DD268162B1 - PROCESS FOR THE PREPARATION OF MONOCLONAL ANTIBODIES TO HUMAN IMMUNE LOBULIN M (IGM) - Google Patents
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Description
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, solche monoklonalen Antikörper mit Verfahren aufzufinden, die eine frühestmögliche Auswahl der Antikörper erlauben. Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen humanes IgM Ist dadurch gekennzeichnet, daß aus dem Serum gesunder Spender humanes IgM nach an sich bekannten Methoden, wie Ammonlumsulfat-PrSzipitation, Ultrazentrifugation und lonenaustauschchromatografie, isoliert wird, mit dem 6-10 Wochen alte weibliche AJ-Mäuse durch mehrere Intraperitoneale Applikationen des Antigens immunisiert werden. Die Lymphozyten werden aus den Milzen der immunisierten Mäuse in bekannter Weise isoliert, mit Mausmyelomzellen der Linie P3-X63-AG 8.653 fusioniert und die Zeilsuspension in Selektionsmedium kultiviert. Die Zellkulturüberstände mit Hybridzellwachstum werden auf antigenspezifische Antikörperbildung im direkten EIA geprüft. Nach Klonselektion der positiv reagierenden Kavitäten und Überführung in die nächstgrößeren Zellkulturgefäße werden nur die Hybridzellen weiter vermehrt, die im direkten EIA mit humanem IgM, nicht aber mit den Immunglobulinen der Isotypen G und A reagieren. Die so erhaltenen Hybridome werden Moniert und rekloniert und die erhaltenen spezifischen Subklone nach an sich bekannten Verfahren in flüssigem Stickstoff kryokon3erviert.The invention has for its object to find such monoclonal antibodies with methods that allow earliest possible selection of antibodies. The process according to the invention for the production of monoclonal antibodies against human IgM is characterized in that human IgM is isolated from the serum of healthy donors by methods known per se, such as ammonium sulphate precipitation, ultracentrifugation and ion exchange chromatography, with the female AJ 6-10 weeks old Mice are immunized by multiple intraperitoneal applications of the antigen. The lymphocytes are isolated from the spleens of the immunized mice in a known manner, fused with mouse myeloma cells of the line P3-X63-AG 8.653 and cultured the cell suspension in selection medium. The cell culture supernatants with hybrid cell growth are tested for antigen-specific antibody formation in the direct EIA. After clone selection of the positively reacting cavities and transfer into the next larger cell culture vessels, only the hybrid cells are further increased, which react in the direct EIA with human IgM, but not with the immunoglobulins of the isotypes G and A. The hybridomas obtained in this way are cloned and recloned, and the specific subclones obtained are cryoconjugated by conventional methods in liquid nitrogen.
Für die Entscheidung, welche monoklonalen Antikörper geeignet sind, in einem Capture-EIA humanes IgM aus verdünnten Körperflüssigkeiten zu binden, wird ein indirekter EIA herangezogen.To determine which monoclonal antibodies are suitable for binding human IgM from diluted body fluids in a capture EIA, an indirect EIA is used.
Nach bekannten Methoden wird durch einen polyklonalen Anti-Human-lgM-Festphasen-Antikörper IgM aus einem verdünnten Serumpool gebunden und den monoklonalen Antikörpern der Zellkulturüberstände als „natives Antigen" präsentiert. Die gebundenen monoklonalen Antikörper werden wie im direkten Nßchweissystem bestimmt. Unter den etablierten Hybridomen befinden sich 4 ZellinienAccording to known methods, IgM from a diluted serum pool is bound by a polyclonal anti-human IgM solid-phase antibody and presented to the monoclonal antibodies of the cell culture supernatants as a "native antigen." The bound monoclonal antibodies are determined as in the direct NWD system There are 4 cell lines
Sifin-lgM-8D10 Sifin-lgM-9G1 Sifin-lgM-10F6 Sifin-lgM-11G4,Sifin-IgM-8D10 sifin-IgM-9G1 sifin-IgM-10F6 sifin-IgM-11G4,
0.3 im direkten und indirekten EIA gleichermaßen hochaktiv reagieren. Diese Hybridome wurden in der ZIM-Hinterlegungsstellefür Zellinien unter den Nummern ZIM-0254, ZIM-0253, ZIM-0252 und ZIM-0255 hinterlegt.0.3 in the direct and indirect EIA react equally highly active. These hybridomas have been deposited in the ZIM cell site depository under numbers ZIM-0254, ZIM-0253, ZIM-0252 and ZIM-0255.
belegt.busy.
1. Milzzellen von AJ-Mä'jsen werden nach 3 intraperitonealen Injektionen mit einer menschlichen IgM-Fraktion gewonnen und nach den bekannten Techniken (Kearney et al., J. Immunol. 123 [1979], 1548) mit Zellen der MyelomzellinieP3- X63-AG8.653 fusioniert. Die Zellsu3pension wird in HAT-Selektionsmedium (Littlefield, Science 145 [1964], 709) RPMI 1640, supplemented mit 20%fetalem Kälberserum, 2mMol/l Glutamin, 5 χ 10"6Mol/l2-Mercaptoethanol, 2g/l Natriumbicarbonat, 10mMol/l Hepes, 240IE/ml Penicillin, 150pg/ml Streptomycin, 4 x 10~7Mol/l Aminopterin, 1 χ 10"4Mol/IHypoxanthin,1,6 x 10"6Mol/IThymidin, unter Zusatz von 1 χ 106Maus-Peritonealexsudatzellen/ml Kulturmedium bei 370C in einer wassergesättigten 5-6%igen COj-Atmosphäre inkubiert.1. Spleen cells of AJ mice are obtained after 3 intraperitoneal injections with a human IgM fraction and isolated according to the known techniques (Kearney et al., J. Immunol., 123 [1979], 1548) with cells of the myeloma cell line P3-X63- AG8.653 merged. The Zellsu3pension is in HAT selective medium (Littlefield, Science 145 [1964], 709) RPMI 1640 supplemented with 20% fetal calf serum, 2 mmol / l glutamine, 5 χ 10 "6 mol / l 2-mercaptoethanol, 2 g / l sodium bicarbonate, 10 mmol / l Hepes, 240IE / ml penicillin, 150pg / ml streptomycin, 4 x 10 -7 mol / l aminopterin, 1 χ 10 "4 mol / IHypoxanthin, 1.6 x 10" 6 mol / IThymidin, χ with the addition of 1 10 6 mouse peritoneal sowing cells / ml culture medium at 37 0 C in a water-saturated 5-6% COj atmosphere incubated.
2. Zur Selektion von Hybridzellen, die spezifische Antikörper gegen humanes IgM in das Kulturmedium sezernieren, wird nach dem ersten Mediumwechsel ein direkter EIA durchgeführt. Unter sterilen Bedingungen werden 20 μΙ Zellkulturüberstand der Masterplatten in 80 μΙ Pufferlösung der mit einer humanen IgM-Fraktion beladenen EIA-Platten überführt. Die Hybridzellklone der Kavitäten mit positiver Reaktion wei den in die nächstgrößeren Gewebekulturplatten überführt und deren Zellkulturüberstände im direkten EIA auf Vorhandensein spezifischer Antikörper mit den Beschichtungsantigenen humanes IgG, IgA und IgM geprüft. Von den IgM-spezifischen Hybridzellen werden sowohl Kryokonserven als auch Reklonierungen angelegt.2. For the selection of hybrid cells which secrete specific antibodies to human IgM in the culture medium, a direct EIA is performed after the first medium change. Under sterile conditions, 20 .mu.l cell culture supernatant of the master plates are transferred into 80 .mu.l buffer solution of the human IgM fraction-loaded EIA plates. The hybrid cell clones of the positive reaction cavities are transferred to the next larger tissue culture plates and their cell culture supernatants in the direct EIA are checked for the presence of specific antibodies with the coating antigens human IgG, IgA and IgM. Of the IgM-specific hybrid cells, both cryopreserved and recloned are applied.
3. Zur Einschätzung der Eignung der IgM-spezifischen monoklonalen Antikörper für einen IgM-Antikörper-capture-EIA werden die Zellkulturüberstände mit einem indirekten EIA überprüft. Das Antigen, humanes IgM aus einem Serumpool, wird über einen adsorbtiv gebundenen polyklonalen Anti-Human-lgM-Antikörper (Ziege) den monoklonalen Antikörpern des Zellkulturüberstandes präsentiert und die Bindungsreaktion durch einen Peroxidase-markierten Anti-Maus-Antikörper (Ziege) angezeigt. Lediglich 20% der etablierten Hybridome zeigen in diesem Testsystem eine positive Reaktion.3. To assess the suitability of the IgM-specific monoclonal antibodies for an IgM antibody capture EIA, the cell culture supernatants are checked with an indirect EIA. The antigen, human IgM from a serum pool, is presented to the monoclonal antibodies of the cell culture supernatant via an adsorptively bound polyclonal anti-human IgM antibody (goat) and the binding reaction is indicated by a peroxidase-labeled anti-mouse antibody (goat). Only 20% of the established hybridomas show a positive reaction in this test system.
4. Die Zellinien der im direkten und indirekten Testsystem hochaktiv reagierenden Antikörper4. The cell lines of the highly active in the direct and indirect test system antibodies
Sifin-lgM-8D10 (ZIM-Nr. 0254) Sifin-lgM-9G1 (ZIM-Nr.0253) Sifin-lgM-1OF6(ZIM-Nr.O252) Sifin-lgM-11 Q4 (ZIM-Nr.0255)Sifin-IgM-8D10 (ZIM No. 0254) sifin-IgM-9G1 (ZIM No. 0253) sifin-IgM-1OF6 (ZIM No. O252) sifin-IgM-11 Q4 (ZIM No. 0255)
werden mit den bekannten Zellkulturtechniken vermehrt bzw. wachsen nach Zelltransfer in mit Pristane (2,6,10,14 — Tetramethylpentadecan) behandelten syngenen Mäusen als Ascitestumor.are propagated by the known cell culture techniques after cell transfer in Pristane (2,6,10,14-tetramethylpentadecane) treated syngeneic mice as ascites tumor.
Die sezernierten monoklonalen Antikörper werden sowohl aus dem Zellkulturüberstand als auch aus dem Ascitespunktat nach bekannten Verfahren gereinigt. Besonders geeignete Präparationen lassen sich nach Affinitätschromatografie über IgM-Sepharose darstellen.The secreted monoclonal antibodies are purified from both the cell culture supernatant and the ascites punctate by known methods. Particularly suitable preparations can be prepared by affinity chromatography over IgM-Sepharose.
monoklonalen Anti-Human-lgM-Antikörpern aus den Zellkulturüberständen wird mit einem Anti-Maus-Ig-Antikörper-Monoclonal anti-human IgM antibodies from the cell culture supernatants are incubated with an anti-mouse Ig antibody.
Abb. 2Fig. 2
in Kontakt gebracht. Die Bindung von humanem IgM wird mit einem polyklonalen Anti-Human-lgM-Antikörper-brought into contact. The binding of human IgM is monitored with a polyclonal anti-human IgM antibody
Abb. 3Fig. 3
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CN108330105B (en) * | 2018-03-30 | 2020-07-14 | 四川迈克生物新材料技术有限公司 | Anti-human IgM monoclonal antibody, hybridoma cell strain and application thereof |
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