DD274448A1 - METHOD FOR THE PRODUCTION OF HUMAN MONOCLONAL ANTICOERPER AGAINST STRUCTURAL PROTEINS OF HIV - Google Patents
METHOD FOR THE PRODUCTION OF HUMAN MONOCLONAL ANTICOERPER AGAINST STRUCTURAL PROTEINS OF HIV Download PDFInfo
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung humaner monoklonaler Antikoerper (hmAk) gegen Strukturproteine des Human Immunodificiency Virus (HIV, Erreger der Immunschwaechekrankheit AIDS). Die hmAK CB-hp25-1 bis -3 sowie CB-hgp41-1 und -2 werden aus den Hybridomen H-CB-hp25-1 bis -3 sowie H-CB-hgp41-1 und -2 (ZIM-0315 bis -0317 sowie ZIM-0318 und -0319) gewonnen, die ihrerseits aus der Human-Maus-Heteromyelomzellinie CB-Fu2 (ZIM-0314) nach Fusion mit HIV-tragenden B-Lymphozyten erhalten werden. Das Anwendungsgebiet der Erfindung ist die medizinische Diagnostik.The invention relates to a method for producing human monoclonal antibodies (hmAb) against structural proteins of the human immunodificiency virus (HIV, pathogens of the immunodeficiency syndrome AIDS). The hmAK CB-hp25-1 to -3 and CB-hgp41-1 and -2 are prepared from the hybridomas H-CB-hp25-1 to -3 and H-CB-hgp41-1 and -2 (ZIM-0315 bis - 0317 and ZIM-0318 and -0319), which in turn are obtained from the human mouse heteromyeloma cell line CB-Fu2 (ZIM-0314) after fusion with HIV-bearing B lymphocytes. The field of application of the invention is medical diagnostics.
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung humaner monoklonaler Antikörper (hmAk) gegen Strukturproteine des Human Immunodeficiency Virus (HIV). Das Anwendungsgebiet der Erfindung ist die medizinische Diagnostik.The invention relates to a method for producing human monoclonal antibodies (hmAb) against structural proteins of the human immunodeficiency virus (HIV). The field of application of the invention is medical diagnostics.
Charakteristik der bekannten technischen LösungenCharacteristic of the known technical solutions
Die Produktion hmAK stellt eine relativ neue Quelle von Antikörpern für die Diagnostik, Prophylaxe und Therapie verschiedener Erkrankungen des Menschen dar. International werden große Anstrengungen zur Erzeugung hmAk gegen bakterielle und virale Antigene, Tumor- und Zeil- bzw. Gewebsantigene unternommen (James, K. u. G,T. Bell: Human monoclonal antibody production. Current status and future prospects. J. Immunol. Meth. 100 [1987], 5-40). Erstmalig hatten Köhler und Milstein (Nature, 1975,256,495) durch somatische Fusion von murinen antikörperbildenden Zellen und Zellen einer permanent wachsenden Plasmozytomzellinie Hybridome erzeugt, die nach entsprechenden Klonierungsschritten monoklonal Antikörper von der Maus gegen eine gewünschte Antigenspezifität produzierten. Nach dieser prinzipiellen biotechnologischen Lösung sind auch monoklonale Antikörper gegen Determinanten des HIV erzeugt worden. (Chassagne, J., Verelle, P., Klatzmann, D., Montagnier, L., Dionet, C, Gluckman, J.C, Patent Cooperation Treaty [1986] WO 86/04336; Mc Dougal, J. S., Nicholson, J. K., Gross, G.D., Cort, S. P., Kennedy, M.S., Mawle, A.C.: J.Immunol. 137 [1986] 2937-2944; Robert-Guroff, U., Brown, U., GaIIo, H.C: Nature316 [1985] 72-74).The production of hmAK represents a relatively new source of antibodies for the diagnosis, prophylaxis and therapy of various human diseases. Internationally, great efforts are being made to produce hmAb against bacterial and viral antigens, tumor and cell or tissue antigens (James, K. and G, T. Bell: Human monoclonal antibody production, Current Status and Future Prospects, J. Immunol., Meth., 100 [1987], 5-40). For the first time, Köhler and Milstein (Nature, 1975, 256, 495) had generated hybridomas by somatic fusion of murine antibody-producing cells and cells of a permanently growing plasmacytoma cell line which, after appropriate cloning steps, monoclonally produced antibodies from the mouse against a desired antigen specificity. Following this principal biotechnological solution, monoclonal antibodies to HIV determinants have also been generated. (Chassagne, J., Verelle, P., Klatzmann, D., Montagnier, L., Dionet, C, Gluckman, JC, Patent Cooperation Treaty [1986] WO 86/04336; Mc Dougal, JS, Nicholson, JK, Gross , GD, Cort, SP, Kennedy, MS, Mawle, AC: J. Immunol. 137 [1986] 2937-2944; Robert-Guroff, U., Brown, U., GaIIo, HC: Nature 316 [1985] 72-74 ).
Die effektive Gewinnung humaner monoklonaler Antikörper (hmAk) gegen die verschiedensten Antigenspezifitäten ist weltweit bisher durch 2 Hauptprobleme erschwert (Engleman, E. B., S.K.Foung, J.Larrickund A.Raubitschek; Human hybridomas and monoklonal antibodies, Plenum Press, New York 1985):Efficient recovery of human monoclonal antibodies (hmAbs) against a wide variety of antigenic specificities has been hindered by 2 major problems worldwide (Engleman, E.B., S.K. Foung, J. Larrick, and A. Raubitschek, Human hybridomas and monoclonal antibodies, Plenum Press, New York 1985):
1. Die Verfügbarkeit einer Fusionszellinie, die mit vergleichbarer Fusionsfrequenz wie im Maus χ Maus-System in der Lage ist, humane B-Lymphozytcn zu immortalisieren.1. The availability of a fusion cell line capable of immortalizing human B lymphocytes at a similar frequency of fusion as in the mouse χ mouse system.
2. Die geringe Frequent an Antigen-spezifischen B-Precursorzellen im peripheren Blut des Menschen.2. The low frequency of antigen-specific B precursor cells in the peripheral blood of humans.
Mit diesen beiden Pi oblemen ist eine geringe Ausbeute an Hybridomzellklonen verbunden, die spezifische Antikörper gegen ein vorgegebenes Antigen produzieren. Damit ist auch mit großer Wahrscheinlichkeit der Umstand zu erklären, daß weltweit trotz intensiver Bemühungen die Herstellung hmAk gegen Strukturproteine des HIV durch somatische Zellhybridisierung bisher selten beschrieben wurde (Banapour, B., K.Rcsenthal, L.Rabin, V.Sharma, L. Young, J.Fernandez, E. Engleman, M.McGrath, G. Reyes u. J. Lifson: Characterization and epitopo mapping of a human monoclonal antibody reactive with the envelop glycoprotein of human immunodeficiency virus. J. Immunol. 13911987), 4027-4033; McClure, J., EP-PS 251612). Die bisher beschriebenen humanen mAk gegen HIV-Proteine wurden mit Hilfe der Transformation humaner B ..ymphozyten mit Epstein-Barr-Virus (EBV) erzeugt, ua das EBV ein humanpathogenes Virus darstellt, ist die prospektive Anwendung der so produzierten Antikörper beim Menschen mit Problemen belastet. Trotz intonsiver Bemühungen gelang es anderen Arbeitsgruppen nicht, z. B. durch 30 Fusionen von peripheren Blutlymphozyten HlV-lnfizierter mit der NS-1 Parental .ellinie, humane mAk gegen HIV-Antigene zu erzeugen (Zolla-Pazner, S., Pinler, A., Mizuma, H.: J.Virol.Meth. 17 [1987] 45-53). Zur Patentanmeldung kommt hier ein Verfahren zur Herstellung humaner mAk gegen HlV-Strukturproteine und die Gewinnung entsprechender mAk mn neuen, verbesserten Eigenschaften unter Verwendung der Fusionszellinie CB-Fu2 (ZIM-0314).A low yield of hybridoma cell clones that produce specific antibodies to a given antigen is associated with these two conditions. This is also likely to explain the fact that the production of hmAk against structural proteins of HIV by somatic cell hybridization has so far rarely been described worldwide despite intense efforts (Banapour, B., K. Rcsenthal, L. Rabin, V. Sharma, L. Young, J. Fernandez, E. Engleman, M. McGrath, G. Reyes, and J. Lifson: Characterization and epitope mapping of a human monoclonal antibody reactive with the envelop glycoprotein of human immunodeficiency virus J. Immunol., 13911987), 4027 -4033; McClure, J., EP-PS 251612). The previously described human mAbs against HIV proteins were generated by the transformation of human B .ymphozyten with Epstein-Barr virus (EBV), including EBV is a human pathogenic virus, is the prospective application of the antibodies thus produced in humans with problems loaded. Despite intonsive efforts, other working groups were unable to For example, by 30 fusion of peripheral blood lymphocytes HIV-infected with the NS-1 parental cell line to produce human mAbs against HIV antigens (Zolla-Pazner, S., Pinler, A., Mizuma, H .: J. Virol. Meth. 17 [1987] 45-53). For the patent application here comes a method for the production of human mAb against HIV structural proteins and the recovery of corresponding mAk mn new, improved properties using the fusion cell line CB-Fu2 (ZIM-0314).
Ziel der ErfindungObject of the invention
Das Ziel der Erfindung besteht darin, der medizinischen Diagnostik humane monoklonale Antikörper zur Verfügung zu stellen, die zum Aufbau eines Testsystems zur Erkennung von Antigenen des HIV geeignet sind.The object of the invention is to provide human monoclonal antibodies to medical diagnostics which are suitable for constructing a test system for the detection of HIV antigens.
Darlegung des Wesens der ErfindungExplanation of the essence of the invention
' Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zu entwickeln, mit dem zunächst effektiv Hybridomzellinien erzeugt werden können, von denen in anschließenden Verfahrensschritten humane monoklonale Antikörper (hmAk) gegen verschiedene Determinanten des HIV isoliert werden können. Die t lybridomzellinien sollen mit ökonomisch günstigem Aufwand in vitro und in vivo kultivierbar sein und für eine Reinigung ausreichend hohe Mengen an hmAK sezernieren.The invention has for its object to develop a method by which initially hybridoma cell lines can be generated from which human monoclonal antibodies (hmAb) can be isolated against various determinants of HIV in subsequent process steps. The hybridoma cell lines should be able to be cultured in vitro and in vivo with economically favorable outlay and to secrete sufficiently high amounts of hmAK for purification.
Die Aufgabe wurde dadurch gelöst, daß eine Human-Maus-Heteromyelomzellinie (CB-Fu 2) aus normalen humanen B-Lymphozyten und einer Maus-Myelomzellinie hergestellt, mit dieser Zellinie nach Fusion mit B-Lymphozyten aus dem peripheren B.ut HlV-infizierter Probanden Hybridomzellen (H-CB-hp25-1 bzw. -3 sowie H-CB-hgp41-1 und -2) selektiert, zur Züchtung eingesetzt und aus dem zellfreien Überstand humane monoklonal Antikörper (CB-hp25-1 bis -3 sowie CB-hgp41 -1 und -2) isoliert worden. Die Hoteromyelomzellinie CB-Fu 2 wurde durch Sektion solcher Hybridomzellen gewonnen, die keine eigene Antikörperproduktion aufwiesen und aus deren Subklonen die Linie CB-Fu 2 hervorgeht. Die Human-Maus-Heterofusionszellinie CB-Fu 2 zeichnet sich durch eine hohe Fusionsfrequenz und eine hohe Immortalisationsrate Immunglobulin-produzierender B-Lymphozyten aus. Mit dieser Zellinie wurden nach Fusion mit B-Lymphozyten aus dem peripheren Blut HlV-infizierter Probanden verschiedene hmAk gegen Strukturproteine des HIV erzeugt. Die Spezifität dieser Antikörper wurde in verschiedenen Testsystemen charakterisiert.The object was achieved by preparing a human-mouse heteromyeloma cell line (CB-Fu 2) from normal human B lymphocytes and a mouse myeloma cell line, with this cell line after fusion with B lymphocytes from peripheral B.ut HIV-infected Subjects hybridoma cells (H-CB-hp25-1 or -3 and H-CB-hgp41-1 and -2) selected, used for breeding and from the cell-free supernatant human monoclonal antibody (CB-hp25-1 to -3 and CB -hgp41-1 and -2). The hot-cell cell line CB-Fu 2 was obtained by sectioning such hybridoma cells which did not have their own antibody production and whose subclones yield the CB-Fu 2 line. The human mouse heterofusion cell line CB-Fu 2 is characterized by a high fusion frequency and a high immortalization rate of immunoglobulin-producing B lymphocytes. With this cell line, different hmAk against structural proteins of HIV were generated after fusion with B-lymphocytes from the peripheral blood of HIV-infected subjects. The specificity of these antibodies was characterized in different test systems.
Tabelle 1 zeigt die Resultate des Primärscreenings der Zellkulturen etwa 3 Wochen nach der Fusion. In 99% der angelegten Zellkulturen wurde in HAT-(Hypoxanthin, Aminopterin, Thymidinl-Medium progressives Zellwachstum beobachtet, zum großen Teil mehr als ein Zeilklon. In mehreren Kavitäten wurc.'r» die Produktion von IgM bzw. IgG nachgewiesen. In einigen Zellkulturüherständen konnten im EIA IgM- bzw. IgG-Antikörper gegen HIV-Bestandteile bestimmt werden.Table 1 shows the results of the primary screening of cell cultures about 3 weeks after fusion. In 99% of the cell cultures grown, HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidinium) medium showed progressive cell growth, in large part more than one cell clone, and several cavities were found to produce IgM or IgG, respectively, in some cell culture sources could be determined in the EIA IgM or IgG antibodies against HIV components.
Durch mehnache Klonierungen wurden IgM- und IgG anti-HIV produzierend Zellklone etabliert. Die L-Ketten der Antikörper sind vom kappa-Typ, die IgG-Antikörper vom IgGi-Subtyp. Zwei der spezifischen IgG anti-HIV Antikörper wurden näher unterrucht und als CB-hgp41 -1 und CB-hp25 bezeichnet.By many cloning IgM and IgG anti-HIV producing cell clones were established. The L chains of the antibodies are of the kappa type, the IgG antibodies of the IgGi subtype. Two of the specific IgG anti-HIV antibodies were more closely under- stood and named CB-hgp41-1 and CB-hp25.
Mit Hilfe des Westernblots wurde die Antigenspezifität der Antikörper näher untersucht. U monokionale Antikörper CB-hgp41-1 reagiert mit dem gp41 Transmembran-Env-Protein des HIV. Die Reaktion mit rekombinanten M..*'nenen erbrachte auch eine Bande im gp160-Bereich, dem Precursorprotein von gp120 und gp41. Mit Hilfe von mehreren Peptiden, die analog verschiedener Bereiche des gp41 synthetisiert wurden, wurde die genaue Bindungsstelle des Antikörpers im Bereich der Aminosäuren 606-612 identifiziert. Der monoklonal Antikörper CB-hp25zeigt eine Reaktion mit dem Major-Corprotein p25 und den Precursorproteinen p55undp41.With the help of the Westernblots the antigen specificity of the antibodies was examined more closely. U monoclonal antibody CB-hgp41-1 reacts with HIV's gp41 transmembrane env protein. The reaction with recombinant mice also yielded a band in the gp160 region, the precursor protein of gp120 and gp41. Using several peptides synthesized analogously to different regions of gp41, the exact binding site of the antibody in the region of amino acids 606-612 was identified. The monoclonal antibody CB-hp25 shows a reaction with the major corprotein p25 and the precursor proteins p55 and p41.
Der Immunofluoreszenztest weist mit den HlV-infizierten Zellen charakteristische Reaktionsmuster der monoklonalen Antikörper aus. Die Zellinien zeigen stabiles Wachstum und kontinuierliche Antikörperproduktion über einen Zeitraum von mehreren Monaten.The immunofluorescence test identifies characteristic patterns of reaction of the monoclonal antibodies with the HIV-infected cells. The cell lines show stable growth and continuous antibody production over a period of several months.
Überraschenderweise bewirken diese Antikörper in einem biologischen Testmodell gegenüber entsprechenden Kontrollen eine Verzögerung der Infektion humaner T-Zellen mit dem HIV und zeigen damit eine potentielle Wirksamkeit zur Prophylaxe bzw. Therapie des AIDS.Surprisingly, in a biological test model, these antibodies cause a delay in the infection of human T cells with HIV compared to corresponding controls and thus show a potential effectiveness for the prophylaxis or therapy of AIDS.
Die Hybridome sind in der Hinterlegungsstelle des Zentralinstituts für Molekularbiologie der AdW der DDR, Berlin Buch, unter folgenden Nummern registriert:The hybridomas are registered in the depository of the Central Institute of Molecular Biology AdW of the GDR, Berlin Book, under the following numbers:
H.CB-hp25-1alsZIM-0315H.CB-hp25-1alsZIM-0315
H-CB-hp25-2alsZIM-0316H-CB-0316 hp25-2alsZIM
H-CB-hp25-3alsZIM-0317H-CB-0317 hp25-3alsZIM
H-CB-hgp41-1alsZIM-0318H-CB-0318 hgp41-1alsZIM
H-CB-hgp41-2alsZIM-0319,H-CB-hgp41-2alsZIM-0319,
die Fusionslinie CB-Fu2 unter ZIM-0314.the fusion line CB-Fu2 under ZIM-0314.
Die Hybridomzellkulturen eignen sich zur in vitro- bzw. in vivo-Produktion der humanen monoklonalen Antikörper CB-hp25-1, CB-hp25-2, CB-hp25-3 sowie CB-hgp41-1 und CB-hgp41-2.The hybridoma cell cultures are suitable for in vitro and in vivo production of the human monoclonal antibodies CB-hp25-1, CB-hp25-2, CB-hp25-3 and CB-hgp41-1 and CB-hgp41-2, respectively.
Ergebnisse der Fusbn zwischen der Parentalzeilinie CB-Fu2 und peripheren Blutlymphozyten eines HIV-AntikörperträgersResults of fusbiness between the parental line CB-Fu2 and peripheral blood lymphocytes of an HIV antibody carrier
Ausführungsbeispieleembodiments
1. Zellpräparation: Mononukleäre Zellen (MNZ) werden aus heparinisiertem Blut von HIV-A: 'ikörperträgern durch Dichtegradientenzentrifugation gewonnen. Die Heteromyelomzellinie CB-Fu2 ist durch Fusiot. on normalen humanen B-Lymphozyten und der Maus-Myelomzellinie P3X63 Ag8/653 entstanden. Es werden solche Hybridomzellen selektiert, die keine eigene Antikörperproduktion aufweisen. Diese Zellinien werden mohrfach in 8-Azaguanin passagiert bzw. kloniei:, cn HAT-sensitive Subklone zu erhalten. Die Linie CB-Fu2 zeichnet sich durch ein gutes Wachstum und eine hohe Immortalisierungsrate humaner B-Lumphozyten nach Hybridisierung aus.1. Cell Preparation: Mononuclear cells (MNZ) are obtained from heparinized blood of HIV-A: ik antibody carriers by density gradient centrifugation. The heteromyeloma cell line CB-Fu2 is by Fusiot. on normal human B lymphocytes and the mouse myeloma cell line P3X63 Ag8 / 653. There are selected such hybridoma cells that do not have their own antibody production. These cell lines are often passaged in 8-azaguanine or kloniei:, cn HAT-sensitive subclones to obtain. The CB-Fu2 line is characterized by good growth and immortalization rate of human B-lymphocytes after hybridization.
2. Zellfusion und Zellkulturbedingungen: Die mononukleären sowie die CB-Fu2-Zellen werden in Serum-freiem RPM11640 (SIFlN, DDR) zweimal sedimentiert und anschließend in einem 1:5 Verhältnis von Heteromyelomzellen zu MNZ gemischt und erneut sedimentiert. Nach dem Dekantieren des Überstandes und der Resuspendierung des Sediments in der Restflüssigkeit wird langsam unter ständiger Bewegung des Sediments autoklaviertes, noch flüssiges Polyethylenglykol 1500 zugegeben. Nach einer Wirkzeit von 90sec wird das Polyethylenglykol durch Zugabe von RPM1160 langsam verdünnt. Anschließend werden die Zellen nochmals gewaschen und danach mit RPM11640 mit einem Anteil von 10% fetalem Kälberserum (FKS) auf eine Konzentration von 106 Zellen/ml verdünnt. 100μΙ dieser Zellsuspension werden pro Näpfchen einer 96-well-Zellkulturplatte einpipettiert. Nach 24 Stunden wird pro Näpfchen 100μΙ einer doppelt konzentrierten HAT-Lösung zugesetzt. Nach 2-4 Wochen2. Cell fusion and cell culture conditions: The mononuclear and the CB-Fu2 cells are sedimented twice in serum-free RPM11640 (SIFIN, DDR) and then mixed in a 1: 5 ratio of heteromyeloma cells to MNZ and sedimented again. After decanting the supernatant and resuspending the sediment in the residual liquid, autoclaved, still liquid, polyethylene glycol 1500 is added slowly with constant agitation of the sediment. After a reaction time of 90 seconds, the polyethylene glycol is slowly diluted by the addition of RPM1160. Subsequently, the cells are washed again and then diluted with RPM11640 in a proportion of 10% fetal calf serum (FCS) to a concentration of 10 6 cells / ml. 100μΙ of this cell suspension are pipetted per well of a 96-well cell culture plate. After 24 hours, 100μΙ of a double-concentrated HAT solution is added per well. After 2-4 weeks
Kultivierung in feuchter, 5% CGyhaltiger Atmosphäre werden von den Zellkulturen die Überstände gesammelt und hinsichtlich einer spezifischen Antikörperproduktion getestet. Positive Kulturen werden mehrfach mit der Grenzverdünnungstechnik kloniert.Culturing in a moist, 5% CGy-containing atmosphere, the supernatants are collected from the cell cultures and tested for specific antibody production. Positive cultures are cloned several times using the Grenzverdünnungstechnik.
3. Enzymimmunoassay (EIA): Der Nachweis von spezifischen anti-HIV Anitkörpern orfolgt mit Hilfe eines „Sandwich'-EIA. Elektronenmikroskopisch reine HIV-Partikeln aus Zellysat von HlV-inf izierten H9-Zellen werden in einer Proteinkonzentration von 10ng/ml an Flachboden-Mikrotiterplatten aus Polystyren adsorbiert. 50μΙ der Zellkulturüberstände werden in den Antigenbeschichteten Platten über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Waschen werden 50μΙ einer Lösung von Peroxidasekonjugierten Antikörpern spezifisch gerichtet gegen humane Immunglobuline, dazugegeben und 2h bei Raumtemperatur inkubiert. Om gebundene Konjugat wird durch die Substratreaktion mit Wasserstoffperoxid und o-Phenylendiamin nachgewiesen. Die Farbreaktion wird bei 492 nm mit einem Multiscan Vertikalphotometer gemessen. IgG- und IgM-lsotypen werden in den Zellkulturüberständen mit einem Zweiseiten-Bindungsassay getestet (Jahn, S., S.T. Kiessig, A. Lukowsky, H.-D. Volk, T. Porstmann, R. Grunow u. R. v. Baehr: Pokeweed mitogen induced synthesis of human IgG and IgM in vitro. Biomed. Biochim. Acta 45 [1986), 467).3. Enzyme immunoassay (EIA): The detection of specific anti-HIV antibodies is done by means of a sandwich EIA. Electron microscopically pure HIV particles from cell lysate of HIV-infected H9 cells are adsorbed at a protein concentration of 10 ng / ml on flat-bottom polystyrene microtiter plates. 50μΙ of the cell culture supernatants are incubated in the antigen-coated plates overnight at room temperature. After washing, 50 μl of a solution of peroxidase-conjugated antibodies specifically directed against human immunoglobulins are added and incubated for 2 hours at room temperature. Om- bound conjugate is detected by the substrate reaction with hydrogen peroxide and o-phenylenediamine. The color reaction is measured at 492 nm with a Multiscan Vertical Photometer. IgG and IgM isotypes are tested in the cell culture supernatants with a two-site binding assay (Jahn, S., ST Kiessig, A. Lukowsky, H.-D. Volk, T. Porstmann, R. Grunow, and R. v. Baehr : Pokeweed mitogen induced synthesis of human IgG and IgM in vitro, Biomed., Biochim, Acta 45 [1986], 467).
4. Immunoblottlng: Das gereinigte Virusmaterial wird denaturiert und mit 2,5% Sodium Dodecylsulfat (SDS) und 5% 2-Merkaptoethanol bei 900C für 5 min reduziert und danach in einem 10%igen Polyacrylamid-Slebgel elektrophoretisch getrennt. Die Proteinbanden werden auf Nitrozellulosepapier elektrotransferriert. Nach dem Blocken mit 5% Trockenmilch werden die Streifen in 5ml 1:2 verdünnten Zellkulturüberstand eingetaucht. Die gebundenen Antikörpei werden mit Peroxidase-markierten anti-human IgO-Antikörpern und Färbung mit Diaminobenzidin (0,1 % NiCI2) nachgewiesen.4. Immunoblottlng: The purified virus material is denatured and 2.5% Sodium dodecyl sulfate (SDS) and 5% 2-mercaptoethanol at 90 0 C for 5 min, and thereafter reduced in a 10% polyacrylamide Slebgel electrophoretically separated. The protein bands are electrotransferrated onto nitrocellulose paper. After blocking with 5% dry milk, the strips are dipped in 5 ml of 1: 2 diluted cell culture supernatant. The bound antibodies are detected with peroxidase-labeled anti-human IgO antibodies and stained with diaminobenzidine (0.1% NiCl 2 ).
5. Immunofluoreszenztest: H9- oder K37-Zellen, die eine hohe Infektionsrate mit HIV aufweisen, werden auf 10-FeId-Objektträger aus dem Sediment aufgeschwemmt und luftgetrocknet. Die Zellen werden mit eiskaltem Azeton für 10min fixiert und die Zellkdiurüberstände auf die Präparate für 2 h bei 370C gegeben. Nach dem Auswaschen der überschüssigen Antikörper wird für 45min mit einem FITC-antihuman IgG-Antikörper (ATAB, USA) inkubiert und deren Bindung nach dem Waschen mit einem Umkehrfluoreszenzmikroskop untersucht. Als Positivkontrolle dient ein Serumpool von HIV-Antikörperträgern, und als Negativkontrollen werden negative Zellkulturüberstände bzw. zum Ausschluß von anti-zellulären Antikörpern nicht-infizierte H9- oder K37-Zellen verwendet.5. Immunofluorescence Assay: H9 or K37 cells, which have a high HIV infection rate, are floated on 10-well slides from the sediment and air-dried. The cells are fixed with ice-cold acetone for 10 min and the cell culture supernatants are added to the preparations for 2 h at 37 0 C. After washing out the excess antibody, it is incubated with a FITC-antihuman IgG antibody (ATAB, USA) for 45 min and its binding assayed after washing with a reverse fluorescence microscope. The positive control is a serum pool of HIV antibody carriers and negative controls are negative cell culture supernatants or non-infected H9 or K37 cells to exclude anti-cellular antibodies.
6. Neutralisationstest: Es werden humane T-Zellenlinien (K37) gezüchtet, die mit HIV infiziert (K371") oder nicht infiziert (K37~) sind. Die Infektion der K37 -Zellen kann durch Inkubation dieser Zellen mit einem HlV-haltigen, zellfreien Überstand von K37+- Zellen (Variante 1) oder durch Vermischen von K37~- und K37+-Zellen im Verhältnis 100:1 erfolgten (Variante 2). Die Ausbreitung der Infektion in den davon angelegten Zellkulturen wird mit dem Immunfluoreszinztest unter Verwendung eines spezifischen anit-HIV-Antiserums festgestellt. Wird während der Infektionsphase bestimmtes polyklonales anti-HIV-Humanserum den Kulturen zugesetzt, kommt es zur Verhinderung oder Verzögerung der Infektionsausbreitung. Setzt man anstelle des Antiserums z. B. den humanen mAK CB-hgp41 -1 zu, kommt es überraschenderweise zu einem ähnlichen Effekt, insbesondere bei der Variante 2.6. Neutralization Test: Human T-cell lines (K37) infected with HIV (K37 1 ") or uninfected (K37 ~) are cultured Infection of the K37 cells may be achieved by incubation of these cells with an HIV-containing, Cell-free supernatant from K37 + cells (variant 1) or by mixing K37 + and K37 + cells in a ratio of 100: 1 (variant 2) The spread of the infection in the cell cultures applied thereto is determined by the immunofluorescence test using a If anti-HIV human polyclonal anti-HIV serum is added to the cultures during the infection phase, infection may be prevented or delayed by using, for example, the human mAb CB-hgp41-1 instead of the antiserum , Surprisingly, there is a similar effect, especially in variant 2.
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| DD31847888A DD274448A1 (en) | 1988-07-29 | 1988-07-29 | METHOD FOR THE PRODUCTION OF HUMAN MONOCLONAL ANTICOERPER AGAINST STRUCTURAL PROTEINS OF HIV |
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| DD (1) | DD274448A1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0535154A4 (en) * | 1990-06-15 | 1993-12-01 | New York University | Heterohybridomas producing human monoclonal antibodies to hiv-1 |
-
1988
- 1988-07-29 DD DD31847888A patent/DD274448A1/en not_active IP Right Cessation
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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