DD257198A1 - Verfahren zur herstellung monoklonaler antikoerper gegen alkalische phosphatase - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikoerpern gegen das Markerenzym alkalische Phosphatase (AP) aus Kaelberdarm. Ziel der Erfindung ist die Herstellung von Antikoerpern hoher Spezifitaet und starker Bindungsfaehigkeit in guten Ausbeuten. Das erfindungsgemaesse Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man zunaechst in an sich bekannter Weise Milzzellen von Balb/c-Maeusen, die mit AP aus Kaelberdarm immunisiert wurden, mit X63-Ag8.653 Myelomzellen in der Zellkultur fusioniert, die Antikoerper-produzierenden Hybridzellen selektiert, kloniert, weitervermehrt und erfindungsgemaess zur Produktion der monoklonalen Antikoerper durch Kultivierung oder nach Transplantation einsetzt. Die spezifischen Hybridklone wurden im Zentralinstitut fuer Molekularbiologie (Liste 1987) unter folgenden Nummern hinterlegt: E1-D3A7 E1-F9F5 E1-H7E8Anwendungsgebiet der Erfindung sind die verschiedensten Gebiete der Biowissenschaften, einschliesslich Medizin.

Description

eingesetzt wurden.

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen das Enzym alkalische Phosphatase (AP) aus Kälberdarm. Anwendungsgebiet der Erfindung sind die verschiedensten Gebiete der Biowissenschaften, einschließlich Medizin.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Alkalische Phosphatase (AP) aus Kälberdarm wird für den Aufbau von verschiedenen Enzymimmunassays als Markerenzym eingesetzt. Das Enzym findet weiterhin in der Immunhistologie Anwendung und wird hier entweder nach chemischer Kopplung an Antikörper oder durch Bindung über Brückenantikörper in der sog. Alkalische Phosphatase — Anti-Alkalische Phosphatase (APAÄP)-Reaktion benutzt. Für die letztgenannte Reaktion werden spezifische Antikörper gegen AP benötigt. Diese Antikörper sind auch für die Reinigung des Enzyms einsetzbar. In der überwiegenden Zahl der Fälle wurden für diese Zwecke polygonale Antikörper benutzt.

Monoklonale Antikörper wurden bisher von CORDELL et al. (J. Histochem. Cytochem.32 [1984], 219) beschrieben und offensichtlich nur für die APAAP-Reaktion eingesetzt.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung hat das Ziel, monoklonale Antikörper hoher Spezifität und starker Bindungsfähigkeit in guter Ausbeuten herzustellen. Diese Antikörper sollen zum Aufbau immunologischer Tests und für Reinigungszwecke geeignet sein.

Darlegung des Wesens der Erfindung

D^räs erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen AP aus Kälberdärm ist dadurch gekennzeichnet, daß man zunächst in an sich bekannter Weise Milzzellen von Balb/c-Mäusen, die mit gereinigter AP immunisiert wurden, mit X63-Ag 8.653 Myelomzeilen in der Zellkultur unter Zusatz von PEG 1500 fusioniert, das Fusionsgemisch in Mikrobestplatten aussät, Hybridzellen mit einem Selektionsmedium selektiert und die Antikörper-produzierenden Hybride mit einem Festphasen-Immuntest bestimmt.

Die Hybridzellen, die spezifische Antiköper produzieren, wurden ausgewählt weitervermehrt und, ggf. nach Lagerung in flüssigem Stickstoff, erfindungsgemäß zur Produktion der monoklonalen Antikörper durch Kultivierung oder nach Transplantation auf Mäuse in der Aszitesform eingesetzt.

Die für die erfindungsgemäße Antikörperproduktion eingesetzten Hybridzellklone wurden im Zentralinstitut für Molekularbiologie (Liste 1987) unter folgenden Nummern hinterlegt:

E1-D3A7

E1-F9F5

E1-H7E8.

Durch-die Erfindung wird die Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen den Enzymmarker alkalische Phosphatase (AP) aus.Kälberdarm ermöglicht.

Damit können die bisher in erster Linie verwendeten polyklonalen Antikörper durch Reagenzien ersetzt werden, die ständig in großen standardisierbaren Mengen zur Verfugung stehen.

Die durch die Klone E1-D3A7, E1-F9F5und E1-H7E8 synthetisierten monoklonalen Antikörper gegen AP zeigen keine Kfeuzreaktivität mit Peroxidase, einem anderen wichtigen Enzymmarkerfür immunologische Testsysteme. Sie sind deshalb für den Aufbau verschiedenster immunologischerTests geeignet. Die Erfindung soll nachstehend an einem Ausführungsbeispiel näher erläutert werden.

Ausführungsbeispiel

1. Herstellung der Hybridzellklone aus Milzzellen von Balb/c-Mäusen und X63-Ag8.653 Myelomzellen.

Fusion, Kultivierung, Selektion mit Selektionsmedien, Klonierung etc. entspr. der Standardmethoden, nach KÖHLER, G. und CMILSTEIN, Nature 256 (19751,495 und HUDSON, L. und F. C. HAY, Practical lmmunolgy, 2. Aufl., Oxford 1980.

2. Die Selektion der Antikörper-produzierenden Hybridzellen erfolgte mit einem Festphasen-Immuntest, der folgendermaßen durchgeführt wird: Anti-Mäuse-Immunglobulin wird an PVC (Tablettenfolie) gebunden, danach erfolgt die Inkubation mit dem Kulturüberstand der Hybridzellen und anschließend mit alkalischer Phosphatase (AP). Gebundene AP wird durch das Substrat p-Nitrophenylphosphat nachgewiesen. Die Auswertung erfolgt visuell.

3. Die Bestimmung der Klasse bzw. Subklasse der Antikörper wurde mit einem Hämagglutinationshemmtest durchgeführt. Danach synthetisieren die 3 Hybridzellklone Antikörper folgender Immunglobulinklasse bzw.-Subklasse:

E1-D3A7 -IgM

E1-F9f5 — IgGI ' ·

E1-H7E8 —IgGI .

4. Die Absicherung der Nichtreaktivität der synthetisierten Antikörper mit dem Markerenzym Peroxidase erfolgte mit oben genanntem Festphasen-Immuntest. Dabei wurde im letzten Schritt mit Peroxidase inkubiert, die mit dem Substrat O-Phenyldiamin nachgewiesen wurde. Die Auswertung erfolgte visuell.

5. Herstellung der Antikörper . '

Die ausgewählten Hybridzellklone E1-D3A7, ET-F9F5 und E1-H7E8 wurden zur Herstellung der Antikörper gemäß üblicher Techniken (KENNETT, R.H.,T.J.McKearn und K. B. BECHTAL, Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A new dimension in biological analysis. New York und London 1981) eingesetzt.

Claims (1)

1. Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen alkalische Phosphatase (AP) aus Kälberdarm durch Immunisierung von Balb/c-Mäusen mit AP, Fusion ihrer Milzzellen mit Myelomzeilen, Selektion der Antikörper-produzierenden Hybridzellen und Weitervermehrung der Hybridzellklone durch Kultivierung bzw. Transplantation auf Mäusen in der Aszitesform, dadurch gekennzeichnet, daß zur Kultivierung bzw. Transplantation die Klone

   E1-D3A7 (ZIM-Liste1987: )

   E1-F9F5 (ZIM-Liste1987: )

   E1-H7E8 (ZIM-üste1987: )