JP2021505183A

JP2021505183A - ヒトｉｌ−５に結合するモノクローナル抗体、その製造方法および用途

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Publication number: JP2021505183A
Application number: JP2020531654A
Authority: JP
Inventors: 趙▲ジエ▼; 黄浩旻; 朱禎平; 蒋良豊
Original assignee: Sunshine Guojian Pharmaceutical Shanghai Co Ltd
Current assignee: Sunshine Guojian Pharmaceutical Shanghai Co Ltd
Priority date: 2017-12-21
Filing date: 2018-11-30
Publication date: 2021-02-18
Anticipated expiration: 2038-11-30
Also published as: CN109942706A; EP3730518A1; US20210171621A1; WO2019120060A1; US11370836B2; CN111615519A; EP3730518A4; CN111615519B; JP7032534B2

Abstract

本発明は、ヒトＩＬ-５に結合するモノクローナル抗体を提供する。本発明のモノクローナル抗体は、ＩＬ-５で誘発されるＴＦ-１細胞増殖およびＩＬ-５とＩＬ-５ＲＡの相互作用に対して優れた阻害活性を示し、かつ既知の抗ヒトＩＬ-５抗体とは抗原エピトープが異なり、喘息などの好酸球増加に起因する疾患の治療薬として臨床実用化が有望である。

Description

本発明は、抗体技術に関し、より具体的には、ヒトＩＬ-５に結合するモノクローナル抗体、その製造方法及び用途に関する。

気管支喘息（ＢｒｏｎｃｈｉａｌＡｓｔｈｍａ、以下で「喘息」と称する）は、肥満細胞や、好酸球（ＥＯ）などの各種の炎症細胞、及びＴリンパ球などの免疫細胞が共同で関与することにより起こり、慢性の気道炎症を主な特徴とする呼吸系疾患である。喘息の主な表現として、気管支分泌物の凝集やリンパ球、マクロファージ及び好酸球浸潤などの炎症反応が挙げられる。喘息患者には、例えば再発性喘息、胸内苦悶又や咳など、気道の高反応性と可逆性の気流制限がよく見られ、重篤者は呼吸困難症状を伴うことがあり、気道閉塞（可逆性でありながらも）によって非特異性の気管支アレルギーが引き起こされる。

近年、喘息の罹患率と病死率が増えつつある。データ統計によれば全世界で約３億の人が喘息に罹患し、我が国でも推計約３０００万の喘息患者があると見られる。喘息の臨床治療にとって糖質コルチコイド、β２受容体刺激薬、ロイコトリエン拮抗薬、抗コリン薬、ホスホジエステラーゼ阻害薬、テオフィリン系製剤、抗ヒスタミン剤及び他の抗アレルギー薬などの抗炎治療を吸入するのが基本的であるが、重篤喘息患者については症状制御が困難であり、治療に糖質コルチコイドの全身投与が必要とされる場合があるため、骨粗鬆症、感染症や成長遅延などの全身性副作用を起こす恐れがある。したがって、喘息治療の新規標的を見つけ、ホルモン非感受性喘息患者の急性発作を低減することにより喘息症状を改善し、肺機能を回復させ、並びに喘息患者の生活品質を高めることが喘息治療の新たなストラテジーになっている。

好酸球は、炎症反応によって誘発される様々な疾患において重要な役割を果たし、中には喘息も含まれる。さらに、好酸球は分泌物の凝集において重要な役割を果たし、活性化好酸球の数が疾患の重篤度に比例して慢性喘息患者の血液、気管支分泌物や肺腺組織において大きく増加する。また、ステロイド剤を用いる治療では症状の緩和と好酸球数の低下が緊密に関わっていることが確認できた。

インターロイキン-５（ＩＬ-５）は、ホモダイマーを形成しうるグリコシル化タンパク質系サイトカインであり、活性化ＣＤ４＋Ｔリンパ球で作られる。人体において、好酸球の成長と分化は主にＩＬ-５と細胞表面のＩＬ-５受容体との相互作用によって遂行される。ＩＬ-５は、２つの受容体サブユニットａｌｐｈａ（ＲＡ）とｂｅｔａ（ＲＢ）のうちまずＩＬ-５ＲＡに結合するが、この相互作用のみでは信号伝達に十分でなく、ＩＬ-５ＲＡに結合してからＩＬ-５ＲＢに結合することによりＩＬ-５と受容体複合体との親合性を高めて信号伝達を開始させ、このような信号伝達にとって２つのサブユニットＩＬ-５ＲＡとＩＬ-５ＲＢは何れも必須である。ＩＬ-５トランスジェニックマウスの動物モデルにおいて、抗原による刺激がなくてもマウス末梢血および組織中における好酸球数がいずれも大幅に増加する。また、マウスやサルのアレルギー性喘息モデルを利用して検討を行ったところ、抗ＩＬ-５モノクローナル抗体を動物に注射することで気道への好酸球浸潤を効果的に抑止することができ、かつ気管支アレルギー反応の進行を阻止することのできることが確認できた（非特許文献１）。臨床において、好酸球増加型の喘息患者の薬物使用に対する反応と治療効果はその末梢血における好酸球数に比例し、患者の好酸球数が多ければ多いほど治療効果が顕著である。海外で行われた同類薬物の臨床治験データから、喘息悪化率を主要指標とした場合、対照組に比べて抗ＩＬ-５モノクローナル抗体による悪化率低下が５０％以上に達し、並びに肺機能を改善し、糖質コルチコイドの使用量を減らすと同時に喘息患者の生活品質を高めることのできることが確認できた（非特許文献２）。

現在、重症好酸球性喘息患者向けの治療薬として、ＧＳＫ社のＭｅｐｏｌｉｚｕｍａｂ及びＴＥＶＡ社のＲｅｓｌｉｚｕｍａｂがＦＤＡの認可を得て販売されている。しかしながら、市場では特異性と治療効果が高く且つＩＬ-５を標的とする新規薬物に対する期待が依然として高いことから、このような新規薬物の開発は、喘息患者の症状改善と生活品質を高めるのに重要であると考えられる。

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本発明者は、上記の技術課題を解決するために鋭意検討を重ね、抗原免疫からハイブリドーマの選択、抗体の発現と精製、並びに生物活性の同定を経た結果、斬新なＣＤＲ配列を有する抗ヒトＩＬ-５抗体を得ることに至った。本発明の抗体は、既知の抗ヒトＩＬ-５抗体に比べてＩＬ-５依存性の細胞増殖や、ＩＬ-５とその受容体ＩＬ-５ＲＡとの結合に対して優れた阻害活性を示し、抗原結合エピトープの解析から本発明の抗ヒトＩＬ-５抗体が既知の抗ヒトＩＬ-５抗体と異なる結合エピトープを有することが実証されている。

上記目的を達成すべく、本発明は、以下の技術案で構成される。

本発明の第１側面において、ヒトＩＬ-５に結合するモノクローナル抗体を提供する。ヒトＩＬ-５に結合するとき、前記モノクローナル抗体は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１で表される配列における８６Ｃ、９１Ｒ、９６Ｆ及び１０４Ｌのうち少なくとも１個の残基に結合し、かつ前記モノクローナル抗体は、ＩＬ-５とＩＬ-５ＲＡとの結合を阻害することができる。

好ましくは、ヒトＩＬ-５に結合するとき、前記モノクローナル抗体は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１で表される配列における８６Ｃ、９１Ｒ、９６Ｆ及び１０４Ｌのうち少なくとも２個の残基に結合する。

より好ましくは、ヒトＩＬ-５に結合するとき、前記モノクローナル抗体は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１で表される配列における８６Ｃ、９１Ｒ、９６Ｆ及び１０４Ｌのうち少なくとも３個の残基に結合する。。

より好ましくは、ヒトＩＬ-５に結合するとき、前記モノクローナル抗体は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１で表される配列における８６Ｃ、９１Ｒ、９６Ｆ及び１０４Ｌの４個の残基のみに結合する。

本発明の第２側面において、ヒトＩＬ-５に結合するモノクローナル抗体を提供し、前記ヒトＩＬ-５に結合するモノクローナル抗体は、重鎖および軽鎖を含み、前記重鎖は、重鎖相補性決定領域Ｈ-ＣＤＲ１、Ｈ-ＣＤＲ２、Ｈ-ＣＤＲ３を含み、前記Ｈ-ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：６で表され、前記Ｈ-ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：７で表され、前記Ｈ-ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：８で表され、前記軽鎖は、軽鎖相補性決定領域Ｌ-ＣＤＲ１、Ｌ-ＣＤＲ２、Ｌ-ＣＤＲ３を含み、前記Ｌ-ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：９で表され、前記Ｌ-ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０で表され、前記Ｌ-ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１１で表される。

好ましくは、前記ヒトＩＬ-５に結合するモノクローナル抗体は、マウス由来の抗体、キメラ抗体又はヒト化抗体である。

より好ましくは、前記ヒトＩＬ-５に結合するモノクローナル抗体は、重鎖にＳＥＱＩＤＮＯ：３で表されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含み、軽鎖にＳＥＱＩＤＮＯ：５で表されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。

より好ましくは、前記的ヒトＩＬ-５に結合するモノクローナル抗体は、重鎖可変領域のアミノ酸配列がＳＥＱＩＤＮＯ：１３で表され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列がＳＥＱＩＤＮＯ：１５で表される。

好ましくは、前記ヒトＩＬ-５に結合するモノクローナル抗体は、重鎖のアミノ酸配列がＳＥＱＩＤＮＯ：１６で表され、軽鎖のアミノ酸配列がＳＥＱＩＤＮＯ：１７で表される。

本発明の第３側面において、単離したヌクレオチド分子を提供し、前記ヌクレオチド分子は、前記ヒトＩＬ-５に結合するモノクローナル抗体をコードする。

好ましくは、前記ヌクレオチド分子において、重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２で表され、軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：４で表される。

好ましくは、前記ヌクレオチド分子において、重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１２で表され、軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４で表される。

本発明の第４側面において、前記ヌクレオチド分子を含んでなる発現ベクターを提供する。

本発明の第５側面において、前記発現ベクターを含んでなるホスト細胞を提供する。

本発明の第６側面において、前記ヒトＩＬ-５に結合するモノクローナル抗体の製造方法を提供し、前記製造方法、ａ）発現条件下で前記ホスト細胞を培養することにより、前記ヒトＩＬ-５に結合するモノクローナル抗体を発現し、ｂ）前記ホスト細胞から前記ヒトＩＬ-５に結合するモノクローナル抗体を分離精製することを含む。

本発明の第７側面において、前記ヒトＩＬ-５に結合するモノクローナル抗体と、薬学的に許容可能な担体とを含んでなる薬物組成物を提供する。

本発明の第８側面において、前記ヒトＩＬ-５に結合するモノクローナル抗体又は前記薬物組成物の、好酸球増加に起因する疾患を治療するための薬物の製造における用途を提供する。

好ましくは、前記好酸球増加に起因する疾患は、喘息、多発血管炎を伴う肉芽腫症、慢性閉塞性肺疾患、鼻ポリープ、アレルギー性皮膚炎、好酸球増加症候群などであり、より好ましくは、前記好酸球増加に起因する疾患は、喘息である。

本発明に係る抗ヒトＩＬ-５モノクローナル抗体は、ヒトＩＬ-５に特異的に結合し、既知の抗ヒトＩＬ-５抗体に比べて、ＩＬ-５で誘発されるＴＦ-１細胞増殖、及びＩＬ-５とＩＬ-５ＲＡとの相互作用に対してより優れた阻害活性を示す。また、本発明に係る抗ヒトＩＬ-５モノクローナル抗体は、既知の抗ヒトＩＬ-５抗体と異なる抗原エピトープを認識し、好酸球増加に起因する疾患（例えば、喘息）を治療するための薬物製造に有用であり、臨床応用に有望である。

ＩＬ-５抗原に対する、マウス由来の抗ヒトＩＬ-５モノクローナル抗体の相対結合力を測定した結果を示す図である。ＩＬ-５で誘発されるＴＦ-１細胞増殖に対する、マウス由来の抗ヒトＩＬ-５モノクローナル抗体の阻害活性を測定した結果を示す図である。ＩＬ-５で誘発されるＴＦ-１細胞増殖に対する４-６-ヒト化及び４-６-キメラの阻害活性を示す図であり、そのうちブランク対照群に、細胞増殖の下限値を確定するため、ＩＬ-５でなく関連性のない同類対照用抗体を加え、陽性対照群に、細胞増殖の上限値を確定するため、ＩＬ-５と共に関連性のない同類対照用抗体を加え、前記関連性のない同類対照用抗体とは、ＩＬ-５を認識しないが、測定用抗体と同じ定常領域がを持つ抗体を指す。ＩＬ-５と受容体との相互作用に対する４-６-ヒト化及び４-６-キメラの阻害活性を示す図であり、そのうち対照抗体である４-４-ヒト化とは、ＩＬ-５に結合可能だが、ＩＬ-５と受容体との相互作用を阻害しない抗体を指す。４-６-ヒト化の抗原エピトープを解析するＥＬＩＳＡ図であり、そのうちＯＤ_４５０<０．５とは抗体抗原の結合が有意に低下することを意味し、各測定値は、４個の平行ウェールを設けて得られる平均値である。４-６-ヒト化の抗原エピトープを解析するウエスタンブロット図である。４-６-ヒト化の薬物動態を示す図である。４-６-ヒト化の体内薬効を示す図である。

本発明において、「モノクローナル抗体」とは、基本的に均一である群から得られる抗体を指し、すなわち極一部が自然に変異を形成する以外、該群に含まれる単一抗体が同じであることを意味する。モノクローナル抗体は、１つの抗原サイトを高い特異性で認識して結合する。そして、通常のポリクローナル抗体製剤（通常、異なる決定基を認識する複数種類の抗体を含む）と異なり、各モノクローナル抗体は、抗原の単一決定基を認識して結合する。こうした特異性以外でも、モノクローナル抗体の利点としてはハイブリドーマを培養することにより得られ、他の免疫グロブリンによって汚染されることはない。また、「モノクローナル」とは抗体の特性を指し、すなわち基本的に均一である抗体群から得られる抗体であり、何らの特別な方法で製造される抗体と解釈してはいけない。

本発明において、「抗体」および「免疫グロブリン」とは、構造上同じ特徴を有する約１５００００ドルトン（Ｄａ）のヘテロ四量体糖タンパク質であり、２つの同じ軽鎖（Ｌ）と２つの同じ重鎖（Ｈ）とにより構成される。各軽鎖は、共有ジスルフィド結合を介して重鎖と結合し、異なる免疫グロブリンにとって重鎖同士のジスルフィド結合数が異なる。重鎖および軽鎖は、規則的な間隔で鎖内ジスルフィド結合を有し、重鎖の一端に可変領域（ＶＨ）を備え、それに続いて複数の定常領域を備える。軽鎖の一端に可変領域（ＶＬ）を備え、他端に定常領域を備え、かつ軽鎖の定常領域と重鎖の第１定常領域が対向し、軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域が対向する構成である。

本発明において、「可変」とは抗体可変領域の一部が配列上差異があり、各抗体のその特定抗原に対する結合性や特異性を決定する構成である。しかしながら、可変度は、抗体の可変領域全体に渡って均一に分布する訳でなく、軽鎖および重鎖の可変領域において相補性決定領域（ＣＤＲ）又は超可変領域と称される３つのフラグメントに集中して存在する。可変領域で保存性が比較的高い部分は、フレームワーク領域（ＦＲ領域）と称される。天然由来の重鎖および軽鎖の可変領域にそれぞれ４つのＦＲ領域を含み、これらのＦＲ領域はｐ折り畳み構造を形成し、さらに接続リングを形成する３つのＣＤＲによって互いに連結され、ある状況では部分的なｐ折り畳み構造を形成する。各鎖のＣＤＲは、ＦＲ領域が緊密に隣接し、さらに他の鎖のＣＤＲと共同で抗体の抗原結合サイトを形成する［Kabat等、NIH Publ.No.91-3242、第Ｉ巻647-669頁（１９９１）］。定常領域は抗体と抗原の結合に直接に関与せず、例えば、抗体依存性の細胞毒性など、他の生体作用機序を示す。

本発明において、「抗ヒトＩＬ-５抗体」、「抗ヒトＩＬ-５モノクローナル抗体」、「抗ヒトＩＬ-５モノクローナル抗体」又は「ヒトＩＬ-５に結合するモノクローナル抗体」とは、ヒトＩＬ-５抗原に結合しうるモノクローナル抗体を指す。ヒトＩＬ-５抗原としては、ＳＥＱＩＤＮＯ：１で表されるアミノ酸配列を有することが好ましく、本発明の抗ヒトＩＬ-５モノクローナル抗体としては、ＩＬ-５とＩＬ-５ＲＡの結合に対して阻害活性を示すことが好ましい。

本発明において、「キメラ抗体」とは、ある種に由来の重鎖および軽鎖の可変領域配列と、別の種に由来の定常領域配列とを含む抗体を指し、例えば、ヒト定常領域と連結したマウス重鎖および軽鎖の可変領域を備える抗体が挙げられる。

本発明において、「ヒト化抗体」とは、ＣＤＲがヒト以外の動物（例えば、マウス）の抗体から得られ、抗体分子においてＣＤＲ以外の部分（フレームワーク領域および定常領域を含む）がヒト抗体から得られるものを指す。なお、フレームワーク領域のアミノ酸残基については、結合性が維持できる限り種々の変更を加えることができる。

本発明において、発現ベクターについては特に制限がなく、例えばｐＴＴ５、ｐＳＥＣｔａｇ系、ｐＣＤＮＡ系ベクター及び他の哺乳動物発現系に用いるベクターなどが挙げられ、発現ベクターには、適切な転写および翻訳調節配列が連結された融合ＤＮＡ配列が含まれる。

本発明に適用可能なホスト細胞として、上記発現ベクターを含む真核細胞が挙げられ、例えば、哺乳類動物や昆虫ホスト細胞培養系を利用して本発明の融合タンパク質を発現してもよく、ＣＨＯ（ＣｈｉｎｅｓｅＨａｍｓｔｅｒＯｖａｒｙ）、ＨＥＫ２９３、ＣＯＳ、ＢＨＫ、ＳＰ２／０、ＮＩＨ３Ｔ３なども本発明に利用可能である。また、上記発現ベクターを含む原核細胞を利用してもよく、例えばＥ．ｃｏｌｉなどを利用可能である。

本発明に係る抗ヒトＩＬ-５モノクローナル抗体は、薬学的に許容可能な担体と共に薬物製剤や薬物組成物を構成し、薬物製剤又は薬物組成物の形態で安定に薬効を発揮することができる。これらの製剤は、本発明に係る抗ヒトＩＬ-５モノクローナル抗体のアミノ酸コア配列の構造完全性を確保し、同時にタンパク質の多官能基を保護して分解（例えば、凝集、脱アミノ化又は酸化）から免れるようにすることができる。液体製剤の場合、通常、２℃〜８℃の温度範囲で少なくとも１年安定して保存することができ、凍結乾燥剤の場合、３０℃で少なくとも６ヶ月安定して保存することができる。前記抗ヒトＩＬ-５モノクローナル抗体製剤は、製薬分野で一般に使われる懸濁剤、注射液、凍結乾燥剤であってもよいが、注射液又は凍結乾燥剤であることが好ましい。本発明に係る抗ヒトＩＬ-５モノクローナル抗体を注射液又は凍結乾燥剤とした場合、薬学的に許容可能な賦形剤として界面活性剤、溶液安定剤、等張化剤および緩衝液からなる群より選ばれる１種以上を使用することができる。そのうち界面活性剤としては、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（例えば、Ｔｗｅｅｎ−２０又はＴｗｅｅｎ−８０）、ポロキサマー（例えば、ｐｏｌｏｘａｍｅｒ−１８８）、Ｔｒｉｔｏｎ等の非イオン界面活性剤、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ラウリル硫酸ナトリウムや、ミリスチル、リノレイル又はオクタデシルサルコシン、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ、ＭＯＮＡＱＵＡＴ^ＴＭ等が挙げられ、これらの界面活性剤は、抗ヒトＩＬ-５モノクローナル抗体の粒子化傾向を最小限に抑える程度で添加する。溶液安定剤としては、還元糖、非還元糖等の糖類、グルタミン酸ナトリウム、ヒスチジン等のアミノ酸類、トリオール、高級糖アルコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等のアルコール類等が挙げられ、これらの溶液安定剤を単独又は２種以上を組み合わせて使用することができ、最終的に得られた製剤が一定時間内で安定な状態を維持できるよう添加する。等張化剤としては、塩化ナトリウム、マンニトール等が挙げられ、これらの等張化剤を単独又は２種以上を組み合わせて使用することができる。緩衝液については特に制限がなく、例えばＴｒｉｓ、ヒスチジン緩衝液、リン酸塩緩衝液等が挙げられ、これらの緩衝液を単独又は２種以上を併用することができる。

本発明で言う好酸球増加に起因する疾患としては、喘息、多発血管炎を伴う肉芽腫症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、鼻ポリープ、アレルギー性皮膚炎、好酸球増加症候群（ＨＥＳ）などが挙げられる。

以下、実施例、実験例を挙げて本発明を詳述するが、本発明はこれらの実施例、実験例に制限されない。以下において、従来より周知の方法、例えばベクターとプラスミドの構築方法、タンパク質をコードする遺伝子を前記ベクターやプラスミドに導入する方法や、プラスミドをホスト細胞に導入する方法等については説明を省略する。これらの方法としては、当業者が熟知しており、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄＭａｎｉａｉｓ，Ｔ．（１９８９）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，２ｎｄｅｄｉｔｉｏｎ，ＣｏｌｄｓｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓなどの出版物に詳細な説明がある。

実施例１：ＩＬ-５抗原及び陽性対照抗体の調製
ヒトＩＬ-５抗原配列は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇより入手し、アミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：１で表される。上記アミノ酸配列は、コドンを最適化したものであり、ヒトＩＬ-５遺伝子の末端に１つの６×ヒスチジンタグを付け、遺伝子をｐＴＴ５に導入して一過性発現ベクター（ＮＲＣｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅ社製）を構築した。上記発現ベクターを、標準手順に従ってＨＥＫ２９３細胞（ＮＲＣｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅ社製）に導入し、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３発現培地（Ｇｉｂｃｏ社製）で培養した。５日後、上澄液を回収してヒトＩＬ-５-ヒスチジンタグ抗原を精製し、ニッケルカラムで１回目精製を行い、イオン交換クロマトグラフィーで更に精製した。そして、得られたヒトＩＬ-５-ヒスチジンタグをＳＤＳ-ＰＡＧＥで純度を確定し、さらにＴＦ-１細胞を用いてヒトＩＬ-５-ヒスチジンタグの活性を測定した。精製済みのヒトＩＬ-５-ヒスチジンタグは、純度が９５％以上であり、活性が市販の同類製品並みであった。陽性対照抗体Ｎｕｃａｌａ（登録商標）（商品名：Ｍｅｐｏｌｉｚｕｍａｂ）は、ＧＳＫ社より購入した１００ｍｇ規格のものであった。別の陽性対照抗体ｈｕ３９Ｄ１０としては、ＵＳ９５０５８２６Ｂ２に記載の配列に基づいて調製し、そのうち重鎖がＵＳ９５０５８２６Ｂ２のＳＥＱＩＤＮＯ：２で表され、軽鎖がＵＳ９５０５８２６Ｂ２のＳＥＱＩＤＮＯ：８で表され、重鎖の定常領域はヒトＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ）のものを使い、遺伝子を構築した後にｐＴＴ５ベクターに導入し、ＨＥＫ２９３Ｅ発現系（ＮＲＣｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅ社製）で発現してからＰｒｏｔｅｉｎＡカラムで精製した。

ヒトＩＬ-５-ヒスチジンタグの活性は、下記方法によりＴＦ-１細胞を用いて測定した。３７℃に予め加温したＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ社製）で対数増殖期のＴＦ１細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ-２００３^ＴＭ社製）を洗い、３００ｇ×５分間遠心し、この処理を２回繰り返した。ＴＦ１細胞数を計測し、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で細胞を適切な密度に調整した後、細胞を１ウェル当たり１０^４個／１５０μｌの量で９６ウェルプレートに播種した。ヒトＩＬ-５を１０％ＦＢＳのＲＰＭＩ１６４０培地で段階的に希釈した後、１ウェル当たり５０μｌの量で上記９６ウェルプレートに入れ、各濃度ごとに平行して３つのウェルを設けた。２００μｌ／ウェルの蒸留水で９６ウェルプレートの周りを満たし、３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベータで３日間培養し、３日後に各ウェルに２０μｌのＣＣＫ-８溶液（Ｄｏｊｉｎｄｏ社製）を加え、３７℃のインキュベータで引き続き８時間培養した。十分混ぜ合わせてからプレートリーダーでＯＤ_４５０値を測定し、測定データをＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ６で解析してＥＣ_５０を算出した。

実験例２：ＩＬ-５抗原によるマウス免疫及びハイブリドーマの調製とスクリーニング
実施例１のヒトＩＬ-５-ヒスチジンタグ抗原を生理食塩水で適切な濃度に希釈し、同量のフロイント完全アジュバントと混ぜ合わせ、超音波で完全に乳化した後に４〜５週齢のＢａｌｂ／ｃマウス（上海霊暢バイオテック社製、動物製造許可証番号：ＳＣＸＫ（上海）２０１３−００１８）１匹ごとに５０ｇ抗原／１００ｌ、数箇所で皮下注射を行った。３週間後、同量のタンパク質とフロイント不完全アジュバントを混ぜ合わせて超音波で完全に乳化したものをマウスに対して数箇所で皮下注射を行い、２週間後には同様の免疫を再び１回繰り返した。こうして免疫を３回繰り返し、３回目免疫が終わってから７日目にマウスから採血し、血清を分離してＥＬＩＳＡ法で血清抗体価を測定した。血清抗体価が１０００００を越えるマウスについては、抗体価を測定してから１週間後に、抗原タンパク質１０μｇを生理食塩水１００μＬに溶かしたものを尾静脈注射で補足免疫を行った。

血清抗体価は、ＥＬＩＳＡ法を利用して測定した。具体的には、炭酸ナトリウム緩衝液（１．５９ｇのＮａ_２ＣＯ_３、２．９３ｇのＮａＨＣＯ_３を純水１Ｌに溶かしたもの）を用いてＩＬ-５-ヒスチジンタグを１０００ｎｇ／ｍｌに希釈し、ＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに１００μずつ分注した。室温で４時間インキュベートし、０．０５％Ｔｗｅｅｎ-２０を含むＰＢＳ緩衝液（０．２ｇのＫＨ_２ＰＯ_４、２．９ｇのＮａ_２ＨＰＯ_４・１２Ｈ_２Ｏ、８．０ｇのＮａＣｌ、０．２ｇのＫＣｌおよび０．５ｍｌのＴｗｅｅｎ-２０を純水１０００ｍｌに調製したもの）でプレートを洗い流した。ウェルを１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳＴでブロッキングし、ＰＢＳＴで洗い流してから段階的に希釈したマウス血清を入れて一定時間かけてインキュベートした。プレートをＰＢＳＴで洗い、適宜希釈したＨＲＰ標識のヒツジ抗マウス二次抗体を加えて一定時間かけてインキュベートした。プレートを洗い流し、着色液［基質着色液Ａ：酢酸ナトリウム３水和物１３．６ｇ、クエン酸１水和物１．６ｇ、３０％の過酸化水素水０．３ｍｌを純水５００ｍｌで調製したもの、基質着色液Ｂ：エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム０．２ｇ、クエン酸１水和物０．９５ｇ、グリセリン５０ｍｌ、ＴＭＢ０．１５ｇを純水５００ｍｌで調製したもの、使用に先立って基質着色液Ａと基質着色液Ｂを１：１の体積比で混合］を入れて着色させた後、終止液（２Ｍの硫酸溶液）を加えて反応を中止させた。プレートリーダーでＯＤ_４５０値を測定し、測定データをＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ６で解析して血清抗体価を算出した。

マウスに対して補足免疫を行ってから３日後に脾細胞を採取して融合を行った。具体的には、成長状態が良好なハイブリドーマｓｐ２／０細胞（中国科学院典型培養物保存委員会の細胞バンクより入手）を３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベータで培養し、融合前日に培養液を１回変えた。融合およびスクリーニングは、以下のように行われた。マウス脾臓を採取して研磨、洗浄して細胞数を計測し、脾細胞とｓｐ２／０細胞を２:１の割合で混ぜ合わせて１５００ｒｐｍ、７分間遠心した。上澄液を取り除き、細胞を２０ｍｌの融合緩衝液（ＢＴＸ社製）で洗い、１０００ｒｐｍ、５分間遠心し、こうした洗浄処理を３回繰り返した。細胞を細胞融合緩衝液２ｍｌに分散して密度が１×１０^７個／ｍｌになるようにし、電気細胞融合装置ＥＣＭ２００１を利用して３０秒内、指定の条件で（ＡＣ６０Ｖ，３０Ｓ；ＤＣ１７００Ｖ，４０μＳ，３Ｘ；ＰＯＳＴＡＣ６０Ｖ，３Ｓ）細胞融合を行った。融合が終わると、ゆっくりと細胞を３７℃に予め加温した１０％血清（Ｇｉｂｃｏ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地に移し、室温で引き続き６０分間放置した。細胞を１０^４個／１００μｌ／ウェルで９６ウェルプレートに播種し、翌日に各ウェルに２×ＨＡＴ（Ｇｉｂｃｏ社製）及び１０％血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地を１００μｌ追加補充した。融合から４日目に１×ＨＡＴ及び１０％血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地を半分変え、７日目に１×ＨＡＴ及び１０％血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地を全部新しく変えた。融合から９日目にサンプルを取ってＥＬＩＳＡで測定し、陽性ハイブリドーマを２４ウェルプレートで拡大培養し、さらに有限希釈法によってサブクローン化することで目的抗体を安定に発現するハイブリドーマ株を選出して保存ライブラリを構築した。ハイブリドーマ細胞株を用無血清培地ＨｙｂｒｉＧＲＯＳＦ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）７日間培養し、ＰｒｏｔｅｉｎＡ／Ｇカラムで上澄液からマウス由来の抗ヒトＩＬ-５モノクローナル抗体を精製した。

実施例３：ＩＬ-５抗原に対するマウス由来の抗ヒトＩＬ-５モノクローナル抗体結合力の評価
本実施例では、ＥＬＩＳＡ法を用いて実施例２で得られた４０個のマウス由来の抗ヒトＩＬ-５モノクローナル抗体を評価した。評価は、炭酸ナトリウム緩衝液でＩＬ-５-ヒスチジンタグを１００ｎｇ／ｍｌに希釈した以外、実施例２の方法と同様であった。

図１に示すように、ＥＣ_５０データ（ＥＣ_５０が小さいほど結合力が高い）から高い結合力を示す抗体１０個（４-６、１０、１３、２２、２６、３２、４１、４５、４６、４７号）を選んで評価に用いた。

実施例４：ＩＬ-５で誘発されるＴＦ-１細胞増殖に対する、マウス由来の抗ヒトＩＬ-５モノクローナル抗体の阻害効果
本実施例では、実施例３で得られたマウス由来の抗ヒトＩＬ-５モノクローナル抗体を用い、以下の手順に従って細胞レベルでの評価を行った。対数増殖期のＴＦ１細胞を３７℃に予め加温したＲＰＭＩ１６４０培地で２回洗い、１０００ｒｐｍ、５分間遠心した。ＴＦ１細胞数を計測し、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で適切な密度に懸濁してから９６ウェルプレートに１０^４個／１５０μｌ／ウェルの量で播種した。ヒトＩＬ-５タンパク質（北京ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ社製）を１０％ＦＢＳのＲＰＭＩ１６４０培地で濃度４０ｎｇ／ｍｌとなるように調製し、この培地でマウス由来の抗ヒトＩＬ-５モノクローナル抗体を適切な濃度に希釈した後、さらに一定倍率に従って９段階の濃度勾配になるように希釈し、同時にＮｕｃａｌａ（登録商標）（Ｍｅｐｏｌｉｚｕｍａｂ）群を設けて陽性対照群とし、ＩＬ-５に結合しないヒトＩｇＧ１アイソタイプ抗体を陰性対照とした。希釈済みの抗体を上記ＴＦ１細胞を含む９６ウェルプレートに５０μｌ／ウェルずつ加え、されに９６ウェルの周りを２００μｌ／ウェルの蒸留水で満たした。３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベーで３日間培養し、３日後に９６ウェルプレートの各ウェルにＣＣＫ-８溶液２０μｌを加え、３７℃、インキュベータで引き続き８時間培養した。十分混ぜ合わせてからプレートリーダーでＯＤ４_５０値を測定し、測定データをＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ６で解析してＩＣ_５０を算出した。マウス由来の抗ヒトＩＬ-５モノクローナル抗体に対して細胞レベルでの評価を行った後、評価結果と活性の高い抗体を用いて次の実験を実施した。

実施例５：マウス由来の抗ヒトＩＬ-５モノクローナル抗体の配列測定
ＥＬＩＳＡ測定や細胞レベルの評価結果に基づき、クローン番号４-６、１３、２２、２６、３２、４１、４５、４６、４７を候補抗体と選出した。Ｔｒｉｚｏｌ（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて上記モノクローナル抗体に対応するハイブリドーマ細胞株から全ＲＮＡを抽出し、逆転写キット（Ｔａｋａｒａ社製）を用いてｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、ＰＣＲ法で文献記載のプライマーペア（ＡｎｔｉｂｏｄｙＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌｕｍｅ１，ＥｄｉｔｅｄｂｙＲｏｌａｎｄＫｏｎｔｅｒｍａｎｎａｎｄＳｔｅｆａｎＤｕｅｂｅｌ，p３２３）を用いてマウス由来の抗ヒトＩＬ-５モノクローナル抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域の遺伝子を増幅し、得られたＰＣＲ産物をｐＭＤ１８-Ｔベクターに導入して配列解析を行い、可変領域の遺伝子配列を確定した。各クローンの可変領域配列を対比解析した結果、４-６号抗体の配列がヒト化に適することが分かり、４-６号クローンを最終の候補抗体とした。該４-６号クローンの配列としては、重鎖可変領域の遺伝子配列が全長３５７ｂｐであり、１１９個アミノ酸残基をコードし、ヌクレオチド配列がＳＥＱＩＤＮＯ：２で表され、アミノ酸配列がＳＥＱＩＤＮＯ：３で表され、かつ軽鎖可変領域の遺伝子配列が全長３２１ｂｐであり、１０７個アミノ酸残基をコードし、ヌクレオチド配列がＳＥＱＩＤＮＯ：４で表され、アミノ酸配列がＳＥＱＩＤＮＯ：５で表され、ＧｅｎＢａｎｋでアミノ酸配列について被対比解析を行った結果、何れもマウスＩｇＧの可変領域遺伝子に合致するのが確認できた。

実施例６：マウス由来の抗ヒトＩＬ-５モノクローナル抗体のヒト化
マウス由来の４-６号抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を、ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇＰＣＲ法を利用してそれぞれヒトＩｇＧ１の軽鎖および重鎖定常領域と繋ぎ、４-６号キメラ抗体（４-６-キメラ）を構築した。

軽鎖可変領域および重鎖可変領域のアミノ酸配列を解析し、ＫＡＢＡＴ法則に従って４-６号抗体の３つの抗原相補性決定領域（ＣＤＲ）および４つのフレームワーク領域（ＦＲ）を確定した。そのうち重鎖相補性決定領域のアミノ酸配列Ｈ-ＣＤＲ１がＮＨＨＩＮ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６）であり、Ｈ-ＣＤＲ２がＹＩＮＰＹＮＤＹＳＲＹＮＱＫＦＫＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：７）であり、Ｈ-ＣＤＲ３がＤＹＧＮＦＷＹＦＤＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：８）であり、かつ軽鎖相補性決定領域のアミノ酸配列Ｌ-ＣＤＲ１がＫＡＳＱＤＩＮＳＹＬＳ（ＳＥＱＩＤＮＯ：９）であり、Ｌ-ＣＤＲ２がＲＡＤＲＬＩＤ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１０）であり、Ｌ-ＣＤＲ３がＬＱＹＤＤＦＰＹＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１１）であった。

ＮＣＢＩＩｇＢｌａｓｔを利用してヒトＩｇＧ生殖系配列（Ｇｅｒｍｌｉｎｅ）と相同性対比を行い、ＩＧＨＶ１-４６＊０１を選んで重鎖ＣＤＲ移植テンプレートとし、マウス由来の４-６号抗体の重鎖ＣＤＲをＩＧＨＶ１-４６＊０１のフレームワーク領域に導入することで重鎖ＣＤＲ移植抗体を構築し、同時にヒトＩｇＧ生殖系配列と相同性対比を行い、ＩＧＫＶ１-３９＊０１を選んで軽鎖ＣＤＲ移植テンプレートとし、マウス由来の４-６号抗体の軽鎖ＣＤＲをＩＧＫＶ１-３９＊０１のフレームワーク領域に導入することで軽鎖ＣＤＲ移植抗体を構築し、得られた抗体を４-６-Ｇｒａｆｔｅｄと定義した。また、フレームワーク領域の一部アミノ酸サイトに復帰変異を導入した。ここで、復帰変異とは、ヒト由来フレームワーク領域の一部アミノ酸残基をマウス由来フレームワーク領域の同一サイトのアミノ酸残基に変えることを意味すする。復帰変異に際して、アミノ酸配列に対してＫＡＢＡＴ編集を行い、サイトの位置をＫＡＢＡＴナンバリングに変更した。重鎖可変領域配列については、ＫＡＢＡＴナンバリングの第４８位Ｍをマウス由来のＩ、第６７位ＶをＡ、第６９位ＭをＬ、第７１位ＲをＶ、第７８位ＶをＡにそれぞれ変更することが好ましく、軽鎖可変領域配列については、ＫＡＢＡＴナンバリングの第３６位ＹをＩ、第４６位ＬをＴ、第４９位ＹをＨ、第６９位ＴをＱにそれぞれ変更することが好ましい。上記可変領域遺伝子配列は、蘇州ＧＥＮＥＷＩＺ社がＣｒｉｃｅｔｕｌｕｓｇｒｉｓｅｕｓのコドン使用選択を参考にしてコドンを最適化して合成したものであった。得られたヒト化可変領域配列とヒトＩｇＧ１定常領域を繋ぎ、該抗体を４-６号ヒト化抗体（４-６-ヒト化）と定義した。

４-６号ヒト化抗体の軽鎖および重鎖遺伝子をｐＴＴ５発現ベクターに導入し、上記軽鎖および重鎖発現ベクターを組み合せてＨＥＫ２９３Ｅ系に一過的に導入して抗体を発現させた。ＨＥＫ２９３細胞は、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３発現培地で培養し、ＰＥＩ法によってプラスミドを細胞に導入し、５日後に上澄液を回収してＰｒｏｔｅｉｎＡカラムで抗体を精製した。

以上のようにして得られた４-６-ヒト化抗体の重鎖可変領域遺伝子は、配列全長が３５７ｂｐであり、１１９個アミノ酸残基をコードし、ヌクレオチド配列がＳＥＱＩＤＮＯ：１２で表され、アミノ酸配列がＳＥＱＩＤＮＯ：１３で表され、かつ４-６-ヒト化抗体の軽鎖可変領域遺伝子は、配列全長が３２１ｂｐであり、１０７個アミノ酸残基をコードし、ヌクレオチド配列がＳＥＱＩＤＮＯ：１４で表され、アミノ酸配列がＳＥＱＩＤＮＯ：１５で表される。そして、ヒトＩｇＧ１定常領域と繋ぎ、４４９個アミノ酸残基からなる４-６-ヒト化の重鎖（ＳＥＱＩＤＮＯ：１６）および２１４個アミノ酸からなる４-６-ヒト化の軽鎖（ＳＥＱＩＤＮＯ：１７）が得られた。

実施例７：ＩＬ-５で誘発されるＴＦ-１細胞増殖に対する抗ヒトＩＬ-５モノクローナル抗体の阻害効果
本実施例では、実施例４と同様にＴＦ-１細胞増殖に対する阻害効果に基づいて４-６号ヒト化抗体（４-６-ヒト化）及び４-６号キメラ抗体（４-６-キメラ）を対比評価した。図３に示すように、ＩＬ-５で誘発されるＴＦ-１細胞増殖に対するＮｕｃａｌａ（登録商標）、ｈｕ３９Ｄ１０、４-６-キメラ、４-６-ヒト化（２９３）及び４-６-ヒト化（ＣＨＯ）（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のＥｘｐｉＣＨＯ発現系を用いて調製、操作はメーカー提供のマニュアルに従う）のＩＣ_５０がそれぞれ７０．８５ｎｇ／ｍｌ、４７．６２ｎｇ／ｍｌ、２８．９３ｎｇ／ｍｌ、３４．１２ｎｇ／ｍｌ及び２９．３７ｎｇ／ｍｌであった。そのうち、４-６号ヒト化抗体（４-６-ヒト化）及び４-６号キメラ抗体（４-６-キメラ）は、ＩＬ-５で誘発されるＴＦ-１細胞増殖に対してほぼ同様の阻害活性を示し、ヒト化が成功であることが実証された。また、本発明の４-６-ヒト化及び４-６-キメラは、生体活性において陽性対照抗体Ｎｕｃａｌａ（登録商標）及びｈｕ３９Ｄ１０を遥かに越えることも確認できた。

実施例８：ＩＬ-５とＩＬ-５ＲＡの相互作用に対する本発明の抗ヒトＩＬ-５モノクローナル抗体の阻害効果
本実施例では、ＥＬＩＳＡ法を利用してＩＬ-５とＩＬ-５ＲＡの相互作用に対する４-６号ヒト化抗体（４-６-ヒト化）及び４-６号キメラ抗体（４-６-キメラ）の阻害活性を評価した。まず、遺伝子レベルでＩＬ-５、ＩＬ-５ＲＡ細胞外領域の遺伝子（アミノ酸配はｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｑ０１３４４を参考し、蘇州ＧＥＮＥＷＩＺ社に依頼して遺伝子合成を行った）を、組み換えＰＣＲ法を利用してそれぞれヒトＩｇＧ１のＦｃ断片に繋ぎ、ｐＴＴ５を用いてＩＬ-５-ｈＦｃ及びＩＬ-５ＲＡ-ＥＣＤ-ｈＦｃの発現ベクターを構築し、ＨＥＫ２９３Ｅ細胞に一過的に導入して発現させ、ＰｒｏｔｅｉｎＡカラムで精製した。そして、自ら作ったヒトＩＬ-５-ｈＦｃでＥＬＩＳＡプレートをコーティングし、ブロッキングしてからビオチン化ＩＬ-５ＲＡ-ＥＣＤ-ｈＦｃと段階的に希釈した測定用抗体の混合物を加え、一定時間かけてインキュベートした後、プレートを洗い流してＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ-ＨＲＰを加えて着色させた。そのうち対照抗体として４-４-ヒト化抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列がＳＥＱＩＤＮＯ：１８で表され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列がＳＥＱＩＤＮＯ：１９で表され、定常領域配列は本発明の４-６-ヒト化と一致した。

図４に示すように、ＩＬ-５と受容体との相互作用に対するＮｕｃａｌａ（登録商標）、４-６-キメラ及び４-６-ヒト化抗体のＩＣ_５０は、それぞれ３１７２ｎｇ／ｍｌ、９７９．９ｎｇ／ｍｌ及び１０９７ｎｇ／ｍｌであり、ＩＬ-５と受容体の相互作用に対する本発明の４-６-キメラ及び４-６-ヒト化の阻害活性が陽性対照抗体Ｎｕｃａｌａ（登録商標）の場合を遥かに上回ることが実証された。

実施例９：抗ヒトＩＬ-５モノクローナル抗体の抗原結合力評価
４-６号ヒト化抗体（４-６-ヒト化）および４-６号キメラ抗体（４-６-キメラ）とＩＬ-５の結合力について、ＢｉａｃｏｒｅＴ２００（ＧＥｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて測定した。具体的には、ＡｍｉｎｅＣｏｕｐｌｉｎｇＫｉｔ（ＧＥｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いてＣＭ５感知チップ（ＧＥｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を活性化させ、さらにチップにＰｒｏｔｅｉｎＡ／Ｇ融合タンパク質（ＴｈｅｒｍｏＰｉｅｒｃｅ社製）を固定量が２０００ＲＵとなるように固定した。ＦＣ３（Ｆｌｏｗｃｅｌｌ３）を参考セルとし、ＦＣ４（Ｆｌｏｗｃｅｌｌ４）を試料セルとした。ＦＣ４セルを用いて４-６号ヒト化抗体（４-６-ヒト化）、４-６号キメラ抗体（４-６-キメラ）又は対照抗体（Ｎｕｃａｌａ（登録商標）及びｈｕ３９Ｄ１０）をそれぞれ捕捉し、濃度が異なるヒトＩＬ-５タンパク質（北京ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ社製）を注入した。サイクリング条件として、ＦＣ全セルに解析物を流速５０ｌ／分間、４分間注入し、解離時間を２０分間とし、さらに６Ｍの塩酸グアニジニウム（国薬グループ化学試薬有限会社製）を流速１０ｌ／分間、３０秒間注入して表面再生化を行い、そしてＢｉａｃｏｒｅＴ２００ＥｖａｌｕａｔｉｏｎＳｏｆｔｗａｒｅＶｅｒ１．０を利用して捕捉抗体シグナルと非捕捉抗体シグナルの差、相互結合性を算出した。

下記表１に示すように、本発明の４-６-ヒト化及び４-６-キメラは、既知の陽性抗体Ｎｕｃａｌａ（登録商標）（Ｍｅｐｏｌｉｚｕｍａｂ）に比べてより迅速にＩＬ-５に結合するため、ＩＬ-５への結合性がより優れるものであった。また、別の陽性対照抗体ｈｕ３９Ｄ１０に比べると、両者とも１０ｐＭの程度であり高い結合性を示した。

実施例１０：抗ヒトＩＬ-５モノクローナル抗体のエピトープ解析
ＩＬ-５のアミノ酸配列は、ＩＰＴＥＩＰＴＳＡＬＶＫＥＴＬＡＬＬＳＴＨＲＴＬＬＩＡＮＥＴＬＲＩＰＶＰＶＨＫＮＨＱＬＣＴＥＥＩＦＱＧＩＧＴＬＥＳＱＴＶＱＧＧＴＶＥＲＬＦＫＮＬＳＬＩＫＫＹＩＤＧＱＫＫＫＣＧＥＥＲＲＲＶＮＱＦＬＤＹＬＱＥＦＬＧＶＭＮＴＥＷＩＩＥＳ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）であった。下線を引いたアミノ酸配列は、ＩＬ-５と受容体の相互作用に重要であると文献で報じられ、これらのサイトに部位特異的変異を導入してそれぞれアラニン残基に変え、ヒスチジンタグが付いたＩＬ-５変異体２３個をＨＥＫ２９３Ｅ細胞に一過的に導入して発現させた。マウス由来のａｎｔｉ-Ｈｉｓ抗体で上澄液のＩＬ-５変異体（ＩＬ-５変異体全てがヒスチジンタグを有する）を捕捉し、捕捉したＩＬ-５変異体に測定用抗体であるＮｕｃａｌａ（登録商標）、ｈｕ３９Ｄ１０及び４-６-ヒト化を結合させ、ＨＲＰ標識のヒツジ抗ヒトＦｃを用いて測定用抗体が捕捉したＩＬ-５変異体に結合したか否かを測定し、測定用抗体が変異体に結合しない場合、該変異サイトが抗体結合に重要であると判断することができる。図５に示すように、２３個変異体のうち８６Ｃ、９０Ｒ、９１Ｒ、９６Ｆ、１０４Ｌの変異が測定用抗体の結合に対して影響が大きく、しかもこれら５つの変異が抗体結合に与える影響がそれぞれ異なるのが確認でき、この結果を表２に示す。表２に示すように、本発明に係る４-６号ヒト化抗体（４-６-ヒト化）は、Ｎｕｃａｌａ（登録商標）やｈｕ３９Ｄ１０と異なるエピトープを使用するのが確認できる。

上記ＥＬＩＳＡ法によるエピトープ解析結果を検証するため、ウエスタンブロットを利用して上記結果を確認した。ウエスタンブロットの操作は、ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社推薦の方法（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｃｅｌｌｓｉｇｎａｌ．ｃｏｍ／ｃｏｎｔｅｎｔｓ／ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ-ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ／ｗｅｓｔｅｒｎ-ｂｌｏｔｔｉｎｇ-ｐｒｏｔｏｃｏｌ／ｗｅｓｔｅｒｎ）に従って実施した。電気泳動、転写システムや化学発光現像システムは、何れもＢｉｏ-Ｒａｄ社製のものであった。８５〜９４位の１０個変異体に対してウエスタンブロット解析を行い、それぞれｈｕ３９Ｄ１０及び４-６-ヒト化抗体を一次抗体とし、ＨＲＰ標識のヒツジ抗ヒトＦｃ抗体を二次抗体とし、化学発光と現像システムで解析画像を形成した。図６に示すように、８６Ｃ、９０Ｒ及び９１Ｒのうち何れか１つのアミノ酸残基に変異を導入した場合、ｈｕ３９Ｄ１０がＩＬ-５に結合できなくなり、８６Ｃ及び９１Ｒのうち何れか１つのアミノ酸残基に変異を導入した場合、４-６-ヒト化がＩＬ-５に結合できなくなるのが確認できた。

実施例１１：抗ヒトＩＬ-５モノクローナル抗体の種交差性に対する評価
後の薬理学的及び毒物学的研究に備え、本実施例では４-６-ヒト化抗体の種交差性について検証を行った。ラット、マウス、モルモット及びウサギのＩＬ-５遺伝子（遺伝子配列はｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇから取得し，マウスの登録番号Ｐ０４４０１、ラットの登録番号Ｑ０８１２５、モルモットの登録番号Ｏ０８９８７、ウサギの登録番号Ｇ１ＳＬ７９）を合成してｐＴＴ５ベクターに導入し、ＨＥＫ２９３Ｅで一過的に発現させた。マウス由来ａｎｔｉ-Ｈｉｓ抗体で上澄液からＩＬ-５（上記ＩＬ-５は何れもヒスチジンタグを有する）を捕捉し、捕捉したＩＬ-５に測定用抗体Ｎｕｃａｌａ（登録商標）、ｈｕ３９Ｄ１０又は４-６-ヒト化を結合させ、ＨＲＰ標識のヒツジ抗ヒトＦｃで測定用抗体とＩＬ-５の結合を測定した。表３に示すように、本発明の４-６-ヒト化及びｈｕ３０Ｄ１０は、モルモットとマウスのＩＬ-５を効果的に認識できるが、ラットＩＬ-５への結合が比較的弱いのが確認できた。なお、４-６-ヒト化及びｈｕ３０Ｄ１０は何れもウサギＩＬ-５を認識せず、Ｎｕｃａｌａ（登録商標）はラット、マウス、モルモット及びウサギのＩＬ-５を認識しないため、これらの結果については記載を省略した。

実施例１２：抗ヒトＩＬ-５モノクローナル抗体の薬物動態学
本実施例では、ラットを動物モデルとし、本発明に係る４-６-ヒト化抗体を静脈注射で（ＩＶ．）投与する場合の薬物動態学を検討した。

体重約２００ｇのラット４匹を１組とし、各ラットに抗ヒトＩＬ-５モノクローナル抗体又はヒトＩｇＧ１アイソタイプ抗体１ｍｇを静脈注射で投与した。投与を行ってから一定時間で眼窩採血を行い、血液が自然に凝固した後に遠心して血清を回収した。血清中の抗体薬物濃度は、以下の通りにして測定した。つまり、ヒツジ抗ヒトＦｃフラグメント抗体（Ｓｉｇｍａ社製、該抗体は種交差性を考慮して吸着処理を行い、ラット内由来の抗体に結合しないものであった）を濃度１０００ｎｇ／ｍｌ、１００μｌ／ウェルの条件でＥＬＩＳＡプレートにコーティングした後、ＰＢＳＴ＋１％ＢＳＡでブロッキングし、適宜希釈したラット血清を加えた。一定時間インキュベートした後、プレートを洗い流してＨＲＰ標識のヒツジ抗ヒト抗体（Ｓｉｇｍａ社製、該抗体は種交差性を考慮して吸着処理を行い、ラット内由来の抗体に結合しないものであった）を加え、さらに一定時間インキュベートした。プレートを洗い流して着色液を加えて反応させ、終止液を加えて反応を終止させてＯＤ_４５０を測定した。標準検量線を用いてＯＤ_４５０を抗体濃度に変換し、データをＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ６でまとめて処理し、Ｐｈｏｅｎｉｘソフトでラット体内における抗体薬物の半衰期を算出した。

図７に示すように、静脈注射で投与する場合の薬物動態学として、４-６-ヒト化抗体のラット体内における半衰期がヒトＩｇＧ１アイソタイプ抗体の場合とほぼ同じく、それぞれ１３．９０日および１２．６５日であった。

実施例１３本発明の抗ヒトＩＬ-５モノクローナル抗体の体内薬効学研究
本実施例では、オボアルブミン（Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ）で誘発されるマウス喘息モデルを用いて体内薬効学を検討した。

具体的には、Ｂａｌｂ／ｃマウスをランダムに非モデル対照組、モデル対照組、４-６-ヒト化抗体組（低投与量組および高投与量組）および陽性対照抗体組と６組に分け、各組は１０匹ずつであった。オボアルブミン（Ｓｉｇｍａ社製）及び免疫アジュバントとしてＩｎｊｅｃｔＡｌｕｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社製）を混合して懸濁液とし、１日目及び１４日目にマウス腹腔から注射して感作させた（陰性対照組は、腹腔からＰＢＳを注射した）。１％のオボアルブミンを含むＰＢＳ溶液を霧化して噴霧剤とし、２８日目、２９日目および３０日目に噴霧剤でマウスを刺激することにより喘息を誘発した（対照組は、ＰＢＳを霧化してマウスを刺激する）。２０日目および２８日目（オボアルブミン溶液を噴霧剤にしてマウスを刺激する前の２時間）に、皮下注射によってマウスに投与を行い、具体的には、非モデル対照組に抗体を含まない賦形剤溶液、モデル対照組注射に抗体を含まない賦形剤溶液、４-６-ヒト化抗体の低投与量組および高投与量組にはそれぞれ０．４ｍｇ／ｋｇおよび２ｍｇ／ｋｇの抗ヒトＩＬ-５モノクローナル抗体、並びに陽性対照抗体組には２ｍｇ／ｋｇのＲｅｓｌｉｚｕｍａｂ（商品名：Ｃｉｎｑａｉｒ、ＴｅｖａＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＩｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社製）を投与した。３２日目に動物から採血し、フローサイトメータを用いて血液サンプルにおける好酸球数を計測し、具体的には、蛍光色素ＡＰＣ-ｅＦｌｕｏｒ７８０で標識した抗Ｌｙ-６Ｇ抗体、ＰＥ標識の抗ＣＤ１９３抗体およびｅＦｌｕｏｒ５０６標識の抗ＣＤ４５抗体を用いて血液細胞を染色し、これら３種類の抗体染色で全部陽性である細胞を好酸球と判定した。上記蛍光色素標識の抗Ｌｙ-６Ｇ抗体および抗ＣＤ１９３抗体は、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製であり、抗ＣＤ４５抗体は、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製であった。

得られたデータについては、各組の好酸球数などをＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ６で解析し、Ｔ検定で各組の差を確定し、ｐ＜０．０５の場合を有意差があるとし、ｐ＜０．０１の場合を有意差が特に顕著であるとした。

図８に示すように、非モデル組に比べて、モデル組の血液サンプルにおける好酸球数が顕著に上昇し、動物モデル構築が成功であることが確認できた。また、モデル対照組に比べて、４-６-ヒト化抗体の低投与量組、高投与量組及び陽性対照抗体組の好酸球数が何れも顕著に低下し、かつ４-６-ヒト化抗体の低投与量組、高投与量組は、陽性対照抗体組に比してｐ値がそれぞれ０．００６９、０．０００４と有意差があり、体内活性からして４-６-ヒト化抗体が陽性対照抗体Ｒｅｓｌｉｚｕｍａｂを上回ることが確認できた。

Claims

ヒトＩＬ-５に結合するとき、ＳＥＱＩＤＮＯ：１で表される配列における８６Ｃ、９１Ｒ、９６Ｆおよび１０４Ｌのうち少なくとも１つのアミノ酸残基に結合し、かつＩＬ-５とＩＬ-５ＲＡの結合を阻害しうることを特徴とする、ヒトＩＬ-５に結合するモノクローナル抗体。
ヒトＩＬ-５に結合するとき、ＳＥＱＩＤＮＯ：１で表される配列における８６Ｃ、９１Ｒ、９６Ｆおよび１０４Ｌのうち少なくとも２つのアミノ酸残基に結合する、請求項１に記載のヒトＩＬ-５に結合するモノクローナル抗体。
ヒトＩＬ-５に結合するとき、ＳＥＱＩＤＮＯ：１で表される配列における８６Ｃ、９１Ｒ、９６Ｆおよび１０４Ｌのうち少なくとも３つのアミノ酸残基に結合する、請求項２に記載のヒトＩＬ-５に結合するモノクローナル抗体。
ヒトＩＬ-５に結合するとき、ＳＥＱＩＤＮＯ：１で表される配列における８６Ｃ、９１Ｒ、９６Ｆおよび１０４Ｌの４つのアミノ酸残基のみに結合する、請求項３に記載のヒトＩＬ-５に結合するモノクローナル抗体。
ヒトＩＬ-５に結合するモノクローナル抗体であって、
該モノクローナル抗体は、重鎖および軽鎖を含み、
前記重鎖は、重鎖相補性決定領域Ｈ-ＣＤＲ１、Ｈ-ＣＤＲ２、Ｈ-ＣＤＲ３を含み、前記Ｈ-ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：６で表され、前記Ｈ-ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：７で表され、前記Ｈ-ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：８で表され、
前記軽鎖は、軽鎖相補性決定領域Ｌ-ＣＤＲ１、Ｌ-ＣＤＲ２、Ｌ-ＣＤＲ３を含み、前記Ｌ-ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：９で表され、前記Ｌ-ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０で表され、前記Ｌ-ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１１で表されることを特徴とする、ヒトＩＬ-５に結合するモノクローナル抗体。
前記ヒトＩＬ-５に結合するモノクローナル抗体は、マウス由来の抗体、キメラ抗体又はヒト化抗体である、請求項５に記載のヒトＩＬ-５に結合するモノクローナル抗体。
前記モノクローナル抗体の重鎖は、ＳＥＱＩＤＮＯ：３で表されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含み、前記モノクローナル抗体の軽鎖は、ＳＥＱＩＤＮＯ：５で表されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含み、又は
前記モノクローナル抗体の重鎖は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３で表されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含み、前記モノクローナル抗体の軽鎖は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１５で表されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、請求項５又は６に記載のヒトＩＬ-５に結合するモノクローナル抗体。
前記モノクローナル抗体の重鎖は、アミノ酸配列がＳＥＱＩＤＮＯ：１６で表され、前記モノクローナル抗体の軽鎖は、アミノ酸配列がＳＥＱＩＤＮＯ：１７で表される、請求項７に記載のヒトＩＬ-５に結合するモノクローナル抗体。
単離したヌクレオチド分子であって、
請求項１〜８の何れか１項に記載のヒトＩＬ-５に結合するモノクローナル抗体をコードすることを特徴とする、ヌクレオチド分子。
前記ヌクレオチド分子は、
重鎖可変領域をコードし且つＳＥＱＩＤＮＯ：２で表されるヌクレオチド配列、および軽鎖可変領域をコードし且つＳＥＱＩＤＮＯ：４で表されるヌクレオチド配列を含み、又は
重鎖可変領域をコードし且つＳＥＱＩＤＮＯ：１２で表されるヌクレオチド配列、および軽鎖可変領域をコードし且つＳＥＱＩＤＮＯ：１４で表されるヌクレオチド配列を含む、請求項９に記載のヌクレオチド分子。
請求項９又は１０に記載のヌクレオチド分子を含んでなる、発現ベクター。
請求項１１に記載の発現ベクターを含んでなる、ホスト細胞。
請求項１〜８の何れか１項に記載のヒトＩＬ-５に結合するモノクローナル抗体を製造する方法であって、
ａ）発現条件下で請求項１２に記載のホスト細胞を培養することにより、前記ヒトＩＬ-５に結合するモノクローナル抗体を発現させ、
ｂ）前記ａ）のヒトＩＬ-５に結合するモノクローナル抗体を単離、精製することを含むことを特徴とする、製造方法。
請求項１〜８の何れか１項に記載のヒトＩＬ-５に結合するモノクローナル抗体と、薬学的に許容可能な担体とを含んでなる、薬物組成物。
請求項１〜８の何れか１項に記載のヒトＩＬ-５に結合するモノクローナル抗体又は請求項１４に記載の薬物組成物の、好酸球増加に起因する疾患の治療薬の製造における用途。
前記好酸球増加に起因する疾患は、喘息、多発血管炎を伴う肉芽腫症、慢性閉塞性肺疾患、鼻ポリープ、アレルギー性皮膚炎又は好酸球増加症候群である、請求項１５に記載の用途。
前記好酸球増加に起因する疾患は、喘息である、請求項１６に記載の用途。