CN107427577A - 具有蛋白酶可切割接头的肽构建体 - Google Patents

Abstract

提供了适合于口服给药的构建体，其包含通过不稳定肽接头连接的第一多肽和第二多肽，其中不稳定肽接头对存在于肠道中的一种或多种蛋白酶是不稳定的，并且其中第一多肽和第二多肽基本上对所述一种或多种蛋白酶具有抗性。

Description

具有蛋白酶可切割接头的肽构建体

发明领域

本发明涉及适于口服给药的、包含通过不稳定肽接头连接的多肽的构建体，以及包含这种构建体的药物组合物。本发明还涉及制备此类构建体的方法，测定此类构建体的不稳定性的方法，利用此类构建体的方法，编码此类构建体的核酸，包含编码此类构建体的核酸的cDNA和载体，表达或能够表达此类构建体的宿主细胞，以及此类构建体或药物组合物的用途。

发明背景

包含两个或更多个多肽的构建体是一类具有多功能性质的生物分子。通过将两个或更多个多肽遗传融合在一起，所得构建体可获得从各组分多肽衍生的许多不同功能。这样的构建体已经被用于许多目的的生物研究中，例如蛋白质纯化和成像。这些构建体也已成为生物制药的重要类别。有效的构建体需要适宜的接头。多肽不用接头的直接融合可能导致许多不期望的结果，包括融合多肽的错误折叠、多肽生产中的低产量或受损的生物活性。因此，结合多肽的接头的选择或合理设计是重组多肽技术中的重要领域。

许多构建体掺入了对于体内递送或重组生产目的相对稳定的接头。稳定的接头将功能性结构域共价地结合起来，而在整个体内或重组生产过程中充当一个分子。多肽之间的稳定连接可以提供许多优点，例如延长的血浆半衰期和对宿主生物蛋白酶切割的抵抗。然而，稳定的接头还具有几个潜在的缺点，包括多肽之间的空间位阻，降低的生物活性和改变的生物分布(Chen等人，2013 Adv Drug Deliv Rev.65(10)：1357-1369))。因此，有利的是在体内从构建体中释放游离多肽，从而潜在地减少空间位阻，改善生物活性或实现个体多肽的独立功能。

在对肠道具有作用的多肽的情境下，这种释放理想地在口服给药后发生在肠道中。优选的可能是这种释放仅在肠道内的一个或多个特定位置发生。

在至少一些实施方案中，与现有技术的物质相比，本发明的构造体可具有以下一个或多个优点：

(i)增加的口服给药适应性；

(ii)增加的口服给药后局部递送至肠道的适应性；

(iii)在肠道的一个或多个特定区域靶向(即将构建体切割成组分多肽)的能力；

(iv)在一种重组产物中掺入两种或更多种可分离多肽的便利性增加；

(v)改善的治疗和/或预防胃肠道感染或自身免疫和/或炎性疾病；

(vi)在异源宿主例如细菌(例如大肠杆菌)和/或哺乳动物细胞和/或酵母或霉菌(例如属于曲霉属，酵母属，克鲁维酵母属，汉逊酵母属或毕赤酵母属例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris))的异源宿主中表达的增加的适应性；

(vii)生产期间增加的对蛋白酶降解的稳定性(例如抗酵母、霉菌或哺乳动物细胞蛋白酶)；

(viii)改善的多肽折叠；

(ix)重组生产期间增加的产量；

(x)改善的生物活性和/或生物分布；

(xi)用于药物的适应性和改进的性能；

(xii)用于功能性食品的适应性和改进的性能。

发明内容

本发明人生产了适于口服给药的出人意料地有利的构建体，包含通过不稳定肽接头连接的第一多肽和第二多肽。这些构建体由于其生产的便利性及其在肠道内释放游离组分多肽的能力而是特别有利的。在一个实施方案中，游离组分多肽可以在肠道的一个或多个特定区域中释放。

可以预期，这些构建体在预防或治疗GIT的疾病例如自身免疫和/或炎性疾病如炎性肠病，或者预防或治疗来自肠道常驻病原微生物的感染中具有特别的用途。

本发明提供了适合于口服给药的构建体，包含通过不稳定肽接头连接的第一多肽和第二多肽，其中不稳定肽接头对存在于肠道中的一种或多种蛋白酶是不稳定的，并且其中第一多肽和第二多肽基本上抵抗所述一种或多种蛋白酶。还提供了与本发明构建体相关的相关组合物、方法和核酸。

附图说明

图1-使用胰蛋白酶蛋白酶测定法证明ID3A的不稳定性的染色的PAGE凝胶

图2-使用胰蛋白酶蛋白酶测定法证明ID25A和ID26A的不稳定性的染色的PAGE凝胶

图3-使用胰蛋白酶蛋白酶测定法证明ID27A和ID28A的不稳定性的染色的PAGE凝胶

图4-使用粪便蛋白酶测定法证明ID3A、ID25A、ID26A、ID27A和ID28A的不稳定性的染色的PAGE凝胶

图5-使用粪便蛋白酶测定法证明ID55F、ID56F、ID57F、ID58F、ID59F和ID60F的不稳定性的染色的PAGE凝胶

图6-证明ID3A和ID25A的存储稳定性的染色的PAGE凝胶

图7-证明ID26A、ID27A和ID28A的存储稳定性的染色的PAGE凝胶

图8-证明ID4A的存储稳定性的染色的PAGE凝胶

序列说明

SEQ ID NO：1-构建体ID3A和ID55F中使用的接头的多肽序列

SEQ ID NO：2-构建体ID25A和ID57F中使用的接头的多肽序列

SEQ ID NO：3-构建体ID26A和ID58F中使用的接头的多肽序列

SEQ ID NO：4-构建体ID27A和ID59F中使用的接头的多肽序列

SEQ ID NO：5-构建体ID28A和ID60F中使用的接头的多肽序列

SEQ ID NO：6-构建体ID56F中使用的接头的多肽序列

SEQ ID NO：7-ID3A构建体的多肽序列

SEQ ID NO：8-ID25A构建体的多肽序列

SEQ ID NO：9-ID26A构建体的多肽序列

SEQ ID NO：10-ID27A构建体的多肽序列

SEQ ID NO：11-ID28A构建体的多肽序列

SEQ ID NO：12-ID55F构建体的多肽序列

SEQ ID NO：13-ID57F构建体的多肽序列

SEQ ID NO：14-ID58F构建体的多肽序列

SEQ ID NO：15-ID59F构建体的多肽序列

SEQ ID NO：16-ID60F构建体的多肽序列

SEQ ID NO：17-ID56F构建体的多肽序列

SEQ ID NO：18-ID1A ICVD的多肽序列

SEQ ID NO：19-ID5F ICVD的多肽序列

SEQ ID NO：20-编码ID3A构建体的多核苷酸序列

SEQ ID NO：21-编码ID25A构建体的多核苷酸序列

SEQ ID NO：22-编码ID26A构建体的多核苷酸序列

SEQ ID NO：23-编码ID27A构建体的多核苷酸序列

SEQ ID NO：24-编码ID28A构建体的多核苷酸序列

SEQ ID NO：25-编码ID55F构建体的多核苷酸序列

SEQ ID NO：26-编码ID57F构建体的多核苷酸序列

SEQ ID NO：27-编码ID58F构建体的多核苷酸序列

SEQ ID NO：28-编码ID59F构建体的多核苷酸序列

SEQ ID NO：29-编码ID60F构建体的多核苷酸序列

SEQ ID NO：30-编码ID56F构建体的多核苷酸序列

SEQ ID NO：31-编码构建体ID3A和ID55F中使用的接头的示例性多核苷酸序列

SEQ ID NO：32-编码构建体ID25A和ID57F中使用的接头的示例性多核苷酸序列

SEQ ID NO：33-编码构建体ID26A和ID58F中使用的接头的示例性多核苷酸序列

SEQ ID NO：34-编码构建体ID27A和ID59F中使用的接头的示例性多核苷酸序列

SEQ ID NO：35-编码构建体ID28A和ID60F中使用的接头的示例性多核苷酸序列

SEQ ID NO：36-编码构建体ID56F中使用的接头的示例性多核苷酸序列

SEQ ID NO：37-拟议的糜蛋白酶不稳定接头

SEQ ID NO：38-ID4A构建体的多肽序列

发明详述

不稳定肽接头

本发明的构建体包含连接第一和第二多肽的不稳定肽接头。在本发明的一个实施方案中，可以对不稳定肽接头进行改造，使得其抵抗蛋白酶切割至所需程度，和/或仅在暴露于肠道的特定区域时才被切割。例如，如果构建体在诸如酵母的宿主中重组产生，则由酵母产生的胰蛋白酶样蛋白酶可切割重组构建体产物。这可能导致纯化困难，并引起调节、临床和商业复杂化。类似地，如果例如第一多肽是毒素，则构建体的第二多肽可起到“淬灭”毒素的作用，直到其在适宜的靶标位置释放。

根据本发明的一个实施方案，这可以通过将屏蔽残基掺入位于不稳定位点侧翼的不稳定肽接头中来实现。屏蔽残基在不稳定肽接头的不稳定位点侧翼，并降低其不稳定性。也可以通过将不稳定位点更靠近不稳定肽接头或位于不稳定肽接头的外围来增加切割抗性。这个概念被称为“屏蔽的不稳定位点”，并提供受控制的不稳定性。

在本发明的另一个实施方案中，可以对不稳定肽接头进行改造，使得其对肠道蛋白酶的切割是高度不稳定的，从而在口服给药后快速释放构建体的组成型的第一和第二多肽。这通过将一个或多个不稳定位点掺入不稳定肽接头中而实现，使得不稳定位点暴露于蛋白水解，例如通过将不稳定位点基本上定位于不稳定肽接头的中心和/或通过使不稳定位点基本上不被侧翼残基屏蔽。这个概念被称为“非屏蔽的不稳定位点”。

适当地，不稳定肽接头具有至少3，例如至少4，例如至少5，例如至少6，例如至少7，例如至少8，例如至少9，至少10个残基的长度。适当地，不稳定肽接头具有不大于40，例如不大于35，例如不大于30，例如不大于25，例如不大于20，例如不大于15个残基的长度。

预期将P残基掺入本发明构建体的不稳定肽接头中将基本上防止不稳定肽接头的切割。适当地，不稳定肽接头不包含任何P残基。

胰蛋白酶不稳定位点

屏蔽的胰蛋白酶不稳定位点

适当地，本发明构建体的不稳定肽接头包含胰蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶的切割位点。适当地，不稳定肽接头包括至少1个，例如至少2个，例如至少3个，例如至少4个，例如至少5个，例如至少6个，例如至少7个，例如至少8个，例如至少9个，例如至少10个K残基。适当地，不稳定肽接头包括至少1个，例如至少2个，例如至少3个，例如至少4个，例如至少5个，例如至少6个，例如至少7个，例如至少8个，例如至少9个，例如至少10个R残基。优选地，切割位点是一个或多个K残基。

在胰蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶不稳定位点的情况下的屏蔽残基可以是D或E。适当地，不稳定肽接头包含选自D或E的一个或多个屏蔽残基。

适当地，包含在不稳定肽接头内的所有K或R残基在其N-末端侧具有至少1个，例如至少2个，例如至少3个，例如至少4个，例如至少5个屏蔽残基，其中屏蔽残基选自由D和E组成的列表。适当地，包含在不稳定肽接头内的所有K或R残基在其N-末端侧具有1至5、1至4、1至3、1至2、2至5、2至4、2至3、3至5、3至4、4至5个屏蔽残基，其中屏蔽残基选自由D和E组成的列表。

适当地，包含在不稳定肽接头内的所有K或R残基在其C-末端侧具有至少1个，例如至少2个，例如至少3个，例如至少4个，例如至少5个屏蔽残基，其中屏蔽残基选自由D和E组成的列表。适当地，包含在不稳定肽接头内的所有K或R残基在其C末端侧具有1至5、1至4、1至3、1至2、2至5、2至4、2至3、3至5、3至4、4至5个屏蔽残基，其中屏蔽残基选自由D和E组成的列表。

适当地，所有K和R残基都具有至少一个与它们相邻的屏蔽残基，适当地，随后是一个或多个另外的连续的屏蔽残基。适当地，屏蔽残基存在于一个或多个K或R残基的一侧或两侧。

适当地，不稳定肽接头包含或更适当地由以下格式的多肽序列组成：

[-(G_aS)_x-U_c-B-U’_d-(G_bS)_y-]_z

其中，

a是1-10；

b是1-10；

U是D或E；

U’是D或E；

c是0-7；

d是0-7；

x是1-10；

y是1-10

z是1-10，和

B是K或R。

适当地，a是2至5，更适当地，a是4。适当地，b是2至5，更适当地，b是4。适当地，x是1至5，更适当地，x是1。适当地，y是1至5，更适当地，y是1。适当地，z是1至3，更适当地，z是1。适当地，B是K。适当地，如果存在U，则是D。适当地，如果存在U’，则是D。在一个实施方案中，c是1且d是1。在另一个实施方案中，c是0且d是0。在另一实施方案中，c是4且d是0。适当地，U和U’各自是D，c和d均是1。

适当地，不稳定肽接头包含或更适当地由以下格式的多肽序列组成：

-B-(G_aS)_x-B’-

其中，

a是1-10；

x是1-10；

B是K或R，和

B’是K或R。

在一个实施方案中，a是2至5，更适当地，a是4。在另一个实施方案中，x是1至5。更适当地，x是2。适当地，B是K。适当地，B’是K。

适当地，不稳定肽接头包含或更适当地由以下格式的多肽序列组成：

-B-(G_aS)_x-B’-(G_bS)_y-B”-

其中，

a是1-10；

b是1-10；

x是1-10；

y是1-10；

B是K或R

B’是K或R，和

B”是K或R。

在一个实施方案中，a是2至5，更适当地，a是4。在一个实施方案中，b是2至5，更适当地b是4。在另一个实施方案中，x是1至5。更适当地，x是2。在另一个实施方案，y是1至5。更适当地，y是2。适当地，B是K。适当地，B’是K。适当地，B”是K。

非屏蔽的胰蛋白酶不稳定位点

适当地，本发明构建体的不稳定肽接头包含胰蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶的切割位点。适当地，不稳定肽接头包括至少1个，例如至少2个，例如至少3个，例如至少4个，例如至少5个，例如至少6个，例如至少7个，例如至少8个，例如至少9个，例如至少10个K残基。适当地，不稳定肽接头包括至少1个，例如至少2个，例如至少3个，例如至少4个，例如至少5个，例如至少6个，例如至少7个，例如至少8个，例如至少9个，例如至少10个R残基。优选地，切割位点是一个或多个K残基。

适当地，包含在不稳定肽接头内的所有K或R残基在其N-末端侧具有至少1个，例如至少2个，例如至少3个，例如至少4个，例如至少5个非屏蔽残基，其中非屏蔽残基选自：C、A、S、N、G、L、I、V、T、M、F、Y、H、W和Q；更适当地是A、G、L、I、V、M、S和T；更适当地是A、G、L、I、V和S；更适当地G和S组成的列表。适当地，包含在不稳定肽接头内的所有K或R残基在其N-末端侧具有1至5、1至4、1至3、1至2、2至5、2至4、2至3、3至5、3至4、4至5个非屏蔽残基，其中屏蔽残基选自：C、A、S、N、G、L、I、V、T、M、F、Y、H、W和Q；更适当地是A、G、L、I、V、M、S和T；更适当地是A、G、L、I、V和S；更适当地是G和S组成的列表。

适当地，不稳定肽接头中包含的所有K或R残基在其C-末端侧具有至少1个，例如至少3个，例如至少4个，例如至少5个非屏蔽残基，其中非屏蔽残基选自：C、A、S、N、G、L、I、V、T、M、F、Y、H、W和Q；更适当地是A、G、L、I、V、M、S和T；更适当地是A、G、L、I、V和S；更适合地G和S组成的列表。适当地，包含在不稳定肽接头内的所有K或R残基在其C-末端侧具有1至5、1至4、1至3、1至2、2至5、2至4、2至3、3至5、3至4、4至5个非屏蔽残基，其中屏蔽残基选自C、A、S、N、G、L、I、V、T、M、F、Y、H、W和Q；更适当地是A、G、L、I、V、M、S和T；更适当地是A、G、L、I、V和S；更适当地是G和S组成的列表。

适当地，所有的K和R残基都具有至少一个与其相邻的非屏蔽残基，适当地随后是一个或多个其它邻接的非屏蔽残基。适当地，非屏蔽残基出现在一个或多个K或R残基的一侧或两侧。

适当地，不稳定肽接头不包含任何D或E残基。适当地，不稳定肽接头由选自C、A、S、N、G、L、I、V、T、M、F、Y、H、K、R、W和Q；更适当地A、G、L、I、V、M、S、T、K和R残基；更适当地S、G、K和R残基组成的列表。

适当地，不稳定肽接头包含或更适当地由以下格式的多肽序列组成：

[-(G_aS)_x-B-(G_bS)_y-]_z

其中，

a是1-10；

b是1-10；

x是1-10；

y是1-10

z是1-10，和

B是K或R。

适当地，a是2至5，更适当地，a是4。适当地，b是2至5，更适当地，b是4。适当地，x是1至5，更适当地，x是1。适当地，y是1至5，更适当地，y是1。适当地，z是1至3，更适当地，z是1。适当地，B是K。

适当地，不稳定肽接头包含或更适当地由以下格式的多肽序列组成：

[-(G₄S)_x-B-(G₄S)_y-]_z

其中，

x是1-10；

y是1-10

z是1-10，和

B是K或R。

适当地，x是1至5，更适当地，x是1。适当地，y是1至5，更适当地，y是1。适当地，z是1至3，更适当地，z是1。适当地，B是K。

糜蛋白酶不稳定位点

非屏蔽的糜蛋白酶不稳定位点

或者，或除了胰蛋白酶不稳定位点之外，本发明构建体的不稳定肽接头包含糜蛋白酶或糜蛋白酶样蛋白酶的切割位点。适当地，不稳定肽接头包括至少1个，例如至少2个，例如至少3个，例如至少4个，例如至少5个，例如至少6个，例如至少7个，例如至少8个，例如至少9个，例如至少10个选自W、F、Y、L和M；更适当地W、F和Y组成的列表中的残基。适当地，不稳定肽接头由选自S、G、W、F、Y、L和M；例如S、G、W、F和Y组成的列表中的残基组成。

适当地，不稳定肽接头包含或更适当地由以下格式的多肽序列组成：

[-(G_aS)_x-J-(G_bS)_y-]_z

其中，

a是1-10；

b是1-10；

x是1-10；

y是1-10

z是1-10，和

J是W、F、Y、L或M；例如W，F或Y。

在一个实施方案中，a是2至5，在另一实施方案中，b是2至5，在另一实施方案中，x是1至5，在另一实施方案中，y是1至5，在另一实施方案中，z是1至3。适当地，x是1，y是1，z是1。

适当地，不稳定肽接头包含或更适当地由以下格式的多肽序列组成：

[-(G₄S)_x-J-(G₄S)_y-]_z

其中，

x是1-10；

y是1-10

z是1-10，和

J是W、F、Y、L或M；例如W，F或Y。

在一个实施方案中，x是1至5，在另一实施方案中，y是1至5，在另一实施方案中，z是1至3。适宜地，x是1，y是1且z是1。

MMP不稳定位点

在一个实施方案中，本发明构建体的不稳定肽接头包含MMP3、MMP10或MMP12的切割位点。

不稳定性(Lability)

可以使用在实施例1至3中定义的粪便蛋白酶测定法、胰蛋白酶蛋白酶测定法和/或糜蛋白酶蛋白酶测定法来测定构建体的不稳定性，因此测定构建体作为受控制不稳定性或高度不稳定构建体的效用。

适当地，在粪便蛋白酶测定法和/或胰蛋白酶蛋白酶测定法和/或胰凝乳蛋白酶蛋白酶测定法中混合至少10，例如至少20，例如至少30，例如至少40，例如至少50，例如至少60，例如至少70，例如至少80，例如至少90，例如至少100，例如至少110，例如至少120，例如至少130，例如至少140，例如至少150，例如至少160分钟后，按质量计至少20％，例如至少40％，例如至少60％，例如至少80％，例如至少90％，例如至少100％的构建体保持未切割的。

或者，在粪便蛋白酶测定和/或胰蛋白酶蛋白酶测定和/或胰凝乳蛋白酶蛋白酶测定中混合后不超过5，例如不超过4，例如不超过3，例如不超过2，例如不超过1分钟，至少60％，例如至少80％，例如至少90％，例如至少100％的构建体是切割的。

在本发明的一个方面，提供了测定本发明构建体的不稳定性的方法，包括步骤：(a)将构建体在包含胰蛋白酶的溶液，包含糜蛋白酶的溶液，粪便上清液，小肠液或包含肠肽酶的溶液中温育(例如通过进行胰蛋白酶蛋白酶测定法，糜蛋白酶蛋白酶测定法或粪便蛋白酶测定法)，然后(b)在一个或多个温育期之后确定切割的构建体的比例。

在本发明的另一方面，提供了将单体抗体或其单体抗原结合片段递送至肠道的靶标区域的方法，包括步骤：(a)进行上述测定构建体不稳定性的方法，(b)选择针对肠道的靶标区域具有适当的不稳定性水平的构建体，(c)用肠包衣的包装生产所选择的构建体，然后(d)向受试者施用经包装的所选择的构建体。

在本发明的另一方面，提供了一种制备包含已经选择的本发明构建体的产物的方法，所述方法包括将所选择的构建体加入到产物中，其中通过包括以下步骤的方法选择并产生所选择的构建体：(a)进行上述测定构建不稳定性的方法，然后(b)选择针对肠道的靶标区域具有适当的不稳定性水平的构建体。

稳定性

可使用各种生物体来表达重组多肽。常用的表达生物体包括酵母、霉菌和哺乳动物细胞。然而，许多这些表达生物体还产生蛋白酶，例如胰蛋白酶样蛋白酶，其可能切割表达的重组多肽。如果表达的多肽掺入对于存在于肠道中的一种或多种蛋白酶不稳定肽接头，则该肽接头可能不利地对于表达生物体产生的蛋白酶也是不稳定的，从而防止完整多肽的有效表达。

有利的是不稳定肽接头对于由用于产生构建体的重组宿主产生的酶基本上是不稳定的。适当地，不稳定肽接头基本上对由重组宿主例如细菌如大肠杆菌或诸如属于曲霉属，酵母属，克鲁维酵母属，汉逊酵母属或毕赤酵母属的酵母例如酿酒酵母或巴斯德毕赤酵母的酵母或霉菌产生的蛋白酶具有抗性。适当地，重组宿主是酵母。适当地，重组宿主是霉菌。适当地酵母属于酵母属，克鲁维酵母属，汉逊酵母属或毕赤酵母属。酵母的其他实例是属于假丝酵母属和球拟酵母属(Torulopsis)的那些。适当地，霉菌属于曲霉属。霉菌的其它实例是属于支顶孢属(Acremonium)，链格孢属(Alternaria)，金孢菌属(Chrysosporium)，分枝孢子菌属(Cladosporium)，盘基网柄菌属(Dictyostelium)，镰刀霉属(Fusarium)，毛霉属(Mucor)，青霉属(Penicillium)，根霉属(Rhizopus)，葡萄穗霉属(Stachybotrys)，木霉属(Trichoderma)和发癣菌属(Trichophyton)的那些。适当地，在4℃下，不稳定肽接头基本上对由重组宿主产生的蛋白酶具有至少2天，例如至少4天，例如至少9天，例如至少14天，例如至少60天的存储抗性。

用于口服给药的酵母产生的构建体

在本发明的一个方面，提供了一种用于通过口服施用第一免疫球蛋白链可变结构域和第二免疫球蛋白链可变结构域治疗肠道疾病的构建体，其中构建体包含通过不稳定肽接头连接的第一免疫球蛋白链可变结构域和第二免疫球蛋白链可变结构域，其中：

(i)不稳定肽接头对存在于肠道中的一种或多种蛋白酶是不稳定的，

(ii)不稳定肽接头对酵母蛋白酶是稳定的，和

(iii)第一和第二免疫球蛋白链可变结构域对所述一种或多种蛋白酶基本上具有抗性，和

其中所述构建体在酵母中产生。

在本发明的另一方面，提供了一种通过口服施用来自构建体的第一免疫球蛋白链可变结构域和第二免疫球蛋白链可变结构域来治疗肠道疾病的方法，其中构建体包含通过不稳定肽接头连接的第一免疫球蛋白链可变结构域和第二免疫球蛋白链可变结构域，其中：

(i)不稳定肽接头对存在于肠道中的一种或多种蛋白酶是不稳定的，

(ii)不稳定肽接头对酵母蛋白酶是稳定的，和

(iii)第一和第二免疫球蛋白链可变结构域对所述一种或多种蛋白酶基本上具有抗性，和

其中所述构建体在酵母中产生。

在本发明的另一方面，提供了将第一免疫球蛋白链可变结构域和第二免疫球蛋白链可变结构域递送至肠道的方法，包括在酵母中产生包含通过不稳定肽接头连接的第一免疫球蛋白链可变结构域和第二免疫球蛋白链可变结构域的构建体，然后口服施用该构建体，其中：

(i)不稳定肽接头对存在于肠道中的一种或多种蛋白酶是不稳定的，

(ii)不稳定肽接头对酵母蛋白酶是稳定的，和

(iii)第一和第二免疫球蛋白链可变结构域对所述一种或多种蛋白酶基本上具有抗性。

在本发明的另一方面，提供了制备包含通过不稳定肽接头连接的第一免疫球蛋白链可变结构域和第二免疫球蛋白链可变结构域的构建体的方法，其中：

(i)不稳定肽接头对存在于肠道中的一种或多种蛋白酶是不稳定的，

(ii)不稳定肽接头对酵母蛋白酶是稳定的，和

(iii)第一和第二免疫球蛋白链可变结构域对所述一种或多种蛋白酶基本上具有抗性；

包括在酵母中产生所述构建体的步骤。

适当地，在酵母中产生构建体的步骤是通过提供能够表达用载体转化的本发明构建体的宿主酵母细胞来进行的，其中载体包含编码本发明构建体的多核苷酸，以及其中宿主酵母细胞暴露于适于表达本发明构建体的条件下。

适当地，第一免疫球蛋白链可变结构域和第二免疫球蛋白链可变结构域基本上对酵母蛋白酶具有抗性。

适当地，上述方法进一步包括纯化构建体的步骤。适当地，不稳定肽接头在肠道中被存在于肠道中的一种或多种蛋白酶切割。在本发明的另一方面，提供了通过任何上述方法获得的构建体。

上述使用的构建体和方法涉及构建体在酵母中的产生。然而，这些使用的构建体和方法也同样适用于构建体在产生可能切割肽接头的蛋白酶的任何表达生物体中的产生，所述生物体为例如哺乳动物细胞或霉菌(例如来自支顶孢属，链格孢属，曲霉属，金孢菌属，枝孢菌属，盘基网柄菌属，镰刀霉属，毛霉属，青霉属，根霉属，葡萄穗霉属，木霉属和发癣菌属中的任何一个或多个属)。

本发明的这些实施方案的具体特征进一步讨论如下。

1.对存在于肠道中的一种或多种蛋白酶是不稳定的不稳定肽接头

下面的实施例5和6提供了本发明的特定构建体的细节，该构建体包含对存在于肠道中的一种或多种蛋白酶不稳定的不稳定肽接头。

适当地，不稳定肽接头对存在于肠道中的一种或多种蛋白酶是不稳定的，使得在胰蛋白酶蛋白酶测定中按质量计大于50％，例如大于60％，例如大于70％，例如大于80％，例如大于85％，例如大于90％的构建体在混合后160分钟后，更适当地105分钟后，更适当地60分钟后，更适当地25分钟后，更适当地10分钟后被切割成第一和第二免疫球蛋白链可变结构域。

2.对酵母蛋白酶稳定的不稳定肽接头

下面的实施例7提供了包含对酵母蛋白酶稳定的不稳定肽接头的本发明的具体构建体的细节。下面的实施例9提供了对酵母蛋白酶不稳定的特定构建体(ID4A)的细节。

接头对酵母蛋白酶的稳定性可以使用如下概述的酵母表达方案进行评估。

酵母表达方案：

以下方案概述了将多肽(例如包含ICVD或单体ICVD的构建体)克隆到酿酒酵母的染色体中的方法，使得在适当的生长培养基中的诱导导致多肽表达并分泌到细胞外上清液中。

以下描述的酿酒酵母菌株用于该方法：用于表达和制造多肽的生产菌株是来自EUROSCARF系列(EUROpean Saccharomyces Cerevisiae ARchive for Functionalanalysis)的CEN.PK系列的衍生物。CEN.PK菌株的基因型为：MATa/MATαura3-52/ura3-52；trp1-289/trp1-289；leu2-3，112/leu2-3，112；his3Δ 1/his3Δ 1；MAL2-8C/MAL2-8C；SUC2/SUC2。然后进一步修饰该菌株以通过缺失半乳糖激酶基因(gal1::URA3)抑制在半乳糖上生长的能力。这是用于通过多肽表达构建体转化的最终菌株。

单体或多聚体DNA构建体，其中通过蛋白质接头结合的多肽(例如包含ICVD或单体ICVD的构建体)被克隆到适当的多拷贝染色体整合载体中(Lopes等人，1991.Gene.105,83-90。)，产生整合盒。整合盒可以包括诱导型启动子(例如pGal7，Nogi&Fukasawa(1983)，Nucleic Acids Res.11(24)：8555-68)，多肽编码区，编码分泌到酵母细胞外上清液中的信号序列(紧邻在多肽编码区的第一个氨基酸的上游融合(Hashimoto等人，1998.ProteinEngineering.11(75-77))，有助于重组进入染色体的营养缺陷型选择标记和DNA序列。用编码整合盒的线性DNA转化感受态酵母细胞，随后在适当的营养缺陷型培养基上进行选择(例如省略亮氨酸，其中亮氨酸生物合成基因作为选择标记)导致在rDNA基因座的整合和扩增，使得100-200个拷贝的表达构建体可以存在于细胞中。除去选择性压力后，表达构建体保持稳定地整合到染色体中。或者，可以基于具有相似表达盒的酵母2μM质粒，从多拷贝附加型载体实现多肽产生，而不需要染色体整合。

为了诱导多肽表达，将所得酵母菌株的菌落接种到5mL补充有2％葡萄糖的酵母大豆胨液体培养基中，并在30℃(150-200rpm)下过夜生长。第二天，在500mL Erlenmeyer瓶中，用全部5mL过夜培养物接种50mL含有2％葡萄糖和0.5％半乳糖(用于诱导)的酵母大豆汤胨液体培养基。所得的诱导培养物在30℃，200rpm下温育3天。然后将培养物在旋转式转子离心机中以4200rpm旋转20分钟以除去酵母细胞。然后将上清液顺序通过0.45μm和0.2μm的过滤器过滤。

在进行酵母表达方案之后，多肽可以任选地在在4℃无菌条件下在酵母上清液中经历存储期。

适宜地，本发明的构建体对酵母蛋白酶是稳定的，使得使用酵母表达方案产生构建体(即没有随后的存储期)后以及然后任选地存储2天，更适宜地4天或更适宜地9天后，按质量计不超过10％，更适宜地不超过5％，更适宜地不超过1％的构建体被切割成第一和第二免疫球蛋白链可变结构域。本文所用的“0天存储”是指没有随后的存储期。

酵母产生的多肽可能不同于使用替代表达生物体如细菌产生的多肽，因为酵母产生的多肽可以包括翻译后修饰，例如糖基化。

3.第一和第二免疫球蛋白链可变结构域，其基本上对存在于肠道中的一种或多种蛋白酶具有抗性

以下实施例5和6提供了包含第一和第二免疫球蛋白链可变结构域的本发明特定构建体的细节，其中第一和第二免疫球蛋白链可变结构域基本上对存在于肠道中的一种或多种蛋白酶具有抗性。

适当地，第一免疫球蛋白链可变结构域和第二免疫球蛋白链可变结构域基本上对存在于肠道中的一种或多种蛋白酶具有抗性，使得在胰蛋白酶蛋白酶测定中按重量计至少70％，例如至少80％，例如至少90％，例如至少95％，例如至少99％，例如约100％的第一免疫球蛋白链可变结构域和按重量计至少70％，例如至少80％，例如至少90％，例如至少95％，例如至少99％，例如约100％的第二免疫球蛋白链可变结构域在混合10分钟后，更适宜地25分钟后，更适宜地60分钟后，更适宜地105分钟后，更适宜地160分钟后保持未切割。

4.基本上对酵母蛋白酶具有抗性的第一和第二免疫球蛋白链可变结构域

下面的实施例7提供了包含免疫球蛋白链可变结构域的本发明的具体构建体的细节，其中免疫球蛋白链可变结构域对酵母蛋白酶是稳定的。

适当地，第一免疫球蛋白链可变结构域和第二免疫球蛋白链可变结构域基本上对酵母蛋白酶具有抗性，使得在使用酵母表达方案产生第一或第二免疫球蛋白链可变结构域以及然后任选地存储2天，更适宜地存储4天或更适宜地存储9天后，按质量计不超过10％，更适宜地不超过5％，更适宜地不超过1％的第一或第二免疫球蛋白链可变结构域被切割。

评估上述1-4点的稳定性和不稳定性

适当地，通过凝胶电泳然后目视检查凝胶来评估构建体的切割质量和/或第一和第二免疫球蛋白链可变结构域的未切割质量和/或第一和第二免疫球蛋白链可变结构域的切割质量。更适当地，通过定量凝胶电泳进行评估。或者，通过凝胶电泳然后进行质谱分析进行评估。

通过与分子量标记物相比较，凝胶上对应于切割的构建体和未切割的免疫球蛋白链可变结构域的条带可以被鉴定为具有构建体质量(即一种组成性免疫球蛋白链可变结构域的质量)的基本上一半的那些条带。通过与分子量标记条带相比较，凝胶上对应于切割的免疫球蛋白链可变结构域的条带可以鉴定为具有低于整个组成性免疫球蛋白链可变结构域的分子的分子量。

在一个实施方案中，本发明构建体的不稳定肽接头不包含WO2009/021754中公开的多肽。更具体地，在一个实施方案中，本发明构建体的不稳定肽接头不包含序列GGGGSDDDDKGGGGS(SEQ ID NO：4)。

包括免疫球蛋白链可变结构域(ICVD)例如VH和VHH的多肽、抗原结合多肽、抗体及抗体片段

多肽是由结合在一条链中的多个氨基酸残基组成的有机聚合物。如本文所用，“多肽”与“蛋白质”和“肽”可互换使用。多肽当它们含有一个或多个形成抗原结合位点的氨基酸残基序列时，被认为是抗原结合的，所述抗原结合位点能够以亲和力结合靶抗原上的表位(适当地表示为Kd值，Ka值，kon率和/或koff率，如本文进一步描述的)。抗原结合多肽包括多肽，例如抗体，抗体片段和抗原结合片段。多肽可以包含能够以高亲和力结合靶标的区域(适当地表示为Kd值，Ka值，kon率和/或koff率，如本文进一步描述的)。此类多肽包括DARPins(Binz等人，Journal of Molecular Biology 332(2)：489-503)，Affimers^TM，Fynomer^TM，Centyrins，Nanofitins和环肽。

常规抗体或免疫球蛋白(Ig)是包含四条多肽链的蛋白质：两条重(H)链和两条轻链(L)链。每条链分为恒定区和可变结构域。重链可变结构域在本文中缩写为VHC，并且轻(L)链可变结构域在本文中缩写为VLC。这些结构域，与其相关的结构域和由其衍生的结构域在本文中称为免疫球蛋白链可变结构域。VHC和VLC结构域可以进一步细分为被称为“互补决定区”(“CDR”)的高变区域，散布有更保守的区域(称为“框架区”)(“FR”)。已经精确定义了框架区和互补决定区(Kabat等人，1991 Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH出版号91-3242，其通过整体引用并入本文)。在常规抗体中，每个VHC和VLC由以下顺序从氨基末端至羧基末端排列的三个CDR和四个FR组成：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。两个重免疫球蛋白链和两个轻免疫球蛋白链的常规抗体四聚体是由通过例如，二硫键，互相连接的重和轻的免疫球蛋白链，以及相连的重链相似物形成的。重链恒定区包括三个结构域CH1，CH2和CH3。轻链恒定区由一个结构域CL组成。重链的可变结构域和轻链的可变结构域是与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区域通常介导抗体与宿主组织或因子(包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞))和经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。术语抗体包括IgA、IgG、IgE、IgD、IgM型(以及其亚型)的免疫球蛋白，其中免疫球蛋白的轻链可以是κ或λ型。由两个相同的重(H)链和两个相同的轻(L)链多肽组装的免疫球蛋白-γ(IgG)抗体的整体结构被完全建立并且在哺乳动物中高度保守(Padlan 1994 Mol Immunol 31：169-217)。

在骆驼科的血清中发现常规抗体结构的例外。除常规抗体外，这些血清还具有特异的IgG抗体。称为重链抗体(HCAb)的这些IgG抗体缺乏L链多肽，并且缺少第一恒定结构域(CH1)。在其N末端区域，同二聚体蛋白的H链含有专门的免疫球蛋白链可变结构域，称为VHH，其用于与其同源抗原缔合(Muyldermans 2013 Annu Rev Biochem 82：775-797，Hamers-Casterman等人1993 Nature 363(6428)：446-448，Muyldermans等人1994 ProteinEng 7(9)：1129-1135，其通过整体引用并入本文)。

本文所用的抗原结合片段(或“抗体片段”或“免疫球蛋白片段”)是指特异性结合靶标的抗体的一部分(例如其中一个或多个免疫球蛋白链不是全长，但其特异性结合靶标的分子)。术语抗原结合片段中包含的结合片段的例子包括：

(i)Fab片段(由VLC、VHC、CL和CH1结构域组成的单价片段)；

(ii)F(ab')2片段(包含通过铰链区上的二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段)；

(iii)Fd片段(由VHC和CH1结构域组成)；

(iv)Fv片段(由抗体的单臂的VLC和VHC结构域组成)；

(v)scFv片段(由使用重组方法通过合成接头连接的VLC和VHC结构域组成，使得它们能够制成其中的VLC和VHC区域配对以形成单价分子的单个蛋白质链)；

(vi)VH(由VHC结构域组成的免疫球蛋白链可变结构域(Ward等人Nature 1989341:544-546)；

(vii)VL(由VLC结构域组成的免疫球蛋白链可变结构域)；

(viii)V-NAR(由来自软骨鱼纲(chondrichthyes)IgNAR的VHC结构域组成的免疫球蛋白链可变结构域(Roux等人，1998 Proc Natl Acad Sci USA 95：11804-11809和Griffiths等人，2013 Antibodies 2：66-81，通过整体引用引入本文)

(ix)VHH。

VHH或VH中的氨基酸残基的总数可以在110-130的范围内，适当地为112-120，并且最合适为115。

包括多肽和不稳定肽接头的本发明的构建体可以例如通过使用核酸合成技术制备编码两种或更多种多肽的核酸和不稳定肽接头，然后表达由此获得的核酸来获得(如本文进一步详细描述的)。根据具体实施方案，根据本发明的构建体不具有与天然存在的多肽的氨基酸序列(即，共有100％序列同一性)完全相同的氨基酸序列。

适当地，本发明构建体的第一和/或第二多肽是抗原结合多肽，更适宜地，第一和/或第二抗原结合多肽是免疫球蛋白链可变结构域，抗体或其抗原结合片段。更适宜地，抗原结合片段选自：VL，V-NAR，scFv，Fab片段，F(aB’)2片段或免疫球蛋白链可变结构域，例如VHH和VH。

特异性、亲和力(affinity)和亲合力(avidity)

特异性是指特定抗原结合多肽可以结合的不同类型的抗原或抗原决定簇的数目。抗原结合多肽的特异性是抗原结合多肽将特定抗原识别为独特的分子实体并将其与另一种区分开来的能力。

由抗原与抗原结合多肽解离的平衡常数(Kd)表示的亲和力是抗原决定簇与抗原结合多肽上的抗原结合位点之间的结合强度的量度：Kd值越小，抗原决定簇与抗原结合多肽之间的结合强度越强(或者亲和力也可以表示为亲和常数(Ka)，它是1/Kd)。取决于具体的目的抗原，可以通过已知方法测定亲和力。

亲合力是抗原结合多肽与相关抗原之间结合强度的量度。亲合力与抗原决定簇与抗原结合多肽上的抗原结合位点之间的亲和力以及存在于抗原结合多肽上的相关结合位点的数量二者有关。

适当地，抗原结合多肽将以10^-6至10^-12M的解离常数(Kd)结合，更适当地为10^-7至10^-12M，更适当地为10^-8至10^-12M，以及更适当地为10^-9至10^-12M。

任何小于10^-6的Kd值被认为表示结合。抗原结合多肽与抗原或抗原决定簇的特异性结合可以以任何合适的已知方式测定，包括例如Scatchard分析和/或竞争性结合测定法，例如放射免疫测定法(RIA)，酶免疫测定法(EIA)和夹心竞争测定法，以及本领域已知的其不同变型。

多肽和多核苷酸序列

本发明的构建体、不稳定肽接头以及包含在构建体内的第一和第二多肽都包含氨基酸残基。

适当地，第一和第二多肽各自包含选自SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19组成组的序列或更适当地由其组成。

适当地，构建体包含选自SEQ ID NO：7至17组成组的序列或更适当地由其组成。适当地，构建体包含选自SEQ ID NO：8至11和13至16组成组的序列或更适当地由其组成。

适当地，不稳定肽接头包含选自SEQ ID NO：1至6组成组的序列或更适当地由其组成。适宜地，不稳定肽接头包含选自SEQ ID NO：2至5组成组的序列或更适当地由其组成。

构建体中除了不稳定肽接头之外的区域中的氨基酸残基可以被具有相似化学结构的另一个氨基酸残基替代，并且预期对多肽的功能、活性或其他生物学性质几乎没有影响。这样的取代是“保守”取代。这样的保守取代适当地是下组中的一个氨基酸被来自同一组内的另一个氨基酸残基取代的取代：

排除不稳定肽接头的构建体可以适当地包括一个或多个保守取代。

在本发明的一个方面，提供了编码本发明构建体的核酸。

为了避免疑问，单字母氨基酸代码如下：

G-甘氨酸(Gly)，P-脯氨酸(Pro)，A-丙氨酸(Ala)，V-缬氨酸(Val)，L-亮氨酸(Leu)，I-异亮氨酸(Ile)，M-甲硫氨酸(Met)，C-半胱氨酸(Cys)，F-苯丙氨酸(Phe)，Y-酪氨酸(Tyr)，W-色氨酸(Trp)，H-组氨酸(His)，K-赖氨酸(Lys)，R-精氨酸(Arg)，Q-谷氨酰胺(Gln)，N-天冬酰胺(Asn)，E-谷氨酸(Glu)，D-天冬氨酸(Asp)，S-丝氨酸(Ser)，T-苏氨酸(Thr)。

多聚体

根据本发明的构建体包含第一多肽和第二多肽。因此，本发明的构建体是多聚体的并且可以适当地是多价的。这样的构建体可以包含相同的第一多肽和第二多肽。由两个相同的多肽构成的构建体是“同型双头(homobihead)”。在本发明的一个方面，提供了包含两个相同多肽的构建体。或者，构建体可以由彼此不同的第一多肽和第二多肽组成(“异型双头”)。

构建体可以是多价和/或多特异性的。多价构建体(例如二价构建体)包含两个或更多个结合多肽，并因此提供两个或更多个位点，在该位点对抗原的附着可以适当地在不稳定肽接头切割之前或之后发生。多价构建体的例子可以是同型双头或异型双头。多特异性构建体如双特异性构建体包含两个不同的结合多肽，其呈现两个位点，在该位点(a)可以发生向两种不同的抗原的附着，或(b)可以发生在相同抗原上的两个不同的表位的附着，适当地在不稳定肽接头切割之前或之后。多特异性构建体的例子可以是一个异型双头。多特异性构建体是多价的。

本发明的构建体可以包含另外的第三多肽(通过肽接头连接到第一多肽)，并且还可以包含另外的第四多肽(通过肽接头连接到第二多肽)或由其组成，其中第三和第四多肽对存在于肠道中的一种或多种蛋白酶基本上具有抗性，并且如本文关于第一和第二多肽所定义。由四种多肽构成的本发明的构建体被称为“四头”。适当地，肽接头对存在于肠道中的一种或多种蛋白酶基本具有抗性，或者肽接头是如本文所定义的不稳定肽接头。

适当地，第一、第二、第三和/或第四多肽的分子量不大于300kDa，例如250kDa，例如200kDa，例如180kDa，例如160kDa，例如140kDa，例如120kDa，例如100kDa，例如80kDa，例如60kDa。

胃肠道和消化酶

胃肠道(GIT)是负责消耗和消化食物、吸收营养并排出废物的器官系统。在人类和其他哺乳动物中，GIT由食管、胃、小肠(十二指肠、空肠和回肠)和大肠(盲肠、结肠、直肠和肛管)组成。各种病原体可能定居，并且各种疾病可能在GIT的不同地区出现。肠道(与胃肠道相反)由小肠和大肠组成。

胃肠道的不同部位各自含有消化酶的复杂混合物。这些消化酶包括蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和核酸酶。蛋白酶包括丝氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶和金属蛋白酶。通过分离连接氨基酸残基的肽键(蛋白水解)，蛋白酶参与将多肽链消化成较短的片段。一些从蛋白质链分离末端氨基酸(外肽酶)，另一些攻击蛋白质的内部肽键(内肽酶)。

蛋白水解可以是高度混杂的，使得广泛的蛋白质底物被水解。蛋白酶的情况是这样的：其将肠道中多种摄取的多肽切割成较小的多肽片段。

许多蛋白酶通常与底物上的单个氨基酸(不稳定位点)结合，因此仅对该残基具有特异性。存在于肠道中的蛋白酶包括胰蛋白酶、胰蛋白酶样蛋白酶、糜蛋白酶、糜蛋白酶样蛋白酶、羧肽酶、弹性蛋白酶、氨基肽酶、羧肽酶和肠肽酶。胰蛋白酶样蛋白酶在赖氨酸或精氨酸残基之后切割肽键。糜蛋白酶样蛋白酶在疏水残基如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、亮氨酸和甲硫氨酸之后切割肽键。特别是酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。

适当地，不稳定肽接头对存在于肠道中的一种或多种蛋白酶是不稳定的，并且其中第一和第二多肽基本上对所述一种或多种蛋白酶具有抗性，其中一种或多种蛋白酶存在于小肠或大肠中，适当地在空肠、回肠和/或盲肠。适当地，一种或多种蛋白酶是丝氨酸蛋白酶。适当地，一种或多种蛋白酶选自肠肽酶、胰蛋白酶、胰蛋白酶样蛋白酶、糜蛋白酶和糜蛋白酶样蛋白酶。

适当地，本发明构建体的第一和第二多肽对存在于肠道中的所有蛋白酶基本上具有抗性。这样的蛋白酶包括源自胃肠道共生菌群或病原菌的蛋白酶，例如其中蛋白酶是细胞膜附着的蛋白酶、分泌的蛋白酶和细胞裂解释放的蛋白酶。适当地，肠道是哺乳动物的肠道，如人、猿、鼠、牛、羊或猪肠道。

GIT疾病

GIT的疾病是指涉及胃肠道，即食管、胃、小肠(十二指肠、空肠和回肠)和大肠(盲肠、结肠、直肠和肛门)的疾病。本发明的构建体可用于治疗或预防这些疾病。下面描述GIT的示例性疾病。

GIT的自身免疫性疾病和/或炎性疾病

当免疫系统对正常身体组织的反应不利时，自身免疫疾病就会发展。自身免疫疾病可能导致身体组织受损，器官生长异常和/或器官功能变化。该病症可能仅影响一种器官或组织类型，或可影响多种器官和组织。通常受自身免疫病症影响的器官和组织包括血液成分如红血细胞，血管，结缔组织，内分泌腺如甲状腺或胰腺，肌肉，关节和皮肤。炎性疾病是以炎症为特征的疾病。许多炎性疾病是自身免疫疾病，反之亦然。

慢性炎症性肠病(IBD)克罗恩氏病和溃疡性结肠炎，其影响儿童和成人，是GIT的自身免疫性和炎性疾病的例子(Hendrickson等人2002 Clin Microbiol Rev 15(1)：79-94，通过整体引用引入本文)。溃疡性结肠炎被定义为其中炎症反应和形态变化保持局限于结肠的病症。95％的患者涉及直肠。炎症在很大程度上局限于粘膜，并且包括沿着结肠长度的溃疡、水肿和出血的可变严重程度的连续涉及(Hendrickson等人2002 Clin.MicrobiolRev 15(1)：79-94，通过整体引用并入本文)。溃疡性结肠炎通常表现为与粪便混合的血液和粘液的存在，以及在肠运动过程期间最严重的下腹部痉挛。临床上，血液和粘液腹泻的存在使溃疡性结肠炎与不存在血液的肠易激综合征区分开来。与溃疡性结肠炎不同，克罗恩氏病的呈现通常是微弱的，这导致了延后诊断。诸如涉及的位置、程度和严重性等因素决定了胃肠道症状的程度。具有回肠结肠涉及的患者通常患有餐后腹痛、右下部压痛和偶发性炎性包块。

适当地，本发明的多肽、药物组合物或构建体用于治疗胃肠道的自身免疫性和/或炎性疾病，其选自克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、肠易激综合征、II型糖尿病、肾小球性肾炎、自身免疫性肝炎、干燥综合征、乳糜泻和药物或辐射诱导的粘膜炎(最适当地是克罗恩氏病)。

感染GIT

病毒、细菌、寄生虫和其他致病性感染可发生在GIT中。这些可能限于GIT或起始于GIT然后传播到身体其他部位。本发明的构建体可以用于治疗或预防细菌感染，包括常见的细菌性GIT病原体感染，该病原体包括大肠杆菌，沙门氏菌，弯曲杆菌(Campylobacter)，霍乱弧菌(Vibrio cholerae)，志贺氏菌(Shigella)，产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)，艰难梭菌(Clostridium difficile)，蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)，副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)，耶尔森氏菌(Yersinia enerocolitica)。本发明的构建体可用于治疗或预防病毒感染，包括常见病毒GIT病原体，包括轮状病毒，诺如病毒和小圆形病毒。适当地，本发明的构建体用于治疗或预防医院内感染。适当地，本发明的构建体用于治疗或预防艰难梭菌感染。

适当地，本发明构建体的第一和/或第二多肽与可通过肠道接近的靶标(例如肠道内的靶标)结合。适当地，靶标是源自肠道常驻病原微生物的有害物质。适当地，靶标选自：白介素(例如IL-1、IL-1ra、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18和IL-23)，白介素受体(例如IL-6R和IL-7R)，转录因子(例如NF-kB)，细胞因子(例如TNF-α、IFN-γ、TGF-β和TSLP)，跨膜蛋白(例如gp130和CD3)，表面糖蛋白(例如CD4、CD20、CD40)，可溶性蛋白质(如CD40L)，整联蛋白(如a4b7和αEβ7)，粘附分子(如MAdCAM)，趋化因子(如IP10和CCL20)，趋化因子受体(如CCR2和CCR9)，抑制蛋白(SMAD7)，激酶(如JAK3)，G蛋白偶联受体(如鞘氨醇-1-P受体)和毒素(如艰难梭菌毒素A和艰难梭菌毒素B)；更适当地，靶标选自：TNF-α、艰难梭菌毒素A、艰难梭菌毒素B、CD3和IL-6R；更适当地是TNF-α或艰难梭菌毒素A。适当地，第一和第二多肽的靶标是相同的或不同的。

在一个实施方案中，本发明构建体的第一和/或第二多肽(例如第一和/或第二免疫球蛋白链可变结构域)不结合白介素(例如IL-1、IL-1ra、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18和IL-23)。

在另一个实施方案中，本发明构建体的第一和/或第二多肽(例如第一和/或第二免疫球蛋白链可变结构域)不结合白介素受体(例如IL-6R和IL-7R)。

在另一个实施方案中，本发明构建体的第一和/或第二多肽(例如第一和/或第二免疫球蛋白链可变结构域)不结合转录因子(例如NF-kB)。

在另一个实施方案中，本发明构建体的第一和/或第二多肽(例如第一和/或第二免疫球蛋白链可变结构域)不结合细胞因子(例如TNF-α、IFN-γ、TGF-β和TSLP)。

在另一个实施方案中，本发明构建体的第一和/或第二多肽(例如第一和/或第二免疫球蛋白链可变结构域)不结合跨膜蛋白(例如gp130和CD3)。

在另一个实施方案中，本发明构建体的第一和/或第二多肽(例如第一和/或第二免疫球蛋白链可变结构域)不结合表面糖蛋白(例如CD4、CD20和CD40)。

在另一个实施方案中，本发明构建体的第一和/或第二多肽(例如第一和/或第二免疫球蛋白链可变结构域)不结合可溶性蛋白质(例如CD40L)。

在另一个实施方案中，本发明构建体的第一和/或第二多肽(例如第一和/或第二免疫球蛋白链可变结构域)不结合整联蛋白(例如a4b7和αEβ7)。

在另一个实施方案中，本发明构建体的第一和/或第二多肽(例如第一和/或第二免疫球蛋白链可变结构域)不结合粘附分子(例如MAdCAM)。

在另一个实施方案中，本发明构建体的第一和/或第二多肽(例如第一和/或第二免疫球蛋白链可变结构域)不结合趋化因子(例如IP10和CCL20)。

在另一个实施方案中，本发明构建体的第一和/或第二多肽(例如第一和/或第二免疫球蛋白链可变结构域)不结合趋化因子受体(例如CCR2和CCR9)。

在另一个实施方案中，本发明构建体的第一和/或第二多肽(例如第一和/或第二免疫球蛋白链可变结构域)不结合抑制蛋白(SMAD7)。

在另一个实施方案中，本发明构建体的第一和/或第二多肽(例如第一和/或第二免疫球蛋白链可变结构域)不结合激酶(例如JAK3)。

在另一个实施方案中，本发明构建体的第一和/或第二多肽(例如第一和/或第二免疫球蛋白链可变结构域)不结合G蛋白偶联受体(例如鞘氨醇-1-P受体)。

在另一个实施方案中，本发明构建体的第一和/或第二多肽(例如第一和/或第二免疫球蛋白链可变结构域)不结合毒素(例如艰难梭菌毒素A和艰难梭菌毒素B)。

治疗用途和递送

适当地，本发明的构建体或组合物用作药剂，适当地通过口服给药，适当地，用于治疗或预防GIT疾病(见内部)。本发明的构建体或组合物也可以通过口服给药来治疗或预防其它医学病症例如代谢紊乱如肥胖。在一个实施方案中，本发明的构建体或组合物旨在在肠道中具有局部作用。在一个实施方案中，本发明的构建体或组合物不用于通过以治疗有效量递送至循环来治疗或预防疾病。

在本发明的一个方面，提供了一种治疗自身免疫性疾病或艰难梭菌感染的方法，包括向有需要的人施用治疗有效量的本发明的构建体或组合物。

治疗有效量的本发明的构建体是在受试者单剂量或多剂量给药时，在受试者中中和所选靶标的生物学效应至显著程度的量。治疗有效量可以根据诸如疾病状态，个体的年龄、性别和体重等因素以及构建体在个体中引起所需反应的能力而变化。治疗有效量还是其中本发明的构建体的任何毒性或不利影响被治疗有益效果超过的量。本发明的构建体可掺入到适合于口服给予受试者的药物组合物中。本发明的构建体可以是药学上可接受的盐的形式。

在本发明的一个方面，提供了用单体抗体或其单体抗原结合片段治疗疾病的方法，包括向受试者给予本发明的构建体。还提供了用两种或更多种单体抗体或其单体抗原结合片段治疗疾病的方法，包括向受试者给予本发明的构建体。

本发明的药物组合物配制用于口服递送。本发明的药物组合物可以是各种形式。这些包括例如液体、半固体和固体剂型，例如液体溶液剂，分散体或混悬剂，片剂，丸剂和粉剂。固体剂型是优选的。本发明的构建体可以包含药学上可接受的赋形剂，并且适当地可以可摄入片剂，口含片剂，锭剂，胶囊剂，酏剂，混悬剂，糖浆剂，糯米纸囊剂等的形式使用。

通常，药物组合物包括本发明的构建体以及药学上可接受的赋形剂例如运载体。药学上可接受的运载体的例子包括水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等中的一种或多种，以及它们的组合。药学上可接受的运载体还可以包含少量辅助物质，例如润湿剂或乳化剂，防腐剂或缓冲剂，其增强本发明多肽或构建体的保质期或有效性。药物组合物可以包括抗粘附剂，粘合剂，包衣，崩解剂，香料，颜料，润滑剂，吸附剂，防腐剂，甜味剂，冷冻干燥赋形剂(包括冻干保护剂)或压缩助剂。适当地，本发明的构建体在搀入到药物组合物之前被冻干。

适当地，构建体的第一和第二多肽由于多肽或构建体本身的固有性质而对存在于肠道中的所有蛋白酶基本上具有抗性。

本发明的多肽还可以用肠包衣提供。肠包衣是应用于口服药物的聚合物屏障，其保护多肽免受胃的低pH。用于肠包衣的材料包括脂肪酸、蜡、紫胶、塑料和植物纤维。合适的肠包衣组分包括丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸共聚物，乙酸琥珀酸纤维素，邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素，醋酸琥珀酸羟丙基甲基纤维素(醋酸琥珀酸羟丙甲纤维素)，聚乙烯醋酸邻苯二甲酸酯(PVAP)，甲基丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸共聚物，藻酸钠和硬脂酸。合适的肠包衣包括pH依赖性释放聚合物。这些是在胃中发现的高酸性pH下不溶，但是其在较小酸性pH下快速溶解的聚合物。因此，适当地，肠包衣将不会在酸性胃液(pH～3)中溶解，但是将在小肠中(pH高于6)或结肠中(pH高于7.0)存在的较高pH环境下溶解。选择pH依赖性释放聚合物，使得本发明的构建体大概在剂量达到肠道的靶标区域时被释放。

本发明的药物组合物或构建体可以在缓冲液中配制，以便将组合物的pH稳定在5-50或更适当地15-40或更适当地25-30g/升的浓度。适当的缓冲组分的例子包括生理盐，例如柠檬酸钠和/或柠檬酸。适当的缓冲液含有100-200，更适当地125-175mM的生理盐如氯化钠。适当地选择缓冲液使pKa接近组合物的pH或患者的生理pH。

药物组合物中的示例性构建体浓度可以为约1mg/mL至约200mg/ml或约50mg/mL至约200mg/mL，或约150mg/mL至约200mg/mL。

本发明的构建体或药物组合物的水性制剂可以在pH缓冲溶液中制备，例如pH为约4.0至约7.0，或约5.0至约6.0，或可选地约5.5。适当的缓冲液的例子包括磷酸盐，组氨酸，柠檬酸盐，琥珀酸盐，乙酸盐缓冲液和其它有机酸缓冲液。缓冲液浓度可以为约1mM至约100mM，或约5mM至约50mM，这取决于例如缓冲液和制剂所需的张力。

药物组合物的张力可以通过包括张力调节剂来改变。这种张力调节剂可以是带电或不带电的化学物质。典型的不带电张力调节剂包括糖或糖醇或其它多元醇，优选海藻糖，蔗糖，甘露醇，甘油，1,2-丙二醇，棉子糖，山梨糖醇或乳糖醇(特别是海藻糖，甘露醇，甘油或1,2-丙二醇)。典型的带电张力调节剂包括盐，诸如钠、钾或钙离子与氯化物，硫酸盐，碳酸盐，亚硫酸盐，硝酸盐，乳酸盐，琥珀酸盐，乙酸盐或马来酸盐离子的组合(特别是氯化钠或硫酸钠)；或氨基酸如精氨酸或组氨酸。适当地，水性制剂是等渗的，尽管高渗或低渗溶液可能是适当的。术语“等渗”表示与其比较的其它溶液(例如生理盐溶液或血清)具有相同张力的溶液。张力剂可以以约5mM至约350mM的量使用，例如以1mM至500nM的量使用。适当地，组合物中包含至少一种等渗剂。

还可以向药物组合物中加入表面活性剂以减少配制的构建体的聚集和/或使制剂中的微粒的形成最小化和/或减少吸附。示例性的表面活性剂包括聚氧乙烯山梨坦-脂肪酸酯(Tween)，聚氧乙烯烷基醚(Brij)，烷基苯基聚氧乙烯醚(Triton-X)，聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物(泊洛沙姆，Pluronic)和十二烷基硫酸钠(SDS)。合适的聚氧乙烯山梨坦-脂肪酸酯的例子是聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80。表面活性剂的示例性浓度可以在约0.001％至约10％w/v的范围内。

为了保护本发明的构建体免受冻干过程中的不稳定条件的影响，还可加入冻干保护剂。例如，已知的冻干保护剂包括糖(包括葡萄糖、蔗糖、甘露糖和海藻糖)；多元醇(包括甘露醇、山梨醇和甘油)；和氨基酸(包括丙氨酸、甘氨酸和谷氨酸)。冻干保护剂可以以约10mM至500mM的量被包括。

本发明的药物组合物或构建体的施用剂量范围，是产生所需治疗效果的剂量范围。所需的剂量范围取决于本发明的药物组合物或构建体的准确性质，肠道的靶标区域，制剂的性质，患者的年龄，患者状况的性质、程度或严重程度，禁忌症，如果有的话，以及主治医师的判断。可以使用标准经验程序调整这些剂量水平的变化以进行优化。

本发明的药物组合物或构建体的合适的日剂量在50ng-50mg/kg，例如50μg-40mg/kg，例如5-30mg/kg体重的范围内。单位剂量可以从小于100mg变化，但通常将在每剂量250-2000mg的范围内，其可以每天或更频繁地施用，例如每天2或3次或4次或更少频率，例如每隔一天或每周一次。

疾病的治疗还包括治疗其恶化，以及还包括治疗患者的疾病症状缓解，以预防疾病症状的复发。

联合治疗

本发明的药物组合物还可以包含一种或多种活性剂(例如适用于治疗如本文提及的疾病的活性剂)。将本发明的药物组合物用于治疗细菌感染、自身免疫和/或炎性疾病的治疗方法，作为通常用于治疗细菌性、自身免疫性和/或炎性疾病的其它已有疗法的辅助物或与其结合使用在本发明的范围内。

对于肠易激性疾病(例如克罗恩氏病或溃疡性结肠炎)的治疗，可能的组合包括与例如选自以下列表的一种或多种活性剂的组合：包括：5-氨基水杨酸或其前药(如柳氮磺吡啶、奥沙拉嗪或bisalazide)；皮质类固醇(例如泼尼松龙、甲泼尼龙或布地奈德)；免疫抑制剂(例如环孢菌素，他克莫司，甲氨蝶呤，硫唑嘌呤或6-巯基嘌呤)；抗TNF-α抗体(例如，英夫利昔单抗，阿达木单抗，certolizumab pegol或戈利木单抗)；抗IL12/IL23抗体(例如优特克诺单抗)；抗IL6R抗体或小分子IL12/IL23抑制剂(例如阿匹莫德)；抗α-4-β-7抗体(例如，vedolizumab)；MAdCAM-1阻断剂(例如PF-00547659)；针对细胞粘附分子α-4-整联蛋白的抗体(例如那他珠单抗)；针对IL2受体α亚基的抗体(例如，达克珠单抗或巴利昔单抗)；JAK3抑制剂(例如托法替尼或R348)；Syk抑制剂及其前药物(例如，fostamatinib和R-406)；磷酸二酯酶-4抑制剂(如替托司特)；HMPL-004；益生菌；Dersalazine；塞马莫德/CPSI-2364；和蛋白激酶C抑制剂(例如AEB-071)。最适当的组合剂是英夫利昔单抗、阿达木单抗、certolizumab pegol或戈利木单抗。

对于诸如艰难梭菌感染的细菌感染的治疗，可能的组合包括与例如选自下组的一种或多种活性剂的组合，所述组包括艰难梭菌类毒素疫苗，氨苄青霉素，阿莫西林，万古霉素，甲硝唑，fidaxomicin，利奈唑胺，硝唑尼特，利福昔明，拉莫拉宁，二亚胺嘧啶，克林霉素，头孢菌素(如第二代和第三代头孢菌素类)，氟喹诺酮类(如加替沙星或莫西沙星)，大环内酯类(如红霉素，克拉霉素，阿奇霉素)，青霉素，氨基糖苷类，甲氧苄氨嘧啶-磺胺甲唑，氯霉素，四环素，亚胺培南，美罗培南，抗菌剂，杀菌剂或抑菌剂。可能的组合还包括与一种或多种活性剂(是益生菌)的组合，例如布鲁氏酵母或鼠李糖乳杆菌GG。

因此，本发明的另一方面提供了本发明的药物组合物与一种或多种其它活性剂，例如上述一种或多种活性剂的组合。

在本发明的另一方面，药物组合物或构建体与选自上述列表中的至少一种活性剂顺序、同时或分开地施用。

类似地，本发明的另一方面提供一种组合产品，包括：

(A)本发明的药物组合物或构建体；和

(B)一种或多种其它活性剂，

其中组分(A)和(B)中的每一种与药学上可接受的佐剂，稀释剂或运载体混合配制。在本发明的这个方面，组合产品可以是单一(组合)制剂或套盒。因此，本发明的该方面包括与药学上可接受的佐剂、稀释剂或运载体混合的、包括了本发明的药物组合物或构建体和另一种治疗剂的组合制剂。

本发明还包括套盒，包括组分：

(i)与药学上可接受的佐剂、稀释剂或运载体混合的本发明的药物组合物或构建体；和

(ii)与药学上可接受的佐剂、稀释剂或运载体混合的、包含一种或多种其它活性剂的制剂，其中组分(i)和(ii)各自以适于与另一种结合的施用的形式提供。

因此，套盒的组分(i)是与药学上可接受的佐剂、稀释剂或运载体混合的上述组分(A)。类似地，组分(ii)是与药学上可接受的佐剂、稀释剂或运载体的混合的上述组分(B)。一种或多种其它活性剂(即上述组分(B))可以是例如上述关于治疗细菌感染例如艰难梭菌感染、自身免疫和/或炎性疾病如IBD(例如克罗恩氏病和/或溃疡性结肠炎)的任何一种药剂。如果组分(B)是多于一种其它活性剂，则这些其它活性剂可以彼此配制或与组分(A)配制，或者它们可以分开配制。在一个实施方案中，组分(B)是另一种治疗剂。在另一个实施方案中，组分(B)是另外两种治疗剂。本发明该方面的组合产品(组合制品或套盒)可用于治疗或预防自身免疫疾病(例如本文提及的自身免疫疾病)。

载体和宿主

本文所用的术语“载体”是指能够转运与其连接的另一种核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其是指可以连接额外的DNA区段的环状双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中额外的DNA区段可以连接到病毒基因组中。某些载体能够在其被引入的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型(episomal)哺乳动物和酵母载体)。其它载体(例如非附加型哺乳动物载体)可以在引入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够引导与它们有效连接的基因的表达。这些载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)。通常，用于重组DNA技术的表达载体通常是质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，本发明旨在包括这样的其它形式的表达载体，例如用于相同功能的病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒，腺病毒和腺伴随病毒)，以及噬菌体和噬菌粒系统。本发明还涉及编码本发明构建体的核苷酸序列。本文所用的术语“重组宿主细胞”(或简称“宿主细胞”)旨在表示引入了重组表达载体的细胞。这些术语旨在不仅指特定的受试细胞，而且指这种细胞的后代。

在本发明的一个方面，提供了包含编码本发明构建体的多核苷酸或包含所述多核苷酸的cDNA的载体。在本发明的另一方面，提供了用所述载体转化的宿主细胞，其能够表达本发明的构建体。适当地，宿主细胞是诸如属于曲霉属、酵母属、克鲁维酵母属、汉逊酵母属或毕赤酵母属的酵母，如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、大肠杆菌或毕赤酵母(Pichia pastoris)。

如果不稳定肽接头被肠道中存在的蛋白酶切割，而且如果不稳定肽接头也基本上对产生构建体的宿主生物体的蛋白酶具有抗性，则对于生产和便利目的是特别有利的。因此，在本发明的一个实施方案中，不稳定肽接头基本上对产生构建体的宿主生物体的蛋白酶具有抗性。

制备方法

可以使用例如Green和Sambrook 2012 Molecμlar Cloning：A LaboratoryManual第四版Cold Spring Harbor Laboratory Press中公开的技术获得并操作本发明的构建体。

特别地，可以使用人造基因合成来生产根据本发明的构建体(Nambiar等人1984Science 223：1299-1301，Sakamar和Khorana 1988 Nucl.Acids Res 14：6361-6372，Wells等人1985 Gene 34：315-323和Grundstrom等人1985 Nucl.Acids Res 13：3305-3316，通过整体引用并入本文)。编码本发明构建体的基因可以通过例如固相DNA合成来合成产生。整个基因可以从头合成，而不需要前体模板DNA。为了获得所需的寡核苷酸，构建单元按照产物序列所要求的顺序依次偶联到生长的寡核苷酸链上。在链装配完成后，将产物从固相中释放到溶液中，去保护并收集。可以通过高效液相色谱(HPLC)分离产物以获得高纯度的所需寡核苷酸(Verma和Eckstein 1998 Annu Rev Biochem 67：99-134)。

本发明的构建体可以在DNA水平上遗传融合，即编码包含一个或多个多肽例如抗原结合多肽的完整多肽构建体的多核苷酸构建体。通过遗传途径结合多个多肽的一种方法是通过经不稳定肽接头编码序列来连接多肽编码序列。例如，第一多肽的羧基末端可以通过不稳定肽接头编码序列连接到下一个多肽的氨基末端。可以扩展这种连接模式以连接多肽用于构建三、四等功能构建体。在WO96/34103(通过整体引用并入本文)中公开了多价(如二价)VHH多肽构建体的制备方法。

可以对编码构建体的DNA或cDNA进行突变，所述突变对于多肽的氨基酸序列是沉默的，但是为在特定宿主中翻译提供优选的密码子。在例如大肠杆菌和酿酒酵母中翻译核酸的优选密码子是已知的。

可以例如通过对编码构建体的核酸的取代、添加或缺失来实现构建体的突变。可以通过许多方法引入对编码构建体的核酸的取代、添加或缺失，包括例如易错PCR，改组，寡核苷酸定向诱变，装配PCR，PCR诱变，体内诱变，盒诱变，递归整体诱变，指数整体诱变，位点特异性诱变(Ling等人1997 Anal Biochem 254(2)：157-178，通过整体引用并入本文)，基因重装配，基因位点饱和诱变(GSSM)，合成连接重装配SLR)或这些方法的组合。还可以通过包括重组，递归序列重组，磷酸硫酸酯修饰的DNA诱变，含有尿嘧啶的模板诱变，间隙双链突变，点错配修复诱变，修复缺陷型宿主菌株诱变，化学诱变，辐射诱变，缺失诱变，限制性选择诱变，限制性纯化诱变，整体诱变，嵌合核酸多聚体产生或其组合的方法引入对核酸的修饰、添加或缺失。

包含免疫球蛋白链可变结构域如VH和VHH的构建体的表达可以使用适当的表达载体例如原核细胞如细菌例如大肠杆菌(例如根据WO94/04678和WO96/34103中公开的方案，其通过整体引用并入本文)来实现。免疫球蛋白链可变结构域如VH和VHH的表达也可以使用真核细胞，例如昆虫细胞，CHO细胞，Vero细胞或适当的酵母细胞如属于曲霉属、酵母属、克鲁维酵母属、汉逊酵母属或毕赤酵母属的酵母来实现。适当地使用酿酒酵母(例如根据WO94/025591中公开的方案，其通过引用并入本文)。

适当地，本发明的构建体可以在真菌例如酵母(例如酿酒酵母)中生产，包括根据WO02/48382中公开的方法，在包含碳源的培养基上生长真菌，其中50-100wt％的所述碳源是乙醇。

在本发明的一个方面，提供了制备本发明构建体的方法，包括以下步骤：

i)将本发明的多核苷酸克隆到载体，如质粒中，

ii)在允许产生多肽或构建体的条件下，用所述载体转化能够产生本发明的多构建体的细胞如细菌细胞或酵母细胞，

iii)回收构建体，例如通过亲和层析。

条款

定义本发明及其优选方面的一组条款如下：

1.一种适于口服给药的构建体，包含通过不稳定肽接头连接的第一多肽和第二多肽，其中不稳定肽接头对存在于肠道中的一种或多种蛋白酶是不稳定的，并且其中第一和第二多肽对所述一种或多种蛋白酶基本上具有抗性。

2.根据条款1的构建体，其中第一多肽是抗原结合多肽。

3.根据条款2的构建体，其中抗原结合多肽是抗体或其抗原结合片段。

4.根据条款1至3中任一项的构建体，其中第二多肽是抗原结合多肽。

5.根据条款4的构建体，其中第二抗原结合多肽是抗体或其抗原结合片段。

6.根据条款1至5中任一项的构建体，其中第一和第二多肽对肠道中存在的所有蛋白酶基本上具有抗性。

7.根据条款1至6中任一项的构建体，其中肠道是哺乳动物肠道，例如人、猿、鼠、牛、羊或猪肠道。

8.根据条款1至7中任一项的构建体，其中一种或多种蛋白酶存在于小肠或大肠中。

9.根据条款8的构建体，其中一种或多种蛋白酶存在于空肠、回肠和/或盲肠中。

10.根据条款8或9的构建体，其中一种或多种蛋白酶是丝氨酸蛋白酶。

11.根据条款1至10中任一项的构建体，其中不稳定肽接头基本上对产生构建体的宿主生物体的蛋白酶具有抗性。

12.根据条款1至11中任一项的构建体，其中不稳定肽接头包含用于胰蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶的切割位点。

13.根据条款12的构建体，其中不稳定肽接头包含至少1个，例如至少2个，例如至少3个，例如至少4个，例如至少5个，例如至少6个，例如至少7个，例如至少8个，例如至少9个，例如至少10个K残基。

14.根据条款1至13中任一项的构建体，其中不稳定肽接头包含至少1个，例如至少2个，例如至少3个，例如至少4个，例如至少5个，例如至少6个，例如至少7个，例如至少8个，例如至少9个，例如至少10个R残基。

15.根据条款1至14中任一项的构建体，其中不稳定肽接头不包含任何P残基。

16.根据条款1至15中任一项的构建体，其中包含在不稳定肽接头内的所有K或R残基在其N-末端侧具有至少1个，例如至少2个，例如至少3个，例如至少4个，例如至少5个屏蔽残基，其中屏蔽残基选自：D和E组成的列表。

17.根据条款1至16中任一项的构建体，其中包含在不稳定肽接头内的所有K或R残基在其C-末端侧具有至少1个，例如至少2个，例如至少3个，例如至少4个，例如至少5个屏蔽残基，其中屏蔽残基选自：D和E组成的列表。

18.根据条款16或17的构建体，其中所有K和R残基具有与它们相邻的至少一个屏蔽残基。

19.根据条款1至18中任一项的构建体，其中不稳定肽接头不包含任何D或E残基。

20.根据条款1至18中任一项的构建体，其中不稳定肽接头由选自C、A、S、N、G、L、I、V、T、M、F、Y、H、K、R、W和Q组成的列表的残基组成。

21.根据条款20的构建体，其中不稳定肽接头由选自A、G、L、I、V、M、S、T、K和R残基组成的列表的残基组成。

22.根据条款21的构建体，其中不稳定肽接头由选自S、G、K和R组成的列表的残基组成。

23.根据条款1至15中任一项的构建体，其中包含在不稳定肽接头内的所有K或R残基在其N-末端侧具有至少1个，例如至少2个，例如至少3个，例如至少4个，作为至少5个非屏蔽残基，其中非屏蔽残基选自：C、A、S、N、G、L、I、V、T、M、F、Y、H、W和Q组成的列表。

24.根据条款1至15和23中任一项的构建体，其中包含在不稳定肽接头内的所有K或R残基在其C-末端侧具有至少1个，例如至少2个，例如至少3个，例如至少4个，例如至少有5个非屏蔽残基，其中非屏蔽残基选自：C、A、S、N、G、L、I、V、T、M、F、Y、H、W和Q组成的列表。

25.根据条款23或24的构建体，其中所有K和R残基具有与它们相邻的至少一个非屏蔽残基。

26.根据条款23至25中任一项的构建体，其中非屏蔽残基选自由A、G、L、I、V、M、S和T组成的列表。

27.根据条款26的构建体，其中非屏蔽残基选自由A、G、L、I、V和S组成的列表。

28.根据条款27的构建体，其中非屏蔽残基选自由G和S组成的列表。

29.根据条款1至11中任一项的构建体，其中不稳定肽接头包含用于糜蛋白酶或糜蛋白酶样蛋白酶的切割位点。

30.根据条款29的构建体，其中不稳定肽接头包含至少1个，例如至少2个，例如至少3个，例如至少4个，例如至少5个，例如至少6个，例如至少8个，例如至少9个，例如至少10个选自W、F、Y、L和M组成的列表的残基。

31.根据条款30的构建体，其中不稳定肽接头包含至少1个，例如至少2个，例如至少3个，例如至少4个，例如至少5个，例如至少6个，例如至少7个，例如至少8个，例如至少9个，例如至少10个选自W、F和Y组成的列表的残基。

32.根据条款29至31中任一项的构建体，其中不稳定肽接头由选自S、G、W、F、Y、L和M组成的列表的残基组成；例如S、G、W、F和Y。

33.根据条款1至32中任一项的构建体，其中不稳定肽接头具有至少3个残基，例如至少5个残基，例如至少10个残基的长度。

34.根据条款1至33中任一项的构建体，其中不稳定肽接头具有不大于40个残基，例如不大于25个残基，例如不大于15个残基的长度。

35.根据条款1的构建体，其中不稳定肽接头包含以下格式的多肽序列或更适当地由其组成：

[-(G_aS)_x-U_c-B-U’_d-(G_bS)_y-]_z

其中，

a是1-10；

b是1-10；

U是D或E；

U’是D或E；

c是0-7；

d是0-7；

x是1-10；

y是1-10

z是1-10，和

B是K或R。

36.根据条款35的构建体，其中不稳定肽接头包含以下格式的多肽序列或更适当地由其组成：

[-(G_aS)_x-B-(G_bS)_y-]_z

其中，

a是1-10；

b是1-10；

x是1-10；

y是1-10

z是1-10，和

B是K或R。

37.根据条款36的构建体，其中不稳定肽接头包含以下格式的多肽序列或更适当地由其组成：

[-(G₄S)_x-B-(G₄S)_y-]_z

其中，

x是1-10；

y是1-10

z是1-10

B是K或R。

38.根据条款1的构建体，其中不稳定肽接头包含以下格式的多肽序列或更适当地由其组成：

-B-(G_aS)_x-B’-

其中，

a是1-10；

x是1-10；

B是K或R，和

B’是K或R。

39.根据条款1的构建体，其中不稳定肽接头包含以下格式的多肽序列或更适当地由其组成：

-B-(G_aS)_x-B’-(G_bS)_y-B”-

其中，

a是1-10；

b是1-10；

x是1-10；

y是1-10；

B是K或R

B’是K或R，和

B”是K或R。

40.根据条款35至39中任一项的构建体，其中a是2-5。

41.根据条款40的构建体，其中a是4。

42.根据条款35至41中任一项的构建体，其中b是2-5。

43.根据条款42的构建体，其中b是4。

44.根据第35至43项中任一项的构建体，其中x是1-5。

45.根据条款44的构建体，其中x是2。

46.根据条款44的构建体，其中x是1。

47.根据条款35至46中任一项的构建体，其中y是1-5。

48.根据条款47的构建体，其中y是1。

49.根据条款47的构建体，其中y是2。

50.根据条款35至49中任一项的构建体，其中z是1-3。

51.根据条款50的构建体，其中z是1。

52.根据条款35至51中任一项的构建体，其中B是K。

53.根据条款35至52中任一项的构建体，其中U是D。

54.根据条款35至53中任一项的构建体，其中U’是D。

55.根据条款35至54中任一项的构建体，其中c是1。

56.根据条款35至55中任一项的构建体，其中d是1。

57.根据条款35至54中任一项的构建体，其中c是0。

58.根据条款35至55或57中任一项的构建体，其中d是0。

59.根据条款35至54中任一项的构建体，其中c是4且d是0。

60.根据条款35至59中任一项的构建体，其中B’是K。

61.根据条款35至60中任一项的构建体，其中B”是K。

62.根据条款1的构建体，其中不稳定肽接头包含以下格式的多肽序列或更适当地由其组成：

[-(G_aS)_x-J-(G_bS)_y-]_z

其中，

a是1-10；

b是1-10；

x是1-10；

y是1-10

z是1-10，和

J是W、F、Y、L或M。

63.根据条款62的构建体，其中不稳定肽接头包含以下格式的多肽序列或更适当地由其组成：

[-(G₄S)_x-J-(G₄S)_y-]_z

其中，

x是1-10；

y是1-10

z是1-10，和

J是W、F、Y、L或M。

64.根据条款1的构建体，其中不稳定肽接头包含以下格式的多肽序列或更适当地由其组成：

-J-(G_aS)_x-J’-

其中，

a是1-10；

x是1-10；

J是W、F、Y、L或M和

J’是W、F、Y、L或M。

65.根据条款1的构建体，其中不稳定肽接头包含以下格式的多肽序列或更适当地由其组成：

-J-(G_aS)_x-J’-(G_bS)_y-J”-

其中，

a是1-10；

b是1-10；

x是1-10；

y是1-10；

J是W、F、Y、L或M

J’是W、F、Y、L或M，和

J”是W、F、Y、L或M。

66.根据条款62至65中任一项的构建体，其中a是2-5。

67.根据条款66的构建体，其中a是4。

68.根据条款62至67中任一项的构建体，其中b是2-5。

69.根据条款68的构建体，其中b是4。

70.根据条款62至69中任一项的构建体，其中x是1-5。

71.根据条款70的构建体，其中x是2。

72.根据条款70的构建体，其中x是1。

73.根据条款62至72中任一项的构建体，其中y是1-5。

74.根据条款73的构建体，其中y是1。

75.根据条款73的构建体，其中y是2。

76.根据条款62至75中任一项的构建体，其中z是1-3。

77.根据条款76的构建体，其中z是1。

78.根据条款62至77中任一项的构建体，其中J是W、F或Y。

79.根据条款62至78中任一项的构建体，其中J’是W、F或Y。

80.根据条款62至79中任一项的构建体，其中J”是W、F或Y。

81.根据条款1至80中任一项的构建体，其中第一抗体或其抗原结合片段与通过肠道可接近的第一靶标如肠道内的靶标结合。

82.根据条款81的构建体，其中第一靶标是源自肠道常驻病原微生物的第一有害物质。

83.根据条款81的构建体，其中第一靶标选自：TNF-α、艰难梭菌毒素A、艰难梭菌毒素B、CD3或IL-6R。

84.根据条款83的构建体，其中第一靶标选自：TNF-α或艰难梭菌毒素A。

85.根据条款81的构建体，其中第二抗体或其抗原结合片段与通过肠道可接近的第二靶标如肠道内的靶标结合。

86.根据条款85的构建体，其中第二靶标是源自肠道常驻病原微生物的第二有害物质。

87.根据条款85的构建体，其中第二靶标选自：TNF-α、艰难梭菌毒素A、艰难梭菌毒素B、CD3或IL-6R。

88.根据条款87的构建体，其中第二靶标选自：TNF-α或艰难梭菌毒素A。

89.根据条款81至88中任一项的构建体，其中第一和第二靶标是相同的。

90.根据条款81至88中任一项的构建体，其中第一和第二靶标是不同的。

91.根据条款1至90中任一项的构建体，其中抗原结合片段选自：VL、V-NAR、scFv、Fab片段、F(aB’)2片段或免疫球蛋白链可变结构域如VHH和VH。

92.根据条款91的构建体，其中抗原结合片段是VHH。

93.根据条款91的构建体，其中抗原结合片段是VH。

94.根据条款1至93中任一项的构建体，其中在粪便蛋白酶测定和/或胰蛋白酶蛋白酶测定和/或糜蛋白酶蛋白酶测定中按重量计至少20％，例如至少40％，例如至少60％，例如至少80％，例如至少90％，例如至少100％的构建体在混合后至少10，例如至少20，例如至少30分钟后保持未切割。

95.根据条款1的构建体，其中第一和第二多肽各自包含选自SEQ ID NO：18和SEQID NO：19的序列。

96.根据条款95的构建体，其中第一和第二多肽各自由选自SEQ ID NO：18和SEQID NO：19的序列组成。

97.根据条款1的构建体，其中构建体包含选自SEQ ID NO：7至17的序列。

98.根据条款97的构建体，其中构建体由选自SEQ ID NO：7至17的序列组成。

99.根据条款1的构建体，其中不稳定肽接头包含选自SEQ ID NO：1至6的序列。

100.根据条款99的构建体，其中不稳定肽接头由选自SEQ ID NO：1至6的序列组成。

101.根据条款1至94中任一项的构建体，其中构建体包含通过肽接头连接到第一多肽的额外的第三多肽，其中第三多肽基本上对存在于肠道中的一种或多种蛋白酶具有抗性。

102.根据条款101的构建体，其中所述构建体包含通过肽接头与第二多肽连接的额外的第四多肽或由其组成，其中第四多肽基本上对存在于肠道中的一种或多种蛋白酶具有抗性。

103.根据条款101或102的构建体，其中肽接头基本上对存在于肠道中的一种或多种蛋白酶具有抗性。

104.根据条款101或102的构建体，其中肽接头是不稳定肽接头。

105.根据条款1至104中任一项的构建体，其中构建体是肠包衣的。

106.一种药物组合物，包含根据条款1至105中任一项的构建体和药学上可接受的赋形剂。

107.根据条款1至106中任一项的构建体或组合物，用作药物。

108.根据条款107的构建体或组合物，其中药物通过口服给药。

109.根据条款108的构建物或组合物，用于治疗GIT疾病。

110.根据条款109的构建体或组合物用于治疗自身免疫性和/或炎性疾病。

111.根据条款110的构建物或组合物用于治疗炎性肠病如克罗恩病和/或溃疡性结肠炎。

112.根据条款109的构建体或组合物用于治疗细菌感染如艰难梭菌感染。

113.一种核酸，包含编码根据条款1至104中任一项的构建体的序列。

114.一种治疗自身免疫疾病的方法，包括向有需要的人给予治疗有效量的根据条款1至106中任一项的构建体或组合物。

115.一种治疗细菌感染如艰难梭菌感染的方法，包括向有需要的人给予治疗有效量的根据条款1至106中任一项的构建体或组合物。

116.一种用单体多肽治疗疾病的方法，包括向受试者给予根据条款1至106中任一项的构建体或组合物。

117.一种用两种或更多种单体多肽治疗疾病的方法，包括向受试者给予根据条款1至106中任一项的构建体或组合物。

118.一种用两种或更多种单体多肽治疗两种或更多种疾病的方法，包括向受试者给予根据条款1至106中任一项的构建体或组合物。

119.根据条款114至118中任一项的方法，其中疾病是自身免疫性疾病和/或炎性疾病或GIT感染。

120.一种测定根据条款1至104中任一项的构建体的不稳定性的方法，包括以下步骤：(a)例如通过进行实施例1的胰蛋白酶蛋白酶测定，实施例2的糜蛋白酶蛋白酶测定或实施例3的粪便蛋白酶测定，将构建体在包含胰蛋白酶的溶液，包含糜蛋白酶，粪便上清液，小肠液的溶液，或包含肠肽酶的溶液中温育，然后(b)确定在一个或多个温育期之后被切割的构建体的比例。

121.根据条款120的方法，其中不稳定性水平是在实施例1的胰蛋白酶蛋白酶测定、实施例2的糜蛋白酶蛋白酶测定或实施例3的粪便蛋白酶测定中混合后至少10，例如至少20，例如至少30分钟后保留未切割的构建体的百分比。

122.一种将单体抗体或其单体抗原结合片段递送至肠道的靶标区域的方法，包括以下步骤：(a)进行根据条款120或121的方法，然后(b)选择对于肠道的靶标区域具有适当水平的不稳定性的构建体，(c)用肠包衣的包装生产所选择的构建体，然后(d)将包装的所选择的构建体给予受试者。

123.一种将单体多肽递送至肠道的方法，包括向受试者给予条款1至106中任一项的构建体或组合物。

124.根据条款116至119或122至123中任一项的方法，其中受试者是哺乳动物，例如人。

125.一种制备产品的方法，所述产品包含已经被选择的根据条款1至104中任一项的构建体，所述方法包括将所选择的构建体加入产物中，其中所选择的构建体是通过包括以下步骤的方法选择并产生的：(a)执行根据条款120或121的方法，然后(b)选择针对肠道靶标区域具有适当水平的不稳定性的构建体。

126.一种多肽，包含SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQID NO：5，SEQ ID NO：6。

127.一种多核苷酸，包含SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：22，SEQ IDNO：23，SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：28，SEQ IDNO：29，SEQ ID NO：30，SEQ ID NO：31，SEQ ID NO：32，SEQ ID NO：33，SEQ ID NO：34，SEQ IDNO：35，SEQ ID NO：36。

更多条款

定义本发明及其优选方面的一组进一步条款如下：

1.一种适于口服给药的构建体，包含通过不稳定肽接头连接的第一多肽和第二多肽，其中不稳定肽接头对存在于肠道中的一种或多种蛋白酶是不稳定的，并且其中第一和第二多肽基本上对于一种或多种蛋白酶具有抗性。

2.根据条款1的构建体，其中第一多肽是抗原结合多肽，并且第二多肽是抗原结合多肽。

3.根据条款1或2的构建体，其中第一和第二多肽对肠道中存在的所有蛋白酶基本上具有抗性。

4.根据条款1至3中任一项的构建体，其中不稳定肽接头包含至少1个，例如至少2个，例如至少3个，例如至少4个，例如至少5个，例如至少6个，例如至少7个，例如至少8个，例如至少9个，例如至少10个K和/或R残基。

5.根据条款1至4中任一项的构建体，其中包含在不稳定肽接头内的所有K或R残基在其N-末端和/或C-末端侧具有至少1个，例如至少2个，例如至少3个，例如至少4个，例如至少5个屏蔽残基，其中屏蔽残基选自：D和E。

6.根据条款1至4中任一项的构建体，其中包含在不稳定肽接头内的所有K或R残基在其N-末端和/或C-末端侧具有至少1个，例如至少2个，例如至少3个，例如至少4个，例如至少5个非屏蔽残基，其中非屏蔽残基选自C、A、S、N、G、L、I、V、T、M、F、Y、H、W和Q。

7.根据条款1的构建体，其中不稳定肽接头包含以下格式的多肽序列：

[-(G_aS)_x-U_c-B-U’_d-(G_bS)_y-]_z

其中，

a是1-10；

b是1-10；

U是D或E；

U’是D或E；

c是0-7；

d是0-7；

x是1-10；

y是1-10

z是1-10，和

B是K或R。

8.根据条款7的构建体，其中c和d均是0。

9.根据条款1的构建体，其中不稳定肽接头包含以下格式的多肽序列：

-B-(G_aS)_x-B’-

其中，

a是1-10；

x是1-10；

B是K或R，和

B’是K或R。

10.根据条款1的构建体，其中不稳定肽接头包含以下格式的多肽序列：

-B-(G_aS)_x-B’-(G_bS)_y-B”-

其中，

a是1-10；

b是1-10；

x是1-10；

y是1-10；

B是K或R；

B’是K或R，和

B”是K或R。

11.根据条款1的构建体，其中不稳定肽接头包含以下格式的多肽序列：

[-(G_aS)_x-J-(G_bS)_y-]_z

其中，

a是1-10；

b是1-10；

x是1-10；

y是1-10

z是1-10，和

J是W、F、Y、L或M；例如W、F或Y。

12.根据条款7至11中任一项的构建体，其中a是4，b是4且z是1。

13.根据条款1至12中任一项的构建体，其中抗原结合片段选自：VL、V-NAR、scFv、Fab片段、F(aB’)2片段或免疫球蛋白链可变结构域如VHH和VH。

14.一种药物组合物，包含根据条款1至13中任一项的构建体用作通过口服给予治疗GIT的疾病的药物。

15.一种多肽，包含SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQID NO：5或SEQ ID NO：6。

现在将通过以下非限制性实施例进一步描述本发明。

实施例

实施例1：胰蛋白酶蛋白酶测定

为了测试不稳定肽接头的不稳定性，开发了胰蛋白酶蛋白酶测定法。该测定法如下进行。

将L-1-甲苯磺酰氨基-2-苯基乙基氯甲基酮(TPCK)处理的胰蛋白酶-琼脂糖珠(来自牛胰腺的胰蛋白酶；T4019；Sigma Aldrich)的缓冲的(10mM乙酸，pH3.2，含0.01％硫柳汞)水悬浮液用于测定。珠用水(250μl珠+1.25ml水)洗涤3次，然后用胰蛋白酶缓冲液(TRYP缓冲液；1mM Tris-HCl，20mM CaCl2[pH 8.0])洗涤5次。最后，将树脂重悬于TRYP缓冲液中作为50％(v/v)悬浮液。

将100μl的2mg/ml构建体溶液与225μl的50％(v/v)固定化的TPCK处理的胰蛋白酶在TRYP缓冲液中混合。在37℃下在振荡器中温育如0、10、15、30、45和60分钟的时间间隔后，取样如下：将树脂以500×g离心1分钟步骤沉淀，并从上清液中取出40μl样品并与2x上样缓冲液(例如Laemmli缓冲液)混合。将剩余的悬浮液再次混合，并在37℃下放回振荡器。

为了分析，将15μl每个样品与5μl的4x上样染料混合，煮沸10分钟，并在聚丙烯酰胺凝胶(如NuPAGE 10％丙烯酰胺Bis-Tris凝胶)上每个泳道加载15μl。凝胶在SDS-MES缓冲液中在200V下运行35min。将凝胶固定在40％甲醇，7％乙酸中30min，并在胶体考马斯亮蓝染色中染色过夜。凝胶在成像(例如使用7秒曝光的ImageQuant LAS4000)之前在水中脱色。相对于切割的组成型多肽的完整构建体的量可以通过比较每个时间点泳道中相应的条带来评估。

实施例2：糜蛋白酶蛋白酶测定

可以使用胰蛋白酶蛋白酶测定方案，其中胰蛋白酶珠被糜蛋白酶珠取代。

实施例3：粪便提取物蛋白酶测定

为了测试不稳定肽接头的不稳定性，开发了粪便提取物蛋白酶测定法。粪便提取物是一种生理相关的基质，特别是对于靶向大肠的多肽。该测定如下进行。

将来自多个个体的人粪便样品以每克粪便1、2或3mL 1×PBS的比例加入1×PBS而变成浆液。然后将浆液合并(使得一个池代表来自多个个体的粪便的组合的蛋白酶输出)，离心并除去上清液，等分并存储在-70℃。该方法除去粪便基质，包括任何细胞材料。为了消化，在不存在BSA运载体的情况下，将构建体在37℃下在合并的人粪便上清液中以浓度160.16μg/ml温育60min。在诸如0、10、30和60分钟的时间间隔内取等份试样，并在蛋白酶终止液(1x PBS+2x蛋白酶抑制剂混合物(Sigma)+1％PMSF)中1:1混合，并立即在-80℃冷冻。

为了分析，将样品除霜，并将15μl每种样品与5μl 4x上样染料混合，煮沸10min，并在聚丙烯酰胺凝胶(例如NuPAGE 10％丙烯酰胺Bis-Tris凝胶)上的每个泳道加载15μl。凝胶在SDS-MES缓冲液中在200V下运行35min。将凝胶固定在40％甲醇，7％乙酸中30min，并在胶体考马斯亮蓝染色中染色过夜。凝胶在成像(例如使用ImageQuant LAS4000，曝光7sec)之前在水中脱色。相对于被切割的组成型多肽的完整构建体的量可以通过比较每个时间点泳道中相应的较高和较低分子量带来评估。

实施例4：构建体的制备

含有连接(a)两种抗TcdA(艰难梭菌毒素A)ICVD的不同接头序列的同型双头(homobihead)构建体在酿酒酵母中表达，或设计含有连接(b)两种抗TNF-αICVD的不同接头序列的同型双头构建体并在大肠杆菌中表达。抗TcdA构建体是由不同接头分离的ICVDID1A的同型双头。抗TNF-α构建体是由也包括Flag-6His标签的多核苷酸编码的ICVD ID5F的同型双头。

抗TcdA构建体

从酿酒酵母表达同型双头构建体ID3A、ID4A和ID25A至ID28A。这些构建体在任一末端都不携带任何蛋白质标签。含有不稳定肽接头的ID25A至ID28A通过使用ID1A编码DNA作为模板的重叠PCR产生，并克隆到能够在大肠杆菌和酿酒酵母中复制的穿梭载体pUR4547(BAC)的SacI/HindIII位点中。从穿梭载体通过半乳糖诱导实现向来自酿酒酵母的上清液中的表达和完全分泌。最后，使用Capto S阳离子交换树脂(GE)纯化构建体并透析到1×PBS中。

根据如上所述的酵母表达方案，进行在酿酒酵母中的表达和随后的存储。

抗TNF-α构建体

ID55F至ID60F直接克隆到载体pMEK222(QVQ)的SfiI/BsteII位点。ID55F至ID60F携带C-末端Flag-6His标签。将所得质粒转化到大肠杆菌BL21DE3(Novagen)中，用于表达并转运至周质。在Autoinduction medium Terrific液体培养基(Formedium)中过夜生长后，将细胞沉淀，在-80℃下冷冻，并重新悬浮在原始体积的1/10的1×PBS中以破坏外膜。使用Ni-NTA柱，通过AKTA Prime FPLC从上清液中纯化ID55F至ID60F，以结合His标签，接着进行咪唑洗脱并透析至1×PBS。

接头的序列见下表1。

表1

实施例5：使用胰蛋白酶蛋白酶测定法测定抗TcdA构建体的不稳定性

使用实施例1中所述的胰蛋白酶蛋白酶测定来测定靶向TcdA的实施例4的构建体的不稳定性。在图1至3中的SDS-PAGE凝胶中示出测定结果，其中M＝分子量标记；泳道1＝添加胰蛋白酶珠之前的ICVD，泳道2＝消化0min，泳道3＝消化10min，泳道4＝消化25min，泳道5＝消化60min，泳道6＝消化105min，和泳道7＝用胰蛋白酶珠消化160min。

可以看出，ID3A在测试的所有时间段内基本保持完整(图1)。在温育0到10分钟之间后，ID25A(图2)被非常快地完全切割。ID26A(图2)中的屏蔽D残基导致接头从0至10分钟逐渐切割，至105分钟后完成切割。位于ID28A接头(图3)的任一末端的不稳定残基和ID27A(图3)中额外的N侧屏蔽D残基都导致较慢的切割，在温育160分钟后仍在进行。从最稳定到最不稳定的构建体顺序为ID3A>ID28A>ID27A>ID26A>ID25A。

分子量大约为35kDa的未切割的构建体在对应于早期时间点的泳道中可见(图2和图3)。切割的构建体(即组成型单体ICVD)在对应于较晚时间点的泳道中以约18kDa的分子量运行可见。因此，从目视检查这些凝胶显见，在胰蛋白酶蛋白酶测定中混合160分钟后(或者在某些情况下更早)，按重量计大于50％的构建体ID25A、ID26A、ID27A和ID28A被切割成第一和第二免疫球蛋白链可变结构域(泳道7)。这些是包含不稳定肽接头的本发明构建体。

从图1中的凝胶的目视检查也显见，可见的唯一显著条带是对应于完整ID3A构建体(以约37kDa的分子量运行)的那些。因此，在胰蛋白酶蛋白酶测定中混合后，在任何时间点，包括160分钟(泳道7)后，ID3A未被切割成第一和第二免疫球蛋白链可变结构域。ID3A不包含不稳定肽接头并且不是根据本发明的构建体。

此外，从图2和图3中的凝胶的目视检查显见，这些构建体中的第一免疫球蛋白链可变结构域和第二免疫球蛋白链可变结构域本身对存在于肠道中的一种或多种蛋白酶基本上具有抗性。可以看出，没有可见的对应于ICVD单体(分子量约18kDa运行的完整单体)的片段的显著条带，因此在胰蛋白酶蛋白酶测定中混合后测试的所有时间点，包括160分钟，按重量计至少70％的免疫球蛋白链可变结构域明显保持未切割的。

实施例6：使用粪便蛋白酶测定法测定抗TcdA和抗TNF-α构建体的不稳定性

使用实施例3中所述的粪便蛋白酶测定来测定靶向TcdA和靶向TNF-α的实施例4的构建体的不稳定性。测定结果显示于图4(抗TcdA构建体)和图5(抗TNF-α构建体)中的SDS-PAGE凝胶。根据测试的构建体和以分钟计的温育时间段来标记泳道。'X'表示不含ICVD的泳道(只有粪便提取物)。在图5中，“B”表示双头，并且“M”表示被切割的单体。

抗TcdA构建体

从图4可以看出，ID3A在测试的所有时间段内基本保持完整。在温育0到10分钟之间后，ID25A被非常快速地完全切割。ID26A中的屏蔽D残基，ID27A中的额外的N侧屏蔽D残基和位于ID28A接头的任一末端的不稳定残基都导致相对于ID25A较慢的切割。ID26A、ID27A和ID28A的消化在温育30分钟后仍在进行。

抗TNF-α构建体

从图5可以看出，ID55F在测试的所有时间段内基本保持完整。ID56F经历即时全切割。温育0至10分钟之间后，ID57F完全被切割。ID58F中的屏蔽D残基，位于ID60F接头的任一末端的不稳定残基以及ID59F中的额外的N侧屏蔽D残基都导致相对于ID57F较慢的切割。ID58F、ID59F和ID60F的消化在温育60分钟后仍在进行。

粪便蛋白酶测定总结

显然，不稳定肽接头的中心区域(但不是周边区域)的赖氨酸残基增加对粪便蛋白酶的不稳定性。通过使用侧翼天冬氨酸残基屏蔽赖氨酸残基来降低不稳定性。粪便蛋白酶测定中测试的构建体的不稳定性总结在下表2和3中。

表2

表3

实施例7：存储期间抗TcdA构建体的稳定性

在存储期间测试抗TcdA构建体(ID3A、ID25A、ID25A、ID27A和ID28A)随时间的稳定性。在4℃冷藏0、2、4或9天后取样(图6和图7)。可以看出，SDS-PAGE凝胶含有对应于未切割的双头构建体的条带，并且不含有切割单体的条带。因此，在这些条件下，构建体稳定了至少9天。

这些未切割的构建体以约35kDa的分子量运行，并且预期组成型单体具有约18kDa的分子量。从图6和图7中的凝胶的目视检查显见，在比对应于完整构建体本身的35kDa条带更低的分子量下没有显著的条带可见，因此显然地，在使用酵母表达方案(含有0天存储)产生构建体之后以及也在2、4或9天的存储期后，这些构建体中不超过按重量计10％被切割成第一和第二免疫球蛋白链可变结构域。

此外，显见的是，组成型的免疫球蛋白链可变结构域对酵母蛋白酶基本上具有抗性，因为在图6或图7中不可见以比单个ICVD单体(大约18kDa运行)更低的分子量运行的显著条带。因此显然地，在使用酵母表达方案(存储0天)产生第一或第二免疫球蛋白链可变结构域之后，以及也在2、4或9天的存储期后，不超过按重量计10％的第一或第二免疫球蛋白链可变结构域被切割。

实施例8：掺入糜蛋白酶不稳定接头的构建体的产生

可使用类似于上述实施例4中详述的方法，设计包含含有糜蛋白酶不稳定位点(W、F、Y、L或M；特别是W、F或Y)的一系列不同接头序列的同型双头或异型双头构建体并在合适的宿主如酿酒酵母中表达。表4中提供了合适的构建体。

表4

然后使用糜蛋白酶蛋白酶测定和粪便蛋白酶测定来测定这些构建体的不稳定性。

实施例9：在生产和存储期间测试ID4A的稳定性

使用酵母表达方案在酿酒酵母中表达抗TcdA构建体ID4A。ID4A是ICVD ID1A的同型双头，并且在任一末端不携带任何蛋白质标签。接头的序列如上表1所示。

测试了ID4A在生产和存储过程中随时间的稳定性。在4℃冷藏0、2、4或9天后取样(图8)。可以看出，SDS-PAGE凝胶的每个泳道含有对应于切割单体的条带，所有条带都以约10kDa的分子量运行，并且没有泳道明显地包含对应于未切割的双头的条带。似乎ID4A中使用的接头在生产过程中被酵母蛋白酶切割。

因此，从图8中的凝胶的目视检查可以看出，使用酵母表达方案产生构建体(存储0天)后，按质量计大于10％(实际上100％)的ID4A被切割成第一和第二免疫球蛋白链可变结构域。本发明的构建体对酵母蛋白酶是稳定的，并因此ID4A不是本发明的构建体。

在整个说明书和所附权利要求中，除非上下文另有要求，措词“包括”和诸如“包含”和“含有”之类的变型将被理解为暗示包括所指定的整数、步骤、整数组或步骤组，但不排除任何其他整数、步骤、整数组或步骤组。在本说明书中提及的所有专利和专利申请的全部内容通过引用并入本文。本发明包括优选的和更优选的组的所有组合以及适当的和更适当组和上述组的实施方案。

Claims (118)

1.一种用于通过口服给药第一免疫球蛋白链可变结构域和第二免疫球蛋白链可变结构域来治疗肠道疾病的构建体，其中所述构建体包含通过不稳定肽接头连接的第一免疫球蛋白链可变结构域和第二免疫球蛋白链可变结构域，其中：

(i)不稳定肽接头对存在于肠道中的一种或多种蛋白酶是不稳定的，

(ii)不稳定肽接头对酵母蛋白酶是稳定的，和

(iii)第一和第二免疫球蛋白链可变结构域对所述一种或多种蛋白酶基本上具有抗性，和

其中所述构建体在酵母中产生。

2.一种通过口服给药来自构建体的第一免疫球蛋白链可变结构域和第二免疫球蛋白链可变结构域来治疗肠道疾病的方法，其中所述构建体包含通过不稳定肽接头连接的第一免疫球蛋白链可变结构域和第二免疫球蛋白链可变结构域，其中：

(i)不稳定肽接头对存在于肠道中的一种或多种蛋白酶是不稳定的，

(ii)不稳定肽接头对酵母蛋白酶是稳定的，和

(iii)第一和第二免疫球蛋白链可变结构域对所述一种或多种蛋白酶基本上具有抗性；

其中所述构建体在酵母中产生。

3.一种将第一免疫球蛋白链可变结构域和第二免疫球蛋白链可变结构域递送至肠道的方法，包括在酵母中产生然后经口施用包含通过不稳定肽接头连接的第一免疫球蛋白链可变结构域和第二免疫球蛋白链可变结构域的构建体，其中：

(i)不稳定肽接头对存在于肠道中的一种或多种蛋白酶是不稳定的，

(ii)不稳定肽接头对酵母蛋白酶是稳定的，和

(iii)第一和第二免疫球蛋白链可变结构域对所述一种或多种蛋白酶基本上具有抗性。

4.一种制备包含通过不稳定肽接头连接的第一免疫球蛋白链可变结构域和第二免疫球蛋白链可变结构域的构建体的方法，其中：

(i)不稳定肽接头对存在于肠道中的一种或多种蛋白酶是不稳定的，

(ii)不稳定肽接头对酵母蛋白酶是稳定的，和

(iii)第一和第二免疫球蛋白链可变结构域对所述一种或多种蛋白酶基本上具有抗性；

包括在酵母中产生所述构建体的步骤。

5.根据权利要求4的方法，其中所述方法还包括纯化所述构建体的步骤。

6.一种通过权利要求4或5所述的方法获得的构建体。

7.根据权利要求1至6中任一项的构建体，构建体用途或方法，其中所述酵母是酿酒酵母。

8.根据权利要求1至7中任一项的构建体，构建体用途或方法，其中所述不稳定肽接头对存在于肠道中的一种或多种蛋白酶是不稳定的，使得按质量计大于50％的构建体在胰蛋白酶蛋白酶测定中混合后160分钟后被切割成第一和第二免疫球蛋白链可变结构域。

9.根据权利要求1至8中任一项的构建体，构建体用途或方法，其中所述不稳定肽接头对酵母蛋白酶是稳定的，使得在使用酵母表达方案产生构建体后按质量计不超过10％的构建体被切割成第一和第二免疫球蛋白链可变结构域。

10.根据权利要求8或9的构建体，构建体用途或方法，其中通过凝胶电泳评估所述构建体的切割的质量。

11.根据权利要求1至10中任一项的构建体，构建体用途或方法，其中所述第一免疫球蛋白链可变结构域和所述第二免疫球蛋白链可变结构域对存在于所述肠道中的一种或多种蛋白酶基本上具有抗性，使得在胰蛋白酶蛋白酶测定中混合后10分钟后，按质量计至少70％的第一免疫球蛋白链可变结构域和按质量计至少70％的第二免疫球蛋白链可变结构域保持未切割。

12.根据权利要求11的构建体，构建体用途或方法，其中通过凝胶电泳评估第一和第二免疫球蛋白链可变结构域的未切割的质量。

13.根据权利要求1至12中任一项的构建体，构建体用途或方法，其中所述第一免疫球蛋白链可变结构域和所述第二免疫球蛋白链可变结构域对酵母蛋白酶基本上具有抗性。

14.根据权利要求1至13中任一项的构建体，构建体用途或方法，其中所述第一免疫球蛋白链可变结构域和所述第二免疫球蛋白链可变结构域对酵母蛋白酶基本上具有抗性，使得在使用酵母表达方案产生第一或第二免疫球蛋白链可变结构域之后，按质量计不超过10％的第一或第二免疫球蛋白链可变结构域被切割。

15.根据权利要求14的构建体，构建体用途或方法，其中通过凝胶电泳评估第一和第二免疫球蛋白链可变结构域的切割的质量。

16.根据权利要求10、12或15中任一项的构建体，构建体用途或方法，其中所述凝胶电泳是定量凝胶电泳。

17.根据权利要求1至16中任一项的构建体，构建体用途或方法，其中所述第一多肽和第二多肽对存在于所述肠道中的所有蛋白酶基本上具有抗性。

18.根据权利要求1至17中任一项的构建体，构建体用途或方法，其中所述肠道是哺乳动物肠道，如人、猿、鼠、牛、羊或猪肠道。

19.根据权利要求1至18中任一项的构建体，构建体用途或方法，其中所述一种或多种蛋白酶存在于所述小肠或大肠中。

20.根据权利要求19的构建体，构建体用途或方法，其中所述一种或多种蛋白酶存在于空肠、回肠和/或盲肠中。

21.根据权利要求1至20中任一项的构建体，构建体用途或方法，其中所述一种或多种蛋白酶是丝氨酸蛋白酶。

22.根据权利要求1至21中任一项的构建体，构建体用途或方法，其中所述不稳定肽接头包含胰蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶的切割位点。

23.根据权利要求22的构建体，构建体用途或方法，其中所述不稳定肽接头包含至少1个，例如至少2个，例如至少3个，例如至少4个，例如至少5个，例如至少6个，例如至少7个，例如至少8个，例如至少9个，例如至少10个K残基。

24.根据权利要求22或23的构建体，构建体用途或方法，其中所述不稳定肽接头包含至少1个，例如至少2个，例如至少3个，例如至少4个，例如至少5个，例如至少6个，例如至少7个，例如至少8个，例如至少9个，例如至少10个R残基。

25.根据权利要求1至24中任一项的构建体，构建体用途或方法，其中所述不稳定肽接头不包含任何P残基。

26.根据权利要求1至25中任一项的构建体，构建体用途或方法，其中包含在所述不稳定肽接头内的所有K或R残基在其N-末端侧具有至少1个，例如至少2个，例如至少3个，例如至少4个，例如至少5个屏蔽残基，其中屏蔽残基选自：D和E组成的列表。

27.根据权利要求1至26中任一项的构建体，构建体用途或方法，其中包含在所述不稳定肽接头内的所有K或R残基在其C-末端侧具有至少1个，例如至少2个，例如至少3个，例如至少4个，例如至少5个屏蔽残基，其中屏蔽残基选自：D和E组成的列表。

28.根据权利要求26或27的构建体，构建体用途或方法，其中所有K和R残基具有与它们相邻的至少一个屏蔽残基。

29.根据权利要求1至28中任一项的构建体，构建体用途或方法，其中所述不稳定肽接头不包含任何D或E残基。

30.根据权利要求1至28中任一项的构建体，构建体用途或方法，其中所述不稳定肽接头由选自C、A、S、N、G、L、I、V、T、M、F、Y、H、K、R、W和Q组成的列表的残基组成。

31.根据权利要求30的构建体，构建体用途或方法，其中所述不稳定肽接头由选自A、G、L、I、V、M、S、T、K和R残基组成的列表的残基组成。

32.根据权利要求31的构建体，构建体用途或方法，其中所述不稳定肽接头由选自S、G、K和R组成的列表的残基组成。

33.根据权利要求1至25中任一项的构建体，构建体用途或方法，其中包含在所述不稳定肽接头内的所有K或R残基在其N-末端侧具有至少1个，例如至少2个，例如至少3个，例如至少4个，例如至少5个非屏蔽残基，其中非屏蔽残基选自：C、A、S、N、G、L、I、V、T、M、F、Y、H、W和Q组成的列表。

34.根据权利要求1至25和33中任一项的构建体，构建体用途或方法，其中包含在所述不稳定肽接头内的所有K或R残基在其C末端侧具有至少1个，例如至少2个，例如至少3个，例如至少4个，例如至少5个非屏蔽残基，其中非屏蔽残基选自C、A、S、N、G、L、I、V、T、M、F、Y、H、W和Q组成的列表。

35.根据权利要求33或34的构建体，构建体用途或方法，其中所有K和R残基具有与它们相邻的至少一个非屏蔽残基。

36.根据权利要求33至35中任一项的构建体，构建体用途或方法，其中所述非屏蔽残基选自由A、G、L、I、V、M、S和T组成的列表。

37.根据权利要求36的构建体，构建体用途或方法，其中所述非屏蔽残基选自由A、G、L、I、V和S组成的列表。

38.根据权利要求37的构建体，构建体用途或方法，其中所述非屏蔽残基选自由G和S组成的列表。

39.根据权利要求1至20中任一项的构建体，构建体用途或方法，其中所述不稳定肽接头包含糜蛋白酶或糜蛋白酶样蛋白酶的切割位点。

40.根据权利要求39的构建体，构建体用途或方法，其中所述不稳定肽接头包含至少1个，例如至少2个，例如至少3个，例如至少4个，例如至少5个，例如至少6个，例如至少7个，例如至少8个，例如至少9个，例如至少10个选自W、F、Y、L和M组成的列表的残基。

41.根据权利要求40的构建体，构建体用途或方法，其中所述不稳定肽接头包含至少1个，例如至少2个，例如至少3个，例如至少4个，例如至少5个，例如至少6个，例如至少7个，例如至少8个，例如至少9个，例如至少10个选自W、F和Y组成的列表的残基。

42.根据权利要求39至41中任一项的构建体，构建体用途或方法，其中所述不稳定肽接头由选自S、G、W、F、Y、L和M；例如S、G、W、F和Y组成的列表的残基组成。

43.根据权利要求1至42中任一项的构建体，构建体用途或方法，其中所述不稳定肽接头具有至少3个残基，例如至少5个残基，例如至少10个残基的长度。

44.根据权利要求1至43中任一项的构建体，构建体用途或方法，其中所述不稳定肽接头具有不大于40个残基，例如不大于25个残基，例如不大于15个残基的长度。

45.根据权利要求1至22中任一项的构建体，构建体用途或方法，其中所述不稳定肽接头包含以下格式的多肽序列或更适当地由所述多肽序列组成：

[-(G_aS)_x-A_e-U_c-B-U’_d-A_f-(G_bS)_y-]_z

其中，

a是1-10；

b是1-10；

U是D或E；

U’是D或E；

c是0-7；

d是0-7；

x是1-10；

y是1-10；

z是1-10；

B是K或R；

e是0-5，和

f是0-5。

46.根据权利要求45的构建体，构建体用途或方法，其中所述不稳定肽接头包含以下格式的多肽序列或更适当地由所述多肽序列组成：

[-(G_aS)_x-U_c-B-U’_d-(G_bS)_y-]_z

其中，

a是1-10；

b是1-10；

U是D或E；

U’是D或E；

c是0-7；

d是0-7；

x是1-10；

y是1-10；

z是1-10，和

B是K或R。

47.根据权利要求46的构建体，构建体用途或方法，其中所述不稳定肽接头包含以下格式的多肽序列或更适当地由所述多肽序列组成：

[-(G_aS)_x-B-(G_bS)_y-]_z

其中，

a是1-10；

b是1-10；

x是1-10；

y是1-10；

z是1-10，和

B是K或R。

48.根据权利要求47的构建体，构建体用途或方法，其中所述不稳定肽接头包含以下格式的多肽序列或更适当地由所述多肽序列组成：

[-(G₄S)_x-B-(G₄S)_y-]_z

其中，

x是1-10；

y是1-10

z是1-10，和

B是K或R。

49.根据权利要求1至22中任一项的构建体，构建体用途或方法，其中所述不稳定肽接头包含以下格式的多肽序列或更适当地由所述多肽序列组成：

-B-A_e-(G_aS)_x-A_f-B’-

其中，

a是1-10；

x是1-10；

B是K或R；

B’是K或R；

e是0-5，和

f是0-5。

50.根据权利要求49的构建体，构建体用途或方法，其中所述不稳定肽接头包含以下格式的多肽序列或更适当地由所述多肽序列组成：

-B-(G_aS)_x-B’-

其中，

a是1-10；

x是1-10；

B是K或R，和

B’是K或R。

51.根据权利要求45至50中任一项的构建体，构建体用途或方法，其中a是2-5。

52.根据权利要求51的构建体，构建体用途或方法，其中a是4。

53.根据权利要求45至52中任一项的构建体，构建体用途或方法，其中b是2-5。

54.根据权利要求53的构建体，构建体用途或方法，其中b是4。

55.根据权利要求45至54中任一项的构建体，构建体用途或方法，其中x是1-5。

56.根据权利要求55的构建体，构建体用途或方法，其中x是2。

57.根据权利要求55的构建体，构建体用途或方法，其中x是1。

58.根据权利要求45至57中任一项的构建体，构建体用途或方法，其中y是1-5。

59.根据权利要求58的构建体，构建体用途或方法，其中y是1。

60.根据权利要求58的构建体，构建体用途或方法，其中y是2。

61.根据权利要求45至60中任一项的构建体，构建体用途或方法，其中z是1-3。

62.根据权利要求61的构建体，构建体用途或方法，其中z是1。

63.根据权利要求45至62中任一项的构建体，构建体用途或方法，其中B是K。

64.根据权利要求45至63中任一项的构建体，构建体用途或方法，其中U是D。

65.根据权利要求45至64中任一项的构建体，构建体用途或方法，其中U’是D。

66.根据权利要求45至65中任一项的构建体，构建体用途或方法，其中c是1。

67.根据权利要求45至66中任一项的构建体，构建体用途或方法，其中d是1。

68.根据权利要求45至67中任一项的构建体，构建体用途或方法，其中c是0。

69.根据权利要求45至66或68中任一项的构建体，构建体用途或方法，其中d是0。

70.根据权利要求45至65中任一项的构建体，构建体用途或方法，其中c是4且d是0。

71.根据权利要求45至70中任一项的构建体，构建体用途或方法，其中B’是K。

72.根据权利要求1至21中任一项的构建体，构建体用途或方法，其中所述不稳定肽接头包含以下格式的多肽序列或更适当地由所述多肽序列组成：

[-(G_aS)_x-A_e-J-A_f-(G_bS)_y-]_z

其中，

a是1-10；

b是1-10；

x是1-10；

y是1-10；

z是1-10；

J是W、F、Y、L或M；

e是0-5，和

f是0-5。

73.根据权利要求1至21中任一项的构建体，构建体用途或方法，其中所述不稳定肽接头包含以下格式的多肽序列或更适当地由所述多肽序列组成：

[-(G_aS)_x-J-(G_bS)_y-]_z

其中，

a是1-10；

b是1-10；

x是1-10；

y是1-10

z是1-10，和

J是W、F、Y、L或M。

74.根据权利要求73的构建体，构建体用途或方法，其中所述不稳定肽接头包含以下格式的多肽序列或更适当地由所述多肽序列组成：

[-(G₄S)_x-J-(G₄S)_y-]_z

其中，

x是1-10；

y是1-10

z是1-10，和

J是W、F、Y、L或M。

75.根据权利要求1至21中任一项的构建体，构建体用途或方法，其中所述不稳定肽接头包含以下格式的多肽序列或更适当地由所述多肽序列组成：

-J-(G_aS)_x-J’-

其中，

a是1-10；

x是1-10；

J是W、F、Y、L或M和

J’是W、F、Y、L或M。

76.根据权利要求72至75中任一项的构建体，构建体用途或方法，其中a是2-5。

77.根据权利要求76的构建体，构建体用途或方法，其中a是4。

78.根据权利要求72至77中任一项的构建体，构建体用途或方法，其中b是2-5。

79.根据权利要求78的构建体，构建体用途或方法，其中b是4。

80.根据权利要求72至79中任一项的构建体，构建体用途或方法，其中x是1-5。

81.根据权利要求80的构建体，构建体用途或方法，其中x是2。

82.根据权利要求80的构建体，构建体用途或方法，其中x是1。

83.根据权利要求72至82中任一项的构建体，构建体用途或方法，其中y是1-5。

84.根据权利要求83的构建体，构建体用途或方法，其中y是1。

85.根据权利要求83的构建体，构建体用途或方法，其中y是2。

86.根据权利要求72至85中任一项的构建体，构建体用途或方法，其中z是1-3。

87.根据权利要求86的构建体，构建体用途或方法，其中z是1。

88.根据权利要求72至87中任一项的构建体，构建体用途或方法，其中J是W、F或Y。

89.根据权利要求72至88中任一项的构建体，构建体用途或方法，其中J’是W、F或Y。

90.根据权利要求88或89的构建体，构建体用途或方法，其中J和/或J’是Y。

91.根据权利要求1至90中任一项的构建体，构建体用途或方法，其中所述第一免疫球蛋白链可变结构域结合通过肠道可接近的第一靶标，例如肠道内的靶标。

92.根据权利要求91的构建体，构建体用途或方法，其中所述第一靶标是源自肠道常驻病原微生物的第一有害物质。

93.根据权利要求91的构建体，构建体用途或方法，其中所述第一靶标选自：白介素，白介素受体，转录因子，细胞因子，跨膜蛋白，表面糖蛋白，可溶蛋白，整联蛋白，粘附分子，趋化因子，趋化因子受体，抑制蛋白，激酶，G蛋白偶联受体或毒素。

94.根据权利要求93的构建体，构建体用途或方法，其中所述第一靶标选自：TNF-α或艰难梭菌毒素A。

95.根据权利要求91的构建体，构建体用途或方法，其中所述第二免疫球蛋白链可变结构域结合通过肠道可接近的第二靶标，例如肠道内的靶标。

96.根据权利要求95的构建体，构建体用途或方法，其中第二靶标是源自肠道常驻病原微生物的第二有害物质。

97.根据权利要求95的构建体，构建体用途或方法，其中所述第二靶标选自：白介素，白介素受体，转录因子，细胞因子，跨膜蛋白，表面糖蛋白，可溶蛋白，整联蛋白，粘附分子，趋化因子，趋化因子受体，抑制蛋白，激酶，G蛋白偶联受体或毒素。

98.根据权利要求97的构建体，构建体用途或方法，其中所述第二靶标选自：TNF-α或艰难梭菌毒素A。

99.根据权利要求91至98中任一项的构建体，构建体用途或方法，其中所述第一靶标和第二靶标是相同的。

100.根据权利要求91至98中任一项的构建体，构建体用途或方法，其中所述第一靶标和第二靶标是不同的。

101.根据权利要求1至100中任一项的构建体，构建体用途或方法，其中所述第一免疫球蛋白链可变结构域选自VL、VHH和VH。

102.根据权利要求101的构建体，构建体用途或方法，其中所述第二免疫球蛋白链可变结构域选自VL、VHH和VH。

103.根据权利要求101或102的构建体，构建体用途或方法，其中所述第一和/或第二免疫球蛋白链可变结构域是VHH。

104.根据权利要求101或102的构建体，构建体用途或方法，其中所述第一和/或第二免疫球蛋白链可变结构域是VH。

105.根据权利要求1的构建体，构建体用途或方法，其中所述第一和第二免疫球蛋白链可变结构域各自包含选自SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19的序列。

106.根据权利要求105的构建体，构建体用途或方法，其中所述第一和第二免疫球蛋白链可变结构域各自由选自SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19的序列组成。

107.根据权利要求1的构建体，构建体用途或方法，其中所述构建体包含选自SEQ IDNO：8至11和13至16的序列。

108.根据权利要求107的构建体，构建体用途或方法，其中所述构建体由选自SEQ IDNO：8至11和13至16的序列组成。

109.根据权利要求1的构建体，构建体用途或方法，其中所述不稳定肽接头包含选自SEQ ID NO：2至5的序列。

110.根据权利要求109的构建体，构建体用途或方法，其中所述不稳定肽接头由选自SEQ ID NO：2至5的序列组成。

111.根据权利要求1至110中任一项的构建体，构建体用途或方法，其中所述构建体包含通过肽接头连接到所述第一免疫球蛋白链可变结构域的额外的第三多肽，其中所述第三多肽基本上对存在于肠道中的一种或多种蛋白酶具有抗性。

112.根据权利要求111的构建体，构建体用途或方法，其中所述构建体包含通过肽接头连接到所述第二免疫球蛋白链可变结构域的额外的第四多肽或由所述第四多肽组成，其中所述第四多肽基本上对存在于肠道的一种或多种蛋白酶具有抗性。

113.根据权利要求111或112的构建体，构建体用途或方法，其中所述肽接头基本上对存在于所述肠道中的一种或多种蛋白酶具有抗性。

114.根据权利要求111或112的构建体，构建体用途或方法，其中所述肽接头是不稳定肽接头。

115.根据权利要求1至114中任一项的构建体，构建体用途或方法，其中所述构建体是肠包衣的。

116.根据权利要求1至115中任一项的构建体，构建体用途或方法，用于治疗自身免疫病和/或炎性疾病。

117.根据权利要求116的构建体，构建体用途或方法，用于治疗炎症性肠病如克罗恩病和/或溃疡性结肠炎。

118.根据权利要求1至115中任一项的构建体，构建体用途或方法，用于治疗细菌感染如艰难梭菌感染。