DD280785B5 - Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikoerper gegen das Gruppenpolysaccharid der B-Streptokokken - Google Patents

Description

Als Fusionspartnei für diese Zellen wurden Mausmyelomzellen der Linie P 3 X 63 Ag 8/653 (Kearney et al., J. Immunol., 1979,123, 1548) verwendet. Die Kultivierung dieser Zellen erfolgte in einem Zellzuchtmedium RPM11640, das mit 10% fetalem Kälberserumt (FKS) supplementiert wurde.

Die Zellfusion wurde nach Vermischen beider Fusionspartner im Verhältnis 1:5 (Myelomzellinie zu Milzzellen) und ihrer Sedimentation unter Verwendung von Polyethylenglykol durchgeführt. Anschließend erfolgte die Verteilung der fusionierten Zeilön in eine Vielzahl von separaten 200μΙ Kulturen. Zur Selektion der fusionierten von den nichtfusionierteh Myelomzellen wurde ein Zellkulturmedium, das Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin (HAT) enthielt (LITTLEFIELD, Science 1964,145,709), verwandt. Damit erfolgte erfindungsgemäß die Abtrennung jener Klone, die Antikörper der gewünschten Spezifität produzieren. Die Detektion dieser Klone erfolgte durch den Nachweis sezernierter Antikörper in den Zellkulturüberständen wachsender Hybridome mittels eines spezifischen Enzymimmunoassay, der auf der Festphasenbindung von Phenol/Wasser-extrahiertem B-Streptokokken-Gruppenpolysaccharid beruht.

Die so detektieren Antikörper sind spezifisch für das B-Streptokokken-Gruppenpolysacchaiid des Streptococcus agalac^ae. Ermittelte Primärzelikulturen wurden bis zur Monoklonalität kloniert und rekloniert, bis gesichert monoklonale Subklone mit stabiler Antikörperprcduktion in hoher Qualität und Quantität etabliert waren. Diese Hybridome bezeichneten wir als H-CB-GBS. Besonders geeignet sind die Zellkulturen H-CB-GBS-M1,-M 2, -M3.-M4, -M 5, -M6,-M7 und M8.

Die aufgeführten Hybridome sind in der Hinterlegungsstello des Zentralinstituts für Molekularbiologie der AdW, Berlin-Buch, unter folgenden Nummern registriert:

H-C3-GBS-M 8 als ZIM-0290 H-CB-GBS-M7 als ZIM0291 H-CB-GBS-M 6 als ZIM-0292 H-CB-GBS-M 5 als ZIM-0293 H-CB-GBS-M 4 als ZIM-0294 H-CB-GBS-M 3 als ZIM-0295 H-CB-GBSM 2 als ZIM-0293 H-CB-GBS-M1 als ZIM-0297

Die aufgeführten Hybridomzellkultuten eignen sich für eine Massenproduktion von monoklonalen Antikörpern in vivo und in vitro.

Bei der in vitro-Kultivierung der genannton Hybridome lassen sich bei Aussaat von 5.1O⁵ Zellen in herkömmliche 6-well-Zellkulturplatten bis zu 25pg/lgG pro ml Zellkulturüberstand und 3(^g IgM pro ml Zellkulturüberstand nachweisen. Die in vivo-Produktion monoklonaler Antikörper erfolgte durch intra-peritoneale Applikation von 2-10 x 10^e Zellen/ml in mit Pristan vorbehandelter Mäuse nach bekanntem Verfahren. Nach etwa 8-24 Tagen lassen sich durch Punktion bis zu 10 ml Ascitesflüssigkeit konnten bis zu 20mg spezifischer Antikörper nachgewiesen werden. Auf diese Weise konnten aus den genannten Hybridomen die monoklonalen Antikörper CB-GBS-M1, -M 2, -M3, -M4, -M 5, -M 6, -M7 und -M 8 gewonnen werden. Durch verschiedene biochemische und immunochemische Verfahren lassen sich die Antikörper bis zu einem hohen Reinheitsgrad anreichern. Für die Entwicklung bestimmter Testverfahren lassen sich die Antikörper mit Partikeln bzw. mit Enzymen koppeln. Sie können außerdem biotiniliert bzw. für Reinigungsverfahren an Trägermaterialien gekoppelt werden. Die erfindungsgemäß hergestellten monoklonalen Antikörper (mAK) weisen einen hohen Grad an Spezifitätscharakterisierung gegenüber verschiedenen bakteriellen Antigenen auf, die als kreuzroagierende Komponenten einen Einsatz der bisher beschriebenen mAK einschränken wurden. Die neuen mAK zeichnen sich ferner durch eine nacf) Produktions- und Wachstumscharakteristik ausgewiesene hohe Produktion an spezifischen Antikörpern unter in vitro- und in vivo-Bedingungen aus.

Ausführungsbeispiole

Beispiel I

Über einen Zeitraum von 8 Wochen werden 3 weibliche Mäuse im Alter von 8 bis 10 Wochen (Balb/c-Mäuse) 2x wöchentlich mit ΙΟΟμΙ einer formalinabgetcteten B-Streptokokken-Vollkeimsuspension (optische Dichte 1,0 in der 1 cm-Küvette bei 650nm) intravenös immunisiert. 4 Tage nach der letzten Immunisierung werden 2 x 10⁸ Milzzellen isoliert. Diese werden durch Polyethylenglykol 1500 mit 2 x 10⁷ Myelomzellen der Linie P3 X63 Ag8/653 fusioniert. Nach entsprechenden Waschschritten werden die Zellen in 96well-Zellkulturplatten mit 10^s Zellen/well in 100μι ausplattiert. Das Standardzellkulturmedium besteht aus RPM11640 mit 10% FKS. Am folgenden Tag werden 100 μΙ eines doppelt konzentrierten HAT-Mediums zugesetzt. Nach einer WochewerdenöOplHAT-Medium pro well zugegeben. Nach etwa 14 Tagen erfolgt die Prüfung der Primärkuliuren mittels eines hochspezifischen EIA auf die Produktion B-Streptokokken-Gruppenpolysaccharid-spezifischer Antikörper der Maus-Immunglobulinklasse M. Nach dem genannten Verfahren können bis zu 10%-spez. IgM-Antikörper-produzierendo Primärkulturen erzeugt werden.

Die positiven Primärkulturen werden auf Pentonealmakrophagen der Maus dOVwoll) nach dem Grenzverdünnungsverfahren kloniert und rekloniert. Auf diese Weise kann eine hohe Zahl monoklonaler Zellinien mit spezifischer Anti-Gruppe-B-Streptokokken-Gruppen-Polysaccharid-Antikörperproduktion gewonnen werden.

Beispiel Il

Die bis zur Monoklonalität gezüchteten Zellinien mit spez. Antikörperproduktion gegen B-Streptokokken-Gruppen-Polysaccharid werden in feuchter Atmosphäre mit einem 5-%igen CO₂-Anteil in einem Standardkulturmedium gezüchtet. Schrittweise Adaptierung erlaubt die Verringerung des FKS-Anteils auf 2-5%. Durch Verdünnung im Verhältnis 1:10 wird das Zellkulturvolumen schrittweise vergrößert. Nach Erreichen der Massenkultur in Rollerflaschen von 500ml Fassungsvermögen ist die Passage in den 5Ol Bioreaktor möglich.

Beispiel MI

In 6-well-KulturplaUeri werden die rnonoklonalen Hybridome bis auf Zeitzahlen von 1 χ 10°ml gezüchtet. Dio Zellen worden 2x in isotonischer Phosphatpufferlösung gewaschen und in einer Konzentration von 5 χ 10^s Hybridomzellen/ml in der gleichen Lösung aufgenommen. JeImI dieser Zellsuspension wird in Balb/c-Mäuse, die 8 Tage vorher mit 1 ml Pristan i. p. behandelt wurden, i. p. appliziert. Dia Ascitesproduktion läßt sich nach 8-14 Tagen an der Bauchschwellung der Mäuse feststellen. 2-15ml Ascites mit einom Antikörpergehalt von bis zu 20mg spezifischem Antikörper konnten pro Maus gewonnen werden. Die Reinigung der Antikörper erfolgte nach bekannten Verfahren.

Beispiel IV

Nach dem beschriebenen Schema wurden Hybridomzellinien mit monoklonaler Antikörperproduktion gegen B-Streptokokkengruppenpolysaccharid gewonnen, die mit H-CB-GBS-M1, -M 2, -M3, -M4, -M 5, -M6, -M7 und -M8 bezeichnet wurden. Diese Zellinien wurden bezüglich ihrer Spezifität getestet (Tabelle 1) und für die Optimierung des Verfahrens der Herstellung entsprechender Antikörper charakterisiert (Tabelle 2).

Tabells 1: Spezifitätstestung monoklonaler Antikörper gegen das B-Sueptokokken-Gruppenpolys3ccharid des Sc. agalactiae Extinktion 46onm (Entwicklung, Peroxidase markierter Antie-Species-Antikörper, Substrat OPD) Testung ZKÜ, Festphäsenbeladung mit LANCEFIcLO-Antigenen aus

Antikörper ScA ScC ScG ScB

CB-GBS-M1	0,130	0,185	0,095	1,941
CB-GBS-M 2	0,098	0,115	0,104	2,000
CB-GBS-M 3	0,074	0,221	0,042	2,000
CB-GBS-M4	0,023	0,056	0,051	2,000
CB-GBS-M 5	0,049	0,088	0,102	2,000
CB-GBS-M 6	0,062	0,033	0,057	2,000
CB-GBS-M7	0,088	0,102	0,100	2,000
CB-GBS-M 8	0,033	0,067	0,042	2,000

Tabelle 2: Charakterisierung der Hybridomzellinien mit monoklonaler Antikörperproduktion gegen Gruppe B-Streptokokken-Gruppenpolysaccharid

Klon	Verdoppelungs	IgM-Produktion	Ig-Klasse	Isoelektr.
	zeit (h)	(Mg 5 χ 105		Punkt
		Zellen/ml)
H-CB-GBS-M1	18	14,5	M	>8,0
H-CB-GBS-M2	31	28,3	M	>8,0
H-CB-GBS-M3		19,5	M	>8,0
H-CBGBS-M4	24	16,2	M	>8,0
H-CB-GBS-M5	37	31,4	M	>8,0
H-CB-GBS-M6	22	15,3	M	>8,0
H-CB-GBS-M7	28	19,2	M	>8,0
H-CB-GBS-M8	20	10,5	M	>8,0

Claims (4)

1. Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper, die Strukturen des B-Streptokokken-Gruppenpolysaccharides des Streptococcus ayalactiae erkennen, durch Immunisierung von Balb/c-Mäusen mit B-Streptokokken und Immortalisierung ihrer Milzlymphozyten mit einer murinen Myelomzellinie, dadurch gekennzeichnet, daß daraus die Hybridomzellen H-CB-GBS-M1 (ZIM-0297) und H-CB-GBS-M 2 (ZIM-0296) selektiert, zur Züchtung eingesetzt und aus dem zellfreien Überstand die monoklonalen Antikörper CB-GBS-M1 und CB-GBS-M 2 isoliert werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Isolierung der Milzlymphozyten erfolgt, nachdem das Antigen 8 bis 10 Wochen alten weiblichen Mäusen über einen Zeitraum von 3 Wochen zweimal wöchentlich intravenös appliziert wurde.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Antikörper biotiniliert oder an Partikel, Enzyme bzw. an Trägermaterialien gekoppelt werden.

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zu,· Herstellung muriner monoklonaler Antikörper gegen das in der Zellwand des Streptococcus agalactiae lokalisierte B-Streptokokken-spezifisches Antigen Ausgangspunkt der Typisiorung des Streptococcus agalactiae nach dom LANCEFIELD-Schema ist.
Das Anwendungsgebiet der Erfindung ist die human- und veterinärmedizinische Diagnostik.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Die Herstellung monoklonaler Antikörper wurde erstmals von KÖHLER und MILSTEIN (Nature 1975,256,495) Mitte der 70er Jahre beschrieben. Die genannten Autoren beschrieben ein Verfahren zur somatischen Fusion von murinen antikörperbildenden Zellen mit permanent wachsenden Plasmozytomzellinien für die Herstellung von Hybridomen, die nach entsprechenden Klonierungsschritten monoklonale Antikörper der Maus gegen gewünschte Antigenspezifitäten produzieren. Mit dieser prinzipiellen biotechnologischen Lösung sind bereits Antikörper gegen B-Streptokokken hergestellt worden (WANGER, A. R. u. G.M.DUNNY, Infection and Immunity 1987, 55,1170; POLIN, R.A. u. R.KENNETT, J. Clin. Microbiology 1980,11,332; RENCH, M.Α., T.G.METZGER u. C. J.BAKER, J. Clin. Microbiology 1934, 20,852; RUCH, F.5. u. LSMITH, J. Clin. Microbiology 1982, 16,145).

Bisher sind allerdings keine Hybridomlinien bekannt, deren Charakterisierungsgrad hohe Antikörperausbeuten, überprüfter Spezifität des Typs H-CB-GBS-M1, -M2, -M3,-M4, -M6, -M7 und -M8 garantiert.

Ziel der Erfindung

Das Ziel der Erfindung besteht in der Herstellung muriner Hybridome, die monoklonale Antikörper sezernieren, die zum Aufbau von Testsystemen für den Nachweis von B-Streptokokken-Gruppenpolysaccharid des Streptococcus agalactiaü innerhalb der humanmedizinischen und veterinärmedizinischen Diagnostik dienen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zu entwickeln, mit dem zunächst effektiv Hybridomzellinien erzeugt werden können, von denen in darauf folgenden Verfahrensschritton Zeilklone isoliert werden, die Antikörper gegen das Gruppenpolysaccharid der B-Streptokokken (Streptococcus agalactiae) sezeri.ioren. Die Hybridomzeüan sollen ökonomisch günstig in vitro und in vivo kultivierbar sein und für darauffolgende Reinigungsschritte ausreichenden Mengen an monoklonalen Antikörpern sozernieren. Die monoklonalen Antikörper sollen bezüglich ihrer Spezifität im ELISA gegenüber verschiedenen anderen bakteriellen Antigenen charakterisiert sein.

Die Aufgabe wurde dadurch gelöst, daß zunächst Mäuse vom Stamm Balb/c mit formalinabgetötoten Bakteriensuspensionen eines B-Streptokokkenstammes (09OR) der Optischen Dichte 1,0 mit 100 μΙ je Immunisierungsdosis nach einem bestimmten erfinderischen Schema immunisiert wurden. Die Immunisierung erfolgte über einen Zeitraum von 8 Wochen bei zweimaliger intravenöser Applikation der genannten Immunisierungsdosis pro Woche/Als vorteilhaft erwies sich die Immunisierung bei 8-10 Wochen alten weiblichen Mäusen.

Aus den Milzen derart hyperimmunisierter Mäuse wurden

4 Tage nach der letzten Immunisierung nach einem beschriebenen Verfahren Zellsuspensionen hergestellt.