DD294728A5 - Monoklonale antikoerper gegen digoxin und gegen digitoxin produzierende hybridozellinie - Google Patents

Monoklonale antikoerper gegen digoxin und gegen digitoxin produzierende hybridozellinie Download PDF

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DD294728A5
DD294728A5 DD34106990A DD34106990A DD294728A5 DD 294728 A5 DD294728 A5 DD 294728A5 DD 34106990 A DD34106990 A DD 34106990A DD 34106990 A DD34106990 A DD 34106990A DD 294728 A5 DD294728 A5 DD 294728A5
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monoclonal antibody
digitoxin
digoxin
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cell line
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Application number
DD34106990A
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Hans-Uwe Simon
Wolf-Dieter Mueller
Ingrid Wolf
Gerd Wallukat
Walter Hubl
Edith Walther
Gerhard Schlenvoigt
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Friedrich-Schiller-Universitaet,De
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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer einen hochspezifischen und hochaffinen monoklonalen Antikoerper (mAK) gegen Digoxin und Digitoxin produzierenden Hybridomzellinie sowie die Verwendung des monoklonalen Antikoerpers zum Nachweis von Digoxin und Digitoxin und zur Therapie von Digoxin- und Digitoxin-Intoxikationen. Die Hybridomzellinie ist unter der Nummer ZIM 0507 registriert.{Antikoerper, monoklonal; Digoxin; Digitoxin; Hybridomzellinie; Immunoassay; Antidot; Intoxikation; Herzmyozytenkultur; Arzneimittel}

Description

Hierzu 3 Seiten Zeichnungen
Anwendungsgebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer monoklonale Antikörper gegen Digoxin und Digitoxin produzierenden Hybridomzellinie und ihre Anwendung
Der monoklonale Antikörper wird - in der medizinischen Diagnostik:
a) zur Bestimmung von Digoxin-Konzentrationen in Körperflüssigneiten
b) zur Bestimmung von Digitoxin-Konzentrationen in Körperflüssigkeiten
- in der medizinischen Therapie:
a) zur Behandlung von Digoxin-Intoxikationen
b) zur Behandlung von Digitoxin-Intoxikaticnen und
- in der Grundlagenforschung:
a) zur weiteren Aufklärung dea Wirkungsmechanismus von Glykosiden
b) als Hilfsmittel für DNA-Hybridisierungs-Techniken eingesetzt.
Charakteristik des bekannten Standes der Technik Monoklonal Antikörper sind sowohl gegen Digoxin (Hunter, M. M. et al.: J. Immunol. 129 [1982], 1165-1172) als auch gegen Digitoxin (Collignon, A. et al.: Hybridoma 7 [1988], 355-366) bereits beschrieben worden. Auch wurden die Aminosäuren im variablen Teil der Antikörper aufgeklärt, die für die unterschiedliche Affinität gegenüber Digoxin offensichtlich verantwortlich sind (Panka, DJ. et al.: Proc. Natl. Ac?d. Sei. USA 85 [1988], 3080-3084). Monoklonal Antikörper werden auch bereits in Kits zur Bestimmung von Glykosidspiegeln angeboten (Koenig, M. et al.: KHn. Wochenschr. 65 [1987], 1073-1080). Als Antidot bei schweren Digoxin/Digitoxin-Intoxikationen werden gegenwärtig polygonale Antikörper im Handel angeboten (Smolarz, A. et al.: Herz/Kreisl. 18 [1986], 261-266), da solche Intoxikationen durch übliche Intoxikationsverfahren (z.B. Hämoperfusion) nicht beherrscht werden. In DE-OS 3508307 sind monoklonal Antikörper gegen Digoxin sowie ihre Anwendung in Immunoassays und als Antidot bei Digoxin-Intoxikationan beschrieben. Ein moncklonaler Antikörper, der wie das polygonale Serum hoho Affinität zu beiden
wichtigen Glykosiden (Digoxin und Digitoxin) besitzt, ist nicht bekannt. Affinitätskonstanten der Digoxin-Antikörper, die einewesentliche Aussage über die therapeutische Wirksamkeit geben könnten, sind in DE-OS 3508307 nicht angegeben.
Ziel der Erfindung
Die Erfindung hat das Ziel, ein Verfahren zur Herstellung einer monoklonalon Antikörper gegen Digoxin und Digitoxin produzierenden Hybridomzellinie anzugeben und zu verwenden. Der monoklonale Antikörper soll bei vergleichbar guter Therapiewirkung bei Intoxikationen wie das polyklonale Antiserum, eine gute In-vitro- und In-vivo-Vermehrungsfähigkeit haben, wobei eine gleichbleibende Qualität einfach und stabil gesichert sein soll.
Darlegung des Wesens der Erfindung Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung einer monoklonalen Antikörper gegen Digoxin und
gegen Digitoxin produzierenden Hybridomzellinie anzugeben. Die monoklonalen Antikörper sollen eine hohe Spezifität und
Affinität sowohl gegen Digoxin als auch gegen Digitoxin besitzen. Daraus sollen neue Verwendungen gefunden werden. Die Aufgabe wird durch ein Verfahren zur Herstellung einer monoklonale Antikörper gegen Digoxin und gegen Digitoxin
produzierenden Hybridomzellinie erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß Myelomzellen mit Zellen aus Säugetieren, welche
Antikörper gegen Digoxin und gegen Digitoxin produzieren, fusioniert werden. Balb/c-Mäuse werden mit Digoxin- Rinderserumalbumin-Konjugat immunisiert. Aus den Milzen der immunisierten Mäuse wird eine Milzzellsuspension hergestellt. Die Milzzellen werden mit der Maus-Myelomzellinie P63-X63-Ag 8.653 fusioniert. Das Fusionsgemisch aus Milzzellen und Hybridomzellen in Einzelgefäßen mit einem Selektionsmedium verdünnt und in der Weise kultiviert, daß die nicht fusionierten Zellen sich nicht vermehren und absterben, die fusionierten Zellen isoliert, auf Anwesenheit von Antikörpern gegen Digoxin und Digitoxin geprüft und die Hybridomzellen, die Antikörper produzieren, selektioniert und Moniert werden. Die Hybridomzdllinie ist
unter der Nummer ZIM (Zentralinstitut für Molekularbiologie, Akademie der Wissenschaften der DDR, Berlin) hinterlegt.
Die Zellinie läßt sich sowohl in vitro (Flaschen- oder Fermenterkultur) als auch in vivo (Asziteszucht) bei stabiler Antikörperproduktion vermehren. Gemäß der Erfindung wird der monoklonale Antikörper so hergestellt, daß eine Hybridomzellinie, hinterlegt unter der Nummer ZIM 0507, in einem geeigneten Kulturmedium kultiviert und der Antikörper IJ 2 A3 aus dem Überstand gewonnen wird. Die Hybridomzellinie ZIM 0507 wird einer, gegebenenfalls syngenen oder semisyngenen, Maus injiziert und der im Blut oder
peritonealen Exsudat freigesetzte monoklonalen Antikörper IJ 2 A3 wird isoliert.
Der monoklonal Antikörper IJ 2 A3 wird zur Bestimmunp ve η Digoxin und Digitoxin in biologischen Flüssigkeiten verwendet. Digoxin und Digitoxin wird im Blut, Serum, Urin oder in cerebrospinaler Flüssigkeit bestimmt. Der monoklonale Antikörper IJ 2A3 wird zur Herstellung von Immunoassays für den Nachweis und die Bestimmung von Digoxin und/oder Digitoxin
verwendet. Der Vorteil ist, daß mit einem Assay beide Substanzen erfaßt werden.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß der monoklonale Antikörper IJ 2 A3 zur Therapie von Digoxin- und/oder Digitoxin-Intoxikationen verwendet wird. Von Vorteil ist, daß der Antikörper bei beiden Vergiftungsarten wirksam ist. Der monoklonale Antikörper IJ2 A3 wird zur Herstellung von Arzneimitteln, geeignet zur Bekämpfung von Digoxin- und/oder Digitoxin-Intoxikationen verwendet. Der monoklonale Antikörper IJ 2 A3 wird zur Hersteilung von Arzneimitteln, geeignet zur Bekämpfung der Eklampsie verwendet. Der monoklonale Antikörper IJ 2 A3 wird als Hilfsmittel bei DNA-Hybridisierungs-Techniken verwendet.
Ausführungsbelsplel Es zuigen
Fig. 1: Funktionelle Reversibilität der Digitoxinwirkung (Erhöhung der Pulsationsrate an der Herzmyozytenkultur neonataler Ratten) durch den monoklonalen Antikörper IJ 2 A3. Die durch Quabain induzierte Wirkung kann nicht aufgehoben werden.
Fig. 2: Standardkurve von Digoxin Fig. 3: Standardkurve von Digitoxin. Mäuse des Inzuchtstammes Balb/c werden wiederholt intraperitoneal und intravenös mit Digoxin-BSA-Konjugat immunisiert. Die Milzzellen der immunisierten Mäuse werden vier Tage nach der letzten Immunisierung mit der Mausmyelomlinie P3-X63-Ag 8.653, hergestellt von Kearney et al. (J. Immunol. 123 [1979], 1548), nach bekanntem Grundprinzip in vitro fusioniert
(Köhler, G. et al.: Nature 256 [1975], 495).
Die entstehenden Hybridome werden in einem Selektionsmedium (HAT) angezüchtet. Das Selektionsmedium erlaubt nur die Vermehrung der Hybridomzellen. Nach Erscheinen der Hybridom-Zellhaufen erfolgt die Auswahl der Hybridome mit spezifischer Antikörperproduktion mit Hilfe
eines Festphasenimmunoassays und eines Radioimmunoassays (Campbell, A.M.: Monoclonal antibody technology. In:
Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Volume 13, Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, Chapter 2,
S. 33-64,1984).
Die ausgewählten Hybridome mit spezifischer Antikörperproduktion werden in vitro durch limitierte Verdünnung
(Campbell, A. M.: siehe oben S. 151-164) in 96-Well-Mikrotiterplatten selektioniert.
Die von ausgewählten Hybridomzellen produzierten Antikörper werden auf ihre Eignung für ein Drug-Monitoring mit Hilfe eines Enzymimmunoassays und für ihre Eignung als Antidot bei Intoxikationen mit Hilfe einer neonatalen Ratten-Myozytenkultur
geprüft.
Der auf diese Weise gewonnene Hybridzellklon ZIM 0507 wird anschließend weiter vermehrt. In flüssigem Stickstoff ist der Hybridzellklon über große Zeiträume konservierbar und kann boi Bedarf für die Produktion des monoklonalen Antikörpers in
vitro oder in der Aszitestform verwendet werden.
Der Hybridzellklon produziert den monoklonalen Antikörper IJ 2 A3 mit folgenden Eigenschaften: Eigenschaft
Immunglobulinklasse mit Enzymimmunoassay IgGI
Spezifität mit Radioimmunoassay Digoxin, Digitoxin
mit Herzmuskelzellenkultur Digoxin, Digitoxin
Digoxin Digoxin, Digitoxin
Affinität Digitoxin KA= 5,5 x 10'0M"1
Digoxin Ka = ^OxIO10M-1
Antidotwirkung Digitoxin geeignet
in vitro Quabain geeignet
Digoxin ungeeignet
Drug Monitoring Digitoxin geeignet
Quabain geeignet
in vitro (Fermenter) ungeeignet
Vermehrung invivo(Aszites) geeignet
geeignet
Die Erfindung ermöglicht die Herstellung dieses neuen Antikörpers mit überraschend hoher Affinität sowohl gegen Digoxin als auch gegen Digitoxin. Insbesondere kann der erfindungsgemäß hergestellte Antikörper als Antidot sowohl bei Digoxin- als auch bei Digitoxin-Vergiftungen (1 mg/kg Körpergewicht sind geeignet, Intoxikationen mit bis zu 10OOfach erhöhtem Digitoxin-Spiegel zu neutralisieren, siehe Fig. 1) und für ein Drug Monitoring für Digoxin (siehe Fig. 2) und Digitoxin (siehe Fig.3) eingesetzt werden.

Claims (12)

1. Verfahren zur Herstellung einer monoklonale Antikörper gegen Digoxin und gegen Digitoxin produzierenden Hybridomzellinie, dadurch gekennzeichnet, daß Myelomzellen mit Zellen aas Säugetieren, welche Antikörper gegen Digoxin und Digitoxin produzieren, fusioniert werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
a Balb/c-Mäuse mit Digoxin-Rinderserumalbumin-Konjugat immunisiert werden,
b) aus den Milzen der immunisierten Mäuse eine Milzzellsuspension hergestellt wird,
c) die Milzzellen mit der Maus-Zyelomzellinie P3-X63-Ag 8.653 fusioniert werden und
d) die Antikörper gegen Digoxin und gegen Digitoxin produzierende Hybridomzellinie selektioniert wird, und
e) unter der Nummer ZIM 0507 hinterlegt ist,
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
a) das Fusionsgemisch aus Milzzellen und Hybridomzellen in Einzelgefäßen mit einem Selektionsmedium verdünnt und
b) in der Weise kultiviert, daß die nicht fusionierten Zellen sich nicht vermehren und absterben,
c) die fusionierten Zellen isoliert, auf Anwesenheit von Antikörpern gegen Digoxin und Digitoxin geprüft und
d) die Hybridomzellen, die den Antikörper produzieren, selektioniert und kloniert werden.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
a) die Hybridomzellinie, hinterlegt unter der Nummer ZIM 0507, in einem geeigneten Kulturmedium kultiviert und
b) der Antikörper IJ 2 A3 aus dem Überstand gewonnen wird.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
a) die Hybridomzellinie ZIM 0507 einer, gegebenenfalls syngenen oder semisyngenen, Maus injiziert und
b) den im Blut oder peritonealen Exsudat freigesetzten monoklonalen Antikörper IJ2 A3 isoliert wird.
6. Verwendung eines monoklonalen Antikörpers nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß der monoklonale Antikörper IJ 2A3 zur Bestimmung von Digoxin und Digitoxin in biologischen Flüssigkeiten verwendet wird.
7. Verwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß Digoxin und Digitoxin im Blut, Serum, Urin oder in cerebrospinaler Flüssigkeit bestimmt werden.
8. Verwendung nach Anspruch 6 und 7, dadurch gekennzeichnet, daß der monoklonale Antikörper IJ 2 A3 zur Herstellung von Immunoassays für den Nachweis und die Bestimmung von Digoxin und/oder Digitoxin verwendet wird.
9. Verwendung eines monoklonalen Antikörpers nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß der monoklonale Antikörper IJ 2 A3 zur Therapie von Digoxin- und/oder Digitoxin-Intoxikationen verwendet wird.
10. Verwendung eines monoklonalen Antikörpers nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß der monoklonale Antikörper IJ 2 A3 zur Herstellung von Arzneimitteln, geeignet zur Bekämpfung von Digoxin- und/oder Digitoxin-Intoxikationen, verwendet wird.
11. Verwendung eines monoklonalen Antikörpers nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß der monoklonale Antikörper IJ 2 A3 zur Herstellung von Arzneimitteln, geeignet zur Bekämpfung der Eklampsie verwendet wird.
12. Verwendung eines monoklonalen Antikörpers nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß der monoklonale Antikörper IJ 2 A3 a.'s Hilfsmittel bei DNA-Hybridiserungs-Techniken verwendet wird.
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