JPS6196985A - 細胞クロ−ンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、被免疫動物に対して、ホルモン、酵素、その
他の生体活性物質等の一般に免疫学的寛容状態にあると
考えられる物質に対しても特異的に反応する抗体を産生
ずる能力を有するハイブリドーマ細胞株を樹立する方法
に関する。

ＷＩＩＳ細胞（５ｐｌｅｅｎ　　Ｃａ１ｌｓ）および骨
髄腫細胞（ｍｙｅｌｏｍａ　　Ｃｅ１ｌｓ　）ｔｆ）細
胞融合法ニヨるハイブリドーマ細胞に特貫抗体を産生さ
せる方法は、ケーラー（Ｋｏｈｌｅｒ）及びミルシュタ
イ７　（Ｍｔｌｓｔｅｉｎ）によシ報告され（Ｋｏｈｌ
ｅｒ。

Ｇ、、ａｎｄ　　Ｍｔｌｓｔｅｉｎ、Ｇ、　　（１９７
５）Ｎａｔｕｒｅ　　２互６：４９５参照〕、その後の
種々の改良がなされて、現在に至っているＣＧａ１−ｆ
ｒａ、Ｇ、、Ｒｏｗｓ、Ｓ、Ｃ，、ＭｉｌａｔｔｔｎＣ
，、ＢｌＬｔｃｈａｒ、Ｇ、Ｉｉ’、、ａｎｄ　Ｈｏｗ
ａｒｄ。

Ｊ、Ｃ，（１９７７）Ｎａｔｓｒａ　　２６６：５ｓＯ
１Ｇａｌｆｒａ、Ｇ、、Ｍｉｌａｔｅｉｎ、Ｃ，、ａｎ
ｄＦｒｉｇｈｔ、　　Ｂ、　　（１９７９）Ｎａｔｕｒ
ｔｔ　　２７７：　１３１、Ｓｈｕｌｍａｎ、Ｍ、、ａ
ｎｄ　Ｋｏｈｌｅｒ。

Ｃ，（１９７８）ＮａｔｌＬｙｇ　２７６：２６９等参
照〕。しかし被免疫動物に対して免疫学的寛容物質、即
ち免疫担当細胞に自己と認識されてしまう物質に対して
は、生体は一般に抗体を産生じ得えないことが知られて
いる。かように、既知の方法によっては、生体活性物質
その他の特殊な物質に対しては、特異抗体を産生ずるハ
イブリドーマ細胞は産生じ得ないか極めて低率にしか産
生じ得ないのが現状である。

かかる実情に鑑みて、本発明者は、被免疫動物として、
自己免疫疾患状態にあるか又は遺伝的に自己免疫疾患に
なりやすい動物を用いることに着目し、かかる病的状態
にあるマウスを用いることによシ、マウスに免疫学的寛
容物質であることが知られているマウス乳癌フィルス（
ＭＭＴＶ）Ｆ）外殻たんばく質の一つであるＧＰ５２（
分子量５２１Ｏ００の糖蛋白質０ｈｎｏ、Ｔ、、Ｍｅｓ
ａ　　−Ｔｅｊａｄａ、　　Ｒ，、Ｋｅｙｄｅｒ、　　
１．、Ｅａｍａｎａ−ｒａｙａｎａｎ、Ｍ、、Ｂａｗａ
ｃｈ、　　Ｊ、、　　ａｎｄ２４６４参照〕に対す参照
体産生バイブリド−？臂細胞の産生の技術を確立するに
至１）、ＧＰ５２に特異的に反応するモノクローナル抗
体の継続的な・収得に成功した。さらに、酵素であるエ
クオリン（Ａｔｔｑｗ−ｏｒｉｎ　）及びホルモンであ
るインスリンを抗原として、これに対する抗体産生に成
功し、本発明を完成するに至った。

しかして、本発明によれば、自己免疫疾患状態にあるか
又は遺伝的に自己免疫疾患になりやすい動物を該動物と
同一種の正常な動物に対しては免疫学的寛容状態にある
物質で免疫し、この免疫動物から抗体産生細胞を取得し
て骨髄腫細胞とのノ・イブリドーマを形成させ、次いで
このノ・イブリド−マをクローン化することにより、上
記免疫学的寛容状態にある物質に対して特異性を示す抗
体を産生ずる細胞クローンを選択することを特徴とする
、免疫学的寛容状態にある物質に対して特異性を示す抗
体を産生ずる細胞クローンの製造方法が提供される。

本明細書において、「自己免疫疾患状態」とは生体の病
的状態のひとつで、自己と非自己とを識別する生体の認
識機構が不完全である状態であシ、本来なら自己と免疫
担当細胞系に認識されて決して抗体産生を見ない物質に
対しても抗体を産生じてしまう様になる生体の病的状態
をいい、この自己免疫疾患についてのさらに詳しい情報
に関しては、例えばＴＨＥＯＦＩＬＯＰＯＵＬＯ５，Ａ
、。

ＤＩＸＯＮ、Ｆ、（１９８２）Ａｍ、Ｊ。

ｐｏｔｈｏｌ、１０８：３２１−３６５を参照されたい
。

また、「遺伝的に自己免疫疾患になりやすい」動物とは
、該動物種において実験用近文系動物系（兄妹交配によ
って遺伝的に純化された系統）として系統育成されてい
る動物で、その９０％以上の個体が自己免疫疾患になる
動物をいう。

モノクローナル抗体の産生ｑ技術において、抗原物質で
まづ動物を免疫する必要がある。被免疫動物としては、
マウスことにＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃ系マウスが一般に
用いられている。これは細胞融合法を行なう上で骨髄腫
細胞と同系同種のマウス（ＢＡＬＢ／ｃ’）からの胛細
胞を用いるのが良いと一般的に信じられているからであ
る。本発明者は、このＢＡＬＥ／ｃ、系マウスを用いて
、マウス乳癌ウィルスＭＭＴＶ−ｇｐ５２によって免疫
してこのＭＭＴＶ−ｇｐ５２に対する特異抗体を産生ず
るハイブリドーマ細胞を得るととを試みた結果、３６０
０ハイブリドーマ細胞を検索して７１゛クローンを得た
のみであった。

本発明において、自己免疫疾患状態にあるか又は遺伝的
に自己免疫疾患になりやすい動物として、遺伝的に自己
免疫異常に陥るマウス系ＮＺＢとＮｚｒ系ｆｆウス＋７
）−代雑種（７’＋　　）：　（ＮＺＢ×ＮＺＷ）Ｆｌ
、又はＮＺＥ系、ＢＸＳＢ系、ＭＲＬ／ｌ系、ＭＲＬ／
％等のマウス（以下このようなマウスを「自己免疫異常
マウス」という）を免疫胛細胞を得るための被免疫動物
として用いることによシ、極めて高率に抗ＭＭＴＶ−ｇ
ｐ５２抗体を産生ずるハイブリドーマ細胞を産生じ得る
ことが見い出された。

この自己免疫異常マウスはヒトの自己免疫疾患の一つで
あるＳＬＥ（Ｓｙｓｔｅｍｉｃ　　ＬｕｐｕｓＥｒｙｔ
ｈｇｍａｔｏｓｓｓ　）全身性紅斑性狽唐／全身性エリ
テマトーデスと極めて遅遅した症状を呈する実験動物系
であることが知られている。本発明では、これら動物が
自然に発病して来る退会の１〜２週令退会マウスを用い
、この自己免疫異常マウスに対して、免疫学的寛容状態
にある物質を抗原として免疫を開始し、抗体力価が充分
に高くなるまで免疫を繰シ返し、例えば数回の追加免疫
′を行なったのち、最終免疫の３日後に免疫動物から抗
体産生細胞、例えば胛細胞を取得し、これを骨髄腫細胞
との細胞融合法によシ融合させて、免疫学的寛容状態に
ある物質に対して特異性を示す抗体を産生ずる牌、細胞
と骨髄腫細胞とのハイブリドーマを形成させる。胛細胞
と骨髄腫細胞との融合はそれ自体公知の細胞融合法、例
えば前述のクーラー及びミルシュタインによシ報告され
た方法により容易に行なうことができる。その際、ＥＡ
Ｔ選択培地のような融合細胞（ハイブリドーマ細胞）の
みが生存する限定選択培地と用いることによシ、ハイブ
リドーマ細胞を高収率で取得することができる。

なお、本明細書において使用する「免疫学的寛容状態に
ある物質」とは、正常状態にある生体では、すべての生
体の構成要素と産生物に対して、生体の免疫担尚細胞系
はこれを自己と認識して、これらの物質には抗体を産生
じない、たとえば生体の産生ずるホルモンや神経伝達因
子、酵素などは一般には生体にとって自己と認識されて
これに対する抗体は産生されない一心＾÷９物質のこと
を言う。

但しヒトとマウスの間のように種が異なると同様の活性
を有している物質でもその構造がまったく異なる物質で
あれば、この限シではない。即ち抗体は産生される訳で
ある。しかし一般的に言って、上記のホルモンや酵素等
は種が異っても物質の構造上の相違は極めて僅かなのが
一般的でらシ、そのために種が異なる場合にも、これら
の物質に対して抗体を産生させることは極めて困難であ
る場合が多い。

上記の如くして調製されるハイブリドーマ細胞群からは
次いで、免疫に用いた抗原物質（免疫学的寛容状態にあ
る物質）に対して特異反応性を示す抗体を産生ずる能力
のある細胞を検索しクローニングする。この検索及びク
ローニングはそれ自体公知の方法で行なうことができ〔
例えば、ｘｏｈｔｅｒ、　　Ｍｉｔ、１ｌｔａｉｎ　ら
による前述の文献参照〕、例えば、ＥＬＩＳＡ法によシ
検索し、これを限界希釈法によってクローニングするこ
とによシ、モノクロ〒ナル抗体産生株化細胞を取得する
ことができる。

この場合の細胞融合の技術は融合細胞の培養によシ均質
な、いわゆるモノクローナル抗体を連続的に生産せしめ
ることを可能にする技術でｓｂ、その生産方法の一般的
な概要自体はすでに公知であシ〔例えばＫｏｈｌｔｒ、
Ｍｉｌｓｔｅｉｎらによる前述の文献参照〕、本発明に
おいてもその方法をその１ま利用することができるので
、ここでは該文献の引用を以って詳細な説明を省略する
。

以上述べた本発明の方法は、自己免疫異常系のマウスを
免疫寛容物質で免疫することによシ、免疫学的寛容状態
を簡単に破壊し得ることを証明したものであシ、シかし
て本発明の方法によれば、生体活性物質等従来の方法で
は抗体を産生ずることが極めて困難であると考えられて
いた免疫学的寛容状態にある物質に対する抗体産生細胞
系を樹立することができる。

かようにして取得された抗体産生細胞系は試験管内で又
は動物の腹腔内で増殖することが可能であシ、その培地
又は腹水からモノクローナル抗体を取得することができ
る。例えば、ＮＺＢｘＮＺｒ、ｐ、マウス又はＭＲＬ／
ｌ系マウスの肝細胞とマウス骨髄腫細胞（＃、５−ｘ）
とのハイブリドーマ細胞はすべてＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　
ｃ系マウスの腹腔内で増殖が可能でアシ、宿主マウスの
腹水中にモノクローナル抗体を産出する。

例えば、試験管内での増殖は、完全培地ＣＲＰＭｌ−１
６４０Ｈ２ｍＭグルタミン、１ｍＭピルシリン（５Ｇ１
Ｌ％ｉｔｓ／ゴ）及び１５％馬血清（５ｃｒｅｅｎｅｄ
）を補充したもの〕のような増殖培地中で、３７℃、５
％ＣＯ，インキュペター中にて培養することができる。

また、このようにして培養されたバイブＩ）−ｔ−’−
マ細胞は２　Ｘ　１０’〜１×１０？細胞をマウス腹腔
内に接種することもできる。この場合接種に用いるマウ
スは、あらかじめ（１〜２週間前）０．５−のｐｒｉｓ
ｔａｎｅ（Ｐｆａｌｔｚ　　＆　Ｂａｗｅｒ社製）を腹
腔内に注入して前処理をほどこしておくことが望ましい
。接鍾後一般に４日〜１０日で腹水採取が可能となる。

腹水中にはハイブリドーマ細胞とハイブリドーマ細胞の
産生じた抗体とが含まれており、この中のハイブリドー
マ細胞を遠心分離によって除去した後抗体原液として使
用することができる。

以上に述べた方法で産生されるモノクローナル抗体は従
来の文献に未載の新規且つ極めて有用な物質であり、か
かるモノクローナル抗体を用いれば、例えば、ホルモン
や酵素等の生体活性物質の超微量定量方法（μｌｉ−ｓ
ｇ）を確立することができる。さらに、インスリンは糖
尿病治療には必須の物質であるが、現在用いられている
インスリン製剤はブタ由来のものをアミノ酸を変換する
ことによってヒト化して用いられているが、純粋にヒト
由来のものに比して長期使用時に患者がこれに対して抗
体を作ってしまい、インスリンでの治療が行えなくなる
という症例がある。この場合の原因はブタのインスリン
をヒト化したものが有害なのか、該製剤中に微量に含ま
れる不純物によるものか不明であるが、本発明の方法を
応用すれば、各種の抗インスリン抗体を得ることができ
、この抗インスリン抗体を用いれば上記の原因を解明す
ることがで□きる。さらに抗インスリン抗体を用いてア
フイニテイカラムを作成すれば、上記の不純物を効率良
く除去する方法の開発も可能となる。

また、本発明の方法に従えば、各種の免疫学的寛容状態
にある物質に対する特異性モノクローナル抗体の入手が
可能となシ、それらの特異性モノクローナル抗体を用い
ることによってかかる物質の生体内での局在を明らかに
することによシ種々の病気の診断に役立てることができ
、さらに、該特異性モノクローナル抗体を用いてアフイ
ニテイカラムを作成することによシ、免疫学的寛容状態
にらる微量の生体活性物質を多量にｎ製することが可能
となシ各種の難病の治療処置に利用することができる。

次に実施例を掲げて本発明の方法をさらに詳しく説明す
る。

実施例　１：　　ＭＭＴＶ−ｇｐ５２及びｐ４Ｂに対す
るモノクローナル抗体産生細 胞の作製 １ＶＺＢ×ＮＺＷ、Ｆ、５退会の雄（７）−Ｆウスに、
マウス乳癌ウィルス（ＭＭＴＶ）−ｇｐ５２及びｇｐ５
２から酵素処理によって糖鎖を除去した蛋白質２４８（
分子量４８，０００　）を抗原として、初回免疫に各３
０μｙ１第２回免疫に１５／ｊ、９゜最終免疫に１０μ
Ｉをそれぞれ注射した。マウスから免疫胛細胞を最終免
疫終了の日から３日後に採取して、マウス骨髄腫細胞Ｍ
Ｓ−１との融合細胞をＥＡＴ選択培地を用いるｐＥＧ法
によって作製した。ここで用いたＰＥＧ法の詳細につい
ては、Ｇａ１ｆｒｅ、Ｇ、、Ｈｏｗｒ、Ｓ、Ｃ，、Ｍｉ
ｌａ−ｔｅｉｎ、　　Ｃ，、Ｂｕｔｃｈｅｒ、　　Ｇ、
Ｆ、、　　ａｎｄＨｏｗａｒｄ、Ｊ、Ｃ，（１９７７）
Ｎａｔｓｒｅ２６６：５５０、参照。また、ＨＡＴ選択
培地とはヒボキサンチン（ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ　
）　７ミノプテリン（ａｔｎｉｎｏｐｔｇｒｉｎ）とチ
ミジン（ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ　）を含む培地ノコとで、
コノ培地中では、細胞融合の結果形成されたハイブリド
ーマ細胞のみが増殖し、もとの骨髄腫細胞は死滅する選
択培地である。

融合細胞作製から２〜３週間後に、ＥＡＴ選択培地中に
生育してきたハイブリドーマ細胞が３０株得られた（第
１表）。

このハイブリドーマ細胞の産生ずる抗体の特異性につい
て酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ）で検討した結果を下記第２
表に示す。抗原物質であるｙｐ５２に特異的に結合する
抗体産生細胞株が６種分離された。またｐ４８に対する
抗体産生細胞は３株であった。しかも、この内ヒトの乳
癌細胞と交叉反応を示す抗体を産生ずる細胞をｇｐ５２
の場合３株、ｐ４８の場合にも１株産生ずることに成功
した。

実施ｆｌＪ　　２：　　ＭＭＴＶ及（ｊＭＭＴＶ−Ｑｐ
５２に対するモノクローナル抗体産生 細胞の作製 ＩｙｌＲＬ／ｌマウスを被免疫動物として用い、抗原物
質としてマウス乳癌ウィルス（ＭＭＴＶ）及びＡＩＭＴ
Ｖ−ｇｐ５２を用い、実施例１と同様にして、免疫肝細
胞を得てＰＥＧ法によってノ１イプリドーマ細胞を作製
した。下記の第３表に示すように（Ｊｐ５２を抗原とし
て、３０００種のハイブリドーマ細胞を得、ＭＭＴＶに
対して２１００種の細胞を得た。この各細胞株を酵素抗
体法によって特異抗体産生能の有無について検討した結
果、σｐ５２に反応する抗体産生株７２、陽性率ｚ４す
る抗体の反応性の特異性を検討した結果を下記第４表に
示す。ＧＰ５２を抗原とした場合にヒト乳癌細胞株Ｔ４
’７Ｄと反応するもの１０種、ヒト乳癌細胞株ＭＣＩ’
ｒと反応するもの１１種、さらに手術切片の病理標本（
パラフィン組織切片）上で乳癌細胞と反応するもの２種
であった。

ＪＩＭＴＶを抗原とした場合の結果は、抗原に特異反応
性を示すもの３５株、この内ヒト乳癌細胞Ｔ４ｑＤ、Ｍ
ＣＦＴと反応するもの３株であった。

さらに組織切片中の乳癌細胞と反応するもの１株という
結果を得ている。

以上の３株について、さらに２回の限界希釈法によるク
ローニングののち、５Ｘ１Ｇ’〜１０？個のハイブリド
ーマ細胞をＢ　Ａ　Ｌ　Ｅ　／　６マウスの腹腔に注入
することによシ腹腔内で１〜３週間増殖させ、高濃度の
モノクローナル抗体を含む腹水を得ることに成功した。

なお、上記限界希釈法によるクローニングの手順は次の
とおシである：滅菌した９６大のマイクロタイタープレ
ートを使用して、ハイプリードーマの細胞数を０．１／
１００μｌ、　　Ｏ１ｓ／ｌ　００μ！。

１／１００μｌの三段階に希釈して各濃度の細胞液を１
００μｌづり２行のウェル（２４クエル）に分注する。

その後３７℃、５％ＣＯ，インキュベイターで増殖せし
める。

こののち増殖してきた細胞群のうち最も希釈度の高い、
細胞を分注した行のウェルか≦４胞は単一の細胞を親細
胞として増殖してきた細胞であると、９３％以上の確か
らしさて考えることができる。

との抗体のＥＬＩＳＡ法による反応の代表的な例として
、抗ＧＰ５２抗体（２−２Ｃ９Ｆ１０Ｃ４）と抗ＭＭＴ
〆抗体（４−６Ｅ３，４１０）の？ウス乳癌ウィルスに
対する反応性（２種のエピトープ抗体のＥＬＩＳＡ滴定
による；プレートはＣ３Ｅ−Ｍ　Ｍ　７’　ｊ’　／　
Ｍｑ　５　Ｍ　７’　／　（１’　％　粒子テコＦ　シ
ｆｌ−ものを使用）のグラフを第１図に示す。また、同
様の検定をヒト乳癌組織からの抽出物について行った結
果（ヒト乳ガン抗原の２種のモノクローナル・エピトー
プのＥＬＩＳＡでの交叉反応性；プレートはヒト乳ガン
組織抽出液でコートしたものを使用）を第２図に示す。

さらに、この抗体は５ＤＳ−ｐＡＧＥ（ＳＤＳ−ポリア
クリルアミｔ”・ゲル電気泳動法）によって分離された
抗原物質に対しても反応性を有することが証明された。

第３図はＡ例にヒト乳癌細胞抽出物、Ｂ例にはマウス乳
癌ウィルスが電気泳動されたものを、ニトロセルロース
フィルターにプロットしたものでろムこれにモノクロー
ナル抗体を作用させ、抗マワスＩＱＧ抗体に酵素標識し
たもので検出した結果である。この結果明らかなように
、ＭＭＴ〆ではＧＰ５２と反応していることが証明され
た。ヒトの乳癌細胞中にも同様の物質が存在する。

実施例　３：　エフオリｙ　（Ａｇｑｗｏｒｉ）に対す
るモノクローナル抗体産生細胞 の産生 エクオリンはクラゲＡｅｑｕｏｒｇαから分離された特
殊々発光蛋白質で、Ｃα　イオン分子・と結合すると特
異蛍光を発することで知られている（Ｊｏｈｎｓｏｎ、
Ｆ、、Ｓｈｉｍｏｔｎｕｒα、Ｏ０Ｃα　の定量など筋
肉収縮の機構解明に有用な物質であシ、これに対する特
異抗体はこれらの研究上有効な手段を我々に与えるもの
である。

精製されたエクオリンを抗原として、ＮＺＢ×ＮＺＷ、
Ｆ、マウスを免疫して抗体産生能を検討した。このとき
、ＮＺＢ×ＮＺＷ、Ｆ、マウスの免疫時の退会及び同一
の抗原物質を従来一般にモも試みた。

抗原エクオリンを初回２０μｍ１第２回１０μ最終回５
μｇをそれぞれ３群のマウスに注射した。

被免疫動物はＮＺＢ×ＮＺＷ’、Ｆ、マク退会週令と同
系のマウス１１週令とＢＡＬＢ／Ｃマウス５週令の３群
である。

退会終了ののちそれぞれから胛細胞を得て、マウス骨髄
腫細胞ＭＳ−１とｐＥＧ法″によって細胞融合せしめて
、ＥＡＴ選択培地中に増殖してきたハイブリドーマを得
た。その結果は下記第５表に示すように、５週令のＮＺ
Ｅ×ＮＺＷＳＦＨマウス群から１１６株、１１週↑のＮ
ＺＢ×ＮＺＷ、Ｆ。

マウス群から２７株、ＢＡＬＢ／ｃマウス群ではハイブ
リドーマ形成率は高（，６６２株であった。

しかしＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウス群の場合の特異抗
体の産生率は５株、α７％にすぎない。これに対して５
週令のＮＺＢ×ＮＺＷ７．Ｆ、マウスを用いた例では２
２株、１９．０％ときわめて高率であった。

ＮＺＥ×ＮＺＷ、Ｆｌでの加令の影響を示唆する。

結果で、１１１週令マウスでは〕・イブリドーマ形成率
も特異抗体産生率も共に低下の傾向を示している。即ち
、特異抗体産生株は５例、１９．５％と低値を示した。

さらに酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ）によって陽性を見た抗
体について、エクオリンの生化学的活性が中和されるか
否かを検討した結果を下記第６表に示す。Ｃ４＋１イオ
ンと結合してエクオリンが特異蛍光を発するのを阻止す
る能力を有する抗体分子を産生ずるハイブリドーマが得
られたのは５週令のＮＺＥｘＮＺＴｉ７．Ｆ１マウス群
を用いた場合が最も高く６株、１１１週令マウス群の場
合には１例得られたがＢＡＬＢ／ｃマウス群によっては
１例も得られなかつ九。

実施例　４：　インスリンに対するモノクローナル抗体
産生細胞の産生 インスリンは比較的低分子の蛋白性のホルモンでヒトと
ブタのインス寧リンはきわめて類似点が高いことが知ら
れている。

この両者を抗原として４週令のＮＺＢｘＮＺＩＦ’。

Ｆｉマウスを用いて、初回５０μ１１第２回２５μｌ、
最終回３μｉの各インスリンを注射して免疫した。最終
免疫の３日後に各群のマウスから肝細胞を得てマウス骨
髄腫細胞とＥＡＴ選択培地を用いるｐＥＧ法（実施例１
と同様）によシ細胞融合させた。ＥＡＴ選択培地に増殖
してきたノ・イブリドーマ細胞株について、各々の抗原
に対する特異反応性を検討した結果を下記の第７表に示
す。

ヒトのインスリンを抗原としてＮＺＢ×ＮＺＷ。

Ｆｌを免疫した場合には２２０株のハイブリドーマを得
、このうち酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ）によつて陽性と認
められた細胞株は３２株、１４．５％・の陽性率であっ
た。また、ブタ（ｐｏｒｃｉｎｇ　）のインスリンを抗
原とした場合には、ハイブリドーマ細胞を２００株得九
０この中で反応特異性を示したのは６４株、３２０％の
陽性率を示した。

【図面の簡単な説明】

第１図は、抗ＧＰ５２抗体Ｊ（こ２−２ＣｆＦ１０（’
４　）と抗ＭＭＴＶ抗体（５−６Ｅ３，４１０）のマウ
ス乳癌ウィルスに対す名反応性を示すグラフであシ、 第２図は、第１図と同様の検定をヒト乳癌組織からの抽
出物について行なった結果を示すグラフであシ、 第３図はモノクローナル抗体２−２Ｃ９Ｆ１０Ｃ；によ
るヒト乳癌細胞抽出物及びマウス乳癌ウィルスのニトロ
セルロースフィルＩ’−上−１：（ＤＳＤＳ−ポリアク
リルアミド・ゲル電気泳動後の抗原の検出状態をプロッ
トした図である。 ＡＳ Ａ：　ｌＺ）季しがン神記ａＴ４７Ｄ　ＣＩＢ　：　Ｍ
ＭＴＶ　Ｃ３Ｈ／Ｍｒｎ５ｍｔ／ｃｌモノクローナル城
体：　２−２Ｃ９ＦＩＯＣ４第３図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、自己免疫疾患状態にあるか又は遺伝的に自己免疫疾
   患になりやすい動物を、該動物と同一種の正常な動物に
   対しては免疫学的寛容状態にある物質で免疫し、この免
   疫動物から抗体産生細胞を取得して骨髄腫細胞とのハイ
   ブリドーマを形成させ、次いでこのハイブリドーマをク
   ローン化することにより、上記免疫学的寛容状態にある
   物質に対して特異性を示す抗体を産生する細胞クローン
   を選択することを特徴とする、免疫学的寛容状態にある
   物質に対して特異性を示す抗体を産生する細胞クローン
   の製造方法。 ２、自己免疫疾患状態にあるか又は遺伝的に自己免疫疾
   患になりやすい動物とはＮＺＢ×ＮＺＷの第一代雑種（
   Ｆ＿１）マウス、又はＮＺＢ系、ＢＸＳＢ系、ＭＲＬ／
   ｌ系もしくはＭＲＬ／ｎ系マウスである特許請求の範囲
   第１項記載の方法。 ３、骨髄腫細胞とはマウス骨髄腫細胞である特許請求の
   範囲第２項記載の方法。 ４、特許請求の範囲第１項記載の方法で製造された抗体
   産生細胞クローンを、試験管内で又は動物の腹腔内で増
   殖させ、培地又は腹水から免疫学的寛容状態にある物質
   に対して特異性を示す抗体を取得することを特徴とする
   免疫学的寛容状態にある物質に対して特異性を示す抗体
   の産生方法。 ５、免疫学的寛容状態にある物質が、ホルモン又は酵素
   である特許請求の範囲第１〜４項のいずれかに記載の方
   法。