JP4954104B2 - Il−5介在障害を治療および診断するための改良方法 - Google Patents
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Description
本願は、1994年12月23日出願の米国特許出願番号08/363131の一部継続出願である、1995年6月6日出願の米国特許出願番号08/470110および08/467420の一部継続出願である、1995年12月22日出願のPCT/US95/17082の一部継続出願である。
Butterfieldら、In:Immunopharmacology of Eosinophils,H.SmithおよびR.Cook,Eds.,151−192頁、Academic Press,London(1993) Corriganら、Immunol.Today、13:501−507(1992) Griffenら、J.Aller.Clin.Immunol.、67:548−557(1991) Bousquetら、N.Eng.J.Med.、323:1033−1039(1990) Motojumaら、Allergy、48:98(1993) Dentら、J.Exp.Med.、172:1425(1990) Hitoshiら、Int.Immunol.3:135(1991) Coffmanら、Science、245:308−310(1989) Sherら、Proc.Natl.Acad.Sci.、83:61−65(1990) Chandら、Eur.J.Pharmacol.、211:121−123(1992)
「変性抗体」とは、選択された宿主細胞にて発現させることにより得ることのできる、変性免疫グロブリンのコーディング領域によりコードされるタンパク質をいう。かかる変性抗体は、改変抗体(例えば、キメラまたはヒト化抗体)または免疫グロブリン定常領域のすべてもしくは一部、例えば、Fv、FabもしくはF(ab)2などを欠いている抗体フラグメントである。
本発明の抗体、変性抗体およびフラグメントの構築において用いる場合、ヒト以外の種(例えば、ウシ、ヒツジ、サル、ニワトリ、齧歯動物(例えば、ネズミおよびラット)など)を用い、天然のIL−5またはそのペプチドエピトープを付与して所望の免疫グロブリンを得ることができる。従来のハイブリドーマ技法を用いてヒト以外の種のmAbをIL−5に分泌するハイブリドーマ細胞系を得る。そのようなハイブリドーマを、実施例のセクションにおいて記載されるように、96−ウェルプレートに被覆したIL−5、あるいは別法としてストレプタビジン被覆プレートに結合したビオチニル化IL−5を一緒に用いて結合についてスクリーニングする。
本発明はまたヒトIL−5と対抗して方向づけられるmAbより由来のFabフラグメントまたはF(ab’)2フラグメントの使用を包含する。これらのフラグメントはIL−5および好酸球介在症状に対するインビボにおける保護剤として、あるいはIL−5診断剤として有用である。Fabフラグメントは軽鎖全体および重鎖のアミノ末端部を含有し;F(ab’)2フラグメントはジスルフィド結合により結合した2つのFabフラグメントにより形成されるフラグメントである。mAb 2B6、2E3および他の同様の高親和性のIL−5結合抗体は、FabフラグメントおよびF(ab’)2フラグメントの供給源を提供し、常套手段、例えば、mAbを適当なタンパク質分解酵素、パパインおよび/またはペプシンで切断することにより、または組換え技法により得ることができる。これらのFabおよびF(ab’)2フラグメントは、それ自体が治療剤、保護剤または診断剤として、および本明細書に記載の組換え体またはヒト化抗体の形成において有用な可変領域およびCDR配列を含む配列のドナーとして有用である。
mAb 2B6または前記の他の抗体は、ドナー抗体の抗原結合特異性により特徴付けられる種々の変性抗体を設計して得るのに有用な、可変重鎖および/または軽鎖ペプチド配列、フレームワーク配列、CDR配列、その機能的フラグメントおよびアナログ、ならびにそれらをコードする核酸配列などの配列を付与する。
変性免疫グロブリン分子は、キメラ抗体およびヒト化抗体などの改変抗体を含む変性抗体をコードすることができる。所望の変性免疫グロブリンのコーディング領域は、第1免疫グロブリンパートナー(ヒトフレームワークまたはヒト免疫グロブリン可変領域)に挿入されるIL−5抗体、好ましくは本発明により得られるような高親和性抗体の抗原特異性を有するペプチドをコードするCDRコード化領域を含有する。
好ましくは、mAb 2B6または他の適当なドナーmAb(例えば、2E3、2F2,4A6など)の可変軽鎖および/または重鎖配列およびCDRおよびそのコード化核酸配列を、以下の方法により、本発明の変性抗体、好ましくはヒト化抗体の構築に利用する。同一または類似する技法を用いて、本発明の他の具体例を実施してもよい。
ヒト化抗体のさらに別の発現法として、米国特許第4873316号に記載されるように、トランスジェニック動物における発現を利用することができる。この特許はトランスジェニック的に哺乳動物に組み込まれた場合に雌がミルク中に所望の組換えタンパク質を産生させるような動物のカゼインプロモーターを用いる発現系に関するものである。
改変抗体を所望の方法により発現させて、ついでその抗体を適当なアッセイを用いてインビトロ活性について試験する。近年一般的なELISAアッセイフォーマットを利用して改変抗体とIL−5の結合を定性的かつ定量的に評価する。加えて、さらにその後にヒト臨床実験を行う前に他のインビトロアッセイを用いて中和効能を明確にし、通常のクリアランス機構にもかかわらず、体内における改変抗体の永続性を評価することができる。
2B6より調製されるヒト化抗体について記載されている操作に従って、当業者であれば他のドナーIL−5抗体、可変領域配列および本明細書に記載のCDRペプチドからヒト化抗体を構築することもできる。改変抗体は、改変抗体の受容体により潜在的に「自己」と認識される可変領域フレームワークで産生することもできる。可変領域のフレームワークを少し修飾し、受容体に対して免疫原性が顕著に増加することなく、抗原結合を大きく増加させることができる。そのような改変抗体は、IL−5介在症状に対してヒトを効果的に治療するかもしれない。かかる抗体はまたそのような症状の診断に有用であるかもしれない。
本発明はまた、好酸球関連徴候、すなわち、好酸球産生過多に伴う症状、例えば喘息を患っているヒトの治療法であって、1またはそれ以上の本明細書に記載の改変抗体または変性抗体、またはそのフラグメントを含む、有効量の抗体を投与することからなる方法に関する。
ヒトIL−5をDrosophila Schneider2(S2)細胞にて発現させて均質に精製した。ネズミIL−5をSpodoptera frugiperda 21(Sf21)細胞を用いてバキュロウイルスにて発現させて均質に精製した。モノクローナル抗体、TRFK−5(中和ラット抗−マウスIL−5抗体)をGenzyme Corp.(MA、Cambridge)より入手した。
組換えヒトIL−5(IL−5)を一群7匹のCAF1雌マウス(Charles River、Wilmington、MA)の免疫原として用いた。動物に、1対1の割合のTiter MAXTM(CytoRx Corp.、Norcross、GA)で乳化させたリン酸緩衝セイライン(PBS)中のIL−5を4ヶ月にわたって3回皮下注射した。初回抗原投与量は50μg(マイクログラム)であり、追加抗原刺激量は25および10μg(マイクログラム)であった。追加抗原刺激接種を行った後、血清試料を採集し、レセプター結合阻害アッセイおよびB13増殖アッセイ(またはIL−5中和アッセイ(実施例2C))により、IL−5への結合について、および中和活性について検定した。マウスはすべて、IL−5に結合する血清試料を産生した。脾臓ドナーとして選択された動物に、殺す3日前に10μg(マイクログラム)の組換えヒトIL−5を静脈内に追加抗原投与した。
最初にKohlerら(Nature、256:495(1975))により報告された融合操作を、細胞単層を用いる技法(Kennetら編、”Hybridomas:A new dimension in biological analysis”、368−377頁、Plenum Press、New York)を行うために修飾して用いた。2匹のドナーマウスからの脾臓細胞をプールし、1000万個のSP2/0/Ag14骨髄腫細胞に対して5000万個の割合の脾臓細胞を用いて融合を行った。融合陽性ウェルの上清をELISAを用いてIL−5との結合についてアッセイした。IL−5に対する抗体を産生する細胞を含むウェルを広げ、上清をIL−5レセプター結合阻害アッセイおよびB13(中和)増幅アッセイ(以下に記載)にてスクリーンした。
モノクローナル抗体2B6を産生するハイブリドーマ細胞系SK119−2B6.206.75(1)を、American Type Culture Collection(ATCC)、Rockville、MD、USAに寄託し、それは特許手続き上の微生物寄託の基準となるブタペスト条約(1977年)に従って、特許寄託菌として受入れ番号HB11783で受け入れられた。
A.ELISA
MaxiSorbTMイムノプレート(Nubc、Naperville、IL)の各ウェルを0.05M炭酸塩緩衝液(pH9.6)中のIL−5(0.2μg)で被覆した。4℃で一夜インキュベートした後、プレートをPBS(0.025%Tween(登録商標)20含有)ですすぎ、PBS(0.025%Tween(登録商標)20含有)中の1%BSAを用いて室温で2時間遮断した。非希釈ハイブリッド上清をIL−5被覆のウェルに加え、室温で2時間インキュベートした。該プレートを注ぎ、ペルオキシダーゼ標識化ヤギ抗−マウスIgG&IgM(Boehringer Mannheim、Indianapolis、IN)を1%BSAおよび0.025%Tween(登録商標)20を含有するPBSに1/7500の希釈度で加えた。2時間後にプレートを洗浄し、0.1%尿素ペルオキシドおよび1mg/mlのオルトフェニレンジアミンを含有する、0.2mlの0.1Mクエン酸緩衝液(pH4.75)を添加した。15分経過後、プレートをVMaxTMマイクロプレートリーダー(Molecular Devices、Menlo Park、CA)上、450nmで読み取った。
ヒトIL−5レセプター(IL−5R)のα鎖を発現するDrosophilaS2細胞の膜抽出物を用いてレセプターに結合するIL−5についての抗体の作用を測定した。109個の細胞を1000xg、4℃で10分間遠心してペレット状にした。その細胞ペレットをドライアイス/エタノール浴中で15分間凍結させた。該ペレットを解凍し、PBS(10ml)に4℃で再び懸濁させ、1000xgで10分間遠心してペレット状にした。その細胞ペレットをPBS中に2回洗浄し、低張緩衝液(10mM Tris(pH7.5)、3mM MgCl2、1mM ジチオスレイトール、1mM フェニルメチルスルホニルフルオリド、1μM ロイペプシン、1μM ペプスタチンA)(13.5ml)に再び懸濁させ、5分間氷上でインキュベーションした。その細胞懸濁液を15mlのDounceホモジナイザー中で均一にし、2.5Mシュークロース溶液を用いてシュークロースの最終濃度を0.25Mとした。1000xgで15分間遠心分離に付すことで細胞残骸を除去した。細胞膜を100000xg、4℃で90分間遠心してペレット状にし、50mlの10mM Tris(pH7.5)、3mM MgCl2、250mMシュークロースに再び懸濁させ、−70℃で貯蔵した。
ネズミIL−5/IL−3依存性細胞系、LyH7.B13(B13)をR.Palacios(Basel Institute of immunology、Switzerland)の好意により入手した。L−グルタミン、非必須アミノ酸、ピリビン酸ナトリウム、ペニシリン−ストレプトマイシン(すべて、GibcoBRL)、加えて2−メルカプトエタノール(5x10−5M、Sigma)、10%ウシ胎児血清(Globepharm、Surrey、UK)および1−10単位のネズミIL−5を補足した、RPMI1640培地(GibcoBRL、Renfrewshire、UK)で週に2回、細胞を継代培養した。アッセイ用の細胞を適宜希釈した試験試料の存在下、96−ウェルの丸底プレートで三重(5000個の細胞/ウェル)にて48時間培養し、0.5μCi−3H−チミジン(Amersham、Bucks、UK)で最終4時間パルス処理した。その細胞を1205ベータプレート(LKB Wallac、Beds、UK)にてシンチレーションカウントするのに処理した。
固定されたhIL−5および抗体の動力学的および平衡結合特性はBIAcore光学バイオセンサー(Pharmacia Biosensor、Uppsala、Sweden)を用いて測定した。動力学的データは以前に開示されている関係(Karlssonら、J. Immunol. Meth.、145:229−240(1991))を用いて評価した。
A.PCRおよびコンビナトリアルライブラリー構築
3匹のマウスの脾臓より精製したRNAを、以前にHuseら(Science 246:1275(1989))およびKang、S.A.(Methods:Companion Methods Enzymol.、2:111(1991))に記載されているように、次のキットで供給されるプライマー(dT)15または3’Fd(IgG1、IgG2a&IgG3)およびカッパ軽鎖プライマーのいずれかを用いてcDNAキット(Boehringer Mannheim、Indianapolis、IN)で逆転写した。免疫グロブリンcDNAをプライマーおよび記載(Huseら、前掲)の熱循環条件を用いてPCRにより増幅させた。すべての反応に対して、AmpliWaxTM PCR Gem100(Perkin Elmer Cetus、Norwalk、CT)ビーズを用い、製造主プロトコルに従ってHot Start技法を利用した。PCR産物をゲル精製し、消化し、pMKFabGene3ベクター(Amesら、J. Immunol.、152:4572(1994))にライゲーションした。FdcDNAとライゲーションさせた後のライブラリータイターは5.1x107CFUであり、カッパcDNAとライゲーションさせた後では1.5x106CFUであった。ファージミドライブラリーで形質転換したXL1−Blue細胞(Stratagene、La Jolla、CA)をヘルパーファージVCSM13(Stratagene)で感染させ、ファージをBarbasおよびLerner(Methods:Companion Methods Enzymol.、2:119(1991))に記載されているように調製した。
4個のマイクロタイターウェル(Immulon II Removawell Strips、Dynatech Laboratories Inc.、Chantilly、VA)を、0.1M重炭酸塩(pH8.6)中のIL−5(1μg/ウェル)で4℃で一夜被覆した。そのウェルを水で洗浄し、3%BSAを含有するPBSで37℃で1時間遮断した。遮断溶液を除去し、ライブラリーをマイクロタイターウェルに加え(50μl/ウェル)、37℃で2時間インキュベーションした。pHをグリシンで2.2に調整し、1mg/mlのBSAを含有する、0.1M HClで付着ファージを溶出する前に、ウェルをTBS/Tween(登録商標)(50mM Tris−HCl、pH7.5、150mM NaCl、0.5%Tween(登録商標)20)で10回洗浄し、H2Oで1回洗浄した。
第3および第4ラウンドのバイオパンニングより単離したクローンのコロニーリフトを記載(BarbasおよびLerner、前掲)に従い処理した。フィルターを、Bolton−Hunter試薬(NEN、Billerica、MA)を用い、製造主推奨の操作に従ってヨウ素化した、0.5−1.0μCiの125I−IL−5と共に、1%BSA含有PBS中、室温で1時間インキュベーションし、0.25%Tween含有のPBSで洗浄し、Kodak XARフィルムに暴露した。IL−5反応性Fabを発現するコロニーをオートラジオグラフィーで検出した。
ファージミドDNAをNheIおよびSpeIで消化し、遺伝子IIIを除去し、自己ライゲーションに付した。XL1−Blue細胞を形質転換させて、単離されたクローンを1%グルコースおよび50μg/mlカルベニシリン(carbenicillin)含有のスーパーブロス(SB)培地(30gトリプトン、20g酵母抽出物、10gの3−[N−モルホリノ]プロパンスルホン酸(MOPS)、pHを7に調整)(5.0ml)中に37℃で一夜増殖させた。この培養物1mlからの細胞を、3500rpmで10分間、Beckman GS−6R遠心機にてペレット状とし、50μg/mlカルベニシリン含有のSB(5ml)に植え付けるのに用いた。培養物を37℃で1時間振盪し、イソプロピル−b−D−チオガラクトピラノシド(IPTG;1mM)を加え、培養物を一夜28℃に移した。細胞ペレットを4℃で20分間30mM Tris(pH8.0)に懸濁させた20%シュークロースに溶かし、つづいてMicrofugeで10分間遠心分離に付すことにより可溶性Fabをペリプラズム抽出物より調製した。既知量のネズミFabを含有する試料と比較することによりウェスタンブロットによりFab濃度を評価した。異なる細菌ペリプラズム抽出物は、ウェスタンブロット分析により評価した場合、1ないし20μg/mlの範囲の、同様の濃度のFabを含有した。
タンパク質の精製を助成するのにキレート化ペプチドを重鎖のカルボキシ末端で改変した。NheIおよびSpeIで消化してM13遺伝子IIIコーディング領域を除去した後、6個のヒスチジン残基をコードする、一対の重複オリゴヌクレオチド:
[配列番号43]5’−CTAGCCACCACCACCACCACCACTAA−3’;
[配列番号44]3’−GGTGGTGGTGGTGGTGGTGATTGATC−5’
をFab発現ベクターにサブクローニングした。Fab発現の誘発は前記のように行った。28℃で一夜誘発させた後、20%シュークロース、30mM TRIS(pH8.0)中、4℃で30分間インキュベーションさせることで、細胞ペレットのペリプラズム溶菌液を調製した。尿素およびBrij−35デタージェントを浄化した上清に、各々、2Mおよび1%の最終濃度まで添加した。室温で1時間攪拌した後、その処理かつ浄化した上清を、緩衝液A(100mM Na−Phosphate、10mM Tris、0.3M NaCl、2M尿素、pH8.0)で平衡にした5mlニッケル−NTA金属封鎖カラム(1.5x3cm)に直接0.5ml/分で充填した。カラム容量の4倍(20ml)で洗浄した後、前記したのと同じ緩衝液をpH8からpH4の逆pH勾配でカラム容量の6倍(30ml)を用いて結合物質を溶出した。精製されたFabがpH5.5でシャープな対称ピークにてカラムより溶出された。それは>90%純度であり、DNAがなかった。
イムロン(Immulon)IIプレート(Dynatech)を0.1M重炭酸塩緩衝液(pH8.6)に懸濁させたタンパク質で一夜4℃で被覆した。希釈および洗浄を0.05%TweenTM20含有のPBSにて行った。プレートを洗浄し、1%BSA含有のPBSで1時間室温で遮断した。可溶性Fabまたは精製されたFabを含有する種々の希釈度の細菌性上清をプレートに加えた。1時間インキュベーションした後、プレートを洗浄し、ビオチニル化ヤギ抗−マウスκ(Southern Biotechnology Associates, Inc.、Birmingham、AL)を1時間にわたって加えた(1:2000希釈度;50μl/ウェル)。プレートを洗浄し、ストレプタビジン標識ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼを1時間で加えた(1:2000希釈度;50μl/ウェル)。プレ−トを洗浄し、ABTSペルオキシダーゼ基質を加え(100μl/ウェル;Kirkegaard&Perry Laboratories、Gaithersburg、MD)、405nmでの光学密度をUVmaxTM(Molecular Devices)マイクロプレートリーダー上で読み取った。
IL−5で被覆したマイクロタイターウェルに対する複数回のラウンドのバイオパンニングに付すことで、ライブラリーからFabをIL−5に運ぶファージを選択した。4ラウンドの選択操作の後、IL−5反応性Fabを125I−IL−5を用いるコロニーリフトアッセイにより同定した。第3ラウンドから34個の、第4ラウンドから4個の標識されたIL−5と結合したコロニーが同定された。IL−5との結合を、Fab−遺伝子III融合タンパク質を発現する培養上清を用い、直接結合性ELISAにより確認した。DNAをこれらコロニーより単離し、M13遺伝子IIIのコーディング領域を除去した後、可溶性Fab発現を誘発した。ペリプラズムフラクションを調製し、IL−5との結合についてELISAでアッセイした。Fabは他のタンパク質、rC5aと明確に結合することなく、IL−5に特異的に結合した。
mAb(2B6)のFdおよびκcDNAを前記の条件を用いてPCRにより単離した。ゲル精製されたフラグメントを遺伝子IIIcDNAのヘキサ−His配列3’を含むように修飾されたpMKFabGene3ベクターにサブクローンし、プラスミドpMKFabGene3Hを得た。2B6重鎖および軽鎖を含有する機能的なIL−5結合Fabクローンをコロニーリフトアッセイにより同定した。遺伝子IIIをNheI/SpeII消化および自己ライゲーションを介して除去し、重鎖をフレームにてヘキサ−Hisに融合させ、前記のように精製した。用量依存法において、このFabはペアレントmAb、ネズミ2B6の値と同様の、約7.5μg/mlのIC50でレセプター結合を阻害した。
中和mAb 2B6のFdをコードするcDNAをXhoI/SpeIフラグメントとして軽鎖cDNAの代わりにSstI/XbaIフラグメントを含有するpMKFabGene3Hにサブクローンした。このファージミドをSstIおよびXbaIで消化し、IL−5免疫化マウス(前記)より由来のSstI/XbaI消化された軽鎖PCR産物とライゲーションした。ライゲーション後のライブラリータイターは4x105CFUであった。バイオパンニングおよびコロニーリフロアッセイをコンビナトリアルライブラリーについて前記したように行った。
1種のヒト化抗体をそのヒト抗体フレームワーク内にネズミCDRを含むように設計した。次の操作を行うことで、IL−5特異的マウス抗体2B6のこのヒト化バージョンを調製した。
Boehringer Mannheim(Indianapolis、IN)より入手したキットを用いて2B6、2F2および2E3の各々のハイブリドーマ細胞系(実施例1を参照のこと)より、mRNAを単離し、cDNAキット(Boehringer Mannheim)で得られたプライマー(dT)15を用いて逆転写してcDNAを調製した。マウス免疫グロブリンに特異的なPCRプライマーを用い、重鎖可変領域のアミノ酸番号9(KABAT 番号表示システム)からヒンジ領域に、および軽鎖可変領域のアミノ酸番号9(KABAT 番号表示システム)から定常領域の末端にまで広がっているドメインをコードするDNAを増幅した。各々の抗体鎖のいくつかのクローンを独立PCR反応により得た。
5’ GTACATATGCAAGGCTTACAACCACAATC 3’である。
5’ GGACAGGGCTTACTAGTGGGCCCTCTGGGCTC 3’である。
5’ AGGT(CまたはG)(CまたはA)A(GまたはA)CT(GまたはT)TCTCGAGTC(TまたはA)GG 3’である。
5’ CTAACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTGACAATGGG 3’である。
5’ CCAGATGTGAGCTCGTGATGACCCAGACTCCA 3’である。
上記パートAの重鎖および軽鎖ネズミcDNAクローンを配列決定した。これらクローンの可変領域の配列決定の結果を配列番号1−6(図1−6)に示す。クローンは、各々、マウス重鎖可変領域または軽鎖可変領域の間に保存されていることが知られているアミノ酸を含有した。そのCDRアミノ酸配列を以下に列挙する。
C.ヒトフレームワークの選択
2B6重鎖CDR[図7および配列番号1−2]およびヒト抗体のフレームワーク配列を得る場合、合成重鎖可変領域を調製した[配列番号18]。これは、つなぎ合わされると、アミノ酸番号21−106(KABAT番号付け)をコードする4種の合成オリゴヌクレオチド[配列番号27および28][配列番号29および30]を用いて調製した。オリゴヌクレオチドを、CORフレームワーク(前掲)を基礎とするもう一つ別のヒト化重鎖より由来の配列を含むpUC18プラスミドを基礎とするpUC18のHpaI−KpnI制限部位にライゲーションした。このプラスミドはシグナル配列[配列番号17]および残りの可変領域の配列を提供するものである。マッピングされた配列中の誤りは、変異原性プライマーとのPCRによるか、または現存する制限部位への合成リンカーの付加により訂正した。
IgG1イソ型から由来のヒト化重鎖は、配列番号19に示されるような合成重鎖可変領域を利用している。2B6重鎖CDRを含有するこの合成VHを前記したように設計して合成した。
キメラおよびヒト化2B6を発現するCHOの精製は、通常のタンパク質A(またはG)アフィニティークロマトグラフィーに付し、つづいてイオン交換およびモレキュラーシーブクロマトグラフィーに付すことにより行うことができる。幸運にも同様の方法を他のmAb(例えば、呼吸シンシチウムウイルス、インターロイキン−4およびマラリアサーカムスポロゾイト抗原に対するmAb)を>95%の純度で精製するのに用いた。
プラスミドpCDIL5HZHC1.0[配列番号49]を得る場合、フレームワーク位置73のトレオニンの代わりにアスパラギンを用いる発現プラスミドpCDIL5HZHC1.1を調製した。これは、EcoRVおよびXhoI末端[配列番号51および配列番号52]を有する合成リンカーを同様に消化されたpCDIL5HZHC1.0にライゲーションすることにより行った。同様に、発現プラスミドpCDIL5HZHC1.2はフレームワーク37のバリンの代わりにイソロイシンを用いる。これはHpaIおよびXbaI末端[配列番号53および配列番号54]を有する合成リンカーを同様に消化されたpCDIL5HZHC1.0にライゲーションすることにより行った。発現プラスミドpCDIL5HDHC1.3もまた、HpaIおよびXbaI末端[配列番号53および配列番号54]を有する合成リンカーを同様に消化されたpCDIL5HZHC1.1にライゲーションすることにより調製された。
ネズミmAb2B6重鎖可変領域のアミノ酸番号9−104(KABAT番号表示)をコードするDNAを、2B6ハイブリドーマ細胞系より得られたcDNA(実施例4を参照のこと)のpGEM7Zf+を基礎とするPCRクローン由来のAvaII−StyI制限フラグメントとして単離した。このフラグメントを4つの小型合成オリゴマーリンカー[配列番号35および36][配列番号37および38]と一緒にBstX1−HindIIIで消化したpUC18を基礎とするプラスミドに組み合わせることにより、フランキング重鎖可変領域の配列およびシグナル配列[配列番号17]を得た。、密接に関連したネズミ重鎖より推定したN−末端アミノ酸のコンセンサスを最初の8個のVH残基に帰属させ、配列番号35および36内でコードした。2B6重鎖の最初の15個のN−末端アミノ酸を配列決定することにより、重鎖の推定アミノ酸配列を確認した。
A.ELISA
以下の抗体:24G9(非中和)、4A6(中和)および2B6(中和)を、2ng/ml−32ng/mlの間の濃度で評価した。
(1)mAbをBIAcoreチップに固定した(実施例2Dを参照のこと)。5μl/分の流速でhIL−5(25μl)を4A6表面上に通した。ついで、IL−5レセプターα鎖(25μl中15、30、60、120nM)を注入した。4A6/IL−5複合体への結合におけるIL−5レセプターα鎖(Ra)の動態は、Kon=6.3x105(/M/s);Koff=2.3x10−3(/s)として計算することができる。IL−5−IL−5Pαの相互作用についての動態はKon=7.5x105(/M/s);Koff=2.8x10−3(/s)である。かくして、mAb 4A6はIL−5とIL−5レセプターα鎖の間の相互作用に対して有意な作用を付与しない。
14時間経過後(20℃)、沈降速度によりhIL−5、mAb 4A6および可溶性IL−5レセプターα鎖の3成分混合物を分析した。可溶性IL−5レセプターα鎖/hIL−5/mAb複合体と同じ大きさに相当する複合体が観察された。
Claims (4)
- アレルギー反応、アトピー反応、アレルギー性鼻炎、喘息、慢性好酸球性肺炎、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、小児脂肪便症、好酸球性胃腸炎、チャーグ・ストラウス症候群、好酸球性筋痛症候群、過好酸球性症候群、偶発性血管性浮腫を含む浮腫性反応、蠕虫感染、オンコセルカ皮膚炎およびアトピー性皮膚炎の群から選択される好酸球産生過多に伴う症状を治療するための医薬の製造における、ヒトIL−5のヒトIL−5レセプターα鎖への結合を遮断しない、ヒトIL−5についての中和モノクローナル抗体である、ヒトIL−5およびIL−5/IL−5レセプターα鎖複合体と結合し、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC)受入番号HB11943を有するハイブリドーマ細胞系により産生される抗体の使用。
- 好酸球産生過多に伴う症状が喘息である請求項1記載の使用。
- 好酸球産生過多に伴う症状がアレルギー性鼻炎である請求項1記載の使用。
- 好酸球産生過多に伴う症状が過好酸球性症候群である請求項1記載の使用。
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