DD260515A1 - Verfahren zur herstellung von agglutinierenden monoklonalen antikoerpern gegen menschliche a-erythrozyten - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von agglutinierenden monoklonalen Antikoerpern gegen menschliche Erythrozyten des Blutgruppenmerkmals A. Ziel der Erfindung ist es, diese monoklonalen Antikoerper von hoher Spezifitaet und Reaktivitaet in leicht beherrschbarer Weise und kostenguenstig in groesseren Mengen herzustellen, um menschliche Erythrozyten des Blutgruppenmerkmals A zu typisieren. Das erfindungsgemaesse Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass das in an sich bekannter Weise gewonnene Hybridom Sifin mAK Anti-A-1 (21 III 5/E 10) zur Herstellung der mAK in Zellkultur oder nach Transplantation in der Aszitesform in Maeuse eingesetzt wird. Anwendungsgebiet der Erfindung ist die medizinische Diagnostik, speziell die Blutgruppenserologie.
Description
Die erfindungsgemäß hergestellten mAK reagieren spezifisch mit den Erythrozyten der Blutspendemerkmale A1, A2, A1B und A2B, jedoch nicht mit 0 und B. Sie erfüllen bzw. übertreffen die im Arzneibuch der DDR gestellten Forderungen an ein Blutgruppentestserum „Anti A".
Die Isotypcharakterisierung ergab, daß alle Subklone dieser Linie vom IgM-Typ waren. Unter Screeningbedingungen durchgeführte Vergleiche belegen, daß bei der Bestimmung des Titers eine Überlegenheit gegenüber einem polyklonalen menschlichen Anti A-Testserum (Sifin) bzw. gleiche oder höhere Verdünnungen gegenüber einem monoklonalen Anti A-Testserum (Seraclone, Fi. Biotest-Serum-Institut GmbH, Frankfurt (BRD) ermittelt wurden (Tab. 1).
Bestimmung des Titers von Zellkulturüberständen der Linie Sifin mAK Anti A-1 im Vergleich zu zwei kommerziellen Blutgruppentestseren „Anti A"
A1 | 2 | 3 | A2 | 512 | Blutgruppenmerkmal*1 A1B | 2 | 512 | A5 | >B | 2 | 32 | 3 | 32 | |
Testserum „Anti A" sifin | 1*2 | 1024 | 2048 | 1 | 2 3 1 | 1 | ||||||||
Charge: 13611 85 | 2 048 | 256 256 256 | 32 | |||||||||||
Testserum „Anti A"
seraclone
Biotest
Charge: 121055 | 4096 | 1024 | 4096 | 512 | 1024 | 2 048 | 512 | 4096 | 512 | 1024 | 1024 |
Zellkulturüberstand Sifin mAK Anti A-1 | 4096 | 1024 | 4096 | 2 048 | 1024 | 2 048 | 2 048 | 4 096 | 1024 | 2048 | 2 048 |
Testbedingungen: DerTestwurdefüralleAntiseren simultan durchgeführt.
DieTestseren wurden in Mikrotestplatten zu gleichen Volumina verdünnt und mit identischen Volumina von 1-2%igen in physiologischer NaCI-Lösung gewaschenen Erythrozyten vermischt. Reaktionszeit: 20 min/23°C
*1 Keine Reaktion mit den Blutgruppenmerkmalen B und 0
*2 1 ...SunterschiedlicheSpendererythrozyten
1) Milzzellen von Balb/c-Mäusen, die mit mindestens 4 Applikationen von menschlichen ArErythrozyten immunisiert worden waren, wurden nach den üblichen Techniken mit P30/1 Myelomzellen fusioniert. Die Zellsuspension wurde in HAT-Selektiomedium (RPM11640 supplementiert mit 20% fetalem Kälberserum, 2mM/l Glutamin, 2g/l Natriumbicarbonat, 10mMol/l Hepes, 240JE/ml Penicillin, 150μg/ml streptomycin, 4 χ 10~7 Mol/l Aminopterin, 1 χ 10~4 Hypoxanthin, 1,6x 10~5 Mol/l Thymikin) unter Zusatz von 1 χ 10s Maus-Peritonealexsudatzellen/ml 7-10 Tage bei 370C in einer wassergesättigten 5—6%igen CO2-Atmosphäre inkubiert.
2) Die Selektion antikörper-produzierender Klone wurde simultan mit dem Mediumwechsel durchgeführt. Unter sterilen Bedingungen wurde die Hälfte des Zellkulturüberstandes aus den Vertiefungen der Mikrotestplatte entnommen und in getrennten Agglutinations-Mikrotestplatten identischer Abmessung, mit gewaschenen menschiichen Testerythrozyten der Blutgruppen A17A^A1B1A2B, B und 0 in Kontakt gebracht. Aus den Vertiefungen derZellkulturmikrotestpiatte, deren Überstände eine spezifische Agglutination hervorriefen, wurden Hybridzellklone isoliert und separat in Kultur geführt. Nach Bestätigung der Spezifitätsreaktion wurden sowohl Kryokonserven als auch Reklonierungen nach bekannten Methoden angelegt, in deren Ergebnis nach dem Agglutinationstiter selektiert wurde.
3) Das Hybridom SIFlN mAK Anti A-1 (21 III 5/E 10), dessen in den Zellkulturüberstand sezernierte monoklonale Antikörper die im Arzneibuch der DDR an ein Blutgruppentestserum „Anti A" festgelegten Forderungen für die Höhe des Titers und der Avidität mit A1, A2, A1B und A2B Erythrozytensuspensionen erfüllen bzw. übertreffen, kann mit den bekannten Zellkulturtechniken vermehrt und die Kulturüberstände einschlägig gewonnen werden. Die Spezifität wurde an mehr als 50 Spendererythrozyten je Blutgruppenmerkmal A11A21A1B1A2B, B .nd 0 überprüft.
4) Eine Produktion der genannten Antikörper durch Vermehrung der Hybridomzeilen als Aszites-Tumor in Paraffin-stimulierten Balb/c-Mäusen wies für 15 eingesetzte Tiere eine 100%ige Aszites-Tumorangehrate auf.
Claims (1)
- Verfahren zur Herstellung von agglutinierenden monoklonalen Antikörpern gegen menschliche A-Erythrozyten durch Immunisierung von Balb/c-Mäusen mit menschlichen A-Erythrozyten, Fusion ihrer Milzzellen mit Mausmyelomzellen.der Linie P30/1, Selektion der spezifischen agglutinierenden antikörperbildenden Hybride, deren Klonierung und Kultivierung bzw. Transplantation in der Aszitesform in Mäuse, dadurch gekennzeichnet, daß zur Kultivierung bzw. Transplantation der Klon SIFIN mAK „Anti-A-1 (21 III 5/E 10)" eingesetzt wird.Anwendungsgebiet der ErfindungDie Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern, die humane Erythrozyten der Blutgruppe A spezifisch agglutinieren. Das Anwendungsgebiet ist die Typisierung von Erythrozyten der Blutgruppe A in der Blutgruppenserologie von Blutspende- und Transfusionseinrichtungen, klinischen- und gerichtsmedizinischen Laboratorien.Charakteristik der bekannten technischen LösungenDie Kenntnis der Blutgruppe eines Menschen ist eine unabdingbare Voraussetzung für die Ausführung von Bluttransfusionen und Transplantationen. Im klassischen ABO-Blutgruppensystem werden die Merkmale 0, A, B und AB unterschieden. Die Merkmale sind unter anderem auf der äußeren Membran von menschlichen Erythrozyten vorhanden und können von menschlichen Serumantikörpern agglutiniert werden. Zur Vermeidung von Unverträglichkeitsreaktionen bei Bluttransfusionen und Transplantationen werden die Blutgruppenmerkmale durch Antiseren ermittelt. Blutgruppentestseren bestehen aus besonders ausgewählten menschlichen Seren, deren Reaktionsparameter mit Erythrozyten den jeweiligen gesetzlichen Bestimmungen (z. B. Arzneibuch der DDR) gerecht werden müssen. In der Regel werden sie von freiwilligen, mit der jeweiligen Blutgruppensubstanz immunisierten Spendern gewonnen. Jedes für diese Zwecke gewonnene Serum wird selbst bei gleichen Spendern graduelle Unterschiedein der Avidität und im Titer aufweisen. Die Eignung für einen Testserumpool muß überprüft werden. Eine exakte Reproduzierbarkeit der Herstellung derartiger Testseren ist nicht gegeben.Im Gegensatz dazu lassen sich mit Hilfe der von KÖHLER und MILSTEIN (Nature 256 [1975] 495) entwickelten Hybridantechnologie spezifische, gegen menschliche Blutgruppenmerkmale gerichtete monoklonale Antikörper produzierende Hybridomzellinien etablieren. In der Literatur sind bereits monoklonale Antikörper dieser Spezifität beschrieben (VOAK et. al. Vox Sang. 39, [1980], 13, MOORE et. al. Develop, biol. standard. 57, [1984], 49, MESSETER et. al. Biotest Bulletin 1, [1983], 308). Diese permanent kultivierbaren Zellinien sezernieren die Antikörper in das Zellkulturmedium, das die Grundlage für einen diagnostischen Einsatz bildet. Die Literaturdaten lassen sich wegen Nichtverfügbarkeit der jeweiligen Ausgangsmaterialien nicht reproduzieren bzw. überprüfen.Ziel der ErfindungDie Erfindung hat das Ziel, agglutinierende monoklonale Antikörper gegen menschliche Erythrozyten mit dem Blutgruppenmerkmal A zur Verfügung zu stellen. Sie sollen durch Zellkultivierung gewonnen werden und in ihren Reaktionsparametern die gesetzlichen Forderungen des Arzneibuches der DDR erfüllen.Darlegung des Wesens der ErfindungDas erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von agglutinierenden monoklonalen Antikörpern ist dadurch gekennzeichnet, daß zunächst in an sich bekannter Weise 6—10 Wochen alte weibliche Balb/c-Mäuse mit gewaschenen humanen A-pErythrozyten in mehreren Applikationsstufen sowohl intraperitoneal als auch intravenös immunisiert werden. Die Lymphozyten werden aus den Milzen der immunisierten Mäuse isoliert, mit P30-/1 Myelomzellen fusioniert und die Zellsuspension in Selektionsmedium (Littlefield, Science 145 [1964] 709) kultiviert. Simultan mit dem Mediumwechsel werden die Zellkulturüberstände der Mikrotestplatten auf Anwesenheit agglutinierender Antikörper gegen humane Testerythrozyten überprüft. Aus den Vertiefungen der Mikrotestplatten, die eine positive Reaktion aufweisen, werden Hybridzellklone isoliert und separat in der Zellkultur geführt. Nach beständiger spezifischer Agglutionsreaktion, Kryokonservierung und nach Reklonierung werden die Subklone nach spezifischer Wirkung, Titer und Avidität bewertet. Unter den derart stabilisierten Hybridomen wurde auch eine Zellinie etabliert, die monoklonale Antikörper in dasZellkulturmediumsezerniertund unter der Nomenklatur 21 III 5/E lOoderSifin mAK-Anti A-1 im Staatlichen Institut für Immunpräparate und Nährmedien hinterlegt wurde. Diese Zellinie wird erfindungsgemäß zur Produktion der mAK in der Zellkultur eingesetzt, wobei eine stabile Produktion über einen längeren Zeitraum ohne Veränderung der Antikörperbildungsraten möglich ist. Die Produktion der mAK ist gleichermaßen auch nach Transplantation in der Aszitesform in Mäuse möglich.
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Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DD29059786A DD260515B5 (de) | 1986-05-26 | 1986-05-26 | Verfahren zur Herstellung von agglutinierenden monoklonalen Antikoerpern gegen menschliche A-Erythrozyten |
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Publications (2)
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DD260515A1 true DD260515A1 (de) | 1988-09-28 |
DD260515B5 DD260515B5 (de) | 1994-06-09 |
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DD29059786A DD260515B5 (de) | 1986-05-26 | 1986-05-26 | Verfahren zur Herstellung von agglutinierenden monoklonalen Antikoerpern gegen menschliche A-Erythrozyten |
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DD (1) | DD260515B5 (de) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0948356B1 (de) * | 1996-12-18 | 2006-03-22 | Forschungszentrum Karlsruhe GmbH | Mittel zur identifizierung und therapie metastasierender tumore |
-
1986
- 1986-05-26 DD DD29059786A patent/DD260515B5/de not_active IP Right Cessation
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EP0948356B1 (de) * | 1996-12-18 | 2006-03-22 | Forschungszentrum Karlsruhe GmbH | Mittel zur identifizierung und therapie metastasierender tumore |
Also Published As
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DD260515B5 (de) | 1994-06-09 |
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