために免疫感作動物から採取す
る。抗体を産生する能力をもつ体細胞、特にＢ細胞が骨
髄腫細胞系統との融合に適している。これらの体細胞
は、感作動物のリンパ節、脾臓および末梢血に由来する
ものであってもよい。本発明の実施形態においては、ラ
ット脾臓細胞を用いる。それは、一部はこれらの細胞が
マウス骨髄腫細胞系統と比較的高い割合の安定な融合体
を生じるからである。しかし、その代わりにヒト、マウ
ス、ウサギ、ヒツジもしくはヤギの細胞、または他の動
物種からの細胞を用いることもできる。

【００２５】リンパ球腫からハイブリドーマ産生融合法
に用いるための特別な骨髄腫細胞系統が開発された [コ
ーラーおよびミルシュタイン(Kohler,Xilstein),Eur.J.
Immuno1.6:511(1976);シュルマン(Shulman) ら,Nature
276:269(1978) ；フォーク(Volk)ら,J.V1rol.42:220(19
82) 〕。これらの細胞系統は、少なくとも３つの理由で
開発された。第１は、融合ハイブリドーマを、融合して
おらず同様に無限に自己増殖する骨髄腫細胞から選別す
るのを容易にするためである。通常はこれは、ハイブリ
ドーマの増殖を支持する特定の選択培地においてそれら
を増殖不可能にする酵素欠損を伴う骨髄腫細胞を用いて
達成される。第２の理由は、リンパ球腫細胞がそれら自
身の抗体を産生する固有の能力に由来する。モノクロー
ナル法を採用する目的は、希望する単一抗体をハイブリ
ドーマの体細胞成分の遺伝的制御下で産生する、無限の
寿命をもつ融合ハイブリッド細胞系統を得ることであ
る。ハイブリドーマによる腫瘍細胞抗体の産生を排除す
るために、内在性の免疫グロブリンＬ鎖およびＨ鎖を産
生し得ない骨髄腫細胞系統を用いる。これらの細胞系統
を選ぶ第３の理由は、融合に対するそれらの適性および
効率である。

【００２６】多数の骨髄腫細胞系統を融合細胞ハイブリ
ッドの調製に用いることができ、これにはたとえばP3X6
3-Ag8 、P3X 63-Ag8.653、P3/NS1-Ag4-1(NS-1)、Sp2/0-
Ag14、およびSI94/5.XXO.Bu.1 が含まれる。P3X63-Ag8
およびNS-1細胞系統についてはコーラーおよびミルシュ
タイン(Kohler,Milsteln)[Eur.J.Immunol.6:511(1976)]
が述べている。シュルマン(Shulman) ら[Nature 276:26
9(1978)]はSp2/0-Ag14骨髄腫細胞系統を開発した。S194
/5.XXO.Bu.1 系統はトラウブリッジ(Trowbridge) [J.Ex
p.Med.148:313(1979)]により報告されている。

【００２７】抗体を産生する脾臓細胞またはリンパ節細
胞と骨髄腫細胞とのハイブリッドを形成する方法は、通
常は体細胞と骨髄腫細胞をそれぞれ10:1の割合で (ただ
しこの割合は約20:1−約1:1 に及びうる) 、細胞膜の融
合を促進する１または２以上の物質 (化学物質、ウイル
スまたは電気) の存在下に混合することによる。融合法
についてはコーラーおよびミルシュタイン(Kohler, Mi1
stein) (前掲) 、ゲフター(Gefter)ら[Somatic Cell Ge
net.3:231(1977)]、ならびにフォーク(Volk)ら,J.Viro
l.42:220(1982)]が述べている。これらの研究者たちが
用いた融合促進剤はセンダイウイルスおよびポリエチレ
ングリコール(PEG) であった。

【００２８】融合法によれば生存ハイブリッドが極めて
低い頻度で得られるので (たとえば脾臓を体細胞源とし
て用いる場合、ほぼ１×１０⁵ 個の脾臓細胞につき１個
のハイブリッドが得られるにすぎない) 、融合細胞ハイ
ブリッドを残りの非融合細胞、特に非融合骨髄腫細胞か
ら選択する手段を得ることが必須である。目的とする抗
体産生ハイブリドーマを得られた他の融合細胞ハイブリ
ッドの中から検出する手段も必要である。

【００２９】一般に融合細胞ハイブリッドの選択は、ハ
イブリドーマの増殖を支持するが、普通は無限に分割し
続ける非融合骨髄腫細胞の増殖を阻止する培地中で細胞
を培養することにより達成される。融合に用いた体細胞
はインビトロ培養では長期生存性を維持せず、従って問
題を生じない。本発明の実施例においてはヒポキサンチ
ンホスホリボシルトランスフェフーゼを欠如する(HPRT
陰性) 骨髄腫細胞を用いた。これらの細胞に対する選択
は、ヒポキサンチン／アミノプテリン／チミジン(HAT)
培地、すなわち融合細胞ハイブリッドが脾臓細胞のHPRT
陽性遺伝子型のため生き残る培地において行われる。遺
伝子型において感応性であるハイブリッドの増殖を支持
する培地中で選別しうる異なる遺伝子欠損 (薬物感受性
など) をもつ骨髄腫細胞の使用も可能である。

【００３０】融合細胞ハイブリッドを選択的に培養する
ためには数週間が必要である。この期間の初期に、目的
とする抗体を産生するハイブリッドを同定する必要があ
り、次いでそれらをクローン化し、増殖させることがで
きる。一般に得られたハイブリッドのほぼ10％が目的抗
体を産生するが、約１〜約3 0 ％であることが稀ではな
い。抗体産生ハイブリッドの検出は幾つかの標準アッセ
イ法のいずれによっても達成することができ、これには
文献記載の酵素結合イムノアッセイ法およびラジオイム
ノアッセイ法が含まれる [たとえばケネット(Kennet)ら
(編者), Monoclonal Antibodies and Hybrid ：A New
Dimension in Biological Analyses, p.376-384,ブレナ
ム・ プレス, ーューヨーク(1980)を参照されたい] 。

【００３１】目的とする融合細胞ハイブリッドが選択さ
れ、個々の抗体産生細胞系統中へクローン化されると、
各細胞系統を２種類の標準法のいずれかによって増殖さ
せることができる。ハイブリドーマ細胞の懸濁液を組織
適合性動物に注射することができる。次いで注射された
動物は腫瘍を発現し、これが融合細胞ハイブリッドによ
り産生される特異的モノクローナル抗体を分泌する。動
物の体液、たとえば血清または腹水を採取して、モノク
ローナル抗体を高濃度で得ることができる。あるいは個
々の細胞系統をインビトロで実験室用培養器内において
増殖させることができる。単一の特異的モノクローナル
抗体を高濃度で含有するこの培地をデカンテーション、
渡過または遠心分離によって採取し、次いで精製するこ
とができる。

【００３２】モノクローナル抗体は周知のファージライ
ブラリー系を用いて調製することもできる。抗体のフラ
グメントの使用および形成は周知である：たとえばＦａ
ｂフラグメント [ティッセン(Tiissen), Practice and
Theory of Enzyme lmmunoassays(エルゼビル, アムステ
ルダム,1985)] 、Ｆｖフラグメント [ホッホマン(Hochm
an)り、Biochemistry 12:1130(1973); シャロン(Sharo
n)ら,Biochemistry 15:1591(1976);エールリッヒら, 米
国特許第4,355,023 号明細書] 、および抗体半分子 (オ
ーブィトール−ハーグリーブズ, 米国特許第4,470,925
号明細書) 。さらにこれらの本発明化合物および組成物
を用いて既知の技術により、たとえばハイブリドーマを
さらに融合させることにより (すなわちいわゆるクアド
ローマ(quadroma)を形成するために; リーナィング, 米
国特許第4,474,493 号明細書) 、または半分子の化学的
再結合により [ブレンナン(Brennan) ら,Science 229:8
1(1985)]、二重特異性抗体を形成することができる。

【００３３】ハイブリドーマおよびモノクローナル抗体
は、いかなる供給源からのヒトI L−５に対しても、た
とえば市販の、もしくは天然供給源からのもの、または
化学的合成法もしくは組換えＤＮＡ技術の適用によるも
のに対しても調製することができる。本明細書において
“細換えI L −５”は、原核または真核細胞発現系にお
いてＩＬ−５をコードする細換えＤＮＡ（ｃＤＮＡ) に
より産生されるＩＬ−５を意味するものと定められる。
さらに真核細胞系においては、ゲノムＤＮＡをＩＬ−５
の産生に用いることができる。産生されるＩＬ−５はグ
リコシル化されていてもよく、グリコシル化されていな
くてもよい。

【００３４】ネズミおよびヒトＩＬ−５をコードするＤ
ＮＡのヌクレオチド配列は知られているので [たとえば
アズマ(Azuma) ら, Nucleic Acids Res.14:9149(1986)
を参照されたい] 、それらのＤＮＡはマッツーシ(Katte
ucci) ら [J.Am.Chem.Soc.103:3185(1981)] のホスホル
アミダイト固体支持体法、ヨー(Yoo) ら [J.Biol.Chem.
764:17078(1989)]の方法、または他の周知の方法により
化学的に合成することができる。これは、たとえばバル
ら (国際特許出願公開W085/02200号明細書) がＩＬ−２
をコードするＤＮＡを化学的に合成したように、比較的
小型のオリゴヌクレオチドを合成し、それらを互いにリ
ゲートすることにより実施しうる。

【００３５】あるいはＩＬ−５を産生しうる細胞系統を
刺激して、ＩＬ−５ｍＲＮＡを産生させ、これを標準法
によりＩＬ−５ｃＤＮＡを産生させる鋳型として用いる
ことができる。次いでｃＤＮＡライブラリーを調製し、
既知の配列情報に基づくオリゴヌクレオチドプローブ混
合物を用いてこの中にＩＬ−５ｃＤＮＡを同定すること
ができる。次いでこのｃＤＮＡを、利用しうる多数の細
菌、酵母または哺乳動物の発現系のいずれかにおいてク
ローン化し、発現させることができる。この方法は組換
えラット、マウスまたはヒトＩＬ−５の調製に利用され
ている [たとえばトラベニール(Travenler) ら, DNA 8:
491(1989):ミナミタケ(Minamitake)ら,J.Biochem.107:2
92(1990); ウベルラ(Uberla)ら,Cytoklne 3:72(1991)を
参照されたい] 。ヒトＩＬ−５は、同一出願人による米
国特許出願 (特許出願第07/615,061号明細書, 1990年11
月16日出願) 中で、ヒトＩＬ−５をコードするｃＤＮＡ
をチャイニーズハムスター卵巣(CHO) 細胞において発現
させることにより調製された。ツジモト(Tsujimoto) ら
[J.Biochem.106:23 (1989)]も、CHO 細胞における細換
えヒトI L −５の産生について述べている。

【００３６】さらに他の方法においては、既知のヌクレ
オチド配列に基づくオリゴヌクレオチドプロープ混合物
を用いて、標準法により調製されたゲノムＤＮＡライブ
ラリー中のＩＬ−５を同定することができる。こうして
同定されたＤＮＡをライブラリーから制限エンドヌクレ
アーゼ開裂により切り取り、配列決定し、そして真核細
胞発現系において、または (必要に応じて標準法により
イントロンを切除したのち) 原核細胞発現系において発
現させることができる。この方法でキャンベル(Campbel
l)ら[Proc.船tl.Acad.Sci.USA 84:6629(1987)]は、ヒト
I L −５をサル腎臓(COS) 細胞において産生している。

【００３７】もちろんｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡライ
ブラリーは両方とも、オリゴヌクレオチドプローブを用
いる代わりに標準的な発現クローン化法を利用してスク
リーニングすることができる。こうして調製されたＩＬ
−５は、既知の免疫学的方法またはバイオアッセイを利
用して検出される。I L −５ポリペプチドは、たとえば
メリフィールド(Merrifield)[J.Am.Chem.Soc.85:2149(1
963)] の記載に従って合成ペプチド化学により直接に調
製することもでき、またはＩＬ−５は購入することがで
きる。

【００３８】目的とするモノクローナル抗体を産生する
ハイブリドーマが得られると、1 つの種の結合領域が他
の種の抗体の非結合領域と結合した種間モノクローナル
抗体を調製する方法を用いることができる [リウ(Liu)
ら,Proc.Natl.Acad.Scl.USA84:3439(1987)]。たとえば
げっ歯類モノクローナル抗体からのＣＤＲをヒト抗体に
グラフトし、これによりげっ菌類抗体を“ヒト化”する
ことができる [リーヒマン(Riechmann) ら,Nature 332:
323(1988)]。より詳細には、ヒト定常領域を含むか、ま
たは含まないヒト抗体可変領域に上記のＣＤＲをグラフ
トすることができる。この方法は、たとえばヒトインタ
ーロイキン−２レセプターのp55(Tac)サプユニットに対
するマウスモノクローナル抗体をヒト化するために用い
られている [クイーン(Queen) ら, Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA 86:10029(1989)]。

【００３９】ヒトＩＬ−５に対して特異的なモノクロー
ナル抗体のＨ鎖およびＬ鎖可変領域ならびにそれらの抗
体からのＣＤＲをコードする本発明のｃＤＮＡを、この
ような様式で工学的に調製することができる。抗体の可
変領域内のＣＤＲの位置は、多数の周知の標準法により
決定しうる。たとえばカバト(Kabato)ら (前掲) はＣＤ
Ｒの位置を決定するための規則を発表した。これらの規
則を用いて決定されたＣＤＲを本明細書においては“カ
バトＣＤＲ”と呼ぶ。たとえば後記のように抗体鎖の三
次元結合部位ループに関与するアミノ酸残基に基づいて
ＣＤＲ構造ループを同定するために利用しうるコンピュ
ータープログラムも得られる。

【００４０】本明細書において用いられる方法は、多様
な動物抗体のヒト化に利用しうる。 （ａ）ヒト化のためのヒト枠組み構造として用いるヒト
抗体配列を選び、そして（ｂ）このヒト枠組み構造に挿
入するために選ぶべき動物モノクローナル抗体の可変領
域残基を決定することによる２段階法が採用される。第
1 段階は、それに関する配列情報が得られるヒト枠組み
構造配列のうち利用可能な最良のものを選ぶことよりな
る。この選択法は下記の選択基準に基づく：

【００４１】（１）パーセント一致率 ヒト化すべき動物モノクローナル抗体のＨ鎖およびＬ鎖
可変領域の配列を最適状態で配置し、好ましくは既知の
すべてのヒト抗体Ｈ鎖およびＬ鎖可変領域の配列と比較
する。これは、主として２種類のヒト抗体、NEW および
KOL の使用のみに依存する先行技術方法と対照的であ
る。これらの抗体に関しては構造情報が得られ、その表
示はそれらが由来するヒト患者のイニシャルである。現
在では抗体ＨＩＬの構造も知られている (ブルックヘブ
ン・ コードP8FAB)。配列をこうして比較して、残基の一
致率を記録し、パーセント一致率を決定する。他の要素
がすべて等しい場合、動物抗体との最高のパーセント一
致率をもつヒト抗体を選ぶことが望ましい。

【００４２】（２）配列アンビギュイティー 次いで上記の既知のヒト抗体鎖配列を、未同定残基およ
び／またはアンビギュイティーの存在、すなわち配列不
確定性につき評価する。これらの不確定性のうち最も一
般的なものは、配列決定処理に際してアンモニアが失わ
れることによりアミドアミノ酸の代わりに酸性アミノ酸
が誤同定されること、たとえば蛋白質中に実際に存在す
る残基がグルタミン残基であった場合にグルタミン酸残
基の誤同定である。不確定性はカバト(labato)ら (前
掲) などのデータベースの検査により確認される。他の
要素がすべて等しい場合、このアンビギュイティーが可
能な限り少ないヒト抗体鎖を選ぶことが望ましい。

【００４３】（３）ピン領域スペーシング 抗体鎖可変領域はドメイン内ジスルフィド橋を含む。こ
れらの橋を構成するシステイン残基間の距離 (残基の
数) をピン領域スペーシングと呼ぶ [コチア(Chothia)
ら, J.Mol.Biol.196:901(1987)] 。他の要素がすべて等
しい場合、選ばれたヒト抗体のピン領域スペーシングが
動物抗体のものと類似するか、または等しいものを選ぶ
ことが最も望ましい。コンピューターモデリングを容易
にするために、ヒト配列ピン領域スペーシングが既知の
抗体三次元構造のものと類似することも望ましい。以上
の基準に基づいて、全体的に最良の望ましい特性の組み
合わせをもつヒト抗体 (１種類または２種類以上) を動
物抗体のヒト化のための枠組み構造として選ぶ。選ばれ
たＨ鎖およびＬ鎖は同一または異なるヒト抗体のいずれ
に由来するものであってもよい。

【００４４】本発明の第２段階は、このヒト枠組み構造
内へグラフトさせるために選ぶべき動物抗体の可変領域
配列を決定することよりなる。この選択法は下記の選択
基準に基づく： （１）残基の選択 ２種類の可能な可変領域残基を動物抗体配列中において
評価する。その第１はいわゆる“最小残基”である。こ
れらの最小残基は、ＣＤＲ構造ループ、ならびにコンピ
ューターモデリングにより示されるようにこのＣＤＲ構
造ループを支持および／または配向させるために必要な
付加的残基を合わせたものからなる。他方の種類の可能
な可変領域残基は“最太残基”と呼ばれる。それらは、
最小残基、およびカバトＣＤＲ、およびコンピューター
モデリングにより示されるようにＣＤＲ構造ループ残基
から約１０オングストローム以内にあり、かつ水性溶剤
到達可能表面約５オングストローム² 以上を保有する付
加的残基を合わせたものからなる [リー(Lee) ら, J.Bi
ol.Chem.55:379(1971)] 。後記の実施例においては、Ｃ
ＤＲ構造ループ残基から５オングストローム以内にある
残基が選ばれた。

【００４５】（２）コンピューターモデリング 可能な可変領域残基を同定するために、（ａ）ヒト化す
べき動物抗体の可変領域配列、（ｂ）選ばれたヒト抗体
枠組み構造配列、ならびに（ｃ）種々の最小および最大
の動物抗体残基をグラフトさせたヒト抗体枠組み構造配
列からなるすべての可能な組換え抗体につき、コンピュ
ーターモデリングを実施する。コンピューターモデリン
グは、蛋白質モデリングに適したソフトウェア、ならび
に（ａ）動物抗体のものに最も良く一致する可変領域ア
ミノ酸配列を有し、かつ（ｂ）既知の三次元構造をもつ
抗体からの構造情報を用いて実施される。使用しうるソ
フトウェアの例は、SYBYL バイオポリマー・ モジュール
ソフトウェア (トリポス・ アソシエーツ) である。それ
から構造情報が得られる抗体はヒト抗体であってもよい
が、必ずしもそうである必要はない。後記の実施例には
1FI9と表示されるネズミ抗体からの構造情報を用いた。
以上の分析において得られた情報に基づいて、その動物
抗体のものに最も近似するコンピューターモデリング構
造を与える動物可変領域を含む組換え鎖をヒト化のため
に選ぶ。

【００４６】抗ヒトＩＬ−５モノクローナル抗体JESI-3
9D10 (その調製についてはのちに記載する) の部分Ｈ鎖
および完全Ｌ鎖可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレ
オチド配列は、配列表中にそれぞれ配列番号(SEQ ID N
O):１および２により定められる。これらのヌクレオチ
ド配列から予想されるアミノ酸配列も配列番号(SEQ IDN
O):１および２中に定められる。配列番号(SEQ ID NO):
１により定められるヌクレオチド配列 (Ｈ鎖配列) 中の
塩基1-26はポリメラーゼ連鎖反応(PCR) プライマーから
得られた。従ってクローン化配列は塩基27において開始
する。配列番号(SEQ ID NO):１からの対応するアミノ酸
配列は、Ｖ_H の成熟ポリペプチドのものであって、枠組
み構造１のリーダー、すなわち最初の14残基を含まない
ものである。配列番号(SEQ ID NO):２により定められる
ヌクレオチド配列(L鎖配列) 中の塩基１および２は PCR
プライマーから得られた。従ってクローン化配列は塩基
３において開始する。対応するアミノ酸配列は、Ｖ_L の
りーダーおよび成熟ポリペプチドのものである。カバト
(Kabato)ら (前掲) の方法により決定されたモノクロー
ナル抗体JESI-39DIOのＨ鎖可変領域のＣＤＲは、配列番
号(SEQ ID NO):１により定められるアミノ酸配列のアミ
ノ酸残基26-30 、45-60 および93-100からなる。後記の
結合部位ループ構造のコンピューター分析により決定さ
れるように、モノクローナル抗体JESI-39DIOのＨ鎖可変
領域のＣＤＲ構造ループは、配列番号(SEQ ID NO):１に
より定められるアミノ酸配列のアミノ酸残基21-27 、47
-50 および93-101からなる。

【００４７】上記のＨ鎖ＣＤＲをコードするヌクレオチ
ド配列は、配列番号(SEQ ID NO):１により定められるヌ
クレオチド配列の塩基76-90 、133-180 および277-300
(カバト決定法) ならびに塩基61-81 、139-150 および
277-303 (ループ分析法) からなる。カバト(Kabato)ら
(前掲) の方法により決定されたモノクローナル抗体JES
I-39DIOのＬ鎖可変領域のＣＤＲは、配列番号(SEQ ID N
O):２により定められるアミノ酸配列のアミノ酸残基44-
54 、70-76 および109-117 からなる。後記の結合部位
ループ構造のコンピューター分析により決定されるよう
に、モノクローナル抗体JESI-39DIOのＬ鎖可変領域のＣ
ＤＲ構造ループは、配列番号(SEQ ID NO):２により定め
られるアミノ酸配列のアミノ酸残基 46-51、70-72 およ
び111-116 からなる。

【００４８】上記のＬ鎖ＣＤＲをコードするヌクレオチ
ド配列は、配列番号(SEQ ID NO):２により定められるヌ
クレオチド配列の塩基 130-162、208-228 および 325-3
51 (カバト決定法) ならびに塩基136-222 、208-216 お
よび331-348(ループ分析法)からなる。以上から、こう
して決定されたＣＤＲは9-48塩基によりコードされるこ
とが分かる。従って蛋白質の工学的調製に用いられるＤ
ＮＡは、配列番号(SEQ ID NO):１および２により定めら
れるヌクレオチド配列のそれぞれ約12-333および約9-38
4 塩基からなる。同様に重要なものは、蛋白質の工学的
調製に用いられるイソタイプの選択に用いる定常領域で
ある。

【００４９】本発明のＣＤＲをヒト抗体上へのグラフト
形成によりヒト化抗体を調製するために用いる場合、Ｃ
ＤＲ外ではあるが、ＣＤＲまたはＩＬ−５と相互作用す
ると思われる１個または２個以上のアミノ酸残基を含有
させることが望ましいであろう (クイーン(Queen) ら、
前掲) 。本発明のＣＤＲは、抗体JESI-39D10の機能性を
模倣した非ペプチド系模擬化合物の設計の基礎にもなり
うる。このような模擬化合物の調製法についてはサラゴ
ビ(Saragovl)ら[Science 253:792(1991)] が述べてい
る。

【００５０】抗体ヒト化の基礎を提供するほか、配列番
号(SEQ ID NO):１および２の情報を利用して、バード(B
ird)ら[Science 242:423(1988)] が述べているＬ鎖およ
び／またはＨ鎖可変領域からの結合ＣＤＲからなる一本
鎖ＩＬ−５結合蛋白質、またはヒューストン(Huston)ら
[Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879(1988)]が述べている
生合成抗体結合部位(BABS)を調製することができる。単
離されたＨ鎖可変ドメインからなる単一ドメイン抗体
[ワード(Ward)ら, Nature 341:544(1989)] も、配列番
号(SEQ 1D NO):１の情報を利用して調製することができ
る。

【００５１】１または２以上の本発明ＣＤＲを直接に、
またはリンカー配列により互いに結合させて、ポリペプ
チドにすることもできる。１または２以上のＣＤＲを他
の (非−免疫グロブリン) ポリペプチドまたは蛋白質中
へ工学的に挿入し、これによりＩＬ−５結合能をそのポ
リペプチドまたは蛋白質に付与することも可能である。
本明細書において“配列番号(SEQ ID NO):１もしくは２
により定められる配列またはそのサブ配列を有するモノ
クローナル抗体のＨ鎖またはＬ鎖可変領域を含む”ポリ
ペプチドは、以上のＣＤＲ含有形態をすべて包含すると
規定される。抗体JESI-39D10のＨ鎖およびＬ鎖可変領域
またはそれらのＣＤＲをコードするＤＮＡは、配列番号
(SEQ ID NO):１および２中に得られる核酸配列情報を利
用して、標準法により調製することができる。たとえば
それらのＤＮＡは、たとえばマッツーシ(Matteucci) ら
[J.Am.Chem.Soc.103:3185(1981)]のホスホルアミダイト
固体支持体法、ヨー(Yoo) ら[J.Biol.Chem.764:17078(1
989)] の方法、または他の周知の方法により化学的に合
成することができる。

【００５２】あるいは、遺伝子の配列および利用しうる
多数の制限エンドヌクレアーゼの部位特異性は知られて
いるので、当業者はモノクローナル抗体JESI-39D10を産
生するハイブリドーマのゲノムＤＮＡから遺伝子を容易
に同定し、かつ単離し、そしてＤＮＡを開裂させて、目
的配列を得ることができる。PCR 法 [サイキ(Salki)ら,
Science 239:487(1988)]、たとえばドーエルティー(Da
ugherty) ら[NucleicAclds Res.19:2471(1991)] により
示される方法を用いても同じ結果が得られる。適宜な新
たな制限部位を導入し、特定のべクター中への取り込み
を容易にするために、所望によりPCR に用いるプライマ
ーを設計することができる。

【００５３】抗体JESI-39D10のＨ鎖およびＬ鎖可変領域
をコードするＤＮＡを得るためのさらに他の方法は、モ
ノクローナル抗体JESI-39D10を産生するハイブリドーマ
から単離されたｍＲＮＡを鋳型として用いてｃＤＮＡを
調製し、それから標準法により可変領域をクローン化す
ることを伴う [たとえばウォール(Wa11)ら, Nuc1eicAci
ds Res.5:3113(1978)；ツァルスート(Za1sut)ら, Nuc1e
1c Acids Res.8:3591(1980); カビリー(Cabilly) ら, P
roc.Natl.Acad.Scl.USA 81:3273(1984); ボス(Boss)ら,
Nucleic Acids Res.12:3791(1984);アムスター(Amste
r)ら, NucleicAcids Res.8:2055(1980); ムーアら, 米
国特許第4,642,234 号明細書を参照されたい] 。

【００５４】もちろん遺伝子コードの縮重のため、多数
の異なるヌクレオチド配列が、配列番号(SEQ ID NO):１
および２ならびにその中のＣＤＲにより定められるアミ
ノ酸配列を有するＣＤＲ、ポリペプチドおよび抗体をコ
ードしうる。同様に後記のアミノ酸配列を有するヒト化
抗体も多数の異なるＤＮＡによりコードしうる。

【００５５】用いられる個々のコドンは、作成の簡便
さ、および原核系または真核系における最適な発現の両
方につき選ぶことができる。これらの機能上の均等物も
本発明の一部である。さらに、生物学的機能を実質的に
変化させないわずかなアミノ酸の置換、付加または欠失
のある、ポリペプチドおよび蛋白質の保守的に修飾され
た変異体がありうることは当業者は知っている [アンフ
ィンゼン(Anfinsen), Science 181:223(1973);グランサ
ム(Grantham), Science 185:862(1974)]。

【００５６】配列番号(SEQ ID NO):１および２により定
められるアミノ酸配列ならびに後記のヒト化抗体がこの
ように保守的に修飾された変異体も、本発明により考慮
される。たとえば化学合成によって、または修飾された
PCRプイマーの使用もしくは部位特異性突然変異形成に
よって、本発明のＤＮＡを修飾して所望によりこのよう
な変異体を形成することは、当業者が容易になしうる範
囲のものである。より実質的な修飾を行うことが有利な
場合もある。たとえばロバーツ(Roberts) ら [Nature 3
28:731(1987)] は、部位特異的突然変異誘発により結合
部位の周辺の２個の帯電残基を除去することによって、
親和性および特異性の高められた抗体を調製した。

【００５７】抗体JESI-39D10のＨ鎖およびＬ鎖可変領域
をコードするＤＮＡをべクターに挿入することは、それ
らのＤＮＡおよびべクターの末端が両方とも適合性の制
限部位を含む場合は容易に達成される。これが不可能で
ある場合、制限エンドヌクレアーゼ開裂により生じた一
本鎖ＤＮＡオーバーハングを消化して平滑末端を形成す
ることによりＤＮＡおよび／またはべクターの末端を修
飾するか、または一本鎖末端を適宜なＤＮＡポリメラー
ゼでフィルインすることによって同じ結果を達成する必
要があろう。あるいはヌクレオチド配列 (リンカー) を
末端にリゲートすることにより、希望するいかなる部位
をも形成することができる。これらのリンカーは、希望
する制限部位を定める特異的オリゴヌクレオチド配列を
含むものであればよい。開裂したべクターおよびＤＮＡ
フラグメントを、必要に応じてホモポリマーテイル形成
または PCRにより修飾することもできる。

【００５８】本発明の抗体、結合組成物、もしくは一本
鎖結合蛋白質、またはこれらのモノクローナル抗体に対
して産生された抗イディオタイプ抗体を用いて、ＩＬ−
５関連疾患を治療するための薬剤組成物を調製すること
ができる。これらの抗体のフラグメント、たとえばＦａ
ｂまたはＦｖフラグメント、単離されたＨ鎖またはＬ鎖
もしくはそれらのフラグメント、およびたとえば個々の
ＣＤＲ領域からなる短いポリペプチドも、上記組成物中
に使用しうる。上記組成物のあるものはＩＬ−５遮断ま
たは拮抗作用をもち、ＩＬ−５活性を抑制するために用
いることができる。それらの組成物は、本発明の抗体、
結合組成物または一本鎖結合蛋白質および生理学的に受
容しうるキャリヤーを含む。

【００５９】他の組成物は、本発明のモノクローナル抗
体を抗原として用いて調製された抗イディオタイプ抗
体、および生理学的に受容しうるキャリヤーを含む。モ
ノクローナルまたはポリクローナルのいずれであっても
よく、標準法により調製されるこれらの抗イディオタイ
プ抗体は、I L −５自身の結合活性を模倣すると思われ
る。従ってそれらは I L- 5 アゴニストまたはアンタゴ
ニストとして有用となる可能性がある。

【００６０】有用な薬剤用キャリヤーは、本発明の組成
物を患者に付与するのに通した適合性、無毒性のいかな
る物質であってもよい。無菌の水、アルコール、脂肪、
ろう、および不活性固体がキャリヤーに含まれる。薬剤
学的に受容しうる佐剤 (緩衝剤、分散剤) がこれらの薬
剤組成物に含有されてもよい。一般にそれらの薬物の非
経口投与に有用な組成物は周知である；たとえば Remin
gton's Pharmaceutical Science,第15版 (マック・ パブ
リシング・ カンパニー, ペンシルバニア州イーストン,1
980)。あるいは本発明組成物を移植用ドラッグデリバリ
ーシステムにより患者の体内へ導入することができる
[アーカート(Urquhart)らAnn.Rev.Pharmacol.Toxicol.2
4:199(1984)] 。

【００６１】

【実施例】説明のために用いられる、下記の非限定的実
施例では、固体混合物中の固形分％、液体中の液体％及
び液体中の固形分％は、他に指示しない限り、それぞれ
重量／重量、容量／容量及び重量／容量に基づいて記載
する。細胞培養中は無菌条件を維持した。

【００６２】一般的方法と試薬 他に記載しない限り、本質的に、マニアティス (Maniat
is) 等の Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 19
82, Cold Spring Harbor Laboratory が述べているよう
に、標準組換えＤＮＡ方法を実施した。飽和一晩培養物
からのプラスミドＤＮＡの小規模単離はバーンボイム
(Bornboim) 等の方法 [Nuclelc Acids Res.7:1513(197
9)] に従って実施した。この方法は、分析の目的のため
に、細菌培養物からの少量のＤＮＡの分離を可能にす
る。他に指示しない限り、クレウェル(Clewell) 等が述
べているように [J.Bacteriol. 110:1135(1972)]、多量
のプラスミドＤＮＡを製造した。

【００６３】プラスミドＤＮＡの開裂によって誘導され
た特定制限酵素フラグメントをアガロース中での分取電
気泳動によって単離した。９×５ 1/2 cm のサイズのゲ
ルをトリスボレート緩衝液中で50mAにおいて1 時間処理
し (マニアティス等、上記文献454 頁) 、ＤＮＡを可視
化するために臭化エチジウム 0.5μg/mlによって染色し
た。適当なゲル切片を切り取り、ＤＮＡを電気溶離した
(マニアティス等, 上記文献 164頁) 。電気溶離(elect
roelution)後に、ＤＮＡをフェノール抽出し (マニアテ
ィス等, 上記文献 164頁) 、−20℃においてエタノール
析出させた (マニアティス等、上記文献 461頁) 。

【００６４】制限酵素とT4ＤＮＡリガーゼとは New Eng
land Biolabs (マサチュセッツ州,ビバリー) から購入
した。スーパースクリプトＲＮＡｓｅＨ−逆転写酵素は
BRL/GIBCO(メリーランド州, ガイザースブルグ) から購
入した。Taq ＤＮＡポリメラーゼはストレイタジン(Str
atagene) (カリフォルニア州, ラジョラ) から購入し、
ＤＮＡポリメラーゼのクレノウフラグメントはファルマ
シアLKB バイオテクノロジー社 (Pharmacia LKB Biotec
hnology,Inc.)(ニューンャーンー州, ピスカタウェイ)
から購入し、ウシ腸ホスファターゼは Boehringer Mann
helm Biochemicals インディアナ州, インディアナポ
リス) から購入し、ＲＮＡｓｉｎはプロメガ(Promega)
(ウィスコンシン州, マディソン) から購入した。全て
の酵素は製造者の指示書に従って用いた。セクェナーゼ
型式 (Sequenase version) 2.0配列系は United States
Biochemical (オハイオ州, クリーブランド) から入手
した。

【００６５】デオキシヌクレオチド三リン酸とオリゴｄ
ｔ_12-18 プライマーとウシ血清アルブミン(BSA) は Boe
hringer Mannhelm Biochemicals から入手し、再蒸留フ
ェノールは REL/GIBCO から入手した。プラスミドベク
ターのpSV.Sport とpUC19 、及びコンピテント(compete
nt) 大腸菌の菌株ＤＨ５−アルファ (マックス エフィ
シエンシー(lax Efficiency))はBRL/GIBCO から入手し
た。COS-7 細胞(ATCC CRL 1651) はアメリカンタイプカ
ルチャーコレクション( メリーフンド州, ベテスダ) か
ら入手した。組織培養基、ウシ胎児血清(FBS) 及び補助
剤(supplement)はBRL/GIBCO から入手した。

【００６６】プラスミドpDSRG(ATCC 68233) を用いる標
準方法によって、中国ハムスター卵巣(CHO) 細胞に紐換
えヒトＩＬ−５を発現させ、イムノアフィニナィクロマ
トグラフィーによって精製した。組換えヒトI L −５に
対するウサギ抗血清は標準方法によって製造した。バイ
オチニル化ヤギ抗ウサギＩｇＧはべクターラブス(Vecto
r Labs)(カリフォルニア州, バーリンガム) から入手
し、ストレプトアビジン−アルカリ性ホスファターゼ抱
合体はBRL/GIBCO の製品であった。バイオチニル化ウサ
ギ抗ラットＩｇＧはジャクソンラブス(Jackson Labs)
(ペンシルバニヤ州, ウエストグローブ) から入手し
た。ニトロブルーテトラゾリウム(NBT) と５−ブロモ−
４−クロロ−３−インドリルホスフェート(BCIP)はBRL/
GIBCO から入手した。マイクロタイタープレートELISA
(酵素結合イムノソルベントアッセイ) 測定の基質とし
て用いる高感受性 BLISA AMPLIFICATION SYSTEM(登録商
標) はBRL/GIBCO から入手した。

【００６７】細胞培養 モノクローナル抗体JESI-39D10を産生するハイブリドー
マ細胞ラインをデンブルグ(Denburg) 等[B1ood77:1462
(1991)]が述べているように製造し、最初は、5％C0₂ を
含む加湿37℃室において5 ％FBS 、2mM グルタミン及び
10単位／mlペニシリン／ストレプトマイシンを補ったダ
ルベッコ(Dulbecco)改質イーグル培地(DMBM/高グルコー
ス;GIBC0, メリーランド州, ベテスダ) 中に維持した。
その後、この細胞ラインを、血清の代わりにIXHB1O1 補
助剤 (ハナバイオロジクス(HanaBiologics), カリフォ
ルニア州, アラメダ) を用いることによる血清を含まな
い培養に適応させた。

【００６８】モノクローナル抗体JESI-39D10の特性化 精製 抗体39D10.11(JBS I-39D10のサブクローン) を産生する
細胞ラインによるならし培地を回収し、濾過し、組換え
ヒトI L −５をAFFIGEL-15 (登録商標) 樹脂 (BioRad,
カリフォルニア州, リッチモンド) に結合させることに
よって製造した抗原アフィニティカラムに供給した。次
に、カラムをリン酸塩緩衝生理食塩水(PBS) と0.5 M Na
Cl含有PBS によって連続的に洗浄し、PBS と平衡させ
た。抗体39D10.11をカラムから0.2Mグリシン緩衝液によ
って溶離させ、その後、溶離タンパク質を１Ｍ Tris-HC
l 、pH8 によって直接中和した。精製タンパク質に本質
的にレムリ(Laemmli) [Nature 227:680(1970)]が述べて
いるように還元性条件下で15％ゲル中でのポリアクリア
ミドゲル電気泳動を実施して、Ｈ鎖とＬ鎖とを分離させ
た。両鎖を本質的にマツダイラ(1atsudaira)のエレクト
ロブロッチング法(electroblotting method)[J.Biol.Ch
em.261:10035(1987)] を用いて、IMMOBILON(登録商標)
膜 (ミリポア(Millipore),マサチュセッツ州, ベッドフ
ォードからのPVDF膜) 上への転移によって回収した。ク
ーマシーブリリアントブルーによる染色後にＨ鎖とＬ鎖
とに対応するバンドを膜から切断し、Applied Biosyste
ms Model 477A タンパク質−ペプチド配列決定装置を用
いたN-末端配列決定のために処理した。IMMOBILON(登録
商標) 膜上にブロットした単離Ｈ鎖とＬ鎖との配列決定
を、本質的にユエン(Yuen)等[Biotechnlques 7:74(198
9)]が述べているように実施した。Ｈ鎖は標準条件下で
配列決定することができなかった。Ｌ鎖は15サイクルま
で配列決定された。得られた配列と発表データとの比較
はラットイムノグロブリンＬ鎖の同定を実証した。

【００６９】抗体イソタイプ化(isotyping) ジメド(Zymed)(カリフォルニア州, サンフランシスコ)
からのキットを用いて実施した抗体JESI-39D10のイソタ
イプ化は、Ｈ鎖がガンマ2aイソタイプであり、Ｌ鎖がカ
ッパイソタイプであることを明らかにした (γ2a／κイ
ソタイプ) 。生物活性に対する効果 モノクローナル抗体JESI-39D10は組換えヒトI L −５の
生物活性を強力に阻害する (デンブルグ等, 上記文献)
。この抗体がI L −５のその細胞レセプターへの結合
を阻害することによってこの効果を生ずることを研究が
示している。

【００７０】PCRクローン化 オリゴヌクレオチドプライマー設計とクローン化方法 簡単に説明すると、ラットIgG2a とカッパＨ鎖及びＬ鎖
配列の既知のアミノ末端及びカルボキシル末端に一致す
るオリゴヌクレオチドプライマーを製造した [ライヒマ
ン(Reichmann) 等, Nature 332:323(1988): ブルッジマ
ン(Bruggimann)等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:60
75(1986); へルマン(Hellman) 等,Gene40:107(1985)]
。これらのプライマーを用いて、完全なＬ鎖と先端切
断したＨ鎖とのｃＤＮＡフラグメントを PCR方法を用い
て単離した [サイキ(Saiki) 等, Sclence 239:487(198
8)]。これらのｃＤＮＡフラグメントを配列決定し、ｃ
ＤＮＡの種々な領域から設計された PCRプライマーを用
いて形成した他のクローンとの比較によって確認した。
Ｌ鎖の演繹されたアミノ酸配列はJBSI-39D10Ｌ鎖の最初
の15N-末端アミノ酸残基の配列決定によって実証した。

【００７１】オリゴヌクレオチド合成 抗体JESI-39D10のIgG2a/カッパイソタイプに基づいて、
配列表に定義された配列を有するオリゴヌクレオチドプ
ライマーをアプライドバイオシステムスモデル380A又は
380B合成装置を用いて標準方法によって合成した。これ
らのプライマーの名称 (最初の文字は使用合成装置モデ
ルに一致する) と対応する配列確認番号とは下記の通り
である:

【００７２】オリゴヌクレオチド SEQ IDN0 (配列番号) B2051CC 3 B2031CC 4 A2064CC 5 A2065CC 6 B2137CC 7 B2108CC 8 B2101CC 9 B1852CC 10

【００７３】抗体JESI-39D10のＨ鎖に関しては、成熟Ｈ
鎖ポリペプチドの第６アミノ酸〜第14アミノ酸を含む、
ライヒマン等の上記文献による既知ラットIgG2a 配列の
セグメントから、5'末端プライマーB2051CC を誘導し
た。クローン化を容易にするために、２制限部位、Xba
I と HindIIIをこのプライマーの5'末端に加えた。3'末
端プライマーB2031CC は既知ラット IgG2a定常領域3 配
列( ブルッジマン等, 上記文献) のセグメントに基づく
ものであった。クローン化のために、３制限部位、Sma
I 、EcoRI 及び Sal Iを加えた。Ｌ鎖に関しては、5'及
び3'末端プライマー配列の両方は既知ラットカッパｍＲ
ＮＡ配列 (ヘルマン等, 上記文献) から誘導した。プラ
イマー A2064CCは部分5'非翻訳領域と、翻訳開始コドン
の最初の２ヌクレオチドとを含む。クローン化を容易に
するためにHindIII とBamHI 部位を加えた。3'末端プラ
イマーA2065CC は既知ラットカッパ免疫グロブリンＬ鎖
3'非翻訳領域(3'UTR) のセグメントに基づくものであっ
た。このセグメントは停止コドンの最後の２ヌクレオチ
ドと、停止コドンの3'に直接に22 3'UTRヌクレオチドと
を含む。クローン化を容易にするためにEcoRI とPst I
部位とを加えた。

【００７４】PCR 反応条件 本質的にカタラ(Cathala) 等が述べているように [DNA
2:329(1983)]、抗体JESI-39D10を産生するハイブリドー
マ細胞ラインから細胞質ＲＮＡ全体を取り出した。単離
したＲＮＡを鋳型として用いて、本質的にラッリク(Lar
ric)等が述べているように[Bio/Technology 7:934(198
9)]、第１鎖ｃＤＮＡ合成を実施した。次に、ｃＤＮＡ
生成物に対して0.5ml エッペンドルフ管中で0.5 μｌパ
ラフィン油オーバーレイを用いて50μl 量反応混合物中
でのPCR を実施した。Ｈ鎖合成のための反応混合物はＨ
₂ Ｏ 26.5 μl と、Taq(サーマスアクァティカス(Therm
us aquaticus))ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液 [反応中の最
終濃度：10mMTris-HC1, pH 8.3, 50mM KC1, 1.5mM MgCl
₂, 0.01％(w/v) ゼラチン] と、1.25mM dNTP 5 μl
と、プライマーB2051CC(60pmol)4μ1 と、プライマーB2
031CC(60pmol)4μ1 と、ｃＤＮＡ (総ＲＮＡ3 〜6 μg
から誘導される第１鎖ｃＤＮＡの1/2 を含有) 5 μl
と、Taq ポリメラーゼ (2.5 単位)0.5μl とを含有し
た。Ｌ鎖合成のための反応混合物は、使用プライマーが
A2064CC とA2065CC であること以外は、同じであった。

【００７５】反応はPHC-1 サーモサイクラー(Themocycl
er)(テクネ(Techne), ニュージャージー州, プリンスト
ン) において: 変性のために94℃、1.5 分間; アニーリ
ングのために50℃、2 分間；及び合成のために72℃、3.
5 分間の30サイクルによって実施した。第30サイクルの
終了時に、反応混合物を伸長(extension) のために72℃
においてさらに９分間インキュベートした。PCR 混合物
に対して0.5 μg/ml臭化エチジウムを含む１％アガロー
ス／トリスーボレート(Tris-Borate) ゲル中での電気泳
動を実施した。予想サイズ (Ｈ鎖では約 1.5キロベー
ス、Ｌ鎖では約 0.7キロベース) を有するＤＮＡフラグ
メントをゲルから切断し、電気溶離によって精製した。

【００７６】ｃＤＮＡクローンの検査 ＤＮＡ配列決定 ゲルからの回収、エタノール析出及び制限エンドヌクレ
アーゼ開裂後に、PCR形成される推定Ｈ鎖とＬ鎖ｃＤＮ
Ａを配列決定のために適当なべクターにクローン化し
た。推定Ｈ鎖とＬ鎖ｃＤＮＡとをそれぞれ、HindIII/Ec
oRI 及びBamHI/PstIフラグメントとしてpUC19 べクター
に別々にクローン化した。連結したプラスミドを次に標
準方法によって大腸菌菌株DH5-αに形質転換させた。形
質転換細胞コロニーを単離させ、これらの形質転換細胞
から、それぞれＨ鎖とＬ鎖のための少なくとも２個のク
ローンからプラスミドＤＮＡを配列決定のために製造し
た。これによって得られた (それぞれ、SEQ ID NO:1 と
2 によってＨ鎖とＬ鎖として定義される) 可変領域配列
の既知免疫グロブリン配列との比較は、カバト等の上記
文献の方法によって決定された、推定ＣＤＲの枠組み構
造と位置決め(positioning) とにおける高度の相同を明
らかにした。さらに、Ｌ鎖ｃＤＮＡ配列から予測される
N-末端アミノ酸配列は、抗体JESI-39D10のＬ鎖の実験的
に決定されたN-末端配列と一致した。

【００７７】発現プラスミド構築 単離したｃＤＮＡがヒトＩＬ−５に特異的に結合するこ
とができるタンパク質をコードすることを実証するため
に、抗体JESI-39D10の全長推定Ｈ鎖をPCR によって再構
築した。プライマー B2137CC (SEQ ID NO:7)と B2108CC
(SEQ ID NO:8)とを、初期クローン化先端切断Ｈ鎖ｃＤ
ＮＡを修飾するように設計した。これらのプライマーは
リーダーペプチド、可変領域のN-末端における５欠損(m
issing)アミノ酸残基及び定常領域のC-末端における欠
損残基をコードする配列を供袷した。

【００７８】翻訳を容易にするために、脊椎動物の共通
翻訳開始配列 [Kozak, Nucleic Acids Res. 20:8125(19
87)]をコーディングｃＤＮＡの5'末端に加えた。クロー
ン化を容易にするために、Sal l とEcoRI 制限部位を生
成ｃＤＮＡの5'末端と3'末端とにそれぞれ導入した。プ
ライマー B2101CC (SEQ ID NO:9)と B1852CC (SEQ ID N
O:10) とを用いて、推定Ｌ鎖ｃＤＮＡをも再設計した。
これは主として、発現プラスミド構築のために末端にお
ける制限部位を修飾するために実施した。脊椎動物の共
通翻訳開始配列もこのｃＤＮＡに導入した。PCR を実施
し、ＤＮＡ生成物を上記のように単離し、ＤＮＡを Sal
IとEcoRIとによって開裂した。次にＨ鎖とＬ鎖ｃＤＮ
Ａを別々に、同様に開裂した発現べクター pSRS (ATCC6
8234) に結合させた。プラスミド pSRS はSRαプロモー
ターと複製のSV40起点を含み、COS 細胞におけるｃＤＮ
Ａインサートの複製と発現とを可能にする。

【００７９】形質移入 形質移入の前に、10％FBS と 6mMグルタミンとを補った
DMEM／グルコース中でCOS細胞を増殖させた。指数関数
的に増殖した細胞をトリプシン処理し、新鮮な培地で洗
浄し、新鮮な培地中に２×１０⁷ 細胞／mlの密度で再懸
濁させた。GENEPULSER (登録商標)(バイオラド, カリフ
ォルニア州, リッチモンド) を用いて、製造者の指示書
に従って、エレクトロポレーションを実施した。簡単に
説明すると、COS 細胞懸濁液の250 μl アリコートを各
キュベットに分配した。CIRCLEPREP (登録商標)(Biol0
1, カリフォルニア州, ラジョラ) 精製プラスミドＤＮ
Ａ約10μg を50μl 未満の量でキュベットに加え、細胞
と混合した。使用ＤＮＡサンプルはＨ鎖ｃＤＮＡインサ
ート含有pSRS(pSRS-H)、Ｌ鎖ｃＤＮＡインサート含有pS
RS(pSRS-L)、pSRS-HとpSRS-Lとの等量混合物、非修飾pS
RSを含んだ。0.2volt 電気パルスを 960μF において容
量エクステンダーによって供給した。次に、細胞を60mm
培養皿で培養し、新鮮な培地 5mlを供給し、５％C0₂ イ
ンキュベーター中37℃においてインキュベートした。16
時間後に、培地を吸引によって除去し、無血清培地と取
り替えた。インキュベーションをさらに72時間続け、そ
の後、培地を回収した。

【００８０】イムノブロット分析 形質移入した細胞によるならし培地をCENTRICON(登録商
標) 管 (アミコン(Amicon), マサチュセッツ州, ダンバ
ース) 中での遠心分離によって約10倍に濃縮した後に、
これらの培地に対して非還元性条件下で15％プレキャス
ト(precast)SDSポリアクリルアミドゲル (Integrated S
eparation Systems,マサチュセッツ州,ハイドパーク)
中で電気泳動を実施した。サンプルの同じ２セットを同
じゲルに加えた。２つの同分子量マーカータンパク質混
合物 (97.4、68、43、29、18.4及び 14.3 キロダルトン
タンパク質を含む) もこのゲル中に加えた。

【００８１】電気泳動後に、分離したバンドをセミドラ
イエレクトロブロッター (Semi-dryElectroblotter) (I
ntegrated Separation Systems,マサチュセッツ州, ハ
イドパーク) によってニトロセルロース膜上に移した。
この膜を次に室温において PBS中の３％BSA を加えてイ
ンキュベートした後に、２片に切断した。各片はサンプ
ルの完全なセットを含有した。膜の1 片をならし培地中
のラットIgG 鎖発現の検出するための第１分析に用い
た。この分析は膜を次に室温において：３％BSA を含
む、TBST緩衝液 [10mM Tris-HC1 、pH 7.4、150mM NaCl
及び0.05％TWEEN-20 (登録商標)(ポリオキシエチレンソ
ルビタンモノラウレート)]中のビオチニル化ウサギ抗ラ
ットIgG の1:200 希釈物によって45分間１回、TBST緩衝
液のみによって15分間３回、TBST緩衝液中のストレプト
アビジン−アルカリ性ホスファターゼ抱合体の1:10,000
希釈物によって30分間１回、TBST緩衝液のみによって15
分間３回、及びアルカリ性ホスファターゼ基質 (100mM
Tris-HCl、pH 9、100mM NaCl、5mM MgCl₂ を含むアルカ
リ性ホスファターゼ緩衝液10ml中のNBT 44μl とBCIP33
μl)によって10〜30分間１回処理することによって達成
された。この膜片を次に蒸留水によるすすぎ洗い後に発
色に関して試験した。

【００８２】膜の他方の片を任意のならし培地中にヒト
I L −５結合タンパク質が存在するか否かを調べるため
の第２分析に用いた。この片を室温において:TBST 緩衝
液中の１μg/ml組換えヒトＩＬ−５によって１時間１
回、TBST緩衝液のみによって15分間３回、TBST緩衝液中
の組換えヒトＩＬ−５に対するウサギ抗血清の 1:3,000
希釈物によって１時間１回、TBST緩衝液のみによって15
分間３回、TBST緩衝液中のビオチニル化ヤギ抗ウサギ I
gGの 1:200希釈物によって１時間１回、TBST緩衝液のみ
によって15分間３回、TBST緩衝液中のストレプトアビジ
ン−アルカリ性ホスファターゼ抱合体の1:10,000希釈物
によって30分間１回、TBST緩衝液のみによって15分間３
回、及びアルカリ性ホスファターゼ基質によって連続的
に処理した。次に、この膜を発色に関して試験した。

【００８３】第１分析の結果は、pSRS-HとpSRS-Lの両プ
ラスミドによって同時形質移入した形質転換細胞による
ならし培地のみが検出可能なバンドを生じることを示し
た。バンドのパターンは免疫グロブリンに関して予想さ
れた通りであった。Ｈ鎖又はＬ鎖のみによって形質移入
した細胞からのならし培地を含むレーンには着色が観察
されず、このことはタンパク質が少量であるか又は抗体
が個々のＨ鎖及びＬ鎖を識別できないことを実証する。
Ｈ鎖はＬ鎖の不存在下では通常分泌されないので、なら
し培地中に存在するとは考えられなかった [ボール(Bol
e)等, J.Cell Biol.102:1558(1986)] 。

【００８４】第２分析では、pSRS-HとpSRS-Lの両プラス
ミドによって同時形質移入した形質転換細胞によるなら
し培地からのサンプル中に強いＩＬ−５結合活性が観察
された。これは非還元性 SDSゲル中で約 160キロダルト
ンの見かけの分子量すなわち、完全な抗体分子に予想さ
れるサイズを有して移動する主要な着色したバンドとし
て認められた。

【００８５】酵素結合イムノソルベントアッセイ 組換えモノクローナル抗体がヒトI L −５に特異的に結
合することができることを実証するために、96孔イムノ
アッセイ(EIA) プレートに３％ BSAのみ50μ1又は細換
えヒトＩＬ−５ (５μg/ml、次に BSA溶液によって遮
断) を塗布した。全ての塗布は４℃において約２時間実
施した。次に、上述した種々の COS細胞の形質転換細胞
による又は抗体JES1-39D10産生ハイブリドーマ細胞ライ
ンによるならし培地のアリコート (50μ1)を孔に加え、
プレートを４℃において２時間インキュべ一トした。

【００８６】インキュベーション後に、孔内の培地を室
温において 300μ1 アリコートを用いて連続的に取り替
え、TBST緩衝液のみによって15分間３回、ビオチニル化
ウサギ抗ラットIgG によって約２時間１回、TBSTのみに
よって15分間３回、TBST中のストレプトアビジン−アル
カリ性ホスファターゼ抱合体によって30分間１回、TBST
緩衝液のみによって15分間３回処理し、BRLELISA AMPLI
FICATION SYSTEMS (登録商標) によって5 〜15分間発色
させた。全ての試薬希釈度は上述した通りであった。

【００８７】このアッセイの結果は、天然JESI-39D10抗
体 (ハイブリドーマによるならし培地から) と組換え抗
体 (pSRS-HとpSRS-Lの両プラスミドによって同時形質移
入した形質転換細胞によるならし培地から) の両方が、
強い発色によって実証されるように、ＩＬ−５を塗布し
た孔に保有されることを示した。I L −５が存在しない
場合又は試験サンプルがＨ鎖若しくはＬ鎖のみをコード
するべクターによって形質移入した細胞のならし培地で
ある場合には、バックグラウンド対照 (抗体タンパク質
を含まず) を越える有意な発色は観察されなかった。

【００８８】抗体ヒト化 相同モデリング 上記方法によって、抗体ＨＩＬとＬＡＹが最適ヒト枠組
み構造侯補であることが判明した。ＨＩＬ又はＬＡＹの
Ｈ鎖とＬ鎖の対及びこれらの組合せを最初に追及した。
枠組み構造配列にグラフトすることができる、可能な最
小及び最大JEST-39D10残基のりストが下記表に示す通り
であることが、上記方法によって判明した。

【００８９】 残 基 ^a Ｖ_H 最小リスト： 21-27 、 7-50、66、93-101 Ｖ_H 最大リスト^b ： 19、28、29、30、32、40、45、 46、51、52-60 、71、89、92 Ｖ_L 最小リスト： 46-51 、68、70-72 、84、91、 109 、110-116 Ｖ_L 最大リスト^b ： 44、45、52-54 、56、66、 73-76 、88、89、117 ａ Ｖ_H とＶ_L との残基はそれぞれ EQ D NO:1と EQ D NO:2における残基番 号を意味する。ｂ Ｖ _H とＶ _L との最大リストは対応最小リストと、他の指示残基とを含む。

【００９０】以下に示す特定の構造は上記表からの下記
残基を含有した。 ヒト化抗体 残 基 CMX5-1 Ｖ_H ＨＩＬ最大；Ｖ_L ＬＡＹ最大 CMX5-2 Ｖ_H ＨＩＬ最大；Ｖ_L ＬＡＹ最大 (小構造ＣＤＲループH-I N-末端) CMX5-3 Ｖ_H ＬＡＹ最大；Ｖ_L ＬＡＹ最大 CMX5-4 Ｖ_H ＨＩＬ最小；Ｖ_L ＬＡＹ最小 CMX5-5 Ｖ_H ＨＩＬコバト；Ｖ_L ＬＡＹコバト ＣＤＲのみ ＣＤＲのみ

【００９１】ヒト化抗体の所定の用途は溶解性ヒトI L
−５の生物活性の中和であるので、ヒト化抗体の定常領
域としてγ⁴ を選択した。この理由は補体固定(complem
entfixation) の誘発において４種のヒト免疫グロブリ
ンイソタイプの中でγ⁴ が最小効力であるからである。
ヒト化Ｌ鎖の定常領域としてラットκイソタイプのヒト
カウンターパート(counterpart) を選択した。

【００９２】ヒト化抗体CMX5-1の構築 PCR と通常のクローン化方法との組合せを用いて、合成
CMX5-1ＤＮＡを構築した。Ｖ領域を３セグメントに分割
し, 各セグメントを5'末端と3'末端における指定(desig
nated)制限部位を含むように設計した。哺乳動物遺伝子
中に比較的高い頻度で出現するコドンを選択した。配列
の転位又は欠失を生ずる予想外の二次構造の形成を最小
にするために、オリゴヌクレオチドの設計の言及しない
(silent)変化によって、回帰性(palindromic) 配列と反
復配列とを回避したか又は取り替えた。CMX5-1の全Ｈ鎖
可変領域 (Ｖ_H ) に対応するオリゴヌクレオチドを標準
方法によって合成した。これらのオリゴヌクレオチドの
名称と、これらの配列を定義する対応 SEQ IDNOは次の
通りである：

【００９３】オリゴヌクレオチド SEQ ID NO B2474CC 11 B2419CC 12 B2420CC 13 B2475CC 14 B2477CC 15 B2479CC 16

【００９４】オリゴヌクレオチド対の B2474CCと B2419
CC、 B2420CCと B2475CC、B2477CCと B2479CCを熱変性
させ、アニールし、Taq ポリメラーゼ又はPfu(ストレイ
タジン, カリフォルニア州, ラジョラ) と共にインキュ
ベートした。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR) では、各対の
２種オリゴヌクレオチドは約24〜30ヌクレオチドによっ
て相互に相補的であった。それ故、各ヌクレオチドを他
方の鋳型として用いた。PCR を18サイクル実施し、その
後、Ｖ_H 1 、Ｖ_H 2 及びＶ_H 3 と名付けられた、Ｖ_H の
３共通セグメントに対応する３生成ＤＮＡフラグメント
をアガロースゲル中で電気泳動し、電気溶離によって精
製した。３Ｖ_H ＤＮＡフラグメントの相対的順序、クロ
ーン化のための制限部位及びクローン化べクター pSV.
Sport のマルチクローン化部位マップは次の通りであっ
た:

【００９５】フラグメント 制限部位 PCR プライマー Ｖ_H 1 EcoRI------Spel B2474CC+B2419CC Ｖ_H 2 Spel------XbaI B2420CC+B2475CC Ｖ_H 3 EcoRI/XbaI------SalI/ApaI/SstI B2477CC+B2479CC

【００９６】pSV. Sportのマルチクローン化部位 PstI/KpnI/RsrII/EcoRI/Smal/SalI/SstI/SpeI/NotI/Xba
l/BamHI/HindIII/SnaBI/MluI フラグメントＶ_H 1 を酵素EcoRI とSpeIによって制限
し、ベクターpSV.Sportにクローン化した。次に、フラ
グメントＶ_H 2 をpSV.Sport 中のＶ_H 1 にSpe I部位とX
baI部位における方向性挿入によって結合させた。フラ
グメントＶ_H 3 は別に、EcoRI/XbaI-SalI/APaI/SstI フ
ラグメントとしてpSV.Sport にクローン化した。これら
の３フラグメントをＤＮＡ配列決定によって実証した。
以下でさらに詳述するように、γ⁴ Ｈ鎖定常領域
(Ｃ_H ) のゲノムＤＮＡにＶ _H 3 を最初に結合させ、次
にこのＶ_H 3 −Ｃ_H フラグメントをＶ_H 1 −Ｖ_H 2 フラ
グメントを結合させることによって、全長 CMX5-1 Ｖ_H
ｃＤＮＡを作成した。CMX5-1Ｖ_L ｃＤＮＡを同様なやり
方で、６種の合成オリゴヌクレオチドプライマーを用い
て作成した。これらのオリゴヌクレオチドと、これらの
配列を定義する対応 SEQ ID NOとは次の通りである:

【００９７】オリゴヌクレオチド SEQ ID NO B2425RCC 17 B2426CC 18 B2427CC 19 B2458CC 20 B2459CC 21 B2460CC 22

【００９８】Ｖ_L 1 、Ｖ_L 2 及びＶ_L 3 と名付けられ
た、３種フラグメントは、それぞれオリゴヌクレオチド
対のB2425RCCとB2426CC 、B2427CC とB2458CC 、B2459C
C とB2460CC から誘導されたものであった。Ｖ_L の３連
続セグメントに対応する、これらのＤＮＡフラグメント
をアガロースゲル電気泳動と電気溶離とによって精製し
た。３Ｖ_L ＤＮＡフラグメントの相対的順序、クローン
化のための制限部位及びクローン化べクターpUC19 のマ
ルチクローン化部位マップは次の通りであった:

【００９９】フラグメント 制限部位 PCR プライマー Ｖ_L 1 PstI------BstEII/XbaI B2425RCC+B2426CC Ｖ_L 2 PStI/BStEII-----BamHI B2427CC+B2458CC Ｖ_L 3 BamHI------SalI B2459CC+B2460CC

【０１００】pUC19 のマルチクローン化部位 EcoRI/Sacl/KpnI/SmaHI/BamHI/XbaI/SalI/PstI/SphI/Hi
ndIII Ｖ_L 1 、Ｖ_L 2 及びＶ_L 3 をそれぞれ、PstL-BstEII/Xb
aI、PstI/BstEII-BamHI 及びBamHI-SalIフラグメントと
してべクターpUC19 に別々に最初にクローン化した。3
フラグメントの同定をＤＮＡ配列決定によって実証し
た。次に、Ｖ_L 1を既に含むべクターにＶ_L 2 をBstEII-
BamHIフラグメントとして挿入することによって、Ｖ_L 1
とＶ_L 2 をpUC19 に一緒に構成した。全長Ｖ_L ｃＤＮ
Ａの作成は、最初にＶ_L 3 をＬ鎖定常領域 (Ｃ_L ) に結
合させ、次に、以下でさらに詳述するように、Ｖ_L 1 −
Ｖ_L 2 フラグメントとＶ_L ３−Ｃ_L フラグメントとを結
合させることによって実施された。

【０１０１】ヒト化抗体の合成と分泌とを容易にするた
めに、成熟Ｈ鎖とＬ鎖ポリペプチドの両方のアミノ末端
にリーダーペプチドを結合させた。このリーダーのアミ
ノ酸配列とヌクレオチド配列は、抗CAMPATH-1 抗体のリ
ーダーの配列である (ライヒマン等、上記文献) 。リー
ダーペプチドのコード化配列 (ライヒマン等, 上記文
献) をフラグメントＶ_H 1 とＶ_L 1 の両方に導入した。
全長抗体Ｈ鎖をコードするＤＮＡを構築しようと試み
て、Ｖ_H 合成ｃＤＮＡをヒトγ⁴ 定常領域ゲノムＤＮＡ
(ATCC57413) に、ApaI制限開裂と結合を用いて結合させ
た。この操作は、Ｖ_H 3 含有プラスミドpSV.Sport をNo
tIによって消化させることによって開始され、この後に
クレノウＤＮＡポリメラーゼ (べ一リンゲルマンハイ
ム) による処理によって、平滑末端を形成した。生成Ｄ
ＮＡをエタノール析出させ、再懸濁させ、ApaIによって
消化させた。この制限プラスミドＤＮＡをゲノムγ⁴ 定
常領域のApaI/SmaI 制限フラグメントと結合させた。Ｖ
_H 3 −Ｃ_H ゲノムＤＮＡを次にXbaI/HindIIIフラグメン
トとして切断して、既にＶ_H １−Ｖ_H 2 を含むp SV.Spo
rt中に挿入し、それによって全長Ｈ鎖ＤＮＡの作成を完
成する。

【０１０２】抗体鎖を製造しようと試みて、Ｈ鎖ＤＮＡ
とＬ鎖ＤＮＡを含むプラスミドをCOS 細胞中に同時形質
移入した。しかし、ならし培地の分析後にELISA 又はウ
ェスタンブロッチングによって、分泌免疫グロブリンは
検出不能であった。代替え法として、ヒトγ⁴ 定常領域
ｃＤＮＡを設計し、構築して、ゲノムＤＮＡと取り替え
た。このために標準方法によって６オリゴヌクレオチド
PCRプライマーを合成した。これらのオリゴヌクレオチ
ドの名称と、これらの配列を定義する対応 SEQ IDNOと
は次の通りである:

【０１０３】オリゴヌクレオチド SEQ ID NO B2491CC 23 B2498CC 24 B2499CC 25 B2497CC 26 B2498CC 27 B2656CC 28

【０１０４】プライマー B2491CC、B2499CC 及びB2498C
C はγ⁴ 定常領域ｃＤＮＡのプラス鎖に相当する。プラ
イマー B2498CC、B2597CC 及びB2656CC はマイナス鎖に
相当する。ヒトγ⁴ ゲノムＤＮＡを鋳型として用いて、
ｃＤＮＡをコードする全γ⁴定常領域を含む３連続二本
鎖ＤＮＡフラグメントをPCR によって形成した。３Ｃ_H
ＤＮＡセグメント、クローン化のための制限部位及び使
用プライマーは下記の通りであった:

【０１０５】フラグメント 制限部位 PCR プライマー Ｃ_H Ａ SalI-----EcoRI B2491RCC+B2498CC Ｃ_H Ｂ EcoRI----XhoI/SalI B2499CC+B2500CC Ｃ_H Ｃ SalI/XhoI-------NotI B2598CC+B2656CC

【０１０６】セグメントＡをSalI-EcoRI制限フラグメン
トとしてpUC19 にクローン化した。SalI/XhoI-Notl制限
フラグメントとしてのセグメントＣは、PSV.Sport にク
ローン化した。EcoRI-XhoI/SalI フラグメントとしての
セグメントＢを、既にセグメントＣを含むpSV.Sport に
クローン化した。３セグメントの全てをＤＮＡ配列決定
によって確認した。セグメントＡをPstIとEcoRI とによ
って切断し、このフラグメントを既にセグメントＢとＣ
を含むpSV.Sport にクローン化することによって作成し
た。ヒトγ ⁴ Ｃ_H ｃＤＮＡの制限マップとpSV.Sport マ
ルチクローン化部位におけるそれらの相対的位置は下記
の通りである:

【０１０７】 Ａ Ｂ Ｃ PstI/SalI ・・・・・・・ EcoRI ・・・・・・・・ XhoI ・・・・・・・ NotI/HindIII/SnaBI／MluI

【０１０８】既述した全長Ｈ鎖構造のゲノムγ⁴ フラグ
メントと取り替えるために、γ⁴ Ｃ _H ｃＤＮＡをSalI--
-HindIIIフラグメントとして切断した。最終生成物は、
ベクターpSV.Sport にクローン化された、ｃＤＮＡをコ
ードする全長Ｈ鎖であった。安定な形質移入のために、
全長Ｈ鎖ｃＤＮＡを含むプラスミドPSV.Sport をKpnIに
よって消化させ、次に、Ｔ₄ ポリメラーゼによって処理
して、末端を平滑にし、SnaBI によって消化させた。生
成ＤＮＡフラグメントをアガロースゲル電気泳動によっ
て単離させた後に、GENECLEAN(登録商標) ＤＮＡ精製キ
ット(Bio101,カリフォルニア州, ラジョラ) によって精
製し、平滑末端をSmaI処理プラスミドpSRS又はpDSRG に
結合させた。最終構造をpSRSMPA5H(図1)又はpDSRGMPA5H
( 図2)と名付けた。

【０１０９】抗体ＨＩＬのＨ鎖のアミノ末端が化学的に
ブロックされていることは既に報告されている [チウ(C
hiu)等,Biochemistry 18:554(1977)] 。グルタミンコド
ンがアミノ末端残基として想定され、組換え抗体CMX1、
2 、4 及び5 のＨ鎖に用いられた。抗体CMX5-3のＨ鎖で
は、ＬＡＹ Ｈ鎖アミノ末端残基の、ＬＡＹ Ｈ鎖が１
要素であるサブグルーブＩＩＩの他のヒトＨ鎖配列の対
応残基との比較に従って、ＬＡＹ Ｈ鎖のN-末端アラニ
ンをグルタミン醗残基と置換させた。全長変異Ｌ鎖ｃＤ
ＮＡの構築を容易にするために、グルタミン酸残基105
のコドンをアスパラギン酸コドンと置換させて、Ｖ_L と
Ｃ_L の結合点(junction)近くにSalI制限部位を形成し
た。この修飾はpSV.Sport ベースドCMX5-1L 鎖発現プラ
スミド中のカセットとしてのＶ_L 変異体(variant) の置
換を可能にした。ヒト抗体REI からの配列情報に基づい
てヒトκＬ鎖ｃＤＮＡを最初に構築した[エッブ(Epp)
等, Eur.J.Biochem.45:513(1974)] 。このために、７種
の合成オリゴヌクレオチドプライマーを製造した。これ
らの名称と対応 SEQ ID NO. は下記の通りであった:

【０１１０】オリゴヌクレオチド SEQ ID NO B2262CC 29 B2281CC 30 B2293CC 31 B2294CC 32 A2495CC 33 A2496CC 34 B2704CC 35

【０１１１】オリゴヌクレオチドプライマーの４種は全
長κＬ鎖ｃＤＮＡを含むように合成した。これらのオリ
ゴヌクレオチド (B2262CC 、B2281CC 、B2293CC 及び B
2294CC) を混合し、単一ポリメラーゼ連鎖反応において
伸長させた。PCR 後に、生成物をアガロース電気泳動と
電気溶離とによって精製して、pUC19 にクローン化し、
ＤＮＡ配列決定によって分析した。全ての配列決定クロ
ーンは間違って組込まれた(misincorporated) 塩基を含
有した。次に、PCR プライマーのA2495CC とA2496CC と
を合成して、正確なヒトκＬ鎖定常領域を形成した。A2
495CC の配列はヒトＬＡＹ抗体Ｖ_L 枠組み構造の最後の
４アミノ酸コドンとヒトκ定常領域の開始点(beginnin
g) を含有した。プライマーA2496CC はヒトκ定常領域
のカルボキシル末端に相当した。

【０１１２】異常型の(aberrant)全長Ｌ鎖クローンとプ
ライマーA2495CC とA2496CC とを用いて、PCR を実施
し、PCR 生成物をべクターpVS.Sport にクローン化し
た。しかし、配列決定分析は、この構造も間違って組込
まれた塩基を含有することを示した。この新しいエラー
はオリゴヌクレオチドプライマーA2495CC とA2704CC と
を用いる付加的PCR によって修飾された。これによって
得られた生成物はsalI/HindIII制限フラグメントとし
て、既にＶ_L 3 フラグメントを含むpUC19 にクローン化
した。このようにして、正確なκＬ鎖定常領域ｃＤＮＡ
が得られた。

【０１１３】全長Ｌ鎖ｃＤＮＡを作成するために、Ｖ_L
1 −Ｖ_L 2 を平滑末端HindIII/BamHI フラグメントとし
て切断し、Ｖ_L 3 −Ｃ_L フラグメントを含むSmaI/BamHI
開裂pUC19 中に挿入した。全長Ｌ鎖フラグメントをpUC1
9 からPstI/EcoRIフラグメントとして切断し、発現べク
ターpDSRG とpSRSとに別々にクローン化して、それぞれ
pDSRGMPA5L (図3)とpSRSMPA5L(図4)と名付けられたプラ
スミドを形成した。

【０１１４】抗体CMX5-1のＨ鎖とＬ鎖可変領域のアミノ
酸配列は配列一覧表において SEQ ID NO:36 と SEQ ID
NO:37 とによって、それぞれ定義される。これらの配列
のアミノ酸残基 1〜19は翻訳後プロセシング中に開裂す
る分泌リーダーを含むので、実際の可変領域配列は残基
20によって開始する、SEQ ID NO:36と SEQ ID NO:37と
の配列によって定義される。

【０１１５】ヒト化抗体CMX5-2の構築 ヒト化抗体CMX5-2を構築するために、B3194CC 及びB319
5CC と名付けられた相補的オリゴヌクレオチド (それぞ
れ、SEQ ID NO:38と SEQ ID NO:39 とによって定義され
る配列) を合成し、アニールして、BgIII/SpeIフラグメ
ントを形成して、pSV.Sport 中のCMX5-1Ｈ鎖の42bpBgII
I/SpeIフラグメントと取り替えた。取り替えた領域をＤ
ＮＡ配列決定によって確認した。抗体CMX5-2のＨ鎖とＬ
鎖可変領域のアミノ酸配列は配列一覧表においてSEQ ID
NO:40と SEQ ID NO:41 とによって、それぞれ定義され
る。これらの配列のアミノ酸残基 1〜19は翻訳後プロセ
シング中に開裂する分泌リーダーを含むので、実際の可
変領域配列は残基20によって開始する、SEQ ID NO:40と
SEQ ID NO:41 との配列によって定義される。

【０１１６】ヒト化抗体CMX5-3の構築 ヒト化抗体CMX5-3Ｖ_H を構築するために、抗体JESI-39D
10CDR に基づくアミノ酸配列とヒトＬＡＹ Ｖ_H 枠組み
構造配列とを有する、４種のオリゴヌクレオチドを合成
した。これらのオリゴヌクレオチドの名称と対応 SEQ I
D NO. は下記の通りであった:

【０１１７】オリゴヌクレオチド SEQ ID NO B2784CC 42 B2785CC 43 B2786CC 44 B2921CC 45

【０１１８】オリゴヌクレオチドの組合せ、B2784CC と
B2785CC 及びB2786CC とB2921CC を用いて、PCR を実施
して、生成物を制限して、PstI/SpeI フラグメントとXb
aI/SalI フラグメントとを形成した。これらのＤＮＡフ
ラグメントを用いて、pSV.Sport 中の抗体CMX5-1Ｈ鎖ｃ
ＤＮＡのＶ_H １とＶ_H 3 フラグメントとそれぞれ取り替
えた。抗体CMX5-3のＨ鎖とＬ鎖可変領域のアミノ酸配列
は配列一覧表において SEQ ID NO:46 と SEQ ID NO:47
とによって、それぞれ定義される。これらの配列のアミ
ノ酸残基 1〜19は翻訳後プロセシング中に開裂する分泌
リーダーを含むので、実際の可変領域配列は残基20によ
って開始する、SEQ ID NO:46と SEQ ID NO:47との配列
によって定義される。

【０１１９】ヒト化抗体CMX5-4の構築 抗体CMX5-1を構築するために用いた方法と同じ方法で、
ヒト化抗体CMX5-4Ｖ_Hを構築した。3 対のオーバーラッ
プオリゴヌクレオチドをこのために合成した、これらの
オリゴヌクレオチドの名称 (及び定義する SEQIDNO) は
下記の通りであった:

【０１２０】オリゴヌクレオチド SEQ ID NO B2924CC 48 B2925CC 49 B2926CC 50 B2927CC 51 B2928CC 52 B2929CC 53

【０１２１】オリゴヌクレオチドの組合せ、B2924CC と
B2925CC 、B2926CC とB2927CC 、及びB2924CC とB2925C
C を用いて、PCR 伸長反応によって対応３ＤＮＡフラグ
メントを合成した。これらの３フラグメントをクローン
化し、配列決定し、制限消化と結合とによってpSV.Spor
t に作成した。B3093XY とB3094XY と名付けられたオリ
ゴヌクレオチド (それぞれ、SEQ ID NO:54と SEQ ID N
O:55 によって定義される配列) を最初にアニールし、
次に各オリゴヌクレオチドの3'末端をPCR によって伸長
させることによって、CMX5-4Ｖ_Lを構築した。この生成
物をゲル精製し、BstEIIとSalI制限し、抗体CMX5-1Ｌ鎖
ｃＤＮＡ中のBstEII/SalI フラグメントと取り替えるた
めに用いた。抗体CMX5-4のＨ鎖とＬ鎖可変領域のアミノ
酸配列は配列一覧表において SEQ ID NO:56 と SEQ ID
NO:57 とによって、それぞれ定義される。これらの配列
のアミノ酸残基 1〜19は翻訳後プロセシング中に開裂す
る分泌リーダーを含むので、実際の可変領域配列は残基
20によって開始する、SEQ ID NO:56と SEQ ID NO:57と
の配列によって定義される。

【０１２２】ヒト化抗体CMX5-5の構築 B3136CC とB3137CC 、及びB3138CC とB3202CC なる名称
のオリゴヌクレオチド対を用いて２種ＤＮＡフラグメン
トを合成することによって、CMX5-5Ｖ_H ＤＮＡを構築し
た。これらのオリゴヌクレオチド配列は配列一覧表にお
いて下記の通りに定義される:

【０１２３】オリゴヌクレオチド SEQ ID NO B3136CC 58 B3137CC 59 B3138CC 60 B3202CC 61

【０１２４】生成するPCR フラグメントをゲル精製し、
制限し、抗体CMX5-1のＶ_H ｃＤＮＡ中のSpeI/BamHIフラ
グメント及びBamHI/SalIフラグメントと取り替えるため
に用いた。pSRS中のCMX5-1のＶ_L 3 (BamHI/SalI フラグ
メント) をB3142CC とB3143CC なる名称のプライマー
(SEQ ID NO:62と SEQ ID NO:63 とによってそれぞれ定
義される配列) と鋳型CMX5-1Ｌとを用いてPCR 形成フラ
グメントと取り替えることによって、CMX5-5Ｖ_L ＤＮＡ
を構築した。抗体CMX5-5のＨ鎖とＬ鎖可変領域のアミノ
酸配列は配列一覧表において SEQ ID NO:64 と SEQ ID
NO:65 とによって、それぞれ定義される。これらの配列
のアミノ酸残基 1〜19は翻訳後プロセシング中に開裂す
る分泌リーダーを含むので、実際の可変領域配列は残基
20によって開始する、SEQ ID NO:64と SEQ ID NO:65と
の配列によって定義される。

【０１２５】抗体発現と精製 ヒト化抗体を発現するために、pSRSベースドＬ鎖プラス
ミドとpSV.Sport ベースドＨ鎖プラスミド、各 5〜10μ
g をエレクトロポレーションプロトコールによって５×
10⁶COS細胞中に同時形質移入した。次に、これらの細胞
を完全培地の存在下の60mm培養皿中で培養した。細胞が
沈降して、皿に付着した後 (形質移入及びプレーティン
グの約６時間後) に、培地を吸引し、無血清培地と取り
替えた。ならし培地を72時間目に回収した。ならし培地
中のヒト化抗体の濃度をヒトIgG4−特異性酵素結合イム
ノソルベントアッセイ(ELISA) を用いて測定した。ヌン
クイムノプレート(Nunc lmmunoplates) に、50mM炭酸水
素塩緩衝液(pH9.5) 中の５μg/mlのマウス抗ヒトIgG4-F
c モノクローナル抗体 (カルバイオケム(CaIBiochem),
カリフォルニア州, ラジョラ) を４℃において24時間塗
布した。次に、プレートを室温においてBLOTT0 (ダルベ
ッコ改質リン酸塩緩衝生理食塩水中の５％脱脂ドライミ
ルクと0.05％(v/v)Tween-20)によって90分間ブロックし
た。

【０１２６】過剰なブロッキング試薬(blocking reagen
t)を洗い流した後に、１００μｌ量の連続希釈サンプル
をプレートの孔に供給した。このプレートを37℃におい
て２時間インキュベートし、その後、サンプルを吸引
し、孔を３回洗浄した。ヒツジ抗ヒトIgG(H+L)ペルオキ
シダーゼ抱合体 (ザ バインディング サイト(The Bin
ding Site)、カリフォルニア州サンジエゴ)100μl を各
孔に加え、プレートを37℃において２時間インキュベー
トした。次に、プレートを３回洗浄し、ABTSペルオキシ
ダーゼ基質 (べ一リンゲル マンハイム, インディアナ
州, インディアナポリス)100μl を各孔に加えると、発
色反応が生ずる。プレートを405nm において分光光度計
にかけて測定値を読み取った。

【０１２７】全体で５種類のヒト化抗体のならし培地は
ヒトIgG4に関して陽性と試験された。反復実験は、抗体
CMX5-1、CMX5-2及びCMX5-5に対する３日間ならし培地
(3-day cndition medium)ではIgG4の濃度が同じである
(約 200μg/ml) ことを示した。CMX5-4ならし培地のIgG
4濃度は通常約 2〜3 倍高かった。ＨＩＬ抗体の代わり
にＬＡＹ抗体からのＶ_H 枠組み構造を含む、抗体CMX5-3
含有ならし培地中で測定されるIgG4レベルは、一貫して
抗体CMX5-1、2 及び5 に関して測定された同レベルの約
5〜10分の１であった。

【０１２８】多量の精製ヒト化抗体を得るために、抗体
CMX5〜1 を産生する組換え CHO細胞ラインを確立した。
CMX5-1Ｈ鎖とＬ鎖プラスミドのpSRSMP5HとpDSRGMPA5Lを
20:1の比でCHO 細胞中に同時形質移入し、ヒポキサンチ
ンとチミジン欠除に対する耐性に関して安定な形質移入
体を選択した。メトトレキセート(MTX) 処理の前にヒト
IgG4分泌に関して分析した106 耐性クローンの中の65ク
ローンが陽性と試験された。次に、これらの安定なクロ
ーンに対してメトトレキセート処理を実施して、遺伝子
を増幅させた場合に、クローンの大部分はこの薬物に対
して高度に安定であるように思われた。細胞を20、60、
200nM レベルでＭＴＸによって処理した場合には、最高
ＭＴＸ濃度においてもごく僅かな細胞増殖遅延が観察さ
れたにすぎなかった。

【０１２９】CJA25 と名付けられた、良好な産生体クロ
ーンの１つを、1mM の最終濃度に達するまで段階的に上
昇するMTX 濃度によって連続的に処理した。lmM のＭＴ
Ｘにおける最終抗体発現レベルは約15pg／細胞／日であ
ると算出された。ＭＴＸの不存在下で細胞を２カ月間を
越えて培養することによって、この細胞ラインの安定性
を監視したが、この期間中発現レベルが無変化に留まっ
た。

【０１３０】並行実験では、CHO 細胞に再びpDSRGMPA5H
とpSRSMP5Lとを1:20の比で同時形質移入した。条件は上
記条件と殆ど同じであるとしても、形質移入効率は10〜
100分の1 であることが判明した。40クローンのスクリ
ーニングは10クローンが組換えヒトIgG4分泌に関して陽
性であることを示した。抗体JESI-39D10抗体のレベルを
同様なやり方で測定したが、この場合にはヤギ抗ラット
IgＦｃモノクローナル抗体 (ピアース(Pierce), イリノ
イ州, ロックフォード) をキャプチャー(capture) 試薬
として用い、ヒツジ抗ラットIgG(Ｈ＋Ｌ）ペルオキシダ
ーゼ抱合体 (ザ バイディング サイト, カリフォルニ
ア州, サンジエゴ) を検出試薬として用いた。

【０１３１】ならし培地中の抗体をプロティンＧ又はプ
ロティンＡ／Ｇ（ピアース ケミカル(Pierce Chemica
l))アフィニティクロマトグラフィーを用いる標準方法
によって、クロマトグラフィー物質の製造者が述べてい
るように精製した。アミノ酸組成分析による測定によっ
て、この精製抗体は99％より大きい純度であった。JESI
-39D10ハイブリドーマとクローンCJA25 とからの無血清
ならし培地中の抗体も固定化ヒトＩＬ−５を含むカラム
を用いるアフィニティクロマトグラフィーによって精製
した。これらのカラムは精製ヒトＩＬ−５をAFFIGEL-15
(登録商標) 樹脂 (バイオラド, カリフォルニア州, リ
ッチモンド) に結合させることによって製造された。供
給源の 1つからのならし培地を負荷させた後に、カラム
をリン酸塩緩衝生理食塩水(PBS) と、PBS+0.5M NaClと
によって連続的に洗浄し、次にPBS と再平衡化させた。
次に、ヒトI L −５結合抗体をカラムから0.2Mグリシン
からpH2.95において溶離させ、その後、溶離タンパク質
を１Ｍ Tris-HC1(pH8)によって直接中和した。

【０１３２】このように精製した抗体の濃度は確定モル
吸光係数を用いて280nm におけるUV吸収によって測定し
た。精製タンパク質を濃縮し、リン酸塩緩衝生理食塩水
(pH7.2) に対して透析し、還元性条件下で二通りの10〜
20％ゲル中でのドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルア
ミドゲル電気泳動 [SDS-PAGE; レムリ(Laemmli),Nature
227:680(1970)] にさらした。電気泳動後に、一方のゲ
ルをクマーシーブルーによって染色し、タンパク質バン
ドを可視化した。並行して処理したゲル中のタンパク質
をアミノ末端配列分析によってIMMOBILON(登録商標) ブ
ロッティングによって回収した。この一工程精製方法を
用いて、SDS-PAGEによる測定によると、回収タンパク質
は99％より大きい純度であると算出された。還元性条件
下では、それぞれ免疫グロブリンのＨ鎖とＬ鎖の既知分
子量と一致する、50キロダルトンと23.2キロダルトンの
見かけの分子量を有する２バンドが観察された。

【０１３３】抗体特性化 アフィニティ定数 ヒト化抗体がヒトＩＬ−５に特異的に結合する能力を有
するか否かを判定するために、抗体／抗原複合体の見か
けの解離定数を測定した。これは酵素イムノアッセイプ
レートに50mM炭酸水素塩緩衝液(pH9.5) 中のマウス抗ヒ
トIgG4-Fc (5μg/ml、100 μ1/孔) を塗布することによ
って実施した。次に、プレートを室温においてBLOTTOに
よって90分間ブロックし、3 回洗浄し、37℃において、
精製した(0.05μg/mlの最終濃度で100 μl/孔) 又はな
らし培地として(100μl/孔) のいずれかのヒト化抗体の
一方と共に２時間インキュベートした。ならし培地から
の組換え抗体分子はこれによって、定常領域と予め塗布
した抗体との間の相互作用によって固定されるので、試
験抗体の可変領域は抗原との直接の最大相互作用を可能
にするように均一に配向した。

【０１３４】比較の基準を提供するために、キャプチャ
ー抗体としてネズミ抗ヒトIgG4-Fcの代わりにヤギ抗ラ
ットIgG-Fcを用いて、抗体JESI-39D10を並行分析した。
プレートを３回洗浄した後に、4,000pM 〜2pM の濃度に
おける ¹²⁵Ｉ標識ヒトI L −５の希釈シリーズを各プレ
ートの孔に 100μl の最終量で塗布した。全ての試験孔
は３通りに処理した。対照孔に無標識ヒトI L −５の10
00倍モル過剰量を用いることによって、バックグラウン
ド結合を測定した。反応を室温において２時間平衡さ
せ、この時点において孔を吸引し、TBSTによって５回洗
浄した。次に、孔を分離し、ファルマシア(Pharmacia)L
KBγカウンター内で計数した。全ての非特異的結合対照
は２通りに処理した。結合ヒトＩＬ−５に関して得られ
た数値をスカチャード(Scatchard) 分析 (RADLIGソフト
ウェアを用いる) して、解離定数(kd)値を得た。

【０１３５】この分析からの結果は、ヒト化抗体CMX5-
1、2 、3 及び5 に関して得られたkd値は全て大体同じ
範囲内であり、抗体JESI-39D10の値に近似することを示
した。放射能が殆ど検出されず、用量反応が観察されな
かったので、CMX5-4の見かけのkdを測定することはでき
なかった。

【０１３６】競合結合分析 ヒト化が抗体JESI-39D10の抗原結合領域に変化を導入し
たか否かを判定するために、最終20mM試薬濃度によって
X-NHS ビオチンキット (カルバイオケム, カリフォルニ
ア州, ラジョラ) を用いて、野生型抗体をビオチンで標
識した。生成物をヒトI L −５に対する直接結合ELISA
によって分析し、見かけの50％点の約３倍である濃度を
競合分析に用いた。この濃度はビオチニル化抗体JESI-3
9D10約30ngに相当した。

【０１３７】競合分析を実施し、この分析ではヒトＩＬ
−５を塗布したプレートへのビオチニル化抗体の結合を
無標識抗体JESI-39D10又は抗体CMX5-1、CMX5-2若しくは
CMX5-5の存在下で測定し、各抗体は予めプロティンＡ／
Ｇアフィニティクロマトグラフィーによって精製した。
ELA プレートを室温において0.1M NaHC0₃(pH9.2)によっ
て１時間処理した。次に、TBS 中ヒトＩＬ−５を１００
μg/孔において加えた。プレートを４℃において一晩イ
ンキュベートした後に、３％BSA-TBSml によって室温に
おいて１時間ブロックした。2 倍希釈競合抗体50μl ＋
適当量のビオチニル化抗体JESI-39D10 (50μl 量におい
ても) を各孔に加え、プレートを室温において１時間イ
ンキュベートした。

【０１３８】次に、プレートを TBS一ツイーン20によっ
て５回洗浄し、1 μg/mlホースラディッンュペルオキシ
ダーゼ(HRP)-ストレブトアビジン抱合体と共に室温にお
いて１時間インキュベートし、TBS-ツイーン20によって
５回洗浄し、HRP 基質TMB によって発色させた。次に、
サンプルの吸光度を450nm において分光光度計で測定し
た。無標識抗体JESI-39D10はそのビオチニル化形と約1:
1 の比において競合するが、抗体CMX5-1、2 及び5 によ
って同じ競合度を得るにはさらに多量の抗体を必要とす
ることを結果が示した。無標識抗体JESI-39D10対ビオチ
ニル化抗体JESI-39D10のモル比が1.0 であるとすると、
同程度の結合阻害を生ずるために必要な、抗体CMX5-1、
2 及び5 対ビオチニル化JESI-39D10のモル比は、それぞ
れ3.3 、1.4及び1.4 であると算出された。

【０１３９】ヒトＩＬ−５レセプター結合の阻害 形質移入COS 細胞上の組換えヒトＩＬ−５レセプターα
鎖に対する放射能標識ヒトI L −５の結合をヒト化抗体
CMX5-1、2 及び5 が阻害する能力の研究では、３抗体の
全てがレセプター結合を阻害することが判明した。この
阻害活性はならし培地と精製抗体の両方を用いて観察さ
れた。一定の0.5nM 濃度の標識ＩＬ−５によって、レセ
プター結合の50％阻害(IC₅₀)を惹起するために必要な、
抗体CMX5-1、2 及び5 の濃度はそれぞれ、1.5 〜3.0 、
0.35〜0.7 及び 0.5〜1.1nM であると計算された。野生
型抗体JESI-39D10のID₅₀は0.15〜0.55nMであると判明し
た。

【０１４０】抗体CMX5-5Ｌ鎖の修飾 ５種のヒト化抗体の全てが、クローン化を容易にするた
めに実施したＤＮＡ修飾のために、Ｌ鎖の位置105 にア
スパラギン酸残基を含有した。ネイティブ配列を復元す
るために、位置105 のアスパラギン酸残基を抗体CMX5-5
のＬ鎖中のグルタミン酸残基と取り替えた。これは、Ｖ
_L のカルボキシル末端ペプチドとＣ_L のアミノ末端ペプ
チドとが結合し、GAC がGAG コドンへ変化した配列に相
当するアミノ酸配列を有する、B3289CC (SEQ ID NO.66)
と名付けられた合成オリゴヌクレオチドを用いて、達成
された。このコドン変化は SalI の代わりにXhoI制限部
位を生じた。鋳型としてCMX5-5Ｌ鎖を用いて、オリゴヌ
クレオチドプライマーB3289CC とA2496CC (SEQ ID NO:3
4)によってPCR を実施した。生成ＤＮＡフラグメントを
ゲル精製し、制限し、pSRSベースドCMX5-5Ｌ鎖ｃＤＮＡ
中のSalI/EcoRIフラグメントと取り替えるために用い
た。修飾CMX5-5Ｌ鎖ｃＤＮＡをpSRSから切断し、安定な
発現のためにpDSRG にクローン化した。CMX5-2Ｈ鎖と修
飾CMX5-5Ｌ鎖とから成る新しい変異体をCMX5-OK1と名付
けた。CMX5-5Ｈ鎖と修飾CMX5-5Ｌ鎖とから成る、他の新
しい変異体をCMX5-OK2と名付けた。

【０１４１】生物学的効果 ＩＬ−５誘導CD11b 発現の阻害 10％FBS 、2mM グルタミン及びペニシリンーストレプト
マイシンを補充したイスコーブス改良ダルベッコ培地
(lscoves' Modified Dulbecco's Iedium)(JRHバイオサ
イエンス(BioScience)) 中に、HL-60 (ATCC CCL240) サ
ブクローンを保持した。HL-60 は強力な(multipotent)
ヒト前骨髄細胞ラインであり、酪酸塩又はヒトI L −５
の存在下で、好酸球の表現型特徴を表す細胞を生ずる
[トモナガ(Tomonaga)等, B1ood 67:1433(1986);ファビ
アン(Fabian)等,B1ood 80:788(1992)]。活性化されて、
アレルギー患者の肺に補充される好酸球の表面ではCD11
b/CD18と呼ばれる細胞接着分子の発現増加が観察されて
いる [ゲオラス(Georas)等,Am.J.Resp.CelI Mol.Biol.
7:261(1992)]。

【０１４２】アッセイの前に、HL-60 細胞をアルカリ性
培地 (NaOH又は炭酸水素ナトリウムによってpHを7.6 〜
7.8 に調節) 中での１週間の増殖によって分化のために
処理した(primed)。増殖期間後に、細胞を24孔培養皿に
２×l0⁵ 細胞/ml の密度で移した。連続希釈した試験抗
体を一定量のヒトI L −５と共に37℃において１時間プ
レインキュベートしてから、細胞に加えた。培養物中の
I L −５の最終濃度は150pM であった。72時間後に、細
胞を遠心分離によって回収し、１×１０⁶ 細胞/ml の濃
度で再懸濁させ、50μ1 量 (5 ×10⁴ 細胞) を96孔マイ
クロタイタープレートの孔に分配した。細胞を孔の中で
乾燥させ、70％エタノールで洗浄し、次にTBS-ツイーン
20で洗浄し、10％脱脂ドライミルクと 5％BSA とによっ
てブロックした。

【０１４３】一次抗体 (マウス抗ヒトCD11b;べクトンー
ディキンソン(Becton-Dickinson),マサチュセッツ州,
プレイントリー) を加えた。37℃において2 時間インキ
ュベートした後に、プレートをTBS-ツイーン20による3
回洗浄、一次抗体に対する二次抗体 (ジャクソンイムノ
リサーチ(Jackson lmmunoResearch), ペンシルベニア
州, ウエストグローブ) の結合、再びTBS-ツイーン20に
よる３回洗浄によって連続的に処理した。次に、特異的
に結合した抗体をELISA アンプリフィケーションシステ
ムス(ELISA Amplification Systems)(Gibco-BRL)によっ
て検出した。ヒト化抗体CMX5-1、CMX5-2及びCMX5-5が全
てヒトＩＬ−５のCD11b 誘導活性を阻害しうることが判
明した。相対IC₅₀は下記のように算出された:

【０１４４】 IC₅₀ モル比 サンプル (pM) CMX5/IL-5 IC ₅₀ CMX5／IC ₅₀ 39D10 CMX5-1 1467 7.3:1 8.8 CMX5-2 467 2.3:1 2.8 CMX5-5 800 4:1 4.8 39D10 166 0.83:1 1

【０１４５】表から分かるように、ヒト化抗体CMX5-2と
CMX5-5は抗体CMX5-1よりも強力であるように思われた。アレルゲン誘導マウス好酸球増加症の抑制 ヒト化抗体がインビボにおけるＩＬ−５の活性を中和し
うるか否かを判定するために、若い雄B6D2FI/Jマウスを
ミョウバン沈降オボアルブミンによって、一匹につき 8
mgを用いて感作した。１週間後に、ブースター投与し
た。５非感作対照マウスの群を除いて、他の全ての群は
６マウスを含有した。ブースター投与後の１週間目かつ
試験前に、感作動物に試験抗体を0.5ml 量で腹腔内注入
した。各群は下記の１種類を受容した: 抗体JESI-39D10
O.1mg/体重kg; 抗体JESI-39D10 1mg/体重kg; 抗体CM
X5-1 1mg/体重kg; 及び抗体CMX5-110mg／体重kg。TRFK
と名付けられた抗体、ラット抗マウス1 L −５モノクロ
ーナル抗体 (シュマーヘル(Schumacher)等, 上記文献)
を陽性対照として用いた。対照の感作マウスは生理食塩
水を受容した。

【０１４６】次に、動物をオボアルブミンエーロゾルに
よって1 時間、2 回試験した。試験の24時間後に、気管
支肺胞洗浄 (bronchloalveolar lavage)、末梢血及び肺
組織の標本を採取し、固定し、好酸球特異的染色染料に
よって発色させ、顕微鏡によって検査して、好酸球分布
を調べた。抗体CMX5-1を10mg／体重kgの用量で受容した
マウスでは、それらの気管支肺胞洗浄流体中の好酸球数
が有意に減少することが判明したが、他の細胞種類では
より軽度の変化が観察された。抗体JES1-39D10を受容し
たマウスも好酸球レベルの低下を示した。

【０１４７】ハイブリドーマ寄託 モノクローナル抗体JESI-39D10を産生するハイブリドー
マ細胞ライン(JESI-39D10.11) は1992年1 月8 日にアメ
リカンタイプカルチャーコレクション(ATCC)(メリーラ
ンド州, ロックビル) に寄託され、受託番号ATCC HBIO9
59を与えられた。これらの寄託は特許目的のための培養
物寄託に関するATCC協定に定められた条件下でなされ、
この協定は寄託物が35USC122及び37CFR1.14 に準じて米
国特許商標庁長官に入手可能であり、米国特許の発行後
は公衆に入手可能になることを保証し、寄託物が維持さ
れることを必要とする。寄託菌株の入手可能性を政府の
権限でその特許法に従って与えられる権利に違反して発
明を実施するライセンスと解釈すべきではない。当業者
に自明であるように、本発明の要旨及び範囲から逸脱せ
ずに、本発明の多くの変更及び変化が実施可能である。
ここに述べた特定の実施態様は例としてのみ提供するも
のであり、本発明は請求の範囲によってのみ限定される
ものである。

【化１】

【化２】

【化３】

【化４】

【化５】

【化６】

【化７】

【化８】

【化９】

【化１０】

【化１１】

【化１２】

【化１３】

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【化１５】

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【化１９】

【化２０】

【化２１】

【化２２】

【化２３】

【化２４】

【化２５】

【化２６】

【化２７】

【化２８】

【化２９】

【化３０】

【化３１】

【化３２】

【化３３】

【化３４】

【化３５】

【図面の簡単な説明】

【図１】プラスミドpSRSMPA5H の様式図である。

【図２】プラスミドpDSRGMPA5Hの模式図である。

【図３】プラスミドpDSRGMPA5Lの模式図である。

【図４】プラスミドpSRSMPA5L の模式図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 マーゴールド，ニコラス・ジェイ アメリカ合衆国ニュージャージー州07946, ミリントン，ローリング・ヒル・ドライヴ 99 (72)発明者 エイブラムス，ジョン・エス アメリカ合衆国カリフォルニア州94002, ベルモント，オーク・ノウル・ドライヴ 1817 (72)発明者 ジェン，チュン−ハー アメリカ合衆国ニュージャージー州08820, エディソン，ドッグウッド・ドライヴ ７ (72)発明者 ペトロ，メアリー・イー アメリカ合衆国ニュージャージー州07435, グリーン・ポンド，クリフサイド・レーン 17 (72)発明者 シルヴァー，ジョン・イー アメリカ合衆国カリフォルニア州95130, サンノゼ，ターンウッド・コート 3639 (72)発明者 ティンダル，スティーブン アメリカ合衆国ニュージャージー州07940, マディソン，バーンズデール・ロード 40 (72)発明者 ウインザー，ウィリアム・ティー アメリカ合衆国ニュージャージー州08816, イースト・ブランズウィック・ゲージ・ロ ード 46 (72)発明者 ザヴォドニー，ポール・ジェイ アメリカ合衆国ニュージャージー州07092, マウンテンサイド，セントラル・アヴェニ ュー 279

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 アメリカン・タイプ・カルチャー・コレ
   クション受託番号ＡＴＣＣＨＢ１０９５９で寄託された
   ハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体の
   同定特性を有する組換えモノクローナル抗体であって、
   配列番号：１により定められるＨ鎖可変領域および配列
   番号：２により定められるＬ鎖可変領域を有する組換え
   モノクローナル抗体。
2. 【請求項２】 配列番号：１もしくは配列番号：２によ
   り定められるアミノ酸配列またはそれらの配列のＣＤＲ
   を有する、モノクローナル抗体の可変領域を含む組換え
   ポリペプチド。
3. 【請求項３】 配列番号：１により定められるヌクレオ
   チド配列の１２〜３３３塩基、または配列番号：２によ
   り定められるヌクレオチド配列の９〜３８４塩基を含ん
   でなる単離されたＤＮＡ、またはそのＤＮＡがコードす
   るポリペプチドと同じポリペプチドをコードする単離さ
   れたＤＮＡ。
4. 【請求項４】 請求項３に記載のＤＮＡを含む組換えべ
   クター。
5. 【請求項５】 請求項４に記載の組換えべクターを含む
   宿主細胞。
6. 【請求項６】 請求項５に記載の宿主細胞を該ＤＮＡが
   発現される条件下で培養することを含む、組換えポリペ
   プチドの製法。