CN1850863B - 针对自身抗原和/或种属间高度保守抗原的抗体及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了针对自身抗原和/或种属间高度保守抗原的抗体及其制备方法。该针对自身抗原和/或种属间高度保守抗原的抗体，按照下述方法制备：是用小鼠自身抗原和/或与小鼠自身抗原高度保守的异源抗原免疫NZB/W F1小鼠，得到针对自身抗原和/或种属间高度保守抗原的多克隆抗体或单克隆抗体。本发明可广泛用于生产具有较高效价的针对小鼠自身抗原和/或人鼠间高度保守抗原的抗体。
Description
技术领域
本发明涉及一种针对自身抗原和/或种属间高度保守抗原的抗体及其制备方法。
背景技术
利用单克隆抗体治疗疾病是目前医药业的热点，而单克隆抗体药物的研发需要科研和开发两方面的有机配合。在科研方面，需要确证抗体靶点的有效性，这就需要针对鼠抗原的单克隆抗体进行动物试验。目前主要是在大鼠和豚鼠中得到抗小鼠蛋白的单克隆抗体。但大鼠与豚鼠的抗体在小鼠身上是异源蛋白，较长时间的药效学试验会产生排斥反应，而有些种属间高度保守的蛋白在大鼠与豚鼠中也难以得到单克隆抗体。在开发方面，需要针对人的蛋白产生单克隆抗体，而一些抗体药物的理想靶点在种属间是高度保守的，人源性的蛋白与鼠源性的对应蛋白非常相似。由于小鼠对自身蛋白的免疫耐受，高度保守性的蛋白作为抗原免疫小鼠时很难产生较强的免疫反应。对于同源性高于75％以上的蛋白，一般需要免疫相应的基因敲除鼠才能得到高亲和力的抗体。而基因敲除鼠的构建比较困难，很难针对每一种需要产生抗体的高度保守蛋白进行相应的基因敲除，有些基因敲除后小鼠不能存活，或者产生免疫缺陷，还是不能用于免疫。因此迫切需要一种广泛适用的方法，使得种属间高度保守的抗原能在小鼠中产生较好的免疫反应，从而筛选出高亲和力的抗体。
纯系新西兰黑色小鼠(New Zealand、Black，NZB)在出生后4-6个月大多数发生自身免疫性溶血性贫血。NZB与NZW(New Zealand、white)杂交产生的F1子代动物NZB/W F1(NZB×NZW F1)，B淋巴细胞存在多克隆活化，产生过量抗体及抗自身抗原的抗体，有自发的类似狼疮性肾炎。因此，一般认为它是人类红斑狼疮的最佳天然模型(Aguas，A.P.，Esaguy，N.，Grande，N.R.，Castro，A.P.，andCastelo Branco，N.A.(1999).Acceleration of lupus erythematosus-likeprocesses by low frequency noise in the hybrid NZB/W mouse model.Aviat.Space Environ.Med.70，A132-A136；Morel，L.and Wakeland，E.K.(1998).Susceptibility to lupus nephritis in the NZB/W model system.Curr.Opin.Immunol.10，718-725；Granholm，N.A.，Graves，K.，Izui，S.，and Cavallo，T.(1985).Pathogenic role of anti-DNA antibodies in murine lupus nephritis.J.Clin.Lab Immunol.18，113-118)。
发明内容
本发明的目的是提供一种制备针对自身抗原和/或种属间高度保守抗原的抗体的方法。
本发明所提供的制备针对自身抗原和/或种属间高度保守抗原的抗体的方法，是用小鼠自身抗原和/或与小鼠自身抗原高度保守的异源抗原免疫NZB/W F1小鼠，得到针对自身抗原和/或种属间高度保守抗原的多克隆抗体或单克隆抗体。
所述小鼠自身抗原为小鼠自身蛋白。所述与小鼠自身抗原高度保守的异源抗原是与小鼠自身蛋白具有75％以上氨基酸序列同源性的异源蛋白。
所述小鼠自身蛋白和/或与小鼠自身蛋白具有75％以上氨基酸序列同源性的异源蛋白的免疫佐剂可以为雌激素。
所述雌激素可为雌二醇、雌三醇、雌酚或17β雌二酯。
为了提高目的蛋白抗原性，所述小鼠自身蛋白和/或与小鼠自身蛋白具有75％以上氨基酸序列同源性的异源蛋白的氨基端或羧基端还融合有T细胞特异性抗原决定簇。
所述T细胞特异性抗原决定簇可为可以被小鼠T细胞特异性识别，但不能被小鼠B细胞识别的任何异源蛋白的一部分，如具有序列表中序列1的氨基酸残基序列。
所述小鼠自身蛋白具体可为IL-18；所述与小鼠自身蛋白具有75％以上氨基酸序列同源性的异源蛋白具体可为人MIF或人HMGB1。
所述方法中还包括纯化针对自身抗原和/或种属间高度保守抗原多克隆抗体或单克隆抗体的步骤。
由上述方法制备的针对自身抗原和/或种属间高度保守抗原的多克隆抗体或单克隆抗体也属于本发明的保护范围。
本发明利用NZB/W F1小鼠自发产生自身抗体的特点，避免了小鼠的免疫耐受，使得小鼠自身抗原以及人鼠间高度保守的抗原都能在这种小鼠中产生较好的免疫反应。本发明用皮下植入雌激素的方法进一步打破小鼠的免疫耐受，获得更高的免疫效价。本发明用针对鼠T细胞的细菌抗原肽与目标蛋白产生重组融合蛋白，从而为NZB/W F1小鼠体内的自身抗原特异性B细胞提供有效的T细胞帮助。本发明可广泛用于生产具有较高效价的针对小鼠自身抗原和/或人鼠间高度保守抗原的抗体。
附图说明
图1A为用重组鼠IL-18蛋白第二次免疫NZB/W F1和野生型小鼠的抗体效价结果
图1B为用重组鼠IL-18蛋白第二、三、四次免疫NZB/W F1小鼠的抗体效价结果
图2A为按0毫克/只，0.72毫克/只，2.5毫克/只和5毫克/只的剂量植入雌激素的NZB/W F1小鼠经重组鼠IL-18蛋白第二次免疫后的抗体效价结果
图2B为按0毫克/只，0.01毫克/只，0.05毫克/只，0.18毫克/只和0.72毫克/只的剂量植入雌激素的NZB/W F1小鼠经重组鼠IL-18蛋白第三次免疫后的抗体效价结果
图3为用人MIF蛋白免疫NZB/W F1小鼠的抗体效价结果
图4为用HMGB1-GST和HMGB1-MT免疫NZB/W F1小鼠的抗体效价结果
具体实施方式
下述实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
实施例1、用鼠IL-18蛋白免疫NZB/W F1小鼠获得较高效价
对3个月龄的NZB/W F1小鼠(南京大学模式动物研究所)和B6(野生型)小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)进行如下四次免疫：10微克重组鼠IL-18(Biosource International，Inc.，货号PMC0184)加完全弗氏佐剂皮下免疫(第一次免疫)，14天和21天后5微克重组鼠IL-18加不完全弗氏佐剂皮下免疫两次(第二次和第三次免疫)，再过14天后用5微克重组鼠IL-18静脉注射两次(隔天一次)进行第四次免疫。同时按照上述方法，用PBS(pH 7.5)免疫3个月龄的NZB/W F1小鼠和B6(野生型)小鼠四次，每次免疫剂量为0.1ml/只，作为对照。
每次免疫后1天取血清，用重组鼠IL-18(10微克/毫升)包板，ELISA检测抗体效价。结果表明NZB/W F1鼠的免疫反应明显高于野生型鼠(图1A)，第四次免疫的NZB/W F1鼠的血清效价可达到6万(图1B)。
图1A和图1B中，效价OD＝0.5表示ELISA读数为0.5时血清的稀释度。图1A中，BW-728、BW-729、BW-730、BW-731和BW-732表示PBS第二次免疫后的五只NZB/W F1小鼠的抗体效价；BW-733、BW-734、BW-735、BW-736和BW-737表示重组鼠IL-18第二次免疫后的五只NZB/W F1小鼠的抗体效价；B6-227、B6-229和B6-230表示PBS第二次免疫后的三只B6小鼠的抗体效价；B6-247、B6-248、B6-249和B6-250表示PBS第二次免疫后的四只B6小鼠的抗体效价。图1B中，BW733-1st表示重组鼠IL-18第二次免疫后的编号为BW-733的NZB/W F1小鼠的抗体效价；BW733-2nd、BW734-2nd、BW735-2nd和BW736-2nd表示重组鼠IL-18第三次免疫后的编号分别为BW-733、BW-734、BW-735、BW-736的NZB/W F1小鼠的抗体效价；BW733-IV、BW734-IV、BW735-IV和BW736-IV表示重组鼠IL-18第四次免疫后的编号分别为BW-733、BW-734、BW-735、BW-736的NZB/W F1小鼠的抗体效价。
实施例2、用缓释雌激素药片植入NZB/W F1小鼠皮下，提高小鼠对自身抗原的免疫反应。
将含有0.01至5毫克17β雌二酯的缓释雌激素药片(Innovative Researchof America，Sarasota，FL)植入小鼠颈部皮下，每只小鼠一片。7天后用实施例一中所述方法进行免疫和效价检测。结果表明雌激素可以提高NZB/W F1鼠对自身抗原的免疫反应，雌激素的剂量以0.72毫克/只小鼠为最佳(图2A和图2B)。
图2A和图2B中，效价OD＝0.5表示ELISA读数为0.5时血清的稀释度。图2A中，E-4，E-5，E-6，E-7和E-8表示按0毫克/只的剂量植入雌激素的五只NZB/WF1小鼠经重组鼠IL-18蛋白第二次免疫后的抗体效价结果；E-9，E-10，E-11，E-12和E-13表示按0.72毫克/只的剂量植入雌激素的五只NZB/W F1小鼠经重组鼠IL-18蛋白第二次免疫后的抗体效价结果；E-14，E-15，E-16，E-17和E-18表示按2.5毫克/只的剂量植入雌激素的五只NZB/W F1小鼠经重组鼠IL-18蛋白第二次免疫后的抗体效价结果；E-19，E-20，E-21，E-22和E-23表示按5毫克/只的剂量植入雌激素的五只NZB/W F1小鼠经重组鼠IL-18蛋白第二次免疫后的抗体效价结果。图2B中，E3p-666，E3p-667和E3p-668表示按0毫克/只的剂量植入雌激素的四只NZB/W F1小鼠经重组鼠IL-18蛋白第三次免疫后的抗体效价结果；E3-670，E3-671、E3-672和E3-673表示按0.01毫克/只的剂量植入雌激素的四只NZB/W F1小鼠经重组鼠IL-18蛋白第三次免疫后的抗体效价结果；E3-674，E3-676和E3-677表示按0.05毫克/只的剂量植入雌激素的三只NZB/W F1小鼠经重组鼠IL-18蛋白第三次免疫后的抗体效价结果；E3-679，E3-680和E3-681表示按0.18毫克/只的剂量植入雌激素的三只NZB/W F1小鼠经重组鼠IL-18蛋白第三次免疫后的抗体效价结果；E3-682，E3-683、E3-684和E3-685表示按0.72毫克/只的剂量植入雌激素的四只NZB/W F1小鼠经重组鼠IL-18蛋白第三次免疫后的抗体效价结果。
实施例3、用MIF蛋白免疫NZB/W F1小鼠，获得高亲和力单克隆抗体。
MIF是一个与糖皮质激素相拮抗的细胞介素，广泛参与炎症反应。这个蛋白在败血症，类风湿性关节炎，哮喘等疾病中是很好的药物靶点。人和鼠的MIF氨基酸序列89％相同，小鼠对人的MIF蛋白只产生很弱的免疫反应，需要用MIF基因敲除鼠来得到抗MIF的单克隆抗体。本发明用大肠杆菌表达的人MIF蛋白(将人MIF蛋白(huMIF)的编码区克隆至删除了GST编码区的PET-41a载体(Novagen，USA)，克隆的质粒在DH5α里扩增，再经由BL21中表达。融合蛋白中带有6×his Tag，通过Ni-NTA亲和层析纯化。)免疫野生型Balb/C小鼠和NZB/W F1小鼠，80微克MIF加MPL+TDM乳液状佐剂(sigma)足底免疫，一周一次，共三次。第三次免疫后取血清，用带有GST标签的人MIF蛋白(GST-MIF重组蛋白)(将huMIF的编码区克隆至PET-41a载体(Novagen，USA)，克隆的质粒在DH5α里扩增，再经由BL21中表达。融合蛋白中带有GST Tag，通过谷胱甘肽亲和层析纯化。)包板，GST-MIF重组蛋白的浓度为10微克/毫升，ELISA检测效价。结果表明在NZB/W F1小鼠中的效价比野生型的效价要高很多(图3)。图3中，1、2和3表示三只NZB/W F1小鼠，4、5和6表示三只Balb/C小鼠。
免疫后的NZB/W F1小鼠取淋巴结中的免疫细胞与SP2/0细胞以5∶1比例进行杂交瘤融合，筛选后得到6株分泌特异性结合人MIF抗体的杂交瘤。表1显示其中三种单克隆抗体的解离常数在nM水平。
表1抗MIF单克隆抗体
| 克隆号 | 4E10 | 2A12 | 10C3 |
| 抗体亚型 | IgG2a | IgG2b | IgG2b |
| 解离常数 | 1×10-9M | 1×10-10M | 3×10-9M |
实施例4、用带有T细胞特异性抗原决定簇融合标签的HMGB1蛋白免疫NZB/WF1小鼠获得较高效价。
HMGB1是一个核蛋白，同时也能分泌到细胞外作为细胞介素参与炎症反应。这个蛋白在败血症中是个很好的药物靶点。人和鼠的HMGB1氨基酸序列98％相同，小鼠对人的HMGB1蛋白不产生免疫反应。而HMGB1基因敲除鼠出生几天后就死去了，不可能用于免疫反应。因此目前还没有针对此蛋白的单克隆抗体。本发明表达了人HMGB1与结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MT)Psts-1蛋白氨基酸326-344小肽(DQVHFQPLPPAVVKLSDAL，序列1)的融合蛋白(HMGB1-MT)(将人HMGB1(hu HMGB1)编码N端181氨基酸的cDNA与序列1的小肽编码序列通过PCR方法重组，克隆至删除了GST编码区的PET-41a载体(Novagen，USA)，克隆的质粒在DH5α里扩增，再经由BL21中表达。融合蛋白中带有6×his Tag，通过Ni-NTA亲和层析纯化。)用此作为抗原免疫NZB/W F1小鼠，共免疫两次：10微克HMGB1-MT加完全弗氏佐剂皮下免疫(第一次免疫)，14天后5微克HMGB1-MT加不完全弗氏佐剂皮下免疫(第二次免疫)。第二次免疫后，取血清，用His6-HMGB1(将hu HMGB1编码N端181氨基酸的cDNA通过PCR方法扩增，克隆至删除了GST编码区的PET-41a载体(Novagen，USA)，克隆的质粒在DH5α里扩增，再经由BL21中表达。融合蛋白中带有6×his Tag，通过Ni-NTA亲和层析纯化。)包板，浓度为10微克/毫升，ELISA检测效价。结果表明有两只免疫鼠的效价达到1∶16000(图4)。
同时用GST与人HMGB1融合蛋白(HMGB1-GST)(将hu HMGB1编码N端181氨基酸的cDNA通过PCR方法扩增，克隆至PET-41a载体(Novagen，USA)，克隆的质粒在DH5α里扩增，再经由BL21中表达。融合蛋白中带有GST Tag，通过谷胱甘肽亲和层析纯化。)按照上述方法免疫NZB/W F1小鼠，并按照上述ELISA方法检测效价，其中包板的His6-HMGB1浓度为10微克/毫升，结果得到的最高效价是1∶4000(图4)，此结果比免疫野生型小鼠要好些，但还不够用于杂交瘤的筛选。
图4中，效价OD＝0.5表示ELISA读数为0.5时血清的稀释度；HMGB1-GST-1、HMGB1-GST-2和HMGB1-GST-3表示三只免疫HMGB1-GST的NZB/W F1小鼠；HMGB1-MT-1、HMGB1-MT-2和HMGB1-MT-3表示三只免疫HMGB1-GST的NZB/W F1小鼠。
序列表
<160>1
<210>1
<211>19
<212>PRT
<213>1
<400>1
Asp Gln Val His Phe Gln Pro Leu Pro Pro Ala Val Val Lys Leu Ser
1 5 10 15
Asp Ala Leu
Claims (3)
1.一种制备针对自身抗原和/或种属间高度保守抗原的抗体的方法，是用小鼠自身抗原和/或与小鼠自身抗原高度保守的异源抗原免疫NZB/W F1小鼠，得到针对自身抗原和/或种属间高度保守抗原的多克隆抗体或单克隆抗体；
所述小鼠自身抗原是小鼠自身蛋白；所述与小鼠自身抗原高度保守的异源抗原是与小鼠自身蛋白具有75％以上氨基酸序列同源性的异源蛋白；
所述小鼠自身蛋白和/或与小鼠自身蛋白具有75％以上氨基酸序列同源性的异源蛋白的免疫佐剂为雌激素；
所述小鼠自身蛋白和/或与小鼠自身蛋白具有75％以上氨基酸序列同源性的异源蛋白的氨基端或羧基端还融合有T细胞特异性抗原决定簇；
所述T细胞特异性抗原决定簇的氨基酸残基序列如序列表中序列1所示；
所述小鼠自身蛋白为IL-18；所述与小鼠自身蛋白具有75％以上氨基酸序列同源性的异源蛋白为人MIF或人HMGB1。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述雌激素为雌二醇、雌三醇、雌酚或17β雌二酯。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法中还包括纯化针对自身抗原和/或种属间高度保守抗原多克隆抗体或单克隆抗体的步骤。
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