BESCHREIBUNG
Die Erfindung betrifft (Mäuse-Menschen)-Menschen Hybridoma Zell-Linien.
Hybridoma werden Zellen genannt, die durch Fusionierung einer immortalisierten Zelle (insbesondere einer Myelomazelle) mit einer normalen nichttransformierten Zelle, die normalerweise wegen ihrer Fähigkeit, eine bestimmte Substanz (z.B. eine Lymphozytenzelle zur Herstellung von Antikörpern) zu produzieren, ausgewählt wird, zu einem Hybrid entstehen. Diese Hybride können selektioniert und geklont werden, um so Zell-Linien zu erhalten, die Stoffe mit bestimmter Struktur und/oder Eigenschaft produzieren. Insbesondere können mit Lymphozyten gebildete Hybridomas zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern verwendet werden.
Die Entwicklung der Hybridomatechnologie der letzten Jahre konzentrierte sich auf die Herstellung von Zell-Linien, die sowohl stabil sind wie auch eine hohe und spezifische Produktionskapazi tät tür bestimmte erwünschte Stoffe besitzen. Es gab verschiedene Lösungsversuche, die hauptsächlich im Gebiet Immunoglobuline/Antikörper konzentriert sind.
Das Studium früherer Aktivitäten auf diesem Gebiet gibt einen Überblick über die Probleme und bisherigen Lösungsversuche. Der ursprüngliche Anstoss zur Erforschung von Hybrid Zell Linien, die monoklonale Produkte erzeugen, kam aus dem Gebiet der Immunbiologie.
Konventionelle Antisera enthalten normalerweise eine grosse Zahl von Antikörpern, die alle mit dem gleichen Antigen aufgrund ihrer unterschiedlichen Aminosäuresequenz im Bereich der Bindungsstelle mit mehr oder weniger hoher Affinität reagieren.
Darüber hinaus enthalten sie eine grosse Menge von Antikörpern gegen Antigene, die die früheren Erfahrungen des Individuums, in dem das Antiserum produziert wurde, wiedergeben. Für die meisten Verwendungszwecke sind solche Antisera sicherlich ausreichend, aber neuere Entwicklungen der Wissenschaft machen höhere Anforderungen bezüglich Spezifität und Reproduzierbarkeit notwendig.
Eine elegante, inzwischen bereits klassische Lösung wurde von Köhler und Milstein (Nature, 256/495497 [1975]) beschrieben, die Mäuse-Milz-Lymphozyten von immunisierten Tieren mit drug -sensitiven Mäuse-Myelom-Zellen erfolgreich fusionierten.
Es gelang, die durch Fusion immortalisierten Zellen in vitro zu klonen und zu züchten, d.h. es wurde eine homogene Zellpopulation (monoklonale Antikörper) erhalten, die eine homogene antikörperpopulation produzierte. Durch entsprechende Selektion dieser Zellklone aus den erhaltenen vielen Einzelzellklonen konnten diejenigen Zellen weitergezüchtet werden, welche einen Antikörper mit der gewünschten Antigenspezifität sezernieren.
Die auf diese Weise hergestellten Mäuseantikörper sind in Forschungs- und Diagnostikaanwendungen ausserordentlich wichtig, und einige werden bereits therapeutisch am Menschen untersucht. Es würde jedoch einen wesentlichen Fortschritt für die humane Immunglobulintherapie bedeuten, wenn auch menschliche Antikörper mit ähnlich guter Reproduzierbarkeit und Spezifi tät in dieser Art erhalten werden könnten. Damit würde der Gefahr einer Sensibilisierung vorgebeugt. Einige Versuche, das Problem der Herstellung menschlicher Antikörper in vitro zu lösen, wurden bereits unternommen, bisher jedoch ohne Erfolg.
1. Die Transformation von normalen menschlichen Lymphozyten mit Epstein-Barr-Virus (EBV) ist nicht sehr erfolgreich, da der Prozess sehr langwierig ist und auch das Klonen und Selektionieren sich sehr schwierig gestaltet.
2. Fusionierung von normalen (humanen) Lymphozyten mit menschlichen Myelomzellen scheint die naheliegende Analogie zum Mäuse-Verfahren darzustellen. Das Problem dabei besteht jedoch darin, dass im menschlichen System nur eine einzige Myelom-Zell-Linie existiert und diese Zell-Linie weltweit mykoplasmakontaminiert ist (Mykoplasmen verhindern eine erfolgreiche Fusionierung).
3. Die Fusionierung von normalen (humanen) Lymphozyten mit einer EBV-transformierten menschlichen Lymphoblastoid B-Zell-Linie ist wahrscheinlich das zuverlässigste und reproduzierbarste Verfahren, das bisher beschrieben wurde. Es leidet jedoch an den grundlegenden In-vitro-Charakteristika der Lymphoblastoid-Zellen: sie sind sehr schwer zu klonen und, da sie ein früheres Stadium in der B-Zellen-Differenzierung darstellen, ist die Kapazität der Hybride, Antikörper zu produzieren und zu sezernieren, etwa zehnmal geringer als für eine richtige Myelomzelle.
4. Die Fusionierung von menschlichen Lymphozyten mit Mäuse-Myeloma bringt Zellen mit den gleichen ausgezeichneten In-vitro-Charakteristika wie die Mäuse-Hybridomas hervor, jedoch mit dem grossen Nachteil, dass Mäuse-Menschen-Hybride genetisch unstabil sind. In diesem Zusammenhang ist es speziell nachteilig, dass sie das menschliche Chromosom, das die Information für die Synthese der leichten Kappa-Ketten des Immunglobulin-Moleküls trägt, ausstösst.
Zusammenfassend kann gesagt werden, dass Methode 1 zu schwierig und zu wenig effizient für praktische Zwecke ist. Verfahren 2 hat bisher keine praktische Bedeutung erlangt. Methode 3 ist die bisher beste, während bei Methode 4 auch bei sorglältig- stem Klonen die Produktivität nicht erhalten werden kann.
Zwar konzentrierten sich bisherige Arbeiten meist auf Antikörperproduktion, jedoch kann selbstverständlich der produktive Zellpartner so gewählt werden, dass er einen bestimmten gewünschten Stoff ausscheidet, und mit der immortalisierten Zelle fusioniert wird.
Wir haben gefunden, dass bei Verwendung einer xenogenetischen Hybridoma als Ausgangszelle für eine weitere Fusion mit einer anderen Zelle eine Hybridoma mit stark verbesserter Stabili tät erhalten werden kann.
Es werden Hybridoma Zell-Linien erzeugt durch Fusion einer immortalisierten Zelle mit einer Zelle, die einen bestimmten Stoff produziert.
Die immortalisierte Zelle ist eine xenogenetische Hybridoma Zelle und die stoffproduzierende Zelle ist genetisch verträglich mit dem nichttransformierten Partner in der xenogenetischen Hybridoma.
Die Stabilität solcher Zell-Linien liegt in ihrer Fähigkeit, bei korrekter Kultivierung die Produktion eines bestimmten Stoffes, z.B. eines Antikörpers, zu erhalten.
Vorzugsweise ist die als immortalisierte Zelle gewählte xenogenetische Hybridoma Zelle ein Myelomahybrid, das ihre eigene Fähigkeit zur Produktion von Immunoglobulin verloren hat. Ein Beispiel einer solchen xenogenetischen Hybridoma Zelle ist die einer Myelomazelle mit einer Lymphozyten-Zelle. Geeignete Myelomazellen können von Ratten oder Mäusen erkalten werden und erzeugen vorzugsweise kein Immunoglobulin. Diese Myeloma können ihrerseits wieder Hybride sein (z.B. Mäusemyeloma/Mäuselymphozyten). So eine Zelle ist z.B. die SP-2-Zell Linie. Diese wird dann fusioniert, z.B. mit einer Lymphozyten Zelle einer anderen Spezies, z.B. einer humanen Lymphozyten Zelle.
Vorzugsweise werden für die weitere Fusionierung mit einer stoffproduzierenden Zelle aus solchen Fusionierungen resultierende xenogenetische Zellen ausgewählt, die nicht mehr Immunoglobulin produzieren. Diese xenogenetischen Hybridomas stellen eine freundlichere Umgebung für weitere Stabilität hinsichtlich des Verlustes an Chromosomen dar. Die für die Immortalisierung verwendeten xenogenetischen Hybridomas werden vor weiterer Fusionierung nach bekannten Methoden drug -resistent gemacht, beispielsweise durch Selektion auf 8-Azaguaninresistenz.
Die so erhaltenen Hybridomas stellen stabile Ausgangszellen für weitere Fusionierungen dar. Der andere Fusionspartner wird entsprechend seiner Fähigkeit zur Produktion bestimmter Stoffe ausgewählt, beispielsweise ein Lymphozyt zur Herstellung von Antikörper, und ist genetisch verträglich mit dem nichttransformierten Partner im xenogenetischen Hybridoma.
Um den erforderlichen Spezifitätsgrad zu erhalten, ist es vorteilhaft, die ausgewählte Zelle vorzusensitivieren. Dies kann im Falle der Antikörper durch Immunisierung des Gastkörpers mit einem bestimmten Antigen und anschliessende Gewinnung der Immunozyten (das sind Zellen, die immunologisch kompetent sind), die den entsprechenden Antikörper produzieren, geschehen. Dafür sind z.B. Milz-, Lymphknoten- oder Blutzellen verwendbar.
Die Fusionierung der xenogenetischen Hybridoma Zelle mit der stoffproduzierenden Zelle wird nach an sich bekannten Methoden durchgeführt, beispielsweise durch Inkubation der Zellen in einem geeigneten Medium mit einer die Fusion fördernden Substanz (z.B. PEG 1500). Die Selektion der gewünschten Hybride wird ebenfalls nach bekannten Methoden durchgeführt, beispielsweise in selektiven Medien (z.B. im HAT-Medium [Hypoxanthin/Aminopterin/Thymidin], wenn die immortalisierte Zelle keine Hypoxanthin-Phosphoribosyl-Transferase enthält).
Die erhaltenen Zell-Linien sind stabil und produzieren Antikörper hoher Ausbeute. Sie können auch, falls erwünscht, geklont und reselektioniert werden.
Man stellt solche Hybridoma Zell-Linien her, indem man eine xenogenetische Hybridoma Zelle drug -resistent macht, sie dann mit einer stoffproduzierenden Zelle, die genetisch mit dem nichttransformierten Partner der xenogenetischen Hybridoma kompatibel ist, fusioniert und das gewünschte Hybrid selektioniert.
Die Antikörperproduktion, unter Verwendung solcher Zellen, kann nach bekannten Methoden, entweder in vitro, unter Verwendung geeigneter Medien (z.B. mit einem Gehalt an verdünntem fötalem Kälberserum) oder in vivo durch Injektion in einem Gastkörper (z.B. nackte oder athymische Mäuse oder Ratten) durchgeführt werden. Je nach Methode können ein oder mehrere Reinigungsstufen notwendig sein.
Obwohl selbstverständlich aus ökonomischen Gründen die Verwendung einfacher Hybridoma Zell-Linien bevorzugt ist, können diese Zell-Linien, falls erwünscht, weiter fusioniert werden.
Eine erfindungsgemässe, antikörperproduzierende Hybri doma wird durch Fusion einer Mäuse-Myeloma mit einem humanen Lymphozyten und anschliessende Fusion mit einer vorsensitivierten humanen Lymphozyten Zelle als Antikörperproduzenten erhalten. Die Myelomazellen können, falls erwünscht, ihrerseits
Hybride sein (z.B. die SP-2-Mäuse-Zell-Linie, die ein Maus
Maus-Hybrid darstellt).
In den folgenden Literaturstellen werden beispielsweise sol che Methoden beschrieben:
1. Köhler, G., und Milstein, C.: Nature, 256, 495-497 (1975)
2. Nadler, L.M. et al.: Cancer Research, 40, 3147-3154 (1980)
3. Cosimi, A.B. et al.: N. Engl. J. Med., 305, 308-314 (1981)
4. Zurawski, V.R. et al.: Science, 199, 1439-1441 (1978)
5. Koskimies, S.: Scand. J. Immunol., 11, 73-77 (1980)
6. Steinitz, M. et al.: Nature, 287, 443-445 (1980)
7. Olsson, L., und Kaplan, H.S.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77,
5429-5431 (1980)
8. Croce, C.M. et al.: Nature, 288, 488-489 (1980)
9. Nowinski, R. et al.: Science, 210, 537-539 (1980) 10. Croce, C.M. et al.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 3416-3419 (1979) 11. Galfre, G. et al.: Nature, 266, 550 (1977) 12. Miller, R.A. etal.: N. Engl. J.
Med., 306, 517 (1982) 13. Sikora, K., et al.: Lancet, ill (1982) und z.B. US-PS 4 172 124,
EP Anm. Pub. Nr. 0043 718 und 0044 722 und das kürzlich erschienene Buch über monoklonale Antikörper von McIntyre.
Man kann durch Verwendung einer xenogenetischen Fusionierungsausgangszelle (die ihre Fähigkeit zur Produktion bestimmter Stoffe verloren hat) stabile, rasch wachsende, leicht klonbare und den gewünschten Stoff(z.B. humane Antikörper) mit hoher Ausbeute produzierende Hybridomas erhalten.
Die hergestellten humanen Antikörper können zur Bekämpfung der verschiedensten Erkrankungen eingesetzt werden. Beispielsweise sind sie verwendbar bei Infektionserkrankungen viralen (z.B. Cytomegalo-, Varicella-Zoster-, Herpes simplex-, Hepatitis A und B-, Rubella Virus usw.), bakteriellen (Antitoxine, Antizellwand) oder fungalen (z.B. Candida) Ursprungs. Weiters bei der Bekämpfung aller bösartiger Tumore (mit oder ohne Konjugation an Toxine) sowie von Vergiftungen (Gegengift Antikörper bei Digitalis-, Opiat-, tricyclischen Antidepressant- oder Barbiturat Vergiftungen).
Weitere Anwendungsgebiete sind: Autoimmunerkrankungen (über anti-idiotypische Antikörper-Therapie wie antiantipankreatische -Zellen, anti-anti-Acetylcholinrezeptor, Antirheumatischer Faktor), Blutgruppenantigene (Anti-Rh), Transplantationen (Anti-T-Zell- Behandlung von Abstossungen; Erhöhung der Antikörper zum Herabsetzen der stimulierenden Aktivität des Transplantats), Allergin (IgG Antikörper zu Allergenen, Alternative zu Hyposensitation) und Chorionische Gonadotropoin Antikörper als Kontrazeptiv. Die Hybridoma Zellen können auch als Quelle für mRNA durch Klonen von Immunglobuligenen verwendet werden.
Insbesondere werden (Mäuse-Menschen)-Menschen-Hybridome hergestellt. Die SP-2-Zell-Linie, ursprünglich ein Hybridom zwischen der P3-X63-Ag8-Linie und Mäuse-Milz-Zellen, die Antikörper gegen rote Schafblutzellen bilden, ist bekannt (M.
Shulmann et al., Nature 276/269 [1978]) und besitzt keine Fähigkeit zur Bildung von Antikörpern. Sie wird mit normalen menschlichen peripheren Lymphozyten nach bekannten Verfahren, wie sie z.B. von G. Galfre et al., Nature 266/550 (1977) und R.
Nowinski et al., Science 210/537 (1980) beschrieben sind, fusioniert. Es wird eine grosse Anzahl von Hybriden erhalten, und nach ungefähr fünf Wochen werden fünf Klone selektioniert, die rasches Wachstum ohne Antikörperproduktion zeigen. Diese Zellen werden dann auf Resistenz gegen 8-Azaguanin selektioniert, und mit drei dieser Linien ist es möglich, Mutanten zu erhalten, die gegen 201lg/ml von 8-Azaguanin resistent sind. Diese Zellen sind dann sensitiv gegen Hypoxanthin-Aminopterin-Thymi din(HAT)-Medium, was zeigt, dass sie ihre Fähigkeit zur Erzeugung von Hypoxanthin-Phosphoribosyl-Transferase verloren haben.
Eine dieser Linien (SPAZ-4) wird dann in vitro mit menschlichen Tonsillarlymphozyten fusioniert. Für 108-Tonsillarzellen werden 2 x 107-Myelomzellen eingesetzt. Die Fusionierung wird nach Standardmethoden durchgeführt. Parallel dazu wird auch die SP-2-Zell-Linie fusioniert, um so die Möglichkeit eines Ver gleichs der beiden Zell-Linien zu erhalten. Die so erhaltenen Zell- populationen werden in HAT-Medium inkubiert, um Hybride zu selektionieren. Nachdem alle Zellen in den nichtfusionierten Kontrollkulturen abgestorben sind, wird das HAT-Medium durch ein normales, nicht selektives Wachstumsmedium ersetzt.
Nach zwei Wochen wird der erste Versuch zur Antikörperproduktion durchgeführt, wobei festgestellt wird, dass alle Kulturen aller Fusionierungen menschliche Antikörper produzieren. Vier Wochen später werden die Kulturen nochmals getestet. 83% der SPAZ-4-Hybridomas produzieren immer noch während nur 55% der SP-2-Hybridomas ihre Synthesefähigkeit behalten. Eine Produktion mit hoher Ausbeute wird für 28% der SPAZ-4-Linien, jedoch nur für 3% der SP-2-Linien gefunden.
Unter Berücksichtigung, dass der Verlust der Antikörpersekretion zum Grossteil durch den Verlust des Genoms, das für die leichten Ketten codiert, erklärt werden kann, wird ein spezifischer Test für die Produktion von leichten Ketten durchgeführt. Es wird gefunden, dass 67% der SPAZ-4-Zellen Kappa-Ketten und 88% Lambda-Ketten produzieren. Für SP-2 betragen diese Werte 39% bzw. 61% (es muss dabei darauf hingewiesen werden, dass diese prozentuellen Angaben nur innerhalb jedes einzelnen Experiments und nur für jede einzelne Art von Immunglobulinproduktion vergleichbar sind). Die Ergebnisse sind in der Tabelle 1 zusammengefasst. Es kann aus der Tabelle entnommen werden, dass SPAZ-4 in allen Fällen SP-2 überlegen ist, speziell wenn man die Werte für eine starke Produktion betrachtet, welche allein von praktischer Bedeutung sind.
Alle diese Versuche werden mit nicht geklonten Zellen durchgeführt, um so den Selektivdruck gegen die stabilen Klone zu maximieren (die stabilen Klone tragen mehr genetisches Material und wachsen immer weniger gut als Zellen, die ihre unnötigen Chromosome bereits ausgestossen haben).
Weiters werden Versuche durchgeführt, auch diese Zellen zu klonen. Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass kein einziges stabiles und produzierendes SP-2-Hybrid erhalten wird (dies wird aus der Abwesenheit von Linien geschlossen, wo alle Kulturen, die Wachstum zeigen, auch Antikörperproduktion besitzen). In der SPAZ-4-Linie werden dagegen einige Klone erhalten, die diese Kriterien erfüllen.
Das hier beschriebene Verfahren ist substantiell besser als die literaturbekannten Methoden, da das Instabilitätsproblem gelöst ist. Es muss dabei auch noch darauf hingewiesen werden, dass auch die konventionellen Maus-Maus-Hybridome nicht sehr stabil sind und auch langwieriges Subklonieren immer notwendig ist.
Das Ausmass der Instabilität von SPAZ-4-Hybridomas liegt etwa in der gleichen Grössenordnung wie die der Maus-Maus-Hybridome, das heisst, dass das Arbeiten mit ihnen praktikabel ist.
In den nachfolgenden Beispielen, die die Erfindung näher erläutern, ihren Umfang aber in keiner Weise einschränken sollen, erfolgen alle Temperaturangaben in Celsiusgraden.
Beispiel 1: Herstellung der SPAZ4 Zell-Lnie
Aus dem Heparinblut eines gesunden Donors werden periphere-Blutlymphozyten (PBL's) mittels Zentrifugation über Ficoll-Isopaque isoliert. Nach dem Waschen werden 108-PBL's mit 5 x 107-SP-2-Zellen in 50 ml Dulbeccos H21-Medium, eingesellt auf pH 8, gemischt. Die Zellen werden 5 Minuten bei 600 upm zusammen pellettiert und der Überstand sorgfältig entfernt.
Bei 37 wird 1 ml von 50% PEG 4000 in H21-Medium langsam im Verlauf von einer Minute zugegeben. Weitere 10 ml von H2 1-Medium werden dann während 2 Minuten zugemischt. Die Zellen werden dann pellettiert und in 55 ml HAT-Medium suspendiert (HAT: Dulbeccos H21 mit 20% fötalem Kälberserum (FCS), 10% NCJC 109, 1% nicht essentielle Aminosäuren, 0,5% Pyruvat, 0,2 U/ml Insulin, 1 mM Oxalessigsäure, 104 M Hypoxanthin, 4 x 10-7 M Aminopterin und 1,6 x 10-3 M Thymidin).
Anschliessend wird die Suspension aufgeteilt in 528 0,1 ml Kulturen in Flach-Boden Mikrotiter Gewebekultur-Platten. Frisches
HAT-Medium wird alle 3 bis 5 Tage zwei Wochen lang zugegeben, danach wird zu HT-Medium (Dulbecco H21 mit 10% FCS, 104 M Hypoxanthin und 1,6 x 10 M Thymidin) gewechselt.
Nach dem 15. Tag werden Proben aus den Überständen für den Test auf Produktion von humanen Antikörpern entnommen.
Fünf Kulturen zeigen gutes Wachstum ohne Antikörperbildung.
Diese werden für die Weiterentwicklung von 8-Azaguanin-resistenten Sublinien verwendet.
Von diesen fünf Zell-Linien werden jeweils 2 x 105-Zellen/ml in Dulbeccos H2 1-Medium mit 1% FCS und 20 g/rnl 8-Azaguanin inkubiert. Aus dreien dieser Kulturen ist es möglich, nach wenigen Wochen resistente Zellklone zu isolieren. Mit einem dieser HAT-sensitiven Klone, der SPAZ-4-Zell-Linie, werden die weiteren Versuche durchgeführt.
Beispiel 2: Fusion mit Lymphozyten aus Tonsillen
Aus den Tonsillen eines Kindes wird eine Einzelzellsuspension präpariert und die Lymphozyten über Ficoll-Hypaque-Fraktionierung gewonnen. Von dieser Zellpopulation werden 108-Zellen mit 2 x 107-SPAZ-4- oder SP-2-Zellen nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren fusioniert. Die Zellen werden dann auf 47 0,5 ml Kulturen in HAT-Medium verteilt, die in diesem Fall zusätzlich mit 0,5 Ag/ml Cyclosporin A supplementiert sind.
Nach einem Tag wird 1 ml HAT-Medium ohne Cyclosporin A zugegeben. Am dritten Tag wird 50% des Mediums durch HT Medium ausgetauscht. Medium-Wechsel mit HT-Medium wird dann alle 3 bis 5 Tage durchgeführt.
Test auf Immunglobulinproduktion
Für das Screening wird ein Elisa-System ( Enzym-linked Immunosorbend Assay ) verwendet. Kaninchen-antihuman-Immunglobulin wird auf Nunc-Elisa-Mikrotiterplatten in einer Verdünnung von 1:400 in einem Bikarbonat-Puffer pH 9,6 gebunden. Nach dem Waschen werden die Kulturüberstände für 30 Minuten bei 37 in diesen Platten inkubiert. Nach erneutem Waschen wird mit Peroxidase-Konjugaten Kaninchen-anti-human IgG, IgM, IgA Reagenz (Miles-Yeda) mit einer Verdünnung von 1:400 inkubiert. Nach erneutem Waschen wird die gebundene Konjugatmenge durch Reaktion mit 1,2-Phenylendiaminodihydrochlorid und H202 bestimmt.
Produktion von leichten Antikörper-Ketten wird mit einem analogen Test unter Verwendung eines Ziegen-anti-human-Lambda- oder Ziegen-anti-human-Kappa Peroxidase-Konjugats (Tago) bei einer Verdünnung von 1:3000 durchgeführt.
Die Extinktionen werden mit einem Titertek-Multiscan-Elisa Photometer bestimmt. Die Werte 4 bzw. 7 in der Tabelle beziehen sich auf schwache bzw. starke Extinktionswerte.
Beispiel 3: Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen Influenza Typ A und B (nach in vivo Immunisierung)
Als Influenzavakzine wird Sandovac, das Hämagglutinin und Neuraminidase von A/Bangkok, A/Brazil und B/Singapore enthält, an 3 Versuchspersonen verabreicht und dann am 3., 7., 10., 14., und 17. Tag jeweils 50 bis 60 ml Blut abgenommen. Die Lymphozyten werden durch Zentrifugieren an Ficoll-Paque (Pharmacia) gewonnen und zweimal mit Salzlösung gewaschen.
Für die Fusionierung werden eingesetzt: a) SPAZ-4, wie bereits in Beispiel 1 beschrieben b) SP-2, wie bereits beschrieben c) GM 1500: eine humane Lymphoblastoid-Zelle, resistent gegen 6-Azaguanin (produziert humanes IgG2, Kappa).
SPAZ-4 und SP-2 werden identisch fusioniert. Die Myeloma (107-Zellen) und die humanen Lymphozyten (etwa 3 x 107-Zellen) werden in Gegenwart von DMEM serumfreien Medium bei einem pH 8,0 in einem Teströhrchen gemischt und dann 5 Minu tefl mit 600 upm zentrifugiert. Das erhaltene Pellet wird 1 Minute mit 50% PEG 4000 behandelt und dann langsam mit Medium verdünnt. Nach einem Waschvorgang werden die Zellen auf 176 100 Fg Kulturen in DMEM-HAT-Medium, das 20% fötales Käl- berserum enthält, verteilt und bei 37 in einer feuchten CO2 Atmosphäre kultiviert.
Die GM-1500-Zellen (107-Zellen) werden mit den humanen Lymphozyten (etwa 3 x 107-Zellen) in serumfreiem DMEM Medium bei pH 8,0 gemischt und dann 5 Minuten mit 600 upm zentrifugiert. Das erhaltene Pellet wird 5 Minuten mit 50% PEG 6000 bei 600 upm zentrifugiert und dann langsam mit Medium verdünnt. Nach einem Waschvorgang werden die Zellen auf 176 100-p1-Kulturen in RPMI 1640-Medium, das 20% fötales Kälberserum enthält, verteilt und bei 37 in einer feuchten CO2-Atmosphäre gezüchtet.
Insgesamt werden 35 Fusionen (15 mit GM 1500, 14 mit SPAZ-4 und 6 mit SP-2) durchgeführt und so 6160 Kulturen (2640 mit GM 1500, 2464 mit SPAZ-4 und 1056 mit SP-2) erhalten. Die Medien werden entsprechend dem Zellwachstum etwa alle 3 bis 5 Tage gewechselt. Die Anwesenheit von Antiinfluenza Antikörpern im Überstand wird mittels einer Elisa-Methode nachgewiesen: Die entsprechenden Influenzaantigene werden auf Nunc-Mikrotiterplatten gebunden und der Überstand hinzugefügt. Nach dem Waschen wird mit Peroxidase-Konjugaten Kaninchen-anti-human IgG, IgA, IgM (Miles) zugefügt. Nach Inkubation wird ungebundenes Peroxidase-Konjugat weggewaschen und das gebundene Konjugat durch eine Farbreaktion sichtbar gemacht. Die Extinktionen werden mit einem Tlterex-Mikroplat- ten-Photometer bestimmt. Kulturen mit positivem Ergebnis werden geklont.
Dazu bringt man in 88 neue Kulturen je 1 Zelle/ Kultur in 100 FI DMEM mit 20% fötalem Kälberserum und Mäusethymocyten (bei Hybriden mit SPAZ-4 und SP-2) bzw. 100 111 RPMI 1640 mit 20% fötalem Kälberserum und MRC-5-Zellen (bei Hybriden mit GM 1500). Produktionszellen werden in grösserem Massstab gezüchtet und in flüssigem Stickstoff eingefroren.
Insgesamt werden 86 Kulturen (58 GM 1500, 26 SPAZ-4 und 2 SP-2) geklont, wobei die Auswahlkriterien nicht sehr streng sind. Dies bedingt die relativ niedrige Ausbeute an echt positiven Zellen. Vier positive Zellen von SPAZ-4, eine von SP-2 und keine von GM 1500 werden erhalten, wobei es sich bei der SP-2 nicht um ein Hybrid, sondern um eine spontane EB-virustransformierte Zelle handelt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefasst: Tag GM 1500 SPAZ-4 SP-2 fusion- positive fusion- positive fusion- positive ierte Kulturen ierte Kulturen ierte Kulturen
Kulturen Kulturen Kulturen
3 528 0 528 0 176 0
7 528 0 352 2 176 0 10 528 0 528 1 176 0 14 528 0 528 0 354 1 17 528 0 528 1 176 0 Sa: 2640 0 2464 4 1056 1
Die 5 positiven Zell-Linien werden einige Male weitergeklont und in grösserem Massstab gezüchtet.
Hierbei geht die EBV-Zell Linie zugrunde (es ist bekannt, dass solche Zellen Klonen bei niedriger Dichte nicht vertragen). Die vier positiven Klone wurden als C 15, C 28, C 29 und C 75 bezeichnet.
Beispiel 4: Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen Influenza (nach In-vitro-Immunisierung)
Je 2 ml humane Milzzellen (106/ml) werden in Falcon 2051 Röhrchen gegeben, wobei insgesamt 34 x 106-Zellen eingesetzt werden. Dann wird ein sucrosedichtegradientengereinigter A/ Bangkok-Virus zugesetzt und die Kulturen in RPMI 1640 Medium mit 5% humanen hitzeinaktivierten Plasma 101 Stunden bei 37 in einer Luftatmosphäre mit 5% CO2 gezüchtet. Die erhaltenen Zellen werden wie in Beispiel 3 beschrieben, mit SPAZ-4 fusioniert. Die Zellen werden dann in 176 Kulturen verteilt und im MEM-Medium (Dulbecco), das 20% fötales Kälberserum, HAT und 1 llg/ml Cyclosporin A enthält, gezüchtet. Nach 2 Tagen wird das HAT-Medium nach und nach durch HT Medium ersetzt. Die Kulturen werden am 12. und 19.
Tag nach Immunisierung auf Antiinfluenza-Antikörper untersucht und die positiven Zellen geklont. Es-wird eine positive Zell-Linie erhalten, 132.
Beispiel 5: Charakterisierung der humanen Antiinfluenza mono Monalen Antikörper 5.1 Antikörper C 15:
Es handelt sich um einen Antikörper der Klasse IgG1 mit einer leichten Kette des Typs Kappa. Der Antikörper reagiert mit allen untersuchten Influenza A Viren (H1N1, H2N2, H3N2) und ist höchstwahrscheinlich gegen das Nukleoprotein des Virus gerichtet; er besitzt keine neutralisierende Wirkung in vitro und keinen protektiven Effekt in vivo.
5.2 Antikörper C 28:
Es handelt sich um einen Antikörper der Klasse IgGI mit einer leichten Kette des Typs Lambda. Der Antikörper reagiert nur mit Influenza A Virus des Typs H3N2 und ist höchstwahrscheinlich gegen das Hämagglutinin des Virus gerichtet; er besitzt eine starke neutralisierende Wirkung in vitro und einen sehr starken protektiven Effekt in vivo. Er neutralisiert alle untersuchten H3N2-Virustypen, .13. die aus den Jahren 1968, 1969, 1973, 1974, 1975, 1977, 1979 und 1980.
Die Untersuchung von 1,5 mg/ml Antikörper C 28 mit 1973 A/Port. Chalmers an MDCK Zellen ergibt einen Neutralisationstiter von 12.800. Im gleichen Test gibt ein Standard Human Immunoglobulin von 60 mg/ml einen Neutralisationstiter von 50.
Das heisst, dass der monoklonale Antikörper C 28 bezogen auf den gleichen Proteingehalt 10.240fache Wirksamkeit aufweist.
Berücksichtigt man, dass Antiinfluenza-Antiltörper gegen den Subtyp H3N2 derzeit im Standard Human Immunglobulin relativ hohe Titer erreichen heisst das, dass Antikörper mit gleicher neutralisierender Wirkung, z.B. gegen Cytomegalo- oder Varicella Zoster-Virus, deren Antikörper in Standard Human Immunglobulinen in wesentlich geringerer Konzentration vorliegen, eine noch höhere relative Wirkungssteigerung ergeben.
5.3 Antikörper C 29:
Es handelt sich um einen Antikörper der Klasse IgGI mit einer leichten Kette des Typs Lambda. Der Antikörper reagiert mit Influenza B (8/Singapore) und besitzt keine Aktivität gegen Influenza A.
5.4 Antikörper C 75:
Es handelt sich um einen Antikörper der Klasse IgG3 mit einer leichten Kette des Typs Kappa. Der Antikörper reagiert nur mit Influenza A Virus des Typs H3N2 und ist höchstwahrscheinlich gegen das Hämagglutinin des Virus gerichtet; er besitzt keine neutralisierende Wirkung in vitro und keinen protektiven Effekt in vivo.
5.5 Antikörper B 2:
Es handelt sich um einen Antikörper der Klasse IgGI mit einer leichten Kette des Typs Kappa. Der Antikörper reagiert nur mit Influenza A Virus des Typs H3N2 und ist höchstwahrscheinlich gegen das Hämagglutinin des Virus gerichtet; er besitzt keine neutralisierende Wirkung in vitro und keinen protektiven Effekt ir vivo.
Tabelle 1 Zellen Wochen Immunglobulin Kappa Lambda (%) (%) (%)
4 7 4 7 4 7 SPAZ-4 4 83 28 SP-2 4 55 3 SPAZ-4 5 67 25 88 46 SP-2 5 39 13 61 17 SPAZ-4 6 36 9 SP/2 6 25 2
DESCRIPTION
The invention relates to (mouse-human) human hybridoma cell lines.
Hybridomas are cells that result from the fusion of an immortalized cell (especially a myeloma cell) with a normal non-transformed cell, which is normally selected for its ability to produce a specific substance (e.g. a lymphocyte cell for the production of antibodies) to form a hybrid . These hybrids can be selected and cloned in order to obtain cell lines that produce substances with a specific structure and / or property. In particular, hybridomas formed with lymphocytes can be used to produce monoclonal antibodies.
The development of hybridoma technology in recent years has focused on the production of cell lines that are both stable and have a high and specific production capacity for certain desired substances. There have been various attempts to solve the problem, mainly in the field of immunoglobulins / antibodies.
Studying previous activities in this area gives an overview of the problems and previous attempts to solve them. The original impetus for research into hybrid cell lines that produce monoclonal products came from the field of immunobiology.
Conventional antisera normally contain a large number of antibodies, all of which react with the same antigen with more or less affinity due to their different amino acid sequence in the region of the binding site.
They also contain a large amount of antibodies against antigens that reflect the previous experience of the individual in whom the antiserum was produced. Such antisera are certainly sufficient for most uses, but recent developments in science make higher requirements in terms of specificity and reproducibility necessary.
An elegant, meanwhile already classic solution was described by Köhler and Milstein (Nature, 256/495497 [1975]), who successfully fused mouse spleen lymphocytes from immunized animals with drug-sensitive mouse myeloma cells.
The cells immortalized by fusion were cloned and grown in vitro, i.e. a homogeneous cell population (monoclonal antibodies) was obtained, which produced a homogeneous antibody population. By appropriate selection of these cell clones from the many individual cell clones obtained, those cells could be grown which secrete an antibody with the desired antigen specificity.
The mouse antibodies produced in this way are extremely important in research and diagnostic applications, and some are already being therapeutically investigated in humans. However, it would represent a major advance in human immunoglobulin therapy if human antibodies with similarly good reproducibility and specificity could be obtained in this way. This would prevent the risk of sensitization. Some attempts to solve the problem of human antibody production in vitro have been made, but so far without success.
1. The transformation of normal human lymphocytes with Epstein-Barr virus (EBV) is not very successful because the process is very lengthy and the cloning and selection is also very difficult.
2. Fusion of normal (human) lymphocytes with human myeloma cells seems to be the obvious analogy to the mouse procedure. The problem with this, however, is that only a single myeloma cell line exists in the human system and this cell line is contaminated with mycoplasma worldwide (mycoplasma prevent successful fusion).
3. The fusion of normal (human) lymphocytes with an EBV-transformed human lymphoblastoid B-cell line is probably the most reliable and reproducible method that has been described so far. However, it suffers from the basic in vitro characteristics of lymphoblastoid cells: they are very difficult to clone and, since they represent an earlier stage in B cell differentiation, the capacity of the hybrids to produce and secrete antibodies , about ten times less than for a real myeloma cell.
4. The fusion of human lymphocytes with mouse myeloma produces cells with the same excellent in vitro characteristics as the mouse hybridomas, but with the major disadvantage that mouse-human hybrids are genetically unstable. In this context, it is particularly disadvantageous that it releases the human chromosome, which carries the information for the synthesis of the light kappa chains of the immunoglobulin molecule.
In summary, Method 1 is too difficult and too inefficient for practical purposes. Process 2 has so far had no practical significance. Method 3 is the best so far, while Method 4 does not maintain productivity even with the most careful cloning.
Although previous work has mostly concentrated on antibody production, the productive cell partner can of course be selected so that it secretes a certain desired substance and is fused with the immortalized cell.
We have found that when a xenogenetic hybridoma is used as the starting cell for a further fusion with another cell, a hybridoma with greatly improved stability can be obtained.
Hybridoma cell lines are created by fusing an immortalized cell with a cell that produces a certain substance.
The immortalized cell is a xenogenetic hybridoma cell and the substance-producing cell is genetically compatible with the non-transformed partner in the xenogenetic hybridoma.
The stability of such cell lines lies in their ability, when cultivated correctly, to produce a certain substance, e.g. of an antibody.
Preferably, the xenogenetic hybridoma cell chosen as the immortalized cell is a myeloma hybrid that has lost its own ability to produce immunoglobulin. An example of such a xenogenetic hybridoma cell is that of a myeloma cell with a lymphocyte cell. Suitable myeloma cells can cool down in rats or mice and preferably do not produce immunoglobulin. These myelomas can in turn be hybrids (e.g. mouse myeloma / mouse lymphocytes). Such a cell is e.g. the SP-2 cell line. This is then merged, e.g. with a lymphocyte cell of another species, e.g. a human lymphocyte cell.
For the further fusion with a substance-producing cell, xenogenetic cells resulting from such fusions are preferably selected which no longer produce immunoglobulin. These xenogenetic hybridomas represent a friendlier environment for further stability with regard to the loss of chromosomes. The xenogenetic hybridomas used for the immortalization are made drug-resistant before further fusion by known methods, for example by selection for 8-azaguanine resistance.
The hybridomas thus obtained represent stable starting cells for further fusion. The other fusion partner is selected according to its ability to produce certain substances, for example a lymphocyte for the production of antibodies, and is genetically compatible with the non-transformed partner in the xenogenetic hybridoma.
In order to obtain the required degree of specificity, it is advantageous to presensitize the selected cell. In the case of antibodies, this can be done by immunizing the guest body with a specific antigen and then obtaining the immunocytes (these are cells that are immunologically competent) that produce the corresponding antibody. For this, e.g. Spleen, lymph node or blood cells can be used.
The fusion of the xenogenetic hybridoma cell with the substance-producing cell is carried out according to methods known per se, for example by incubating the cells in a suitable medium with a substance that promotes the fusion (e.g. PEG 1500). The selection of the desired hybrids is also carried out according to known methods, for example in selective media (e.g. in the HAT medium [hypoxanthine / aminopterin / thymidine] if the immortalized cell does not contain hypoxanthine phosphoribosyl transferase).
The cell lines obtained are stable and produce antibodies with a high yield. If desired, they can also be cloned and reselected.
Such hybridoma cell lines are produced by making a xenogenetic hybridoma cell drug-resistant, then fusing it with a substance-producing cell which is genetically compatible with the non-transformed partner of the xenogenetic hybridoma, and selecting the desired hybrid.
Antibody production using such cells can be carried out according to known methods, either in vitro, using suitable media (e.g. containing diluted fetal calf serum) or in vivo by injection into a guest body (e.g. nude or athymic mice or rats) . Depending on the method, one or more cleaning stages may be necessary.
Although the use of simple hybridoma cell lines is of course preferred for economic reasons, these cell lines can be fused further if desired.
An antibody-producing hybri doma according to the invention is obtained as an antibody producer by fusing a mouse myeloma with a human lymphocyte and then fusing with a presensitized human lymphocyte cell. If desired, the myeloma cells can in turn
Be hybrid (e.g. the SP-2 mouse cell line that a mouse
Represents mouse hybrid).
Such methods are described in the following references, for example:
1. Koehler, G. and Milstein, C .: Nature, 256, 495-497 (1975)
2. Nadler, L.M. et al .: Cancer Research, 40, 3147-3154 (1980)
3. Cosimi, A.B. et al .: N. Engl. J. Med., 305, 308-314 (1981)
4. Zurawski, V.R. et al .: Science, 199, 1439-1441 (1978)
5. Koskimies, S .: Scand. J. Immunol., 11, 73-77 (1980)
6. Steinitz, M. et al .: Nature, 287, 443-445 (1980)
7. Olsson, L., and Kaplan, H.S .: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77,
5429-5431 (1980)
8. Croce, C.M. et al .: Nature, 288, 488-489 (1980)
9. Nowinski, R. et al .: Science, 210, 537-539 (1980) 10. Croce, C.M. et al .: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 3416-3419 (1979) 11. Galfre, G. et al .: Nature, 266, 550 (1977) 12. Miller, R.A. et al .: N. Engl. J.
Med., 306, 517 (1982) 13. Sikora, K., et al .: Lancet, ill (1982) and e.g. U.S. Patent 4,172,124
EP Note Pub. Nos. 0043 718 and 0044 722 and the recent McIntyre monoclonal antibody book.
By using a xenogenetic fusion starting cell (which has lost its ability to produce certain substances), stable, rapidly growing, easily clonable and high-yielding hybridomas producing the desired substance (e.g. human antibodies) can be obtained.
The human antibodies produced can be used to combat a wide variety of diseases. For example, they can be used for infectious diseases of viral (e.g. cytomegalo-, varicella-zoster, herpes simplex, hepatitis A and B, rubella virus etc.), bacterial (antitoxins, anticellular wall) or fungal (e.g. candida) origin. Furthermore, in the fight against all malignant tumors (with or without conjugation to toxins) as well as poisoning (antidote antibody for digitalis, opiate, tricyclic antidepressant or barbiturate poisoning).
Other areas of application are: Autoimmune diseases (via anti-idiotypic antibody therapy such as anti-tanpancreatic cells, anti-anti-acetylcholine receptor, anti-rheumatic factor), blood group antigens (Anti-Rh), transplants (anti-T cell treatment of rejection; increase in antibodies to reduce the stimulating activity of the graft), Allergin (IgG antibodies to allergens, alternative to hyposensitation) and Chorionic Gonadotropoin antibodies as contraceptives. The hybridoma cells can also be used as a source of mRNA by cloning immunoglobuligens.
In particular, (mouse-human) human hybridomas are produced. The SP-2 cell line, originally a hybridoma between the P3-X63-Ag8 line and mouse spleen cells that produce antibodies against red sheep blood cells, is known (M.
Shulmann et al., Nature 276/269 [1978]) and has no ability to produce antibodies. It is mixed with normal human peripheral lymphocytes according to known methods, e.g. by G. Galfre et al., Nature 266/550 (1977) and R.
Nowinski et al., Science 210/537 (1980). A large number of hybrids are obtained and after approximately five weeks five clones are selected which show rapid growth without antibody production. These cells are then selected for resistance to 8-azaguanine, and with three of these lines it is possible to obtain mutants that are resistant to 201 µg / ml of 8-azaguanine. These cells are then sensitive to hypoxanthine aminopterin thyme (HAT) medium, indicating that they have lost their ability to produce hypoxanthine phosphoribosyl transferase.
One of these lines (SPAZ-4) is then fused in vitro with human tonsillar lymphocytes. 2 x 107 myeloma cells are used for 108 tonsillar cells. The fusion is carried out according to standard methods. In parallel, the SP-2 cell line is also merged in order to enable the two cell lines to be compared. The cell populations thus obtained are incubated in HAT medium in order to select hybrids. After all cells in the unfused control cultures have died, the HAT medium is replaced with a normal, non-selective growth medium.
After two weeks, the first attempt at antibody production is made and it is found that all cultures of all fusions produce human antibodies. The cultures are tested again four weeks later. 83% of the SPAZ-4 hybridomas still produce while only 55% of the SP-2 hybridomas retain their synthetic ability. High yield production is found for 28% of the SPAZ-4 lines, but only for 3% of the SP-2 lines.
Given that the loss of antibody secretion can be largely explained by the loss of the genome encoding the light chains, a specific test for the production of light chains is carried out. It is found that 67% of the SPAZ-4 cells produce kappa chains and 88% lambda chains. For SP-2 these values are 39% and 61% (it should be noted that these percentages are only comparable within each individual experiment and only for each individual type of immunoglobulin production). The results are summarized in Table 1. It can be seen from the table that SPAZ-4 is superior to SP-2 in all cases, especially when you consider the values for strong production, which are of practical importance only.
All of these experiments are done with non-cloned cells so as to maximize the selective pressure against the stable clones (the stable clones carry more genetic material and grow less and less well than cells that have already released their unnecessary chromosomes).
Attempts are also being made to clone these cells as well. The results indicate that not a single stable and producing SP-2 hybrid is obtained (this is deduced from the absence of lines where all cultures that show growth also have antibody production). In the SPAZ-4 line, on the other hand, some clones are obtained that meet these criteria.
The method described here is substantially better than the methods known from the literature, since the instability problem is solved. It must also be pointed out that the conventional mouse-mouse hybridomas are also not very stable and that lengthy subcloning is always necessary.
The degree of instability of SPAZ-4 hybridomas is roughly the same as that of mouse-mouse hybridomas, which means that working with them is practicable.
In the following examples, which explain the invention in more detail but are not intended to restrict its scope in any way, all the temperatures are given in degrees Celsius.
Example 1: Production of the SPAZ4 cell line
Peripheral blood lymphocytes (PBL's) are isolated from the heparin blood of a healthy donor by centrifugation over Ficoll-Isopaque. After washing, 108-PBL's are mixed with 5 x 107-SP-2 cells in 50 ml of Dulbecco's H21 medium, adjusted to pH 8. The cells are pelleted together at 600 rpm for 5 minutes and the supernatant carefully removed.
At 37, 1 ml of 50% PEG 4000 in H21 medium is added slowly over the course of one minute. A further 10 ml of H2 1 medium are then mixed in over 2 minutes. The cells are then pelleted and suspended in 55 ml HAT medium (HAT: Dulbeccos H21 with 20% fetal calf serum (FCS), 10% NCJC 109, 1% non-essential amino acids, 0.5% pyruvate, 0.2 U / ml Insulin, 1 mM oxaloacetic acid, 104 M hypoxanthine, 4 x 10-7 M aminopterin and 1.6 x 10-3 M thymidine).
The suspension is then divided into 528 0.1 ml cultures in flat-bottom microtiter tissue culture plates. Fresh
HAT medium is added every 3 to 5 days for two weeks, after which it is switched to HT medium (Dulbecco H21 with 10% FCS, 104 M hypoxanthine and 1.6 x 10 M thymidine).
After the 15th day, samples are taken from the supernatants for the test for production of human antibodies.
Five cultures show good growth without antibody formation.
These are used for the further development of 8-azaguanine-resistant sublines.
Each of these five cell lines is incubated with 2 x 105 cells / ml in Dulbecco's H2 1 medium with 1% FCS and 20 g / ml 8-azaguanine. It is possible to isolate resistant cell clones from three of these cultures after a few weeks. The further tests are carried out with one of these HAT-sensitive clones, the SPAZ-4 cell line.
Example 2: Fusion with lymphocytes from tonsils
A single cell suspension is prepared from a child's tonsils and the lymphocytes are obtained by Ficoll-Hypaque fractionation. From this cell population, 108 cells are fused with 2 x 107 SPAZ-4 or SP-2 cells according to the method described in Example 1. The cells are then distributed to 47 0.5 ml cultures in HAT medium, which in this case are additionally supplemented with 0.5 Ag / ml cyclosporin A.
After one day, 1 ml of HAT medium without cyclosporin A is added. On the third day, 50% of the medium is replaced by HT medium. Medium change with HT medium is then carried out every 3 to 5 days.
Test for immunoglobulin production
An Elisa system (enzyme-linked immunosorbend assay) is used for the screening. Rabbit anti-human immunoglobulin is bound to Nunc-Elisa microtiter plates in a dilution of 1: 400 in a bicarbonate buffer pH 9.6. After washing, the culture supernatants are incubated for 30 minutes at 37 in these plates. After washing again, rabbit anti-human IgG, IgM, IgA reagent (Miles-Yeda) is incubated with peroxidase conjugates at a dilution of 1: 400. After washing again, the amount of conjugate bound is determined by reaction with 1,2-phenylenediaminodihydrochloride and H202.
Antibody light chain production is carried out with an analog test using a goat anti-human lambda or goat anti-human kappa peroxidase conjugate (Tago) at a dilution of 1: 3000.
The extinctions are determined with a Titertek-Multiscan-Elisa photometer. The values 4 and 7 in the table refer to weak or strong extinction values.
Example 3: Production of monoclonal antibodies against influenza types A and B (after in vivo immunization)
As an influenza vaccine, Sandovac, which contains hemagglutinin and neuraminidase from A / Bangkok, A / Brazil and B / Singapore, is administered to 3 test subjects and then on the 3rd, 7th, 10th, 14th and 17th day each 50 to 60 ml blood drawn. The lymphocytes are obtained by centrifugation on Ficoll-Paque (Pharmacia) and washed twice with saline.
The following are used for the fusion: a) SPAZ-4, as already described in Example 1 b) SP-2, as already described c) GM 1500: a human lymphoblastoid cell, resistant to 6-azaguanine (produces human IgG2, kappa) .
SPAZ-4 and SP-2 are merged identically. The myeloma (107 cells) and the human lymphocytes (about 3 x 107 cells) are mixed in the presence of DMEM serum-free medium at pH 8.0 in a test tube and then centrifuged for 5 minutes at 600 rpm. The pellet obtained is treated with 50% PEG 4000 for 1 minute and then slowly diluted with medium. After a washing process, the cells are distributed over 176 100 Fg cultures in DMEM-HAT medium containing 20% fetal calf serum and cultivated at 37 in a humid CO2 atmosphere.
The GM-1500 cells (107 cells) are mixed with the human lymphocytes (approximately 3 x 107 cells) in serum-free DMEM medium at pH 8.0 and then centrifuged at 600 rpm for 5 minutes. The pellet obtained is centrifuged for 5 minutes with 50% PEG 6000 at 600 rpm and then slowly diluted with medium. After a wash, the cells are distributed to 176 100-p1 cultures in RPMI 1640 medium containing 20% fetal calf serum and grown at 37 in a humid CO2 atmosphere.
A total of 35 fusions (15 with GM 1500, 14 with SPAZ-4 and 6 with SP-2) are carried out and 6160 cultures (2640 with GM 1500, 2464 with SPAZ-4 and 1056 with SP-2) are obtained. The media are changed approximately every 3 to 5 days according to the cell growth. The presence of anti-influenza antibodies in the supernatant is detected using an Elisa method: the corresponding influenza antigens are bound on Nunc microtiter plates and the supernatant is added. After washing, rabbit anti-human IgG, IgA, IgM (Miles) is added with peroxidase conjugates. After incubation, unbound peroxidase conjugate is washed away and the bound conjugate is made visible by a color reaction. The extinctions are determined with a Tlterex microplate photometer. Cultures with a positive result are cloned.
To do this, one cell / culture is brought into 88 new cultures in 100 FI DMEM with 20% fetal calf serum and mouse thymocytes (in hybrids with SPAZ-4 and SP-2) or 100 111 RPMI 1640 with 20% fetal calf serum and MRC-5 Cells (in hybrids with GM 1500). Production cells are grown on a larger scale and frozen in liquid nitrogen.
A total of 86 cultures (58 GM 1500, 26 SPAZ-4 and 2 SP-2) are cloned, whereby the selection criteria are not very strict. This results in the relatively low yield of genuinely positive cells. Four positive cells from SPAZ-4, one from SP-2 and none from GM 1500 are obtained, the SP-2 not being a hybrid but a spontaneous EB virus transformed cell. The results are summarized in the following table: Day GM 1500 SPAZ-4 SP-2 fusion-positive fusion-positive fusion-positive cultures cultures
Cultures cultures cultures
3 528 0 528 0 176 0
7 528 0 352 2 176 0 10 528 0 528 1 176 0 14 528 0 528 0 354 1 17 528 0 528 1 176 0 Sa: 2640 0 2464 4 1056 1
The 5 positive cell lines are cloned several times and grown on a larger scale.
This is based on the EBV cell line (it is known that such cells cannot tolerate cloning at low density). The four positive clones were named C 15, C 28, C 29 and C 75.
Example 4: Production of monoclonal antibodies against influenza (after in vitro immunization)
2 ml of human spleen cells (106 / ml) are placed in Falcon 2051 tubes, a total of 34 x 106 cells being used. A sucrose density gradient purified A / Bangkok virus is then added and the cultures grown in RPMI 1640 medium with 5% human heat inactivated plasma for 101 hours at 37 in an air atmosphere with 5% CO2. The cells obtained are fused with SPAZ-4 as described in Example 3. The cells are then distributed into 176 cultures and grown in MEM medium (Dulbecco) containing 20% fetal calf serum, HAT and 1 µg / ml cyclosporin A. After 2 days, the HAT medium is gradually replaced by HT medium. The cultures are on the 12th and 19th
Checked for anti-influenza antibody the day after immunization and the positive cells cloned. A positive cell line is obtained, 132.
Example 5: Characterization of the Human Antiinfluenza mono Monal Antibody 5.1 Antibody C 15:
It is an antibody of the class IgG1 with a light chain of the Kappa type. The antibody reacts with all examined influenza A viruses (H1N1, H2N2, H3N2) and is most likely directed against the nucleoprotein of the virus; it has no neutralizing effect in vitro and no protective effect in vivo.
5.2 Antibody C 28:
It is an IgGI class lambda light chain antibody. The antibody only reacts with the H3N2 influenza A virus and is most likely directed against the virus hemagglutinin; it has a strong neutralizing effect in vitro and a very strong protective effect in vivo. It neutralizes all examined H3N2 virus types, .13. those from 1968, 1969, 1973, 1974, 1975, 1977, 1979 and 1980.
Examination of 1.5 mg / ml antibody C 28 with 1973 A / port. Chalmers on MDCK cells gives a neutralization titer of 12,800. In the same test, a standard human immunoglobulin of 60 mg / ml gives a neutralization titer of 50.
This means that the monoclonal antibody C 28 has a potency of 10,240 times based on the same protein content.
If one takes into account that anti-influenza antibodies against the subtype H3N2 currently achieve relatively high titers in the standard human immunoglobulin, this means that antibodies with the same neutralizing effect, e.g. against cytomegalovirus or varicella zoster virus, the antibodies of which are present in a significantly lower concentration in standard human immunoglobulins, result in an even greater relative increase in activity.
5.3 Antibody C 29:
It is an IgGI class lambda light chain antibody. The antibody reacts with influenza B (8 / Singapore) and has no activity against influenza A.
5.4 Antibody C 75:
It is an antibody of class IgG3 with a light chain of the Kappa type. The antibody only reacts with the H3N2 influenza A virus and is most likely directed against the virus hemagglutinin; it has no neutralizing effect in vitro and no protective effect in vivo.
5.5 Antibody B 2:
It is an IgGI class Kappa light chain antibody. The antibody only reacts with the H3N2 influenza A virus and is most likely directed against the virus hemagglutinin; it has no neutralizing effect in vitro and no protective effect in vivo.
Table 1 Cells Weeks Immunoglobulin Kappa Lambda (%) (%) (%)
4 7 4 7 4 7 SPAZ-4 4 83 28 SP-2 4 55 3 SPAZ-4 5 67 25 88 46 SP-2 5 39 13 61 17 SPAZ-4 6 36 9 SP / 2 6 25 2