CH666490A5 - Verfahren zur herstellung von antikoerpern, die gegen insulin gerichtet sind und ihre verwendung. - Google Patents

Description

BESCHREIBUNG Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen Insulin, und ihre Verwendung zum Nachweis von Insulin.

Antiinsulinantikörper sekretierende Zellinien wurden durch Hybridisierung von insulinimmunen Lymphknotenzellen mit der Myelomazellinie SP2/0-Agl4 hergestellt. Dies erfolgte, um monoklonale Antikörper, die gegen Insulin gerichtet sind und eine bekannte Spezifität aufweisen zur Untersuchung und Bestimmung der Immunantwort auf Insulin herzustellen. Die Untersuchung kann auf Test-Sets eingeschränkt werden. Diese Antikörper sind als Diagnostika für menschliche Insulinniveaus wertvoll.

Die Erfindung lässt sich auf verschiedene Insulintypen anwenden, die eigentümlich für das Tier oder den Menschen sind, von welchen sie abstammen; beispielsweise für Humaninsulin, Rinderinsulin, Schweineinsulin, Mausinsulin, Hühnerinsulin und Ratten-, Kaninchen-, Fisch-, Meerschweinchen- und Schafinsuline.

Die monoklonalen Antikörper gegen Insulin (Antiinsu-lin-mAbs) in den diese Antikörper sekretierenen Zellinien sind zur Bestimmung der zirkulierenden Niveaus im Blut für unterschiedliche Insuline einsetzbar, wie Human-, Rinder-, Schweine-, Ratten-, Hühner-, Fisch-, Meerschweinchen-, Schaf- und Mausinsulin. Zusätzlich lassen sich die mAb's gemäss der Erfindung zur Bestimmung von menschlichen Insulinniveaus im Blut als diagnostische Hilfe einsetzen.

Als Stand der Technik wurde von Joyce A. Schroer et al in Journal of Immunology, Vol. 123 (2), August 1979, Seiten 670 bis 675 der Artikel «H-2-Linked Ir Gene Control of Antibody Responses to Insulin» veröffentlicht. Ferner ist von Joyce A. Schroer et al Monoclonal Antibodies in Endocrine Research, Fellows and Eisenbarth (editors), Raven Press, New York, 1981, Seiten 167 bis 179, erschienen. Die Antikörper dieser Veröffentlichung sind ein Satz von vier Antikörpern, die durch eine Zellinie hergestellt werden, die den in der vorliegenden Erfindung verwendeten Zellinien bezüglich der Eigenschaften unterlegen ist.

Ferner ist von Joyce A. Schroer et al «Mapping Epitopes on the Insulin Molecule Using Monoclonal Antibodies», European Journal of Immunology, 1983 (Vol 13, p. 693) veröffentlicht.

Über die Antikörper Angriffsstelle für eine antigene Determinante oder ein Proteinmolekül ist, insbesondere über die molekulare Basis von Hochaffinitätsantigenantikörper-wechselwirkungen auf Insulin, bisher wenig bekannt. Die vorliegende Erfindung lehrt die Entwicklung und die Verwendung monoklonaler Antikörper (mAb) gegen antigene Strukturen auf Insulin. Die erfindungsgemäss erhaltenen Antikörper sind Antiinsulinantikörper und werden durch mittels Hybridisierung von insulinimmunen Lymphknotenzellen und einer Myelomazellinie SP2/0-Agl4 Nature, 1978, Vol. 276, p. 269 hergestellte Zellinien sekretiert. Die Zellinien und ihre entsprechenden monoklonalen Antikörper werden als AE9D6, DB9G8, CC9C10, CG7C7, BE3F9 und CE9H9 bezeichnet. Die mAbs, die durch diese Hybridome sekretiert werden, sind spezifisch für bestimmte Insulinaminosäuresequenzen und wirken daher als Diagnosereagentien zum Bestimmen des menschlichen Insulinniveaus.

Diese Antiinsulinantikörper ermöglichen auch das «Mapping» von antigenen Stellen auf Insulin. Da die monoklonalen Antikörper kreuzreaktiv sind, eignen sie sich auch für die Behandlung von Diabetes. Insbesondere verwendet die Behandlung von Diabetes sowohl Schweine- als auch Rinderinsulin, wie dieses in den Blutstrom injiziert wird. Die Testsets mit den erfindungsgemäss hergestellten Mabs sind dazu fähig, diese Insulinarten zu unterscheiden und demzufolge dazu befähigt, das Niveau menschlicher Insuline, die durch den Körper sekretiert werden, differenziert von der Menge Fremdinsulin (Rind und Schwein), welches in den Körper injiziert wurde, anzugeben.

Sechs Antiinsulin mAbs wurden entwickelt. Die immunologischen Kreuzreaktivitäten dieser mAbs für Spezies-abhängige Varianten von Insulin oder chemisch modifiziertem Insulin wurden bestimmt. Diese mAbs binden an spezifische Aminosäuresequenzen auf dem Insulinmolekül. Antikörper AE9D6 erkennt den Bereich um die Aminosäuresequenz Thr-Ser-Ile der A-Kette von Humaninsulin. Die anderen fünf mAbs reagieren ähnlich, obwohl die exakte Sequenz-Spezifität bisher noch nicht bestimmt worden ist.

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Das körpereigene Immunsystem, insbesondere die Antikörper sekretierenden weissen Blutzellen, wirken durch Reaktion auf Fremdpartikel im Blutstrom. Einige Proteine, Antikörper (oder Immunglobuline) binden an und neutralisieren dadurch Fremdproteine, die in den Körper eintreten. Diese Fremdproteine, die als Antigene bezeichnet werden, steuern den Anfang der Produktion eines komplementären Antikörpers; sie kombinieren, um einen Antigenantikörper-komplex zu bilden. Die Antikörpermoleküle enthalten Bindestellen, die spezifisch und komplementär zu den strukturellen Merkmale(n) oder Epitope(n) des Antigens sind.

Insulin, welches eine Immunantwort hervorruft, von der gezeigt werden kann, dass sie unter einer MHC-verbundenen IR-Gensteuerung erfolgt, ist eines der physikalisch und chemisch besser charakterisierten Proteine. Das Insulinmono-mere besteht aus zwei durch Zwischenkettendisulfidbindun-gen verbundenen Ketten.

Die A-Kette besitzt zwei Helixabschnitte, die durch einen Schleifenbereich, der durch eine zwischen den Ketten zwischen den Cysteinen 7 und 11 verlaufende Disulfidbrücke gebildet wird, getrennt sind; die B-Kette besteht aus Faltblattsegmenten an den Amino- und Carboxyenden, welche durch einen mittleren helikalen Bereich, der mit dem Carboxyter-minalen Helixbereich der A-Kette verschlungen ist, verbunden sind.

Obwohl Insulin kein klassisches Antigen im Sinne einer Fremdsubstanz ist, besitzt Insulin auch strukturelle Oberflä-chenmerkmale, die es dem Insulin erlauben, andere Moleküle zu binden. Die erfindungsgemässen Antiinsulinantikörper sind die ersten Antikörper, die entwickelt wurden, um spezifisch an einem Insulinoberflächenmerkmal zu haften. Die duale Bindebefähigung dieser monoklonalen Antikörper ist insbesondere zur genauen Bestimmung von Insulinniveaus wichtig. Ein mAb allein ist nicht hinreichend, um das Insulinniveau adäquat zu bestimmen; die Verwendung von zwei mAb wird für den Spezifitätstest bevorzugt. Jegliche Kombination der sechs erfindungsgemäss erhältlichen monoklonalen Antikörper kann paarweise in der Doppelbindungsassay (unten beschrieben) eingesetzt werden. Auf diese Art und Weise können Kombinationen von mAbs endogene Insulinsekretion (durch den Körper) von exogenem Insulin (injiziertes Rinder- oder Schweineinsulin) unterscheiden.

Das erfmdungsgemässe Verfahren lässt sich mit jeder der bekannten Klonierungstechniken durchführen. Das nachfolgend beschriebene Verfahren soll die Erfindung nicht durch diese Beschreibung einschränken.

BALB/c Mäuse werden mit Human- oder Rinderinsulin immunisiert und entweder Lymphknotenzellen oder die Milzzellen werden entnommen. Die insulinimmunisierten Zellen werden sodann mit Myelomazellinie SP2/0-Agl4 hybridisiert. Hybridzellen werden sodann in Löcher von Mi-krotiterplatten in HAT-Medium (Hypoxanthin, Aminopte-rin und Thymidin) gegeben, um die nicht hybridisierten Zellen abzutöten, d.h., die nicht verschmolzenen Zellen. Von den überlebenden Hybridomen wird lediglich ein Teil den erwünschten Antikörper herstellen. Die Löcher, die positives Zellwachstum zeigen, werden durch Radioimmunassay untersucht, ob sie an Immunogen binden und anschliessend durch begrenzte Verdünnung mit normalen peritonealen Makrophagen kloniert. Klonierte Antiinsulinantikörper herstellende Zellinien werden sodann in Gewebekultur gezüchtet, um zur Konservierung und späterer Verwendung eingefroren zu werden, oder als Vorrat für Zellen, welche in pri-stanbehandelte Mäuse injiziert werden, um grosse Mengen Antikörper herzustellen, oder um Antikörper enthaltende Überstände herzustellen.

Affinitätsbestimmungen

Die Affinität jedes Antikörpers für sein ihn hervorrufendes Insulin wurde durch kalte Inhibierung der Bindung des Antikörpers an 125-Jodinsulin in einem modifizierten Ra-5 dioimmunassay (RIA) bestimmt. Es ergaben sich Bindungskurven bei konstanter Verdünnung der Immunsera, wobei jedoch Variation der Konzentrationen von gelabeltem Insulin oder einer Mischung von nicht gelabeltem und gelabeltem Insulin identisch waren. Dieses stellt sicher, dass 125 I-Insu-10 lin ununterscheidbar von nicht gelabeltem Insulin bei dieser Bestimmungsmethode ist. 20 |il einer Verdünnung (Verdünnungsmittel 1% BSA, 0,02% Natriumazid in PBS) von Hy-bridomaasziten, die 27 bis 75% gelabelten Insulins banden, wurden mit 20 |il nicht gelabelten Insulins mit einem Viertel 15 logio Konzentration (6 gleiche Proben für jede Konzentration) über einen 100-fachen Konzentrationsbereich gemischt und 1 Stunde bei 37 °C inkubiert. 20 |il, die 10 bis 15 x 103 cpm 1251-Insulin enthielten, wurden zugegeben. Die Proben wurden vermischt und über Nacht bei 4 °C ins 20 Gleichgewicht gebracht. Immunkomplexe wurden durch Zugabe von 50 jxl 27%igen Polyethylenglykols ausgefallt, welches 80 (il/ml menschlichen AB-Serums als Carrier enthielt. Die Proben wurden bei 1000 x G 1 Stunde zentrifugiert. Die Überstände wurden abgesaugt und das Präzipitat in ei-25 nem Gammazähler gezählt. Die maximal ausfällbaren 125 I-Insulincounts wurden für jede Assay bestimmt, indem eine hochkonzentrierte Antikörperprobe verwandt wurde. Untergrundbindung (5 bis 15%) wurde durch Verwendung von drei Blindproben bestimmt: Lediglich Verdünnungsmittel, 30 NMS im 1:5 Verdünnung, und P3-X63-Ag 8-Asziten bei 1:5 Verdünnung. Die Prozent Bindung bei jeder Konzentration kalten Insulins wurden verwandt, um die Konzentrationen gebundenen Insulins zu berechnen und sodann das an freie Anteile gebundene. Die Affinitäten wurden aus den negati-35 ven Steigungen der unter Verwendung eines linearen Regressionsprogramms ermittelten Linien bestimmt.

Speziesabhängige Verdrängungsassays wurden genau wie oben durchgeführt, ausser dass unterschiedliche Insuline eingesetzt wurden, um mit dem Binden des mAb an sein jodier-40 tes Immunogen zu konkurrieren. Jede Konzentration Varianteninsulin wurde auf Bindungsinhibition über einen eine Million-fachen Konzentrationsbereich in 10-fach-Schritten getestet. Das kalte speziesvariante Insulin, 1251-Insulin und die Antikörperverdünnungsmischung wurde lediglich 1 45 Stunde bei 2 °C anstatt über Nacht bei 4 °C inkubiert. Die Proben wurden sodann, wie oben beschrieben, bearbeitet und die Daten als Prozent Bindung gegen Konzentration Inhibitor (100% Bindung wurde der Bindung in Abwesenheit des Inhibitors gleichgesetzt) ausgedrückt. Die 50% Inhibie-50 rungspunkte für jede Kurve wurden bestimmt und dazu verwandt, I50-Werte zu berechnen, indem die Konzentration des speziesvarianten Insulins das dazu benötigt wurde, 50% Bindungsinhibition zu erhalten, durch die Konzentration kalten Immunogens, welches 50% Inhibition ergab, dividiert 55 wurde.

Doppelbindungsassays wurden ausgeführt, indem es entweder 100 (il eines affinitätsgereinigten mAb oder einen 2mal 40%igen(NH4)2S04-Teils Aszitenfluid bei 1:100 Verdünnung erlaubt wurde, 4 bis 16 Stunden an eine Polyvinylplatte zu 60 binden. Die Platte wird anschliessend dreimal mit PBS/ TW20 gewaschen, gefolgt durch Absättigung aller nicht-spezifischen Bindungsplätze auf der Platte mit einer KLH-Lö-sung (0,1% KLH in PES/TW20) über 30 Minuten bei 22 °C. KLH wurde als das Protein zur Sättigung nicht spezifischer 65 Bindungsplätze ausgewählt, da es den niedrigsten Bindungs-untergund hervorruft. 100 (il Rinderinsulin wurden in 1 (ig/ ml zugegeben, um alle Bindungsplätze abzusättigen. Vorläufige Experimente zeigten, dass 100 ng/ml Insulin hinreichend

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war, um alle Antikörperbindungsplätze zu sättigen, wobei ein 10-facher Überschuss zu Äquivalentbindungen führte und in allen nachfolgenden Assays eingesetzt wurde. Nicht gebundenes Insulin wurde durch 5-faches Waschen mit PBS/ TW20 entfernt. Das zweite mAb, entweder biotinyliert für ELISA oder jodiert für RIA, wurde in 100 |xl in 1:1000-fa-cher Verdünnung zugegeben (83 ng Antikörper pro Probe) für biotinylierte Antikörper (vorläufige Experimente zeigten, dass alle Verdünnungen von 1:1000 bis 1:5000 leicht detek-tierbare ELISA-Werte, verglichen mit Untergrundblindproben gaben, wobei das Insulin durch KLH ersetzt wurde)

oder 7 x 104 - 1,2 x 105 cpm (7 bis 112 ng Antikörper pro Platte) für gelabelte Antikörper, und eine Bindung über Nacht ermöglicht. Die Platten wurden 5 x mit PBS/TW20 gewaschen und anschliessend im Gammazähler gezählt oder für ELISA entwickelt. Da die biotinylierten mAbs manchmal hohe Untergrundbindung ergaben, wenn KLH Insulin in der Doppelbindungsassay ersetzte, wurden Blindproben, die eine hohe Insulinkonzentration (100-facher Überschuss) gemeinsam mit dem biotinylierten zweiten mAb für jedes Antikörperpaar zu jedem Assay gegeben wurde enthielten, eingeschlossen und lediglich die ELISA-Werte, die sich bei Zugabe von eines Insulin-Überschusses änderten, als geeignet für Doppelbindung betrachtet. Jedes Antikörperpaar wurde 2 bis 5-mal mit RIA und 2 bis 5-mal mit ELISA getestet. Lediglich RIA-Werte, die mehr als das Doppelte des Untergrundes betrugen, wurden als signifikant betrachtet und eine Bindung von 0,2 bis 27 ng 125 I-Antikörper (2 bis 75 x 103 cpm) wurde detektiert. Die ELISA-Werte bei 492 nm bewegten sich zwischen 0,1 bis 1,9 optische Dichte über dem Untergrund. Doppelbindungsdaten werden in Tabelle 1 angegeben.

Antikörper produzierende sekretierende Zellinien

Siehe Tabelle 2 für die Beschreibung der erfindungsgemäss verwandten Zellinien.

Testsets

Testsets für den Einsatz der Zellinien und ihrer mAb-Produkte können leicht im Laboratorium unter Verwendung konventioneller Techniken hergestellt werden. Sie können 5 auf Kreuzspezifität oder Insulinniveauquantifizierung aufgebaut werden und für den allgemeinen erfindungsgemässen Zweck, die Gegenwart eines speziellen Insulintyps zu bestimmen, ausgelegt werden.

10 Tabelle 1

Resultate der Doppelbindungsassay

1

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5

6

1

H

H

H

M

L

2

H

-

-

-

L

3

L

L

-

-

H

4

H

L

L

M

H

5

H

L

L

H

H

6

L

L

L

L

M .

H = Hoch, > 10 x bkgRIAund > 1,0 optische Dichte bei 492 nm.

25

M = Mittel, entweder > 10 x bkg RIA und 0,1 bis 1,0 optische Dichte bei 492 nm oder > 1,0 optische Dichte bei 492 nm und 2 bis 10 x bkg RIA.

30 l = Niedrig, 2 bis 10 x bkg RIA oder 0,1 bis 1,0 optische Dichte bei 492 nm.

- = kein nachweisbares Binden, wenn der zweite mAb chemisch markiert ist, es wird jedoch eine Bindung beobach-

35 tet, wenn dieser mAb zuerst auf die Platte aufgebracht wird.

Tabelle 2

Charakterisierung von 18 Antiinsulinhybridom-Antikörpern

Affinitätskonstante mAbs

Zellinie

Immunogen"

Isotypus

K0 (M"1)

Spezifität

1

AE9D6

Human

IgGl

3 x 108 (0,98)b eine Ketten-Schleife

2

DB9G8

Rinder

IgGl

5' x 108 (0,95)

?

3

CC9C10

Rinder

IgG2a

2 x 107 (0,73)

?

4

CG7C7

Human

IgGl

7 x 107 (0,98)

?

5

BE3F9

Rinder

IgG2a

3 x 107 (0,97)

7

6

CE9H9

Human

IgGl

2 x 107 (0,96)

9

a Für die Infusion wurden Myelomzellen eingesetzt, somatische Zellen waren BALB/c 12 bis 14 Tage primäre Immunlymphknotenzellen.

b Korrelationskoeffizient von Scatchardauftragungen.

C

Claims (10)

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1. Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern, die gegen Insulin gerichter sind, dadurch gekennzeichnet, dass

A) insulin-immune Lymphknotenzellen mit der Myelom-zelle SP 2/0-Agl4 hybridisiert werden, wobei die folgenden Hybridomzellinien erhalten werden:

a) die Zellinie AE9D6, die monoklonale Antikörper ausscheidet, welche die A-Kette von humanem Insulin erkennen und bezüglich humanem Insulin eine Affinitätskonstante von 3 x 108 aufweisen,

b) die Zellinie DB9G8, die monoklonale Antikörper ausscheidet, die bezüglich Rinderinsulin eine Affinitätskonstan-te von 5 x 108 aufweisen,

c) die Zellinie CC9C10, die monoklonale Antikörper ausscheidet, die bezüglich Rinderinsulin eine Affinitätskonstante von 2 x 107 aufweisen,

d) die Zellinie CG7C7, die monoklonale Antikörper ausscheidet, die bezüglich humanem Insulin eine Affinitätskonstante von 7 x 107 aufweisen,

e) die Zellinie BE3F9, die monoklonale Antikörper ausscheidet, die bezüglich Rinderinsulin eine Affinitätskonstante von 3 x 107 aufweisen,

0 die Zellinie CE9H9, die monoklonale Antikörper ausscheidet, die bezüglich humanem Insulin eine Affinitätskon-stantevon^ x 107 aufweisen,

B) die Hybridomzellinien kultiviert werden und

C) die monoklonalen Antikörper aus dem Kulturüberstand isoliert werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Hybridomzellinie AE9D6 kultiviert wird.

2

PATENTANSPRÜCHE

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Hybridomzellinie DB9G8 kultiviert wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Hybridomzellinie CC9C10 kultiviert wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Hybridomzellinie CG7C7 kultiviert wird.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Hybridomzellinie BE3F9 kultiviert wird.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Hybridomzellinie CE9H9 kultiviert wird.

8. Monoklonale Antikörper, erhalten nach einem der Ansprüche 1-7.

9. Verfahren zum Nachweis von Insulin mit Antikörpern, dadurch gekennzeichnet, dass gegen Insulin gerichtete Antikörper gemäss Anspruch 8 verwendet werden.

10. Verfahren gemäss Anspruch 9 zur Bestimmung des Insulinniveaus und zur Bestimmung des Verhältnisses von Insulin aus endogener Sekretion und exogener Injektion, dadurch gekennzeichnet, dass das Insulin mit einer Kombination, vorzugsweise einem Paar von monoklonalen Antikörpern gemäss Anspruch 8 in Kontakt gebracht wird und die Affinität jedes Antikörpers bestimmt wird.