DD279410A1 - Verfahren zur herstellung von monoklonalen antikoerpern gegen thyreotropes hormon (tsh) - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikoerpern gegen thyreotropes Hormon (TSH), die in der medizinischen Diagnostik angewendet werden koennen. Das erfindungsgemaesse Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man zunaechst in an sich bekannter Weise Milzzellen von Balb/c-Maeusen, die mit gereinigtem TSH immunisiert wurden, mit X63-Ag8.653 Myelomzellen in der Zellkultur fusioniert, die Antikoerper produzierende Hybridzellklone selektiert, kloniert, vermehrt und erfindungsgemaess zur Produktion der monoklonalen Antikoerper durch Kultivierung oder nach Transplantation einsetzt. Die fuer die erfindungsgemaesse Antikoerperproduktion eingesetzten acht Hybridzellklone wurden in der ZIM-Hinterlegungsstelle fuer Zellinien im Zentralinstitut fuer Molekularbiologie hinterlegt. Die erfindungsgemaessen monoklonalen Antikoerper sind hochspezifisch und zeigen keine Kreuzreaktivitaet mit FSH, LH und HCG. Daneben besitzen sie eine sehr starke Bindungsfaehigkeit zum TSH. Die erfindungsgemaess erzeugten Hybridome sind stabil und hochproduktiv. So sind die monoklonalen Antikoerper in der Aszitesfluessigkeit mindestens noch bei einer Verduennung von 1:106 nachweisbar, die vom Klon B40-DE8 noch bei einer Verduennung von 1:1010.

Description

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Das thyreotrope Hormon (Thyreoidea-stimulierendes Hormon, TSH) ist wie die nahe verwandten Hormone humanes Choriongonadotropin (HCG), luteinisierendes Hormon (LH) und Follikel-stimulierendes Hormon (FSH) ein Glykoprotein, das aus zwei Untereinheiten, einer α-Kette und einer ß-Kette, aufgebaut ist. Während die α-Kette bei diesen Hormonen fast identisch ist, besitzen die ß-Ketten neben einer beträchtlichen Aminosäuresequenzhomologie auch eine Reihe spezifischer Regionen. TSH wird in der Hypophyse synthetisiert und steuert die Produktion der Schilddrüsenhormone T3 und T4, die wiederum von entscheidender Bedeutung für den allgemeinen Stoffwechsel sind. Die Bestimmung von TSH dient somit der Untersuchung der Schilddrüsenfunktion. Im allgemeinen wird die TSH-Bestirr.mung als erster und wichtigster Test zur Schilddrüsendiagnostik angesehen. Für den Nachweis und die quantitative Erfassung des thyrectropen Hormone (TSH) sind spezifische Antikörper erforderlich, die in einem spezifischen Immuntest TSH von den nahe verwandten Hormonen unterscheiden können. Für den Aufbau von 2-Seiten-Bindungstests werden z. B. zwei monoklonale Antikörper (MoAK) gegen zwei verschiedene Epitope benötigt, von denen einer der Antikörper spezifisch sein muß. Gerade für die Auswahl der effektivsten Kombinationen, die die sensitivsten Tests ergeben, sind oftmals nur sehr wenige Antikörper geeignet.

Die Herstellung spezifischer Antikörper wird durch die Aminosäuresequenzhomologien der verwandten Hormone und die damit verbundene Kreuzreaktivität beim Immunisieren erheblich erschwert. Diese Schwierigkeiten können durch den Einsatz der Hybridomtechnik und die hierdurch mögliche Herstellung spezifischer monoklonaler Antikörper überwunden werden. Derartige Antikörper wurden schon von mehreren Arbeitsgruppen hergestellt (beschrieben z. B. in den Patenten EP 0173973 (basierend auf JP 18126384) und DD 259137 sowie u.a. in den Publikationen H.G.Wada et al.Clin.Chem.28,1862-1866,1982, und M.M.Benkirane et.al.Endocrinology 121,1171-1177,1987) und auch schon in kommerziellen Testbestecks eingesetzt (z.B. von den Firmen Boehringer Mannheim, LKB, Serono). Bei den meisten der verwendeten Antikörper ist die TSH-Spezifität nicht absolut, so daß selbst in Firmenprospekten Beschreibungen wie „vernachlässigbare Kreuzreaktionen" (Prospekt der Firma Serono) verwendet werden. Auch in DD 259137 werden ein monoklonaler Antikörper hoher und ein monoklonaler Antikörper mittlerer Affinität beschrieben, die noch Kreuzreaktivität mit den Gonadodotropinen FSH, LH und HCG zeigen. Um jedoch noch optimalere Testsysteme aufbauen zu können, werden für einige Fragestellungen in erster Linie absolut spezifische Antikörper benötigt. Eine wichtige Voraussetzung für alle immunologischen Nachweis- und Reinigungsverfahren ist das Vorhandensein stabiler und gut produzierender Hybridzellinien. Zu den meisten der bisher beschriebenen Hybridzellklonen liegen zur Stabilität und Produktivität keine Angaben vor. Die z.B in DD 259137 verwendeten Angaben zur Antikörperkonzentration in der Aszitesflüssigkeit sind zur Abschätzung der aktiven Antikörperfraktion nur bedingt einsetzbar, da unter den mit konventionellen Methoden bestimmten Immunglobulinen noch ein nicht unbeträchtlicher Teil für die jeweilige Fragestellung inaktiver Antikörper sein kann. Demgegenüber ist der Nachweis der Antikörperaktivität auch nach extrem hohen Verdünnungen (d. h. die Bestimmung des aktuellen Titers) ein wesentliches Qualitätsmerkmal für die Produktivität eines Klons, sowohl hinsichtlich seinoi produzierten Antikörpermenge als auch hinsichtlich der Bindungsintonsität des produzierten Antikörpers.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung hat das Ziel, monoklonale Antikörper gegen TSH in guten Ausbeuten herzustellen, die hochspezifisch sind und keinerlei Kreuzreaktivität mit FSH, LH und HCG zeigen und daneben eine sehr starke Bindungstahigkeit zum TSH besitzen. Die Antikörper sollen zum Aufbau eines spezifischen Testsystems zum qualitativen und quantitativen Nachweis von TSH und damit zur Unterscheidung von den nahe verwandten Hormonen HCG, LH und FSH sowie für weitere immunologische Tests (z. B. mit immunhistologischen Methoden) und für Reinigungsverfahren geeignet sein.

Es sollen stabile und hochproduktive Hybridome erzeugt werden, die sich in der Aszitesform zur Gewinnung großer Antikörpermengen gut weitertransplantieren lassen. Die monoklonalen Antikörper sollen in der Aszitesflüssigkeit noch in einer Verdünnung von mindestens 1:10⁶ nachweisbar sein.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen TSH ist dadurch gekennzeichnet, daß man zunächst in an sich bekannter Weise Milzzellen von Balb/c-Mäusen gewinnt, die mit gereinigtem TSH immunisiert wurden.

Die Immunisierung mit Gesamt-TSH hat gegenüber einer Immunisierung mit der ß-Kette des TSH den Vorteil, daß (a) TSH bili jer und leichter beschaffbar ist als die isolierte ß-Kette, (b) die Immunogenität des TSH gegenüber der isolierten ß-Kette so stark ist, daß keine aufwendige Carrierkopplung notwendig ist, um eine starke Antikörperbildung zu induzieren, und (c) auch Antikörper gegen TSH-spezifische Epitope erhalten werden, die erst nach der Assoziation der α- und ß-Kette zum Gesamt-TSH entstehen, wodurch die potentielle Menge an möglichen TSH-spezifischen Antikörpern größer wird.

Die Milzzellen der immunisierten Tiere werden mit X 63-Ag 8.653 Myelomzellen in der Zellkultur unter Zusatz von PEG 1 500 fusioniert, das Fusionsgemisch wird in Mikrotestplatten ausgesät, Hybridzellen werden mit einem Selektionsmedium selektiert und die Antikörper-produzierenden Hybride werden mit einem Festphasen-Immuntest bestimmt.

Dazu werden diejenigen Hybridzellklone ermittelt, die Antikörper produzieren, die stark mit ¹²⁵J-markiertem TSH reagieren, nicht jedoch mit ¹²⁵J-markiertem FSH, LH und HCG. Mit Hilfe dieses Tests können sämtliche Antikörper erfaßt werden, die die verschiedenen TSH-spezifischen Epitope auf dem Gesamt-TSH-Molekül erkennen, unabhängig davon, ob diese Epitope nur auf der ß-Kette lokalisiert sind oder erst durch die Assoziation von α- und ß-Kette zum Gesamt-TSH ents >ehen.

Die Hybridzellen, die spezifische Antikörper gegen TSH produzieren, werden ausgewählt, vermehrt und, ggf. nach Lagerung in flüssigem Stickstoff, erfindungsgemäß zur Produktion der monoklonalen Antikörper durch Kultivierung oder nach Transplantation auf Mäuse in der Aszitesform eingesetzt. Die für die erfindungsgemäße Antikörperproduktion eingesetzten Hybridzellklone wurden am 5.12.1988 in der ZIM-Hinterlegungsstelle für Zellinien im Zentralinstitut für Molekularbiologie unter folgenden Nummern hinterlegt:

Name des Klons	Registriernummer
B25-AB1	ZIM-0429
B 25-AD 5	ZIM-0430
B25-BB1	ZIM-0431
B25-BE8	ZIM-0432
B 25-CF11	ZIM-0433
B 40-AA 3	ZIM-0434
B 40-AE 6	ZIM-0435
B 40-DE 8	ZIM-0436

Die durch die hinterlegten Hybridzellkione synthetisierten monoklonalen Antikörper gegen TSH reagieren ausschließlich mit TSH und nicht mit FSH, LH, HCG oder ß-HCG, wie aus nachstehender Tabelle ersichtlich ist. Sie zeigen demzufolge absolute Spezifität. Dia Antikörper besitzen daneben eine ausgesprochen starke Bindungsfähigkeit für TSH, die sich in einer intensiven Bindung des im Test angebotenen radioaktiv markierten TSH äußert. Für eine starke Bindungsfähigkeit spricht auch die Nachweisbarkeit der Antikörperaktivität in der Antikörper-haltigen Aszitesflüssigkeit nach extrem hohen Verdü nnungen. Lediglich die vom Klon B 25-AB1 produzierten monoklonalen Antikörper besitzen eine mittlere Affinität.

Reaktion der produzierten Antikörper Klon mit¹²⁵J-markiertem

TSH FSH LH HCG ß-HCG

B25-AB1 ++----

+ + +und+ + + + kennzeichnen Antikörper mit hoher und extrem hoher Affinität, und + + kennzeichnet Antikörper mit mittlerer Affinität, wobei die Angabe + + + + auch bedeutet, daß mehr als 60% des in den Versuchsansatz gegebenen ^l25J-markierten TSH gebunden werden. (-) bedeutet, daß eine geringfügig über den Negetivwerten liegende Reaktion zu beobachten ist. Dabei besteht durchaus die Möglichkeit, daß diese sehr schwachen Werte, die nur bei sehr hohen Antikörperkonzentrationen zu beobachten sind, auf geringe TSH-Verunreinigungen in dem verwendeten ¹²⁵-J-rnarkierten FSH zurückzuführen sind.

Die Immunglobulinklasse bzw. -Subklasse der durch die Hybridzellklone produzierten Antikörper zeigt die nächste Tabelle.

Name des Klons	lmmunglobulinklasse bzw. -subklassa
	der prodzierten Antikörper
B25-AB1	IgGI
B2G-AD5	IgGI
B25-BB1	IgGI
B25-BE8	IgGI
B 25-CF11	IgG 2 b
B 40-AA 3	lgG2a
B40-AE6	IgGi
B40-DE3	IgGI

Alle Hybridzellklone besitzen gute Wachstumseigenschaften und zeigen über mehrere Monate in der Zellkultur eine stabile Antikörperproduktion ohne die Notwendigkeit einer Reklonierung. Sie lassen sich sehr gut in der Aszitesform zur Gewinnung großer Antikörpermengen weitertransplantieren. Die Antikörper sind in der Aszitesflüssigkeit noch in einer Verdünnung von mehr als 1:10⁶ nachweisbar; alle Klone gehören demzufolge zu den stark produzierenden Hybridomen. Eine besonders starke Antikörperproduktion zeigen die folgenden Klone: B40-AE6, bei dem in der Aszitesflüssigkeit noch Antikörper in einer Verdünnung von 1:10⁷, B25-AD5, B 25-BB1 und B 25-BE 8, bei denen in der Aszitesflüssigkeit noch Antikörper in einer Verdünnung von 1:10⁸, B40-AA3, bei dem in der Aszitesflüssigkeit noch Antikörper bei einer Verdünnung von 1:10⁹, und B 40-DE8, bei einer Verdünnung von 1:10⁹, und B40-DE8, bei dem in der Aszitesflüssigkeit noch Antikörper in einer Verdünnung von 1:10¹⁰ nachweisbar sind. Besonders der Klon B40-DE8 gehört deshalb in der Stärke seiner Antikörperproduktion zu den absoluten Besonderheiten.

Die Erfindung ermöglicht die Herstellung hochspezifischer und stark reaktiver Antikörper gegen TSH in guten Ausbeuten und demzufolge die Entwicklung von effektiven Testbestecks für die Schilddrüsendiagnostik. Die Erfindung soll nachstehend an einem Ausführungsbeispiel näher erläutert werden.

Ausführungsbeispiel

1. Balb/c-Mäuse wurden mit gereinigtem TSH immunisiert, und die Milzzellen dieser Tiere wurden zur Fusion mit X 63-Ag8.653 Myelomzelien verwendet. Die Fusion, Selektion mit Selektionsmedium, Klonierung usw. erfolgte entspr. der Standardmethode nach G. Köhler und C. Milstein. Nature 256 (1975), 495 und L. Hudson und F. C. Hay Practical Immunology 2.Aufl. Oxford 1980.

2. Die Selektion der Antikörper-produzierenden Hybridzellen wurde mit einem Festphasen-Radioimmuntest entsprechend etablierter Methoden durchgeführt (B. Micheet et al., J. Immunol. Meth. 46 [1981 ], 41). Dazu wurde Anti-Maus-Immunglobulin an PVC-Tablettenfolie adsorbiert, danach erfolgte die Inkubation mit den Kulturüberständen der Hybridzallkolonien und anschließend mit ¹²⁵J-markiertem TSH.

3. Die Spezifitätsprüfung der synthetisierten Antikörper erfolgte mit dem gleichen Festphasen-Radioimmuntest unter Verwendung von ¹²⁵J-markiertem TSH, FSH, LH, HCG und ß-HCG im letzten Inkubationsschritt.

Entsprechend dieser Tests reagieren die durch die Hybridzellklone synthetisierten monoklonalen Antikörper ausschließlich mit TSH und nicht mit FSH, LH, HCG und ß-HCG.

4. Die Subklasse der Antikörper wurde mit einem Festphasen-Radioimmuntest (B. Micheel et al., Biorned. Biochim. Acta 42 [1983], 13) und einem Hämagglutinationshemmtest unter Verwendung von Subkhssen-spezliischem Kaninchen-Anti-Maus-Immunglobulin ermittelt.

Danach gehören die durch die selektierten Klone produzierten Antikörper zu folgenden Klpssen bzw. Subklassen: IgG 1 (B 25-AB1, B25-AD5, B25-BB1, B25-BE8, B40-AE6und B40-DE8), IgG2a (B40-AA3) und lgG2b(B25-CF11).

5. Die ausgewählten Klone, die Anti-TSH-Antikörper produzierten, wurden in bekannter Weise in flüssigem Stickstoff eingefroren und in der Zellkultur und in Mäusen in der Aszitesform zur Antikörpergewinnung eingesetzt (R. H. Kennet,

T. J. McKearn und K. B. Bechtol, Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analysis, New York und London 1981). Alle erhaltenen Klone zeigten in der Zellkultur eine stabile Antikörperproduktion über mehrere Wochen ohne die Notwendigkeit einer Reklonierung. Nach Transplantation auf Mäuse zeigten sie eine gute Produktionsstabilität (Verlust der Antikörperproduktion erst nach mehr als 5 Transplantationspassagen). Da Antikörper noch bei Verdünnungen der Aszitesflüssigkeit von mehr als 1:10⁶ nachgewiesen werden konnten, gehören die selektierten Klone zu den stark produzierenden Hybridomen. Eine besonders starke Antikörperproduktior zeigen die folgenden Klone: B40-AE6, bei dem in der Aszitesflüssigkeit noch Antikörper in einer Verdünnung von MO⁷, B25-AD5, B25-BB1 und B25-BE8, bei denen in de: Aszitesflüssigkeit noch Antikörper in einer Verwendung von 1:10^e, B40-AA3, bei dem in der Aszitesflüssigkeit noch Antikörper bei einer Verdünnung von 1:10⁹, und B40-DE8, bei dam in der Aszitesflüssigkeit noch Antikörper in einer Verdünnung von 1:10¹⁰ nachweisbar sind. Besonders der Klon B40-DE8 gehört deshalb in der Stärke seiner Antikörperproduktion zu den absoluten Ausnahmen.

Die selektierten Hybridzellklone wurden am 5.12.1988 in der ZIM-Hinterlegungsstelle für Zellinien im Zentralinstitut für Molekularbiologie hinterlegt.

Claims (1)

1. Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper gegen thyreotropes Hormon (TSH) durch Immunisierung von Balb/c-Mäusen mit TSH, Fusion ihrer Milzzellen mit Myelomzellen, Selektion der Antikörper-produzierenden Hybridzellen und Vermehrung der Hybridzellklone durch Kultivierung bzw. Transplantation auf Mäuse in der Aszitesform, dadurch gekennzeichnet, daß zur Kultivierung bzw. Transplantation die Klone B25-AB1, B25-AD5, B25-BB1, B25-BE8, B25-CF11, B40AA3, B40-AE6 oder B40-DE8 eingesetzt werden.

   Anwendungsgebiet der Erfindung

   Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von hochspezifischen monoklonalen Antikörpern gogen das thyreotrope Hormon (TSH).

   Anwendungsgebiet der Erfindung ist die medizinische Diagnostik.