DD268162B1

DD268162B1 - Verfahren zur herstellung von monoklonalen antikoerpern gegen humanes immunglobulin m (igm)

Info

Publication number: DD268162B1
Application number: DD31218488A
Authority: DD
Inventors: Herbert Dr-Ing Dipl- Musielski; Andrea Dipl-Chem Dr Re Koehler; Renate Dr-Ing Dipl-Ing Laue
Original assignee: Musielski Herbert Dr Ing Dipl; Koehler Andrea Dipl Chem Dr Re; Laue Renate Dr Ing Dipl Ing
Priority date: 1988-01-12
Filing date: 1988-01-12
Publication date: 1991-03-28
Also published as: DD268162A1

Description

Darlegung des Wesen» der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, solche monoklonalen Antikörper mit Verfahren aufzufinden, die eine frühestmögliche Auswahl der Antikörper erlauben. Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen humanes IgM Ist dadurch gekennzeichnet, daß aus dem Serum gesunder Spender humanes IgM nach an sich bekannten Methoden, wie Ammonlumsulfat-PrSzipitation, Ultrazentrifugation und lonenaustauschchromatografie, isoliert wird, mit dem 6-10 Wochen alte weibliche AJ-Mäuse durch mehrere Intraperitoneale Applikationen des Antigens immunisiert werden. Die Lymphozyten werden aus den Milzen der immunisierten Mäuse in bekannter Weise isoliert, mit Mausmyelomzellen der Linie P3-X63-AG 8.653 fusioniert und die Zeilsuspension in Selektionsmedium kultiviert. Die Zellkulturüberstände mit Hybridzellwachstum werden auf antigenspezifische Antikörperbildung im direkten EIA geprüft. Nach Klonselektion der positiv reagierenden Kavitäten und Überführung in die nächstgrößeren Zellkulturgefäße werden nur die Hybridzellen weiter vermehrt, die im direkten EIA mit humanem IgM, nicht aber mit den Immunglobulinen der Isotypen G und A reagieren. Die so erhaltenen Hybridome werden Moniert und rekloniert und die erhaltenen spezifischen Subklone nach an sich bekannten Verfahren in flüssigem Stickstoff kryokon3erviert.

Für die Entscheidung, welche monoklonalen Antikörper geeignet sind, in einem Capture-EIA humanes IgM aus verdünnten Körperflüssigkeiten zu binden, wird ein indirekter EIA herangezogen.

Nach bekannten Methoden wird durch einen polyklonalen Anti-Human-lgM-Festphasen-Antikörper IgM aus einem verdünnten Serumpool gebunden und den monoklonalen Antikörpern der Zellkulturüberstände als „natives Antigen" präsentiert. Die gebundenen monoklonalen Antikörper werden wie im direkten Nßchweissystem bestimmt. Unter den etablierten Hybridomen befinden sich 4 Zellinien

Sifin-lgM-8D10 Sifin-lgM-9G1 Sifin-lgM-10F6 Sifin-lgM-11G4,

0.3 im direkten und indirekten EIA gleichermaßen hochaktiv reagieren. Diese Hybridome wurden in der ZIM-Hinterlegungsstellefür Zellinien unter den Nummern ZIM-0254, ZIM-0253, ZIM-0252 und ZIM-0255 hinterlegt.

Die monoklonalen Antikörper dieser Zellinien sind vom lgG,-lsotyp. Die μ-Kettenspezifität ist durch den Immunoblottest

belegt.

Der Hauptvorteil derartiger Antikörper liegt in der strikten Standardisierung der Herstellung von hochspezifischen Testreagenzien, mit denen klinisch relevante Aussagen, wie die Ermittlung des akuten Infektionsstatus bei Schwangeren (Röteln, Toxoplasmose), mit höchstmöglicher Präzision getroffen werden müssen. Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten monoklonalen Anti-Human-lgM-Antikörper weisen am Beispiel des Antikörpers der Zellinie Sifin-lgM-11G4 im indirekten EIA im Vergleich zum Antikörper der Zellinie BL-lgM/1 deutlich höhere Bindungseigenschaften auf (Abb. 1). Die Überprüfung der Fangeigenschaften des nach an sich bekannten Verfahren gereinigten monoklonalen Antikörpers Sifin-lgM-11G4 weist im Gegensatz zu den monoklonalen Antikörpern BL-lgM/1 und BL-lgM/11 auf eine wesentliche Erhöhung der Empfindlichkeit für Capture-EIA in der Diagnostik akuter erregerbedingter Erkrankungen hin (Abb. 2). Im direkten IgM-Antikörper-capture-EIA können gegenüber polyklonalen Anti-Human-lgM mit dem monoklonalen Antikörper Sifin- IgM-11G 4 sowohl für die Diagnostik akuter Cytomegalievirusinfektionen (Abb. 3) als auch akuter Toxoplasmoseinfektionen deutlich empfindlichere Testbedingungen geschaffen werden. Ausführungsbeispiel

1. Milzzellen von AJ-Mä'jsen werden nach 3 intraperitonealen Injektionen mit einer menschlichen IgM-Fraktion gewonnen und nach den bekannten Techniken (Kearney et al., J. Immunol. 123 [1979], 1548) mit Zellen der MyelomzellinieP3- X63-AG8.653 fusioniert. Die Zellsu3pension wird in HAT-Selektionsmedium (Littlefield, Science 145 [1964], 709) RPMI 1640, supplemented mit 20%fetalem Kälberserum, 2mMol/l Glutamin, 5 χ 10"⁶Mol/l2-Mercaptoethanol, 2g/l Natriumbicarbonat, 10mMol/l Hepes, 240IE/ml Penicillin, 150pg/ml Streptomycin, 4 x 10~⁷Mol/l Aminopterin, 1 χ 10"⁴Mol/IHypoxanthin,1,6 x 10"⁶Mol/IThymidin, unter Zusatz von 1 χ 10⁶Maus-Peritonealexsudatzellen/ml Kulturmedium bei 37⁰C in einer wassergesättigten 5-6%igen COj-Atmosphäre inkubiert.

2. Zur Selektion von Hybridzellen, die spezifische Antikörper gegen humanes IgM in das Kulturmedium sezernieren, wird nach dem ersten Mediumwechsel ein direkter EIA durchgeführt. Unter sterilen Bedingungen werden 20 μΙ Zellkulturüberstand der Masterplatten in 80 μΙ Pufferlösung der mit einer humanen IgM-Fraktion beladenen EIA-Platten überführt. Die Hybridzellklone der Kavitäten mit positiver Reaktion wei den in die nächstgrößeren Gewebekulturplatten überführt und deren Zellkulturüberstände im direkten EIA auf Vorhandensein spezifischer Antikörper mit den Beschichtungsantigenen humanes IgG, IgA und IgM geprüft. Von den IgM-spezifischen Hybridzellen werden sowohl Kryokonserven als auch Reklonierungen angelegt.

3. Zur Einschätzung der Eignung der IgM-spezifischen monoklonalen Antikörper für einen IgM-Antikörper-capture-EIA werden die Zellkulturüberstände mit einem indirekten EIA überprüft. Das Antigen, humanes IgM aus einem Serumpool, wird über einen adsorbtiv gebundenen polyklonalen Anti-Human-lgM-Antikörper (Ziege) den monoklonalen Antikörpern des Zellkulturüberstandes präsentiert und die Bindungsreaktion durch einen Peroxidase-markierten Anti-Maus-Antikörper (Ziege) angezeigt. Lediglich 20% der etablierten Hybridome zeigen in diesem Testsystem eine positive Reaktion.

4. Die Zellinien der im direkten und indirekten Testsystem hochaktiv reagierenden Antikörper

Sifin-lgM-8D10 (ZIM-Nr. 0254) Sifin-lgM-9G1 (ZIM-Nr.0253) Sifin-lgM-1OF6(ZIM-Nr.O252) Sifin-lgM-11 Q4 (ZIM-Nr.0255)

werden mit den bekannten Zellkulturtechniken vermehrt bzw. wachsen nach Zelltransfer in mit Pristane (2,6,10,14 — Tetramethylpentadecan) behandelten syngenen Mäusen als Ascitestumor.

Die sezernierten monoklonalen Antikörper werden sowohl aus dem Zellkulturüberstand als auch aus dem Ascitespunktat nach bekannten Verfahren gereinigt. Besonders geeignete Präparationen lassen sich nach Affinitätschromatografie über IgM-Sepharose darstellen.

Indirekte Enzymimmunbestimmung (EIA) von monoklonalen Anti-Human-lgM-Antikörpern (mAK) aus dem Zellkulturüberstand. Mikrotestplatten werden mit polyklonalen Anti-Human-lgM-Antikörpern (SIFIN) absorbtiv beschichtet und nach Bindung von IgM aus einem humanen Serumpool bzw. aus Serum eines Myelompatienten mit den angezeigten Verdünnungen von Zellkulturüberständen stationärer Kulturen der Zeilinien Sifin—IgM — 11G4 und BL-lgM/1 in Kontakt gebracht. Die Bindung von

monoklonalen Anti-Human-lgM-Antikörpern aus den Zellkulturüberständen wird mit einem Anti-Maus-Ig-Antikörper-

Peroxidasekonjugat (SIFIN) und Jem Substrat H]O₂ und Orthophenylendiamin angezeigt und photometrisch bewertet.

Abb. 2

Direkte Enzymimmunbestimmung (EIA) von humanem IgM mit monoklonalen Festphasenantikörpern. Mikrotestplatten werden mit den Sättigungskonzentrationen der gereinigten monoklonalen Antikörper Sifin-lgM-11 G4, BL-lgM/1 und BL-lgM/11 absorbtiv beschichtet und mit den angezeigten Serumkonzentrationen eines Spenderpools (30 Proben)

in Kontakt gebracht. Die Bindung von humanem IgM wird mit einem polyklonalen Anti-Human-lgM-Antikörper-

Peroxidasekonjugat und dem Substrat H₂O₂ und Orthophenyldiamin angezeigt und photometrisch bewertet.

Abb. 3

Vergleich von polyklonelen und monoklonalen Festphasen-Antikörpern zur Bewertung von Cytomegalievirus-spezifischen IgM- Antikörpern in positiven Patientenseren. Mikrotestplatten wurden parallel mit dem gereinigten monoklonalen Antikörper Sifin — IgM — 11G 4 und einem polyklonalen Anti-Human-lgM-Antikörper beschichtet und mit den angegebonen Serumkonzentrationen von 3 ausgewählten positiven Patienten (Cytomegalievirus-spezifische IgM-AK) in Kontakt gebracht. Die Bindung von erregerspezifischem IgM wird mit einem Peroxidase-markierten Cytomegalievirusantigen und dem Substrat H₂O₂ und Orthophenylendiamin angezeigt und photometrisch bewertet.

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen humanes Immunglobulin M durch Fusionierung von Milzlymphozyten von AJ-Mäusen, die mit gereinigtem humanem Immunglobulin M immunisiert wurden, mit Mausmyelomzellen der Linie P3-X63-AG 8.653 und anschließende Selektierung der erhaltenen Zellhybride unter Anwendung direkter oder indirekter Enzymimmunbestimmungsmethoden sowie Klonierung, Kryokonservierung und Kultivierung der selektierten antikörperbildenden Hybridome, dadurch gekennzeichnet, daß für die Antikörperproduktion die mit den Hinterlegungsnummern ZIM 0254, ZIM 0253, ZIM 0252 oder ZIM 0255 gekennzeichneten Hybridome eingesetzt warden.

Hierzu 3 Seiten Zeichnungen

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen humanes IgM. Das Hauptanwendungsgeblet dieser monoklonalen Antikörper liegt in der Medizin z. B. in der Diagnostik akuter erregerbedingter Erkrankungen in klinisch-diagnostischen Einrichtungen des Gesundheitswesens.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

In der Diagnostik von akuten erregerbedingten Erkrankungen werden gegenwärtig der Bestimmung von spezifischen IgM-Antikörpern Prioritäten eingeräumt. Neben den klassischen Nachweismethoden der Auftrennung der Patientenseren mittels Dichtegradientenzentrifugation oder Gelfiltration und des anschließenden Nachweises des erregerspezifischen IgM mittels Hämagglutinationshemmtesten oder indirekten Fluoreszenzantikörpertesten haben sich gegenwärtig Enzymimmunbestimmungsmethoden (EIA) durchgesetzt (Voller et al.. Bull. World Health Organ. 53 [1976], 55; Blomberg et al., J.Clin. Microbiol. 17 (1983], 1081; Kurstaket al., Bull. World Health Organ. 64 [1986], 465). Die anfänglich gewählten indirekten EIA-Methoden, bei denen trägerfixiertes Antigen spezifische Antikörper aus dem Patientenserum bindet, wurden wegen ihrer häufigen falsch negativen Aussagen, hervorgerufen durch die Konkurrenz von erregerspezifischen IgG- und IgM-Antikörpern, zu Gunsten von direkten „IgM-capture-EIA'-Methoden zurückgedrängt.

Beim IgM-Antikörper-capture-EIA wird selektiv das IgM aus menschlichen Körperflüssigkeiten über einen trägerfixierten Anti-Human-IgM-Antikörper an die „fet. .e Phase" gebunden (Duermeyer et al., J. Clin. Microbiol. 12 [1980], 805; Schmitz et al., J. Gon. Virol. 50 [1980], 59; Isaac et al., J. Med. Virol. 64 [1982], 55; Nielsen et al., J. Med. Viral. 22 [1987], 67). Nichterfaßtes IgG wird durch Waschen ontfernt. Der erregerspezifische Nachweis wird über ein markiertes Antigen bzw. über einen markierten antigenspezifischen Antikörper geführt. Gegen die wichtigsten Infektionserkrankungen (Röteln, CMV, Hepatitis A und B, Toxoplasmose, Mumps, Masern, Lues etc.) liegen international indirekte und direkte Testsysteme vor. Der Aussagewert der IgM-capture-EIA hängt von der Qualität des trägergebundenen Anti-Human-Testreagens'ab. Die Produktion konventioneller polyklonaler Antikörper benötigt extensive Absorptionsprozeduren zur Eliminierung von kreuzreagierenden Antikörpern. Auch die Bindungscharakteristika schwanken teilweise erheblich von Tier zu Tier und Abnahme zu Abnahme, so daß eine Chargenstandardisierung große Schwierigkeiten bereitet. Diese Probleme können durch monoklonale Anti-Human-/Antikörper (μ-kettenspezifisch) überwunden werden.

Die nach Spezifität und Bindungsverhalten für ein derartiges Testsystem ausgewählten mAK garantieren die Standardisierung der Herstellung des Festphasenantikörpers und seines Verhaltens im Testsystem. Die bisher in der DDR vorliegenden monoklonalen Antikörper gegen humanes IgM, BL-lgM/1 (DD-PS 230879) und BL-lgM/11 (registriert in der ZIM-Hinterlegungsstelle unter den Nummern ZIM-0056 und ZIM-0093) sind für den genannten Anwendungsbereich nur bedingt einsetzbar. In vergleichenden Untersuchungen zum Toxoplasmose- und CMV-EIA war der BL-lgM/1 -Antikörper polyklonalen Antikörperpräparationen deutlich unterlegen.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung hat das Ziel, in leicht beherrschbarer Weise und kostengünstig monoklonale Antikörper gegen humanes IgM bereitzustellen, die in ihren Reaktionsparametern (Spezifität und Affinität) für einen IgM-Antikörper-capture-EIA geeignet sind und deren Stabilität in der Angebotsform .,Lyophilisat" gewährleistet ist.