CN114555643A

CN114555643A - 组合物

Info

Publication number: CN114555643A
Application number: CN202080059225.8A
Authority: CN
Inventors: 斯科特·克罗; 迈克·韦斯特; 凯文·罗伯茨; 蒂姆·卡尔顿; 卢瓦纳·马焦雷; 马里恩·丘比特; 卢德斯·杜阿尔特; 基思·雷
Original assignee: Soreso Pharmaceutical Co
Current assignee: Soreso Pharmaceutical Co
Priority date: 2019-06-21
Filing date: 2020-06-19
Publication date: 2022-05-27
Also published as: US20230143091A1; CA3144200A1; MX2021015762A; IL289125A; AU2020295767A1; KR20220063148A; WO2020254828A1; JP2022538089A; EP3986570A1

Abstract

除了其他方面，还提供了包含TNF‑α结合多肽和IL‑7R结合多肽的组合物。

Description

组合物

发明领域

本发明涉及包含TNF-α结合多肽和IL-7R结合多肽的组合物和构建体。本发明还涉及编码此类构建体的核酸、制备此类组合物和构建体的方法、包含编码此类构建体的核酸的cDNA和载体、表达或能够表达此类构建体的宿主细胞以及此类组合物和构建体的用途。

发明背景

肿瘤坏死因子-α是与全身炎症有关的同源三聚体促炎细胞因子，它以可溶性形式和膜结合形式二者存在。TNF-α主要由单核细胞和巨噬细胞分泌，但也由肿瘤细胞系以及CD4+和CD8+外周血T淋巴细胞以及一些培养的T细胞系和B细胞系分泌。TNF-α与炎性疾病、自身免疫性疾病、病毒感染、细菌感染和寄生虫感染、恶性病和/或神经退行性疾病有关，并且是自身免疫性/自身炎性疾病例如类风湿性关节炎和克罗恩病(CD)的特异性生物疗法的靶点。

白细胞介素-7(IL-7)是由非造血基质细胞和上皮细胞组成性地产生，并且对于胸腺中的T淋巴细胞的发育和对于外周血T细胞的存活和稳态调节是必要的。在肠粘膜中，IL-7还调节先天淋巴样细胞的在表型和功能方面不同的群体，所述群体对于初始引发对病原性微生物激惹的免疫应答是重要的，还调节CD4+淋巴组织诱导(LTi)细胞，所述细胞能够促进淋巴组织器官发生和一些树突细胞群体。IL-7对于T细胞的功能性效应使IL-7成为保护性免疫性以及自身免疫性和炎症的关键增强剂。IL-7对不同靶细胞的效应是通过异二聚体复合物IL-7R(其包含IL-7Rα亚基(CD127)和共同细胞因子受体γ链(γc)(CD132))来介导。IL-7Rα不仅以细胞膜结合的形式，而且以可溶性形式(sIL-7Rα)可获得。除了IL-7/IL-7Rα在人T细胞发育和稳态中发挥作用之外，临床前研究已表明IL-7/IL-7Rα途径与不同自身免疫性疾病和炎性疾病的动物模型相关。

TSLP是似乎参与调节身体粘膜表面处的发炎过程的细胞因子。TSLP刺激树突细胞(DC)和先天淋巴样细胞(ILC)而诱导Th2细胞因子(IL-4、IL-5和IL-13)的分泌并且促进Th2型炎症的发展。现在认为TSLP是包括特应性皮炎、鼻炎的一些变应性病症发病的原因，并且还促进肠道病症，包括嗜酸细胞性食管炎(EoE)和溃疡性结肠炎(UC)。矛盾的是，还报告TSLP对于维持胃肠道中的免疫稳态和粘膜保护是重要的。最近，TSLP可以被表达为两种不同的同种型的发现为此细胞因子的明显不同的活性提供了生物学解释(Fornasa等人2015；Tsilingiri等人2017)。分子研究还显示TSLP基因可以产生通过两个不同的启动子区域调节的两种编码RNA。转录物之一编码159aa的TSLP的长同种型(L-TSLP)(UNIPROT条目Q969D9，SEQ ID NO：22)，并且第二转录物编码包含L-TSLP的C末端63aa的TSLP的短形式(S-TSLP)(UNIPROT条目Q969D9-2，SEQ ID NO：23)。L-TSLP经由包含TSLP特异性受体链(TSLPR)和IL-7Rα链的受体复合物而作用于靶细胞。最近，结构研究显示IL-7和L-TSLP与TSLP-受体复合物的IL-7Rα链的相互作用涉及共同的IL-7Rα结合位点(Verstraete等人2017)。S-TSLP不结合至TSLPR，并且它不能抑制L-TSLP与此受体的结合。就作者所知，目前为止还未鉴定S-TSLP的特异性受体。重要的是，已经显示S-TSLP优选通过健康皮肤被表达并且在健康肠粘膜组织中通过上皮细胞和固有层细胞表达。S-TSLP具有抗炎活性；体外S-TSLP通过单核细胞衍生的DC而抑制促炎性细胞因子的产生，并且有助于将CD103+DC调节至致耐受性表型。

因此，TNF-α、IL-7和L-TSLP都是调节IBD中肠道炎症发展和维持所涉及的细胞类型和途径的细胞因子。抗TNF-α抗体已经改变了克罗恩病和溃疡性结肠炎的治疗方法。然而，使用抗TNF-α药物的患者中大约三分之一是初始无应答者。在初始应答者中，随后的应答损失每年可能在10％到50％之间变化(继发性无应答)。初始无应答的患者不太可能从换用第二抗TNF-α药物中受益；因此，需要新的有效疗法，以更好地解决这些患者未满足的临床需求。目前，IL-7R阻断型抗体的功效尚未在肠道炎性疾病患者中进行测试。然而，临床前研究表明，IL-7R阻断型抗体的短期全身施用可能是胃肠道炎症模型中的有效治疗。在鼠IBD模型中，IL-7R拮抗剂治疗后疗效的主要机制涉及表达中度至高水平IL-7Rα并且由于发炎的肠组织中IL-7的产生增加而被激活的致病性T细胞(IL-7R+效应/记忆T细胞)的局部耗减或功能抑制。IL-7/IL-7R通路的抑制代表了一种通过与TNF-α中和抗体作用中所涉及的机制不同的机制来解决促炎T细胞的新策略。因此，成功组合抗TNF-α和抗IL-7R抗体的效果的组合物或构建体具有提高功效的潜力和/或在更广泛的IBD患者组中具有功效。

WO2004041862、WO2006122786和Coppieters等人2006(通过引用以其整体并入本文中)公开了针对TNF-α的单结构域抗体和相关方面。WO2013056984、WO2015189302、WO2011094259和WO2011104687(通过引用以其整体并入本文中)公开了针对IL-7R的抗体和相关方面。

与现有技术的物质相比，本发明的组合物或构建体在至少一些实施方案中可以具有以下优点中的一个或多个。这些优点可以通过本发明组合物中的每种组分多肽本身来实现，或者可替代地本发明组合物中多肽的组合可以导致一种或多种以下优点的加和或甚至协同效应。

(a)增加对TNF-α和/或IL-7R的亲和力和/或亲合力；

(b)对TNF-α和/或IL-7R增加的中和能力；

(c)增加对信号传导蛋白磷酸化的抑制；

(d)增加对细胞因子产生的抑制；

(e)例如在施用于小鼠、食蟹猴或人时降低的免疫原性；

(f)在蛋白酶的存在下，例如(a)在小肠和/或大肠中存在的蛋白酶和/或IBD炎性蛋白酶例如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、肠激酶、MMP3、MMP10、MMP12、其他MMP和组织蛋白酶的存在下和/或(b)在蛋白酶例如细胞膜附着的蛋白酶、分泌的蛋白酶和从存在于小肠和/或大肠中的肠道共生微生物区系和/或病原性细菌的细胞裂解中释放的蛋白酶的存在下增加的稳定性；

(g)在生产期间对蛋白酶降解的增加的稳定性(例如，对酵母蛋白酶的耐受性)；

(h)对于口服施用的增加的适用性；

(i)对于口服施用之后局部递送至肠道和固有层的增加的适用性；

(j)对于在异源宿主诸如细菌(诸如大肠肝菌(Escherichia coli))或酵母(诸如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris))中表达的增加的适用性；

(k)对于在药物中使用的适用性和改善的特性；

(l)对于在功能性食品中使用的适用性和改善的特性；

(m)改善的组织渗透，诸如渗透发炎结肠粘膜上皮和粘膜下组织以到达粘膜下固有层；

(n)人中的免疫原性降低，例如由于与人免疫球蛋白的序列相似性增加：

(o)更有效地预防或治疗自身免疫性疾病和/或炎性疾病，包括改善其症状，尤其包括炎性肠病和/或粘膜炎，特别是当口服施用时；和

(p)结合至新型表位。

发明内容

本发明人提供了出人意料地有效组合物和构建体，其包含TNF-α结合多肽和IL-7R结合多肽。特别地，已发现在单一组合物中提供TNF-α结合多肽和IL-7R结合多肽可能比分别提供每种结合多肽更有效。在一些实施方案中，在本发明的组合物中这些多肽的组合可以具有加和效应，并且在另外的实施方案中，在本发明的组合物中这些多肽的组合可以具有协同效应。

基于本文公开的使用来自炎性肠病患者的离体培养的肠粘膜组织(实施例4和5)的发现，可以预期这些组合物在预防或治疗自身免疫性疾病和/或炎性疾病方面具有特殊效用。更具体地，本文公开的发现表明这些组合物在预防或治疗炎性肠病(例如克罗恩病、溃疡性结肠炎或检查点抑制剂诱导的结肠炎)或预防或治疗粘膜炎或食管炎，尤其是口服施用时，具有特殊效用。

可以预期，通过在疾病的治疗或预防中将TNF-α结合多肽与IL-7R结合多肽一起使用可以获得相同的益处，其中所述多肽未组合在相同的组合物中。类似地，可以预期，通过在疾病的治疗或预防中将IL-7R结合多肽与TNF-α结合多肽一起使用可以获得相同的益处，其中所述多肽未组合在相同的组合物中。

本发明提供组合物，其包含TNF-α结合多肽和IL-7R结合多肽。

还提供了包含TNF-α结合多肽和IL-7R结合多肽的构建体，以及编码所述构建体的多核苷酸。

还提供了用于治疗或预防自身免疫性疾病和/或炎性疾病的TNF-α结合多肽，以及IL-7R结合多肽；和用于治疗或预防自身免疫性疾病和/或炎性疾病的IL-7R结合多肽，以及TNF-α结合多肽。

特异性TNF-α结合多肽和本文公开的一些数据也公开于PCT申请号WO/2016/156465(通过引用以其整体并入本文中，特别是就该申请涉及TNF-α结合多肽ID-38F而言)。

附图说明

图1-V7R-2E9和ID-A40U在胃肠道提取物中的存活％

图2-ID-A62U和ID-A41U在人粪便上清液中的存活％

图3-UC活检组织中组合的ID-38F和ID-A62U对磷酸化的影响(磷蛋白p38α至Lck)

图4-UC活检组织中组合的ID-38F和ID-A62U对磷酸化的影响(磷蛋白STAT5a至hsp60)

图5-在用单独和联合药剂治疗后，对来自患者的活检组织UC2747、UC2748、UC2749和UC2750测量的总磷酸化强度值

图6-在使用单独和联合药剂(IL-1β和IL-6)治疗后，对来自所有患者的活检组织测量的平均细胞因子产生

图7-在使用单独和联合药剂(IL-8和TNF-α)治疗后，对来自所有患者的活检组织测量的平均细胞因子产生

图8-在使用单独和联合药剂(IL-17A和IL-10)治疗后，对来自所有患者的活检组织测量的平均细胞因子产生

图9-在胰蛋白酶处理前后，对从双头构建体FU3K释放的ID-38F和ID-A62U的SDSPAGE分析

图10-在胰蛋白酶处理前后通过使用IL-7/IL-7R ELISA的FU3K和ID-A62U效力

图11-在胰蛋白酶处理前后通过使用生物素化Humira竞争ELISA的FU3K和ID-38F效力

图12-(a)ID-A62U、(b)ID-38F、(c)ID-A62U和ID-38F从FU3K释放后和(d)ID-A41U在人粪便上清液中的存活％

序列说明

SEQ ID NO：1-ID-38F的CDR1多肽序列

SEQ ID NO：2-ID-38F的CDR2多肽序列

SEQ ID NO：3-ID-38F的CDR3多肽序列

SEQ ID NO：4-ID-38F的FR1多肽序列

SEQ ID NO：5-ID-38F的FR2多肽序列

SEQ ID NO：6-ID-38F的FR3多肽序列

SEQ ID NO：7-ID-38F的FR4多肽序列

SEQ ID NO：8-ID-38F的多肽序列

SEQ ID NO：9-ID-A62U的CDR1多肽序列

SEQ ID NO：1O-ID-A62U的CDR2多肽序列

SEQ ID NO：11-ID-A62U的CDR3多肽序列

SEQ ID NO：12-ID-A62U的FR1多肽序列

SEQ ID NO：13-ID-A62U的FR2多肽序列

SEQ ID NO：14-ID-A62U的FR3多肽序列

SEQ ID NO：15-ID-A62U的FR4多肽序列

SEQ ID NO：16-ID-A62U的多肽序列

SEQ ID NO：17-编码ID-38F的多核苷酸序列(包括两个终止密码子1

SEQ ID NO：18-编码ID-A62U的多核苷酸序列(包括两个终止密码子)

SEQ ID NO：19-肠激酶切割位点的多肽序列

SEQ ID NO：20-包含肠激酶切割位点的多肽序列

SEQ ID NO：21-FU3K中使用的特异性不稳定接头的多肽序列

SEQ ID NO：22-L-TSLP的多肽序列

SEQ ID NO：23-S-TSLP的多肽序列

SEQ ID NO：24-ID-A40U的多肽序列

SEQ ID NO：25-V7R-2E9的多肽序列

SEQ ID NO：26-FU3K双头的多肽序列

SEQ ID NO：27-编码FU3K双头的多核苷酸序列

SEQ ID NO：28-在SEQ ID NO：9的残基1处具有任选的保守性置换的CDR1的多肽序列

SEQ ID NO：29-在SEQ ID NO：10的残基2、3、7、12和16处具有任选的保守性置换的CDR2的多肽序列

SEQ ID NO：30-在SEQ ID NO：11的残基3和9处具有任选的保守性置换的CDR3的多肽序列

SEQ ID NO：31-非蛋白酶不稳定的肽接头形式的多肽序列

SEQ ID NO：32-对胰蛋白酶不稳定的肽接头形式的多肽序列

SEQ ID NO：33-对胰蛋白酶不稳定的肽接头形式的多肽序列

SEQ ID NO：34-对第二胰蛋白酶不稳定的肽接头形式的多肽序列

SEQ ID NO：35-对示例胰蛋白酶不稳定的肽接头的多肽序列

SEQ ID NO：36-对示例胰蛋白酶不稳定的肽接头的多肽序列

SEQ ID NO：37-对示例胰蛋白酶不稳定的肽接头的多肽序列

SEQ ID NO：38-对示例胰蛋白酶不稳定的肽接头的多肽序列

SEQ ID NO：39-对示例胰蛋白酶不稳定的肽接头的多肽序列

SEQ ID NO：40-对示例胰蛋白酶不稳定的肽接头的多肽序列

SEQ ID NO：41-对示例胰蛋白酶不稳定的肽接头的多肽序列

SEQ ID NO：42-对第三胰蛋白酶不稳定的肽接头形式的多肽序列

SEQ ID NO：43-对胰凝乳蛋白酶不稳定的肽接头形式的多肽序列

具体实施方式

包含免疫球蛋白链可变结构域(ICVD)诸如VH和VHH的多肽诸如抗体和抗体片段

多肽是由在链中键合在一起的多个氨基酸残基组成的有机聚合物。如本文所用，‘多肽’与‘蛋白质’和‘肽’可互换使用。当多肽含有形成结合位点而能够以一定亲和力(合适地表达为Kd值、Ka值、k_on速率和/或k_off速率，如本文进一步描述)与靶上的表位结合的氨基酸残基的一个或多个区段时，将多肽称为结合多肽。

结合多肽包括诸如以下的多肽：DARPins(Binz等人2003)、Affimers^TM(Johnson等人2012)、Fynomers^TM(Grabulovski等人2007)、Centyrins(Goldberg等人2016)、Affitins(例如，

Krehenbrink等人2008)、环肽、抗体和抗体片段。结合多肽还包括诸如以下的多肽：亲合体(Affibody)(Nygren 2008)、Affilins(Ebersbach等人2007)、Alphabodies(Desmet等人2014)、Anticalins(Skerra等人2008)、高亲和性多聚体(Avimer)(Silverman等人2005)、Kunitz结构域肽(Nixon和Wood 2006)、Monobodies(Koide和Koide2007)、nanoCLAMP(Suderman等人20171、Adnectins (Lipovsek 2011)和双环肽。

常规抗体或免疫球蛋白(Ig)是包含四个多肽链的蛋白质：两个重(H)链和两个轻(L)链。每个链被分为恒定区和可变结构域。重链可变结构域在本文中缩写为VHC，并且轻(L)链可变结构域在本文中缩写为VLC。这些结构域、与其相关的结构域和由其衍生的结构域在本文中被称为免疫球蛋白链可变结构域(‘ICVD’)。

VHC和VLC结构域可以进一步细分为具有高变异性的区域，称为“互补决定区”(“CDR”)，散布有更保守的区域，称为“框架区”(“FR”)。已经准确定义了框架区和互补决定区(Kabat等人1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版U.S.Department pf Health and Human Services，NIH Publication Number 91-3242，通过引用以其整体并入本文中)。在常规抗体中，每个VHC和VLC由三个CDR和四个FR构成，按照以下顺序从氨基末端到羧基末端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。两个免疫球蛋白重链和两个免疫球蛋白轻链的常规抗体四聚体形成有通过例如二硫键互连的免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链，并且重链类似地连接。重链恒定区包含三个结构域，CH1、CH2和CH3。轻链恒定区包含一个结构域，CL。

重链的可变结构域和轻链的可变结构域是与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区通常介导抗体与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)或经典补体系统的第一组分(C1q)。术语抗体包括IgA、IgG、IgE、IgD、IgM型(以及其亚型)的免疫球蛋白，其中免疫球蛋白的轻链可以是κ类型或λ类型。由两个相同重(H)链和两个相同轻(L)链多肽组装的免疫球蛋白-γ(IgG)抗体的总体结构在哺乳动物中良好确定并且是高度保守的(Padlan 1994 Mol Immunol 31：169-217)。

常规抗体结构的一个例外存在于骆驼科的血清中。除常规抗体以外，这些血清拥有特别IgG抗体。这些IgG抗体(被称为重链抗体(HCAb))缺乏L链多肽并且缺少第一恒定结构域(CH1)。在其N末端区域中，同二聚体蛋白的H链含有专用免疫球蛋白链可变结构域(被称为VHH)，其用于与其同源抗原缔合(Muyldermans等人2013，Hamers-Casterman等人1993，Muyldermans等人1994，通过引用以其整体并入本文中)。

如本文所用，抗体片段是指抗体的与靶特异性结合的部分(例如，其中一个或多个免疫球蛋白链不是全长但是与靶特异性结合的分子)。涵盖在术语抗体片段(或“抗原结合片段”)内的结合片段的实例包括：

(i)Fab片段(由VLC、VHC、CL和CH1结构域组成的单价片段)；

(ii)F(ab')2片段(包含在铰链区通过二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段)；

(iii)Fd片段(由VHC和CH1结构域组成)；

(iv)Fv片段(由抗体的单臂的VLC和VHC结构域组成)；

(v)scFv片段(由使用重组方法通过合成接头接合的VLC和VHC结构域组成，所述合成接头使得所述结构域能够被制成单一蛋白质链，其中VLC和VHC区配对以形成单价分子)；

(vi)VH(由来自常规4链免疫球蛋白的VHC结构域组成的免疫球蛋白链可变结构域(Ward等人1989)；

(vii)VL(由VLC结构域组成的免疫球蛋白链可变结构域)；

(viii)V-NAR(由来自软骨鱼纲(chondrichthyes)IgNAR的VHC结构域组成的免疫球蛋白链可变结构域(Roux等人1998和Griffiths等人2013，通过引用以其整体并入本文中)

(ix)VHH。

VHH或VH中的氨基酸残基的总数可以在11O-140的区域内，更合适地是110-120。

本文提供的示例涉及包含与TNF-α结合的免疫球蛋白链可变结构域和与IL-7R结合的免疫球蛋白链可变结构域的组合物。然而，本文公开的本发明的原理同样适用于包含与TNF-α结合的多肽和与IL-7R结合的多肽(如抗体和抗体片段)的任何组合物。例如，免疫球蛋白链可变结构域可以被掺入多肽诸如全长抗体中。这种方法由McCoy等人2014证明，其提供构造为与人Fc区(包含铰链、CH2和CH3结构域)的融合体的抗HIV VHH，作为二聚体构建体表达。

合适地，本发明的多肽包含免疫球蛋白链可变结构域。更合适地，本发明的多肽由免疫球蛋白链可变结构域组成。合适地，本发明的多肽是抗体或抗体片段。更合适地，本发明的多肽是抗体片段。合适地，抗体片段是VHH、VH、VL、V-NAR、scFv、Fab片段或F(ab')2片段。合适地，抗体片段是免疫球蛋白链可变结构域(例如VHH、VH或VL)。合适地，抗体片段是免疫球蛋白重链可变结构域。更合适地，抗体片段是VHH或VH，最合适地是VHH。

特异性、亲和力、亲合力、效力、抑制和中和

特异性是指特定结合多肽可以与其结合的不同靶(例如抗原或抗原决定簇)的数目。结合多肽的特异性是结合多肽将特定靶识别为独特分子实体并且将其彼此区分的能力。

由靶从结合多肽解离的平衡常数(Kd)表示的亲和力是靶与结合多肽上的结合位点之间的结合强度的量度：Kd的值越小，靶与结合多肽之间的结合强度就越强(可替代地，亲和力还可以表达为亲和力常数(Ka)，其是1/Kd)。亲和力可以根据目标特异性抗原通过已知方法确定。合适地，亲和力是使用动态可切换生物表面(例如，

参见Knezevic等人2012)或通过表面等离子体共振来确定。

亲合力是结合多肽与相关靶之间的结合强度的量度。亲合力与在靶与其在结合多肽上的结合位点之间的亲和力和结合多肽上存在的相关结合位点的数目两者相关。

任何小于10^-6M的Kd值都被认为是结合。结合多肽与靶(例如抗原或抗原决定簇)的特异性结合可以以任何合适的已知方式测定，包括例如Scatchard分析和/或竞争性结合测定，例如放射免疫测定(RIA)、酶免疫测定(EIA)和夹心竞争测定，以及本领域已知的其不同变型。

功效是以产生给定强度的效果所需的量表达的治疗剂(例如结合多肽)的活性的量度。与在低浓度下引起更小应答的更低功效的剂相比，高功效剂在低浓度下引起更大的应答。功效随着亲和力和有效性而改变。有效性是指治疗剂在结合至靶时产生生物应答的能力和此应答的定量数级。术语半数最大有效浓度(EC50)是指在指定暴露时间之后引起在基线与最大之间一半的应答的治疗剂的浓度。治疗剂可引起抑制(可具体称为半数最大抑制浓度，“IC50”)或刺激。EC50和IC50是常用的，并在本文中用作效力的量度。对于TNF-α结合多肽和IL-7R结合多肽，EC50和IC50在本文中可互换使用，因为这两种结合多肽均导致对靶的抑制。

适用于确定TNF-α结合多肽和IL-7R结合多肽的效力的特定测定分别在以下标题“TNF-α结合多肽”和“IL-7R结合多肽”下详述。

多肽和多核苷酸序列

出于比较两个紧密相关的多肽序列的目的，第一多肽序列与第二多肽序列之间的“序列同一性％”可以使用多肽序列的标准设定使用NCBI BLAST v2.0(BLASTP)计算。出于比较两个紧密相关的多核苷酸序列的目的，第一核苷酸序列与第二核苷酸序列之间的“序列同一性％”可以使用核苷酸序列的标准设定使用NCBI BLAST v2.0(BLASTN)计算。

如果多肽或多核苷酸序列与其他多肽或多核苷酸序列的整个长度共享100％序列同一性，则称它们为相同的或等同的。序列中的残基从左向右，即从多肽的N末端至C末端；从多核苷酸的5’末端至3’末端编号。

序列之间的“差异”是指与第一序列相比在第二序列的一个位置中单个氨基酸残基的插入、缺失或置换。两个多肽序列可以含有一个、两个或更多个此类氨基酸差异。在其他方面与第一序列相同(100％序列同一性)的第二序列中的插入、缺失或置换导致序列同一性％降低。例如，如果相同序列的长度是9个氨基酸残基，则第二序列中的一个置换产生88.9％的序列同一性。如果相同序列的长度是17个氨基酸残基，则第二序列中的两个置换产生88.2％的序列同一性。如果相同序列的长度是7个氨基酸残基，则第二序列中的三个置换产生57.1％的序列同一性。如果第一多肽序列和第二多肽序列的长度是9个氨基酸残基并且共享6个相同的残基，则第一多肽序列和第二多肽序列共享大于66％的同一性(第一多肽序列和第二多肽序列共享66.7％的同一性)。如果第一多肽序列和第二多肽序列的长度是17个氨基酸残基并且共享16个相同的残基，则第一多肽序列和第二多肽序列共享大于94％的同一性(第一多肽序列和第二多肽序列共享94.1％的同一性)。如果第一多肽序列和第二多肽序列的长度是7个氨基酸残基并且共享3个相同的残基，则第一多肽序列和第二多肽序列共享大于42％的同一性(第一多肽序列和第二多肽序列共享42.9％的同一性)。

可替代地，出于将第一参考多肽序列与第二比较多肽序列进行比较的目的，可以确定对第一序列进行添加、置换和/或缺失以产生第二序列的数目。添加是将一个氨基酸残基添加到第一多肽的序列中(包括在第一多肽的任一末端处添加)。置换是用一个不同的氨基酸残基替换第一多肽的序列中的一个氨基酸残基。缺失是将来自第一多肽的序列的一个氨基酸残基缺失(包括在第一多肽的任一末端处缺失)。

“保守性”氨基酸置换是其中氨基酸残基被类似化学结构的另一个氨基酸残基替代并且预期对于多肽的功能、活性或其他生物特性具有微小影响的氨基酸置换。此类保守性置换合适地是其中以下组内的一个氨基酸被来自相同组内的另一个氨基酸残基替代的置换：

合适地，疏水性氨基酸残基是非极性氨基酸。更合适地，疏水性氨基酸残基选自V、I、L、M、F、W或C。

如本文所用，多肽序列的编号以及CDR和FR的定义如根据Kabat系统(Kabat等人1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版U.S.Department ofHealth and Human Services.NIH Publication Number 91-3242，通过引用以其整体并入本文中)定义。第一多肽序列与第二多肽序列之间的“对应”氨基酸残基是根据Kabat系统与第二序列中的氨基酸残基共享相同位置的第一序列中的氨基酸残基，同时第二序列中的氨基酸残基与第一序列中的氨基酸残基的身份可以不同。合适地，如果框架和CDR根据Kabat定义是相同长度，则对应残基将共享相同的编号(和字母)。比对可以手动实现或通过使用标准设定使用例如序列比对的已知计算机算法诸如NCBI BLAST v2.0(BLASTP或BLASTN)来实现。

Kabat编号系统在下文应用于本文提供的实施例中使用的特定TNF-α结合多肽和IL-7R结合多肽。

以上ID-38F图中带有前缀“H”的编号是Kabat编号，而氨基酸序列上方的编号是从N末端到C末端连续的氨基酸编号。每个CDR或FR的残基也可以从该CDR或FR的N末端到C末端进行编号。

ID-38F由SEQ ID NO：17的多核苷酸序列编码。ID-A62U由SEQ ID NO：18的多核苷酸序列编码。合适地，本发明中使用的多核苷酸是分离的。“分离”的多核苷酸是从其原始环境除去的多核苷酸。例如，如果将天然存在的多核苷酸与自然系统中共存的材料中的一些或全部分开，则所述多核苷酸是分离的。如果例如多核苷酸被克隆到不是其自然环境的部分的载体中或者如果它被包含在cDNA内，则所述多核苷酸被认为是分离的。

TNF-α结合多肽

功能特性

抗TNF-α多肽、与TNF-α相互作用的多肽或对抗TNF-α的多肽均有效地是TNF-α结合多肽。TNF-α结合多肽可以与TNF-α上的线性或构象表位结合。合适地，TNF-α结合多肽与人TNF-α结合。

合适地，TNF-α结合多肽以10^-6M或更小，更合适地10^-7M或更小，更合适地10^-8M或更小，更合适地10^-9M或更小的平衡解离常数(Kd)与TNF-α结合。

合适地，TNF-α结合多肽的亲和力通过使用动态可切换的生物表面(例如，

参见Knezevic等人2012)来确定。

在一个实施方案中，TNF-α结合多肽的亲和力在25℃通过以下来建立：将TNF-α结合多肽在其C末端融合到单链DNA并将DNA-多肽融合物偶联到金电极(包被在单链DNA的荧光标记的互补链中)，然后将芯片结合的TNF-α结合多肽暴露于10kHz电流和50pM至4.5nM的五种不同浓度的人TNF-α600秒并通过时间分辨荧光来观察解离8小时。

合适地，TNF-α结合多肽中和TNF-α。TNF-α中和多肽是通过例如抑制TNF-α的生物效应来保护细胞免受TNF-α效应的多肽。通常，抗TNF-α治疗性抗体产品已使用具有细胞死亡终点的L929鼠细胞系作为中和测定(Humphreys和Wilson 1999)。可以进行L929测定以通过确定TNF-α结合多肽的半数最大有效浓度(EC50)来测定TNF-α结合多肽中和TNF-α细胞毒性效应的能力。下面提供了L929测定的详细方案。

L929测定

将L929细胞(10000个细胞/孔)在可溶性TNF-α(500pg/ml)和放线菌素(O.75ug/mL)存在下与纯化多肽的稀释液一起培养24小时。在实验结束时，通过使用刃天青来测定细胞毒性。测试对小鼠L929细胞的可溶性人TNF诱导的细胞毒性的抑制以确定与人TNF-α结合的每种多肽的TNF-α中和活性。

材料

-L929细胞(10000个细胞/孔)

-无菌聚丙烯96孔板

-DMEM

-人TNF-α浓度：500pg/ml

-放线菌素D浓度：0.75ug/mL

-纯化的测试多肽

-纯化的多肽的稀释范围(例如)：300nM-5pM(1∶3稀释)

-人TNF-α剂量反应曲线：10ng/mL-0.5pg/mL

孵育时间：22h

-刃天青细胞生存力试剂

方法

在第0天将100ul中的10000个细胞/孔接种在96孔微孔板中的DMEM完全培养基中，并在37摄氏度和5％CO₂储存过夜。在第1天，从300nM的最高浓度开始，为每个纯化的可变结构域设置系列稀释度1∶3(在DMEM+Act.D+TNF中)(体积足以使每个点重复三次)。

向板中添加了以下对照：

1.DMEM完全+0.75ug/mL放线菌素D

2.DMEM完全+0.75ug/mL放线菌素D+0.5ng/mL h-TNF-α

3.DMEM完全+0.01％Triton(仅在含有TNF-α剂量反应的板中)

4.DMEM完全(仅在含有TNF-α剂量反应的板中)

从微孔板的每个孔中除去培养基，并将细胞与100ul的每种多肽稀释液或100ul的不同对照一起孵育。在37摄氏度和5％CO₂孵育22小时后，将10ul刃天青添加到每个孔中，并将细胞在37摄氏度下孵育2小时。随后将50ul的3％SDS添加到每个孔中。然后使用荧光板读数器Ex544nm/Em590nm来读取板。

合适地，TNF-α结合多肽在L929测定中中和人TNF-α细胞毒性，EC50为100nM或更小，例如50nM或更小，例如10nM或更小，例如5mM或更小，例如1nM或更小，例如0.9nM或更小，例如0.8nM或更小，例如0.7nM或更小，例如0.6nM或更小，例如0.5nM或更小，例如0.4nM或更小，例如0.3nM或更小，例如0.2nM或更小，例如0.15nM或更小。

TNF-α结合多肽的中和能力也可以通过ELISA确定。合适地，TNF-α结合多肽在ELISA测定中抑制人TNF-α与TNFR1的结合，EC50为30nM或更小，更合适地10nM或更小，更合适地3nM或更小，更合适地1nM或更小，更合适地0.6nM或更小，更合适地0.5nM或更小，更合适地0.4nM或更小。

可替代地或附加地，TNF-α结合多肽在ELISA测定中抑制人TNF-α与TNFR2的结合，EC50为2nM或更小，更合适地1nM或更小，更合适地0.9nM或更小，更合适地0.8nM或更小，更合适地0.7nM或更小，更合适地0.6nM或更小，更合适地0.5nM或更小，更合适地0.4nM或更小。

合适地，ELISA如WO2018/060453的实施例2中所述进行。

在一个实施方案中，TNF-α结合多肽的亲和力通过直接涂覆在Biacore(或等效物)传感器板上来确定，其中多肽流过板以检测结合。合适地，Biacore T200板在25℃下在30ul/min下在HBS-EP+(GE Healthcare)运行缓冲液中使用。

结构特性

合适地，TNF-α结合多肽是包含抗体片段的多肽。多肽可以是抗体。合适地，抗体片段选自：V-NAR、scFv、Fab片段、F(ab’)2片段或免疫球蛋白链可变结构域，例如VL、VHH和VH。更合适地，抗体片段是免疫球蛋白链可变结构域，更合适地是VHH或VH，最合适地是VHH。

合适地，TNF-α结合多肽包含三个CDR(CDR1、CDR2和CDR3)。

合适地，TNF-α结合多肽的CDR1包含以下或更合适地由以下组成：与SEQ ID NO：1具有20％或更大、更合适地40％或更大、更合适地60％或更大、更合适地80％或更大的序列同一性的序列。

可替代地，TNF-α结合多肽的CDR1包含以下或更合适地由以下组成：与SEQ ID NO：1相比具有不超过3个、更合适地不超过2个、更合适地不超过1个添加、置换和/或缺失的序列。

合适地，TNF-α结合多肽的CDR1中的与它们在SEQ ID NO：1中的相应残基不同的任何残基相对于它们的相应残基而言是保守性置换。合适地，CDR1包含SEQ ID NO：1或更合适地由SEQ ID NO：1组成。

合适地，TNF-α结合多肽的CDR2包含以下或更合适地由以下组成：与SEQ ID NO：2具有20％或更大、更合适地30％或更大、更合适地40％或更大、更合适地50％或更大、更合适地55％或更大、更合适地60％或更大、更合适地70％或更大、更合适地75％或更大、更合适地80％或更大、更合适地85％或更大、更合适地90％或更大的序列同一性的序列。

可替代地，TNF-α结合多肽的CDR2包含以下序列或更合适地由其组成：具有与SEQID NO：2相比不超过8个、更合适地不超过7个、更合适地不超过6个、更合适地不超过5个、更合适地不超过4个、更合适地不超过3个、更合适地不超过2个、更合适地不超过1个添加、置换和/或缺失的序列。

合适地，TNF-α结合多肽的CDR2的与其在SEQ ID NO：2中的对应残基不同的任何残基是相对于其对应残基的保守性置换。合适地，TNF-α结合多肽的CDR2的与SEQ ID NO：2的残基编号10对应的残基是R、H、D、E、N、Q、S、T、Y、G、A、V、L、W、P、M、C、F或I(最适合地是H)。合适地，TNF-α结合多肽的CDR2包含SEQ ID NO：2或更合适地由SEQ ID NO：2组成。

合适地，TNF-α结合多肽的CDR3包含以下或更合适地由以下组成：与SEQ ID NO：3具有30％、更合适地50％、更合适地60％、更合适地80％或更大的序列同一性的序列。

可替代地，TNF-α结合多肽的CDR3包含以下或更合适地由以下组成：与SEQ ID NO：3相比具有不超过3个、更合适地不超过2个、更合适地不超过1个添加、置换和/或缺失的序列。

合适地，TNF-α结合多肽的CDR3中的与它们在SEQ ID NO：3中的相应残基不同的任何残基相对于它们的相应残基而言是保守性置换。合适地，TNF-α结合多肽的CDR3的与SEQID NO：3的残基编号3对应的残基是R、H、D、E、N、O、S、T、Y、G、A、V、L、W、P、M、C、F或I；或合适地是R、H、D、E、N、O、S、T、Y、G、V、L、W、P、M、C、F或I(最合适地是H)。合适地，TNF-α结合多肽的CDR3的与SEQ ID NO：3的残基编号3对应的残基是H并且TNF-α结合多肽的CDR3中的与它们在SEQ ID NO：3中的相应残基不同的任何其他残基相对于它们的相应残基而言是保守性置换。合适地，TNF-α结合多肽的CDR3包含SEQ ID NO：3或更合适地由SEQ ID NO：3组成。

可替代地，TNF-α结合多肽的CDR3包含以下或更合适地由以下组成：与SEQ ID NO：3具有30％，例如50％，例如60％，例如80％或更大的序列同一性的序列，并且CDR3的残基编号3是R、D、N、C、E、Q、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V(合适地是H或H的保守性置换；更合适地是H)。可替代地，CDR3的残基编号3是H或H的保守性置换(最合适地是H)，并且CDR3的与它们在SEQ ID NO：3中的相应残基不同的任何其他残基是保守性置换。

合适地，TNF-α结合多肽的CDR1的残基1是S、V或N；残基2至4是HWM，残基5是Y或C。合适地，TNF-α结合多肽的CDR2的残基1至9是EINTNGLIT；残基10是H、K、S或N；残基11是Y，残基12是G、V、I或A；残基13是D；残基14是S或F；残基15是V或T；残基16是H、K、R或G并且残基17是G。合适地，TNF-α结合多肽的CDR3的残基1是N；残基2是Q或E；残基3是H、K、M或R，残基4至6是GLN。

合适地，TNF-α结合多肽包含三个CDR(CDR1、CDR2和CDR3)和四个框架区(FR1-FR4)。

合适地，TNF-α结合多肽的FR1包含以下序列或更合适地由其组成：与SEQ ID NO：4共享5％、12％、18％、26％、32％、38％、46％、52％、58％、62％、66％、68％、72％、75％、78％、82％、85％、90％、95％或更大的序列同一性的序列。

合适地，TNF-α结合多肽的FR1中的与它们在SEQ ID NO：4中的相应残基不同的任何残基相对于它们的相应残基而言是保守性置换。合适地，TNF-α结合多肽的FR1的与SEQID NO：4的残基编号1对应的残基是G、A、V、L、I、F、P、S、T、Y、C、M、K、R、H、W、D、E或N(更合适地是D或E，最合适地是D)。合适地，TNF-α结合多肽的FR1的与SEQ ID NO：4的残基编号5对应的残基是G、A、V、L、I、F、P、S、T、Y、C、M、K、R、H、W、D、E或N(合适地是V)。合适地，TNF-α结合多肽的FR1的与SEQ ID NO：4的残基编号1至5对应的残基是DVQLV。合适地，TNF-α结合多肽的FR1的与SEQ ID NO：4的残基编号20和/或24对应的残基是疏水的氨基酸(最合适地分别是L或A)。合适地，TNF-α结合多肽的FR1的与SEQ ID NO：4的残基编号29对应的残基是F。合适地，TNF-α结合多肽的FR1包含SEQ ID NO：4或更合适地由SEQ ID NO：4组成。

合适地，TNF-α结合多肽的FR2包含以下或更合适地由以下组成：与SEQ ID NO：5具有10％、15％、25％、30％、40％、45％、55％、60％、70％、75％、85％或90％或更大的序列同一性的序列。

合适地，TNF-α结合多肽的FR2中的与它们在SEQ ID NO：5中的相应残基不同的任何残基相对于它们的相应残基而言是保守性置换。合适地，TNF-α结合多肽的FR2的与SEQID NO：5的残基编号8至11对应的残基是KEXE，其中X是R或L。可替代地，TNF-α结合多肽的FR2的与SEQ ID NO：5的残基编号9至12对应的残基是GLEW。合适地，TNF-α结合多肽的FR2包含SEQ ID NO：5或更合适地由SEQ ID NO：5组成。

合适地，TNF-α结合多肽的FR3包含以下或更合适地由以下组成：与SEQ ID NO：6具有8％、15％、20％、26％、32％、40％、45％、52％、58％、65％、70％、76％、80％、82％、85％、90％、92％或95％或更大的序列同一性的序列。

合适地，TNF-α结合多肽的FR3的与SEQ ID NO：6的残基编号26对应的残基是疏水的氨基酸(合适地是A)。合适地，TNF-α结合多肽的FR3中的与它们在SEQ ID NO：6中的相应残基不同的任何残基相对于它们的相应残基而言是保守性置换。合适地，TNF-α结合多肽的FR3包含SEQ ID NO：6或更合适地由SEQ ID NO：6组成。

合适地，TNF-α结合多肽的FR4包含以下或更合适地由以下组成：与SEQ ID NO：7具有5％、1O％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％或更大的序列同一性的序列。

合适地，TNF-α结合多肽的FR4中的与它们在SEQ ID NO：7中的相应残基不同的任何残基相对于它们的相应残基而言是保守性置换。合适地，TNF-α结合多肽的FR4包含SEQID NO：7或更合适地由SEQ ID NO：7组成。

合适地，TNF-α结合多肽包含以下或更合适地由以下组成：与SEQ ID NO：8具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或更大的序列同一性的序列。合适地，TNF-α结合多肽的N末端是D。合适地，TNF-α结合多肽包含SEQID NO：8或更合适地由SEQ ID NO：8组成。

根据一个具体实施方案，TNF-α结合多肽具有与天然存在的多肽的氨基酸序列不完全相同(即具有100％序列同一性)的氨基酸序列。

IL-7R结合多肽

功能特性

抗IL-7R多肽、与IL-7R相互作用的多肽或对抗IL-7R的多肽均有效地是IL-7R结合多肽。IL-7R结合多肽可以与IL-7R上的线性或构象表位结合。优选地，IL-7R结合多肽与IL-7Rα结合。

合适地，IL-7R结合多肽将与人IL-7R结合。合适地，IL-7R结合多肽与可溶性和膜结合性IL-7R结合。

合适地，本发明的多肽将中和IL-7和/或结合L-TSLP的人IL-7R。

合适地，本发明的多肽中和人IL-7和/或人L-TSLP与人IL-7R的结合。更合适地，本发明的多肽中和人IL-7和/或人L-TSLP与人和至少一种额外的灵长类动物IL-7R两者的结合，所述IL-7R选自：狒狒IL-7R、狨猴IL-7R、食蟹猴IL-7R和恒河猴IL-7R。最合适地，本发明的多肽中和人IL-7和人L-TSLP与人IL-7R的结合。

合适地，IL-7R结合多肽针对IL-7R上的表位，该表位位于和/或形成IL-7R的(一个或多个)IL-7结合位点的部分，从而所述多肽在与IL-7R结合时，导致抑制或减少由IL-7R介导的信号传导。

IL-7R结合多肽是用于本发明目的的中和多肽，前提是该多肽与IL-7R(合适地IL-7Rα)结合，抑制IL-7R与IL-7和/或L-TSLP的结合，如通过ELISA测量。下文实施例1详述了适用于确定本文中抑制水平的特异性ELISA方法。

合适地，IL-7R结合多肽中和与IL-7结合的IL-7R，EC50为2.00nM或更小，例如1.50nM或更小，例如1.00nM或更小，例如0.90nM或更小，例如0.80nM或更小，例如0.70nM或更小，例如0.65nM或更小，例如0.60nM或更小，例如0.55nM或更小，例如0.50nM或更小，例如0.45nM或更小，例如0.4nM或更小，例如0.35nM或更小，例如0.30nM或更小。合适地，通过使用下文实施例1中详述的IL-7/IL-7R中和ELISA来确定EC50。

合适地，IL-7R结合多肽中和在人淋巴细胞中IL-7R依赖性、IL-7诱导的STAT5磷酸化，EC50为100nM或更小，例如50nM或更小，例如25nM或更小，例如10nM或更小，例如8nM或更小，例如6nM或更小，例如5nM或更小，例如4nM或更小，例如3nM或更小，例如2nM或更小，例如1.5nM或更小，例如1nM或更小。合适地，通过使用下文实施例1中详述的IL-7诱导的STAT5磷酸化测定来确定EC50。

合适地，IL-7R结合多肽的亲和力由表面等离子共振来确定。

合适地，IL-7R结合多肽以10^-7M或更小，更合适地10^-8M或更小，更合适地10^-9M或更小，更合适地10^-10M或更小的平衡解离常数(Kd)与IL-7R结合。

在一个实施方案中，IL-7R结合多肽的亲和力通过直接涂覆在Biacore(或等效物)传感器板上来确定，其中多肽流过板以检测结合。合适地，Biacore T200板在25℃下在30ul/min下在HBS-EP+(GE Healthcare)运行缓冲液中使用。

结构特性

合适地，IL-7R结合多肽是包含抗体片段的多肽。多肽可以是抗体。合适地，抗体片段选自：V-NAR、scFv、Fab片段、F(ab’)2片段或免疫球蛋白链可变结构域，例如VL、VHH和VH。更合适地，抗体片段是免疫球蛋白链可变结构域，更合适地是VHH或VH，最合适地是VHH。

合适地，IL-7R结合多肽包含三个CDR(CDR1、CDR2和CDR3)。

合适地，IL-7R结合多肽的CDR1包含以下或更合适地由以下组成：与SEQ ID NO：9具有20％、40％、60％或80％或更大的序列同一性的序列。

可替代地，IL-7R结合多肽的多肽的CDR1包含以下或更合适地由以下组成：与SEQID NO：9相比具有不超过4个、更合适地不超过3个、更合适地不超过2个、更合适地不超过1个添加、置换和/或缺失的序列。

合适地，IL-7R结合多肽的CDR1中的与它们在SEQ ID NO：9中的相应残基不同的任何残基相对于它们的相应残基而言是保守性置换。合适地，IL-7R结合多肽的CDR1包含SEQID NO：9或更合适地由SEQ ID NO：9组成。

合适地，CDR1的残基具有以下特性(SEQ ID NO：28)：

1	2	3	4	5
					S/D	D	A	M	G

更合适地，CDR1包含SEQ ID NO：9或更合适地由SEQ ID NO：9组成。

合适地，IL-7R结合多肽的CDR2包含以下或更合适地由以下组成：与SEQ ID NO：10具有20％或更大、更合适地30％或更大、更合适地40％或更大、更合适地50％或更大、更合适地55％或更大、更合适地60％或更大、更合适地65％或更大、更合适地70％或更大、更合适地75％或更大、更合适地80％或更大、更合适地85％或更大、更合适地90％或更大的序列同一性的序列。

可替代地，IL-7R结合多肽的CDR2包含以下或更合适地由以下组成：与SEQ ID NO：10相比具有不超过8、更合适地不超过7、更合适地不超过6、更合适地不超过5、更合适地不超过4、更合适地不超过3、更合适地不超过2、更合适地不超过1个添加、置换和/或缺失的序列。

合适地，IL-7R结合多肽的CDR2中的与它们在SEQ ID NO：10中的相应残基不同的任何残基相对于它们的相应残基而言是保守性置换。合适地，IL-7R结合多肽的CDR2包含SEQ ID NO：10或更合适地由SEQ ID NO：10组成。

合适地，CDR2的残基具有以下特性(SEQ ID NO：29)：

1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14	15	16	17
																	A	I/T	G/N	W	S	G	A/T	V	T	H	Y	S/G	D	S	V	Q/K	G

合适地，CDR2的与SEQ ID NO：10的残基编号16对应的残基是Q或K，最合适地是K。合适地，CDR2包含SEQ ID NO：10或由其组成。更合适地，CDR2包含SEQ ID NO：10或更合适地由SEQ ID NO：10组成。

合适地，IL-7R结合多肽的CDR3包含以下或更合适地由以下组成：与SEQ ID NO：11具有20％或更大、更合适地30％或更大、更合适地40％或更大、更合适地50％或更大、更合适地55％或更大、更合适地60％或更大、更合适地65％或更大、更合适地70％或更大、更合适地75％或更大、更合适地80％或更大、更合适地85％或更大、更合适地90％或更大的序列同一性的序列。

可替代地，IL-7R结合多肽的CDR3包含以下或更合适地由以下组成：与SEQ ID NO：11相比具有不超过6、更合适地不超过5、更合适地不超过4、更合适地不超过3、更合适地不超过2、更合适地不超过1个添加、置换和/或缺失的序列。

合适地，IL-7R结合多肽的CDR3中的与它们在SEQ ID NO：11中的相应残基不同的任何残基相对于它们的相应残基而言是保守性置换。

合适地，CDR3的残基具有以下特性(SEQ ID NO：30)：

1	2	3	4	5	6	7	8	9
									D	Y	D/V	T	D	V	W	Q	Y/H

合适地，IL-7R结合多肽的CDR3包含SEQ ID NO：11或更合适地由SEQ ID NO：11组成。

合适地，IL-7R结合多肽包含三个CDR(CDR1、CDR2和CDR3)和四个框架区(FR1-FR4)。

合适地，IL-7R结合多肽的FR1包含以下序列或更合适地由其组成：与SEQ ID NO：12共享5％、12％、18％、26％、32％、38％、46％、52％、58％、62％、66％、68％、72％、75％、78％、82％、85％、90％、95％或更大的序列同一性的序列。

合适地，FR1的与其在SEQ ID NO：12中的对应残基不同的任何残基相对于它们的对应残基而言是保守性置换。合适地，FR1的与SEQ ID NO：12的残基编号1对应的残基是D或E，最合适地是D。合适地，FR1的与SEQ ID NO：12的残基编号1至5对应的残基是DVQLV。合适地，FR1包含SEQ ID NO：12或更合适地由SEQ ID NO：12组成。合适地，FR1的与SEQ ID NO：12的残基编号24对应的残基是S。

合适地，IL-7R结合多肽的FR2包含以下或更合适地由以下组成：与SEQ ID NO：13具有10％、15％、25％、30％、40％、45％、55％、60％、70％、75％、85％或90％或更大的序列同一性的序列。

合适地，FR2的与其在SEQ ID NO：13中的对应残基不同的任何残基相对于它们的对应残基而言是保守性置换。合适地，FR2的与SEQ ID NO：13的残基编号10对应的残基是R或L，更合适地是L。合适地，FR2的与SEQ ID NO：13的残基编号8至11对应的残基是KEXE，其中X是R或L，更合适地是L。可替代地，FR2的与SEQ ID NO：13的残基编号9至12对应的残基是GLEW。合适地，FR2包含SEQ ID NO：13或更合适地由SEQ ID NO：13组成。合适地，FR2的与SEQID NO：13的残基编号2对应的残基是F，更合适地，此外，FR2的与SEQ ID NO：13的残基编号14对应的残基是A。合适地，FR2的与SEQ ID NO：13的残基9-14对应的残基是ELEFLA(SEQ IDNO：79)。合适地，FR2的与SEQ ID NO：13的残基9-14对应的残基不是GLEWVS(SEQ ID NO：80)。合适地，FR2的与SEQ ID NO：13的残基编号9对应的残基不是G。更合适地，FR2的与SEQID NO：13的残基编号9对应的残基是E。

合适地，IL-7R结合多肽的FR3包含以下或更合适地由以下组成：与SEQ ID NO：14具有8％、15％、20％、26％、32％、40％、45％、52％、58％、65％、70％、76％、80％、82％、85％、90％、92％或95％或更大的序列同一性的序列。

合适地，FR3的与其在SEQ ID NO：14中的对应残基不同的任何残基相对于它们的对应残基而言是保守性置换。合适地，FR3包含SEQ ID NO：14或更合适地由SEQ ID NO：14组成。合适地，FR3的与SEQ ID NO：14的残基编号18、19和20对应的残基是NSL。合适地，FR3的与SEQ ID NO：14的残基编号21对应的残基是R。合适地，FR3的与SEQ ID NO：14的残基编号22对应的残基是A。

合适地，IL-7R结合多肽的FR4包含以下或更合适地由以下组成：与SEQ ID NO：15具有5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％或更大的序列同一性的序列。

合适地，IL-7R结合多肽的FR4中的与它们在SEQ ID NO：15中的相应残基不同的任何残基相对于它们的相应残基而言是保守性置换。合适地，IL-7R结合多肽的FR4包含SEQID NO：15或更合适地由SEQ ID NO：15组成。

合适地，IL-7R结合多肽包含以下或更合适地由以下组成：与SEQ ID NO：16具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或更大的序列同一性的序列。

合适地，IL-7R结合多肽包含SEQ ID NO：16或更合适地由SEQ ID NO：16组成。

根据一个具体实施方案，IL-7R结合多肽具有与天然存在的多肽的氨基酸序列不完全相同(即具有100％序列同一性)的氨基酸序列。

TNF-α结合多肽和IL-7R结合多肽的特定组合的结构和功能特烂

合适地，TNF-α结合多肽和IL-7R结合多肽都是免疫球蛋白链可变结构域，其中：

(a)TNF-α结合多肽的CDR1包含与SEQ ID NO：1具有40％或更大序列同一性的序列；

(b)TNF-α结合多肽的CDR2包含与SEQ ID NO：2具有40％或更大序列同一性的序列；

(c)TNF-α结合多肽的CDR3包含与SEQ ID NO：3具有50％或更大序列同一性的序列；

(d)IL-7R结合多肽的CDR1包含与SEQ ID NO：9具有40％或更大序列同一性的序列；

(e)IL-7R结合多肽的CDR2包含与SEQ ID NO：10具有40％或更大序列同一性的序列；

(f)IL-7R结合多肽的CDR3包含与SEQ ID NO：11具有50％或更大序列同一性的序列，

更合适地，其中：

(a)TNF-α结合多肽的CDR1包含与SEQ ID NO：1具有60％或更大序列同一性的序列；

(b)TNF-α结合多肽的CDR2包含与SEQ ID NO：2具有50％或更大序列同一性的序列；

(c)TNF-α结合多肽的CDR3包含与SEQ ID NO：3具有60％或更大序列同一性的序列；

(d)IL-7R结合多肽的CDR1包含与SEQ ID NO：9具有60％或更大序列同一性的序列；

(e)IL-7R结合多肽的CDR2包含与SEQ ID NO：10具有50％或更大序列同一性的序列；

(f)IL-7R结合多肽的CDR3包含与SEQ ID NO：11具有60％或更大序列同一性的序列，

更合适地，其中：

(b)TNF-α结合多肽的CDR2包含与SEQ ID NO：2具有70％或更大序列同一性的序列；

(c)TNF-α结合多肽的CDR3包含与SEQ ID NO：3具有65％或更大序列同一性的序列；

(e)IL-7R结合多肽的CDR2包含与SEQ ID NO：10具有70％或更大序列同一性的序列；

(f)IL-7R结合多肽的CDR3包含与SEQ ID NO：11具有65％或更大序列同一性的序列，

更合适地，其中：

(a)TNF-α结合多肽的CDR1包含与SEQ ID NO：1具有80％或更大序列同一性的序列；

(b)TNF-α结合多肽的CDR2包含与SEQ ID NO：2具有85％或更大序列同一性的序列；

(c)TNF-α结合多肽的CDR3包含与SEQ ID NO：3具有80％或更大序列同一性的序列；

(d)IL-7R结合多肽的CDR1包含与SEQ ID NO：9具有80％或更大序列同一性的序列；

(e)IL-7R结合多肽的CDR2包含与SEQ ID NO：1O具有85％或更大序列同一性的序列；

(f)IL-7R结合多肽的CDR3包含与SEQ ID NO：11具有80％或更大序列同一性的序列，

以及在每种情况下，其中最合适地，TNF-α结合多肽在L929测定中以100nM或更低的EC50中和人TNF-α细胞毒性，并且IL-7R结合多肽以100nM或更低的EC50中和在人淋巴细胞中IL-7R依赖性的、IL-7诱导的STAT5磷酸化；和/或其中TNF-α结合多肽以10^-7M或更小的Kd与TNF-α结合，并且IL-7R结合多肽以10^-7M或更小的Kd与IL-7R结合。最合适地，上述多肽以双头构建体形式提供，用于通过口服施用来治疗克罗恩病或溃疡性结肠炎。

合适地，TNF-α结合多肽和IL-7R结合多肽均是相同类型的免疫球蛋白链可变结构域，例如VH、VHH或VL，更合适地是VH或VHH。

TNF-α结合多肽和IL-7R结合多肽的形式

TNF-α结合多肽和IL-7R结合多肽可以连接或不连接。

在一个实施方案中，TNF-α结合多肽和IL-7R结合多肽可以彼此独立地存在于本发明的组合物中(即TNF-α结合多肽和IL-7R结合多肽不相互连接)。在一个具体实施方案中，该组合物包含(a)ID-38F(SEQ ID NO：8)或与其具有至少75％、更合适地至少85％同一性的多肽，和(b)ID-A62U(SEQ ID NO：16)或与其具有至少75％、更合适地至少85％同一性的多肽。

在进一步的实施方案中，包含在本发明的组合物中的TNF-α结合多肽和IL-7R结合多肽彼此连接(从而形成单一构建体)。这种形式对于重组表达目的可能是方便的。因此，本发明的这种构建体是多聚体和多价的。如果构建体中不包含另外的多肽，那么这种构建体可以称为“异双头”。多价构建体包含两种或更多种结合多肽，因此提供了两个或更多个位点，在这些位点上可以发生与抗原的连接(适合地在切割不稳定肽接头之前或之后，前提是这样的接头存在于构建体中-参见下面的“接头”)。

合适地，构建体中的每种多肽的分子量不大于300kDa，例如250kDa、例如200kDa、例如180kDa、例如160kDa、例如140kDa、例如120kDa、例如100kDa、例如80kDa、例如60kDa、例如40kDa、例如30kDa、例如20kDa、例如15kDa。

接头

TNF-α结合多肽和IL-7R结合多肽，如果连接的话，可以直接(即不使用接头)或通过接头而彼此连接。合适地使用接头。接头可以是对蛋白酶不稳定的接头或非蛋白酶不稳定接头。接头合适地是肽，合适地选择以允许多肽与其表位结合。合适地，接头是柔性的，例如足够柔性以允许两种结合多肽同时结合它们的靶。如果用于治疗目的，则接头在被施用多肽的受试者中合适地是非免疫原性的。合适地，多肽和接头被表达为单个邻接多肽构建体。

合适地，肽接头的长度为至少5个，例如至少7个，例如至少10个，例如至少13个，例如至少16个，例如至少19个，例如至少20个，例如至少21个残基。合适地，肽接头的长度不大于40，例如不大于35，例如不大于30，例如不大于25个残基。

合适地，肽接头由选自以下列表中的任何氨基酸组成：精氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。脯氨酸可能是包含在接头中的次优氨基酸，因此肽接头更合适地由选自以下列表中的任何氨基酸组成：精氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。

TNF-α结合多肽和IL-7R结合多肽，如果连接，可以(从N末端到C末端1是抗TNF-α-接头-抗IL-7R的取向或可以是抗IL-7R-接头-抗TNF-α的取向。最合适地，它们的取向是抗TNF-α-接头-抗IL-7R。

包含通过肽接头而连接的TNF-α结合多肽和IL-7R结合多肽的本发明组合物可以例如通过使用核酸合成技术制备编码这两种结合多肽和肽接头的核酸，然后表达由此获得的核酸来获得(如下文“制备方法”标题下进一步详述)。

非蛋白酶不稳定接头

合适地，非蛋白酶不稳定接头是肽并且不包含蛋白酶的切割位点。

合适地，非蛋白酶不稳定接头具有形式-(G_aS_b)_x-其中a是1到10，b是1到5，和x是1至15(SEQ ID NO：31)。更合适地，a是1至5，b是1至2且x是1至10。更合适地a是4，b是1并且x是1至8(SEQ ID NO：32)。

对蛋白酶不稳定的接头

对蛋白酶不稳定的接头比非蛋白酶不稳定接头更合适，因为对蛋白酶不稳定的接头允许释放组成单体并在切割时与其靶自由结合。对蛋白酶不稳定的接头(或“不稳定肽接头”)是肽并且包含至少一个蛋白酶切割位点。在本发明的构建体中包括对蛋白酶不稳定的接头允许例如方便地产生异双头形式的构建体，然后在施用后将其切割成单独的结合多肽。

在本发明的一个实施方案中，不稳定肽接头可以被工程化为其在所需程度上抵抗蛋白酶切割和/或仅在暴露于肠道的特定区域时才被切割。例如，如果在宿主例如酵母中重组产生构建体，则由酵母产生的胰蛋白酶样蛋白酶可以切割重组构建体产物。这可能导致难以纯化并引起监管、临床和商业上的复杂化。

这可以通过将屏蔽残基掺入在(一个或多个)不稳定位点侧翼的不稳定肽接头中来实现。屏蔽残基位于不稳定肽接头的(一个或多个)不稳定位点侧翼并降低其不稳定性。也可以通过将(一个或多个)不稳定位点定位在更接近不稳定肽接头或位于不稳定肽接头的外围来增加切割抗性。这个概念被称为“受保护的不稳定位点”并提供受控的不稳定性。

可替代地，不稳定肽接头可以被工程化为其对肠道蛋白酶的切割高度不稳定，从而在口服施用后从构建体中快速释放组成多肽。这通过将一个或多个不稳定位点掺入到不稳定肽接头中以使该不稳定位点暴露于蛋白水解来实现，例如通过将(一个或多个)不稳定位点基本上定位在不稳定肽接头的中心和/或使不稳定位点基本上不被侧翼残基屏蔽。这个概念被称为“未被屏蔽的不稳定位点”。

预期将P残基掺入本发明构建体的不稳定肽接头中紧接R或K残基之后将基本上防止对不稳定肽接头的切割。合适地，不稳定肽接头不包含任何P残基。

对胰蛋白酶不稳定的位点

合适地，不稳定肽接头包含胰蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶的切割位点。合适地，不稳定肽接头包含至少1个，例如至少2个，例如至少3个，例如至少4个，例如至少5个，例如至少6个，例如至少7个，例如至少8个，例如至少9个，例如至少1O个K残基。合适地，不稳定肽接头包含至少1个，例如至少2个，例如至少3个，例如至少4个，例如至少5个，例如至少6个，例如至少7个，例如至少8个，例如至少9个，例如至少1O个R残基。优选地，切割位点是一个或多个K残基。

合适地，对蛋白酶不稳定的接头包含以下或更合适地由以下组成：形式[-(G_aS_b)_v-(G_cS_d)_w-B_t-(G_eS_f)_x-(G_gS_h)_y]_z，其中B是赖氨酸或精氨酸；t是1至5；a、c、e和g各自独立地是0至10；b、d、f和h各自独立地是0至5；v、w、x和y各自独立地是0至10，且z是1至5(SEQ ID NO：33)。更合适地，B是赖氨酸或精氨酸；t是1至2；a、c、e和g各自独立地是1至5；b、d、f和h各自独立地是1至3；v、w、x和y各自独立地是1至3，且z是1至3，更合适地B是赖氨酸或精氨酸；t是1；a、c、e和g各自独立地是2至4；b、d、f和h各自独立地是1至2；v、w、x和y各自独立地是1至2，并且z是1。

这种形式的特别有利的接头选自-(G₄S)_x-K-(G₄S)_y-，其中x和y各自独立地是1至5(SEQ ID NO：34)，更合适地是-(G₄S)₂-K-(G₄S)₂-(即-GGGGSGGGGSKGGGGSGGGGS-(SEQ IDNO：21)。

合适地，不稳定肽接头包含以下或更合适地由以下组成：-B-(G_aS)_x-B’-形式的多肽序列

其中

a是1至10：

x是1至10：

B是K或R并且

B’是K或R(SEQ ID NO：35)。

在一个实施方案中，a是2至5，更合适地a为4。在进一步的实施方案中，x是1至5。更合适地，x是2。B可能存在或不存在。B’可能存在或不存在。合适地，B是K。合适地，B’是K。

这种形式的特别有利的接头选自-K-(G₄S)₂-K-(SEQ ID NO：36)、-(G₄S)₂-K-(SEQID NO：37)、-K-(G₄S)₂-(SEQ ID NO：38)、-R-(G₄S)₂-R-(SEQ ID NO：39)、-(G₄S)₂-R-(SEQ IDNO：40)和-R-(G₄S)₂-(SEQ ID NO：41)的列表中之一。

合适地，不稳定肽接头包含以下或更合适地由以下组成：-B-(G_aS)_x-B’-(G_bS)_y-B"-形式的多肽序列

其中

a是1至10：

b是1至10：

x是1至10：

y是1至10：

B是K或R：

B’是K或R并且

B″是K或R(SEQ ID NO：42)。

在一个实施方案中，a是2至5，更合适地a是4。在一个实施方案中，b是2至5，更合适地b是4。在进一步的实施方案中，x是1至5。更合适地，x是2。在进一步的实施方案中，y是1至5。更合适地，y是2。合适地，B是K。合适地，B’是K。合适地，B″是K。

对胰凝乳蛋白酶不稳定的位点

可替代地或除对胰蛋白酶不稳定的位点之外，构建体的不稳定肽接头还可包含胰凝乳蛋白酶或胰凝乳蛋白酶样蛋白酶的切割位点。合适地，不稳定肽接头包含至少1个，例如至少2个，例如至少3个，例如至少4个，例如至少5个，例如至少6个，例如至少7个，例如至少8个，例如至少9个，例如至少10个残基，所述残基选自W、F、Y、L和M的列表中；更合适地选自W、F和Y。合适地，不稳定肽接头由选自S、G、W、F、Y、L和M的列表(例如S、G、W、F和Y)中的残基组成。

合适地，对蛋白酶不稳定的接头包含以下或更合适地由以下组成：形式[-(G_aS_b)_v-(G_cS_d)_w-J_t-(G_eS_f)_x-(G_gS_h)_y]_z，其中J是W、F、Y、L或M；t是1至5；a、c、e和g各自独立地是0至10；b、d、f和h各自独立地是0至5；v、w、x和y各自独立地是0至10，且z是1至5(SEQ ID NO：43)。更合适地，J是W、F、Y、L或M；t是1至2；a、c、e和g各自独立地是1至5；b、d、f和h各自独立地是1至3；v、w、x和y各自独立地是1至3，且z是1至3，更合适地J是W、F、Y、L或M；t是1；a、c、e和g各自独立地是2至4；b、d、f和h各自独立地是1至2；v、w、x和y各自独立地是1至2，并且z是1。

对肠激酶不稳定的位点

可替代地或除对胰蛋白酶和/或胰凝乳蛋白酶不稳定的位点之外，构建体的不稳定肽接头还可包含肠激酶切割位点。合适地，不稳定肽接头包含序列DDDDK(SEQ ID NO：19)，例如包含-G₄S-DDDDK-G₄S-(SEQ ID NO：20)或由其组成的序列。

对MMP不稳定的位点

在一个实施方案中，构建体的不稳定肽接头可以包含MMP3、MMP10或MMP12的切割位点。

其他不稳定位点

在一个实施方案中，构建体的不稳定肽接头可以包含其他炎性或微生物蛋白酶的切割位点，其中切割位点是已知的。

构建体中多肽的稳定性

在其中构建体包含非蛋白酶不稳定接头的实施方案中，则合适地，构建体作为一个整体(即结合多肽(其可以是免疫球蛋白链可变结构域)和非蛋白酶不稳定接头)基本上对蛋白酶例如胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶具有抗性。在其中构建体包含对蛋白酶不稳定的接头的实施方案中，则合适地，多肽(即，结合多肽，其可以是免疫球蛋白链可变结构域)基本上对蛋白酶例如胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶具有抗性，但蛋白酶不稳定接头对蛋白酶例如胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶不稳定。

不稳定肽接头对表达宿主的稳定性

各种生物可用于表达重组多肽。常用的表达生物包括酵母、霉菌和哺乳动物细胞。然而，许多这些表达生物也产生蛋白酶，例如胰蛋白酶样蛋白酶，其可以切割表达的重组多肽。如果表达的多肽包含对存在于肠道中的一种或多种蛋白酶不稳定的肽接头，那么该肽接头也可能不合意地对由表达生物产生的蛋白酶不稳定，从而阻止完整多肽的有效表达。

不稳定肽接头对由用于产生构建体的重组宿主产生的酶基本上稳定是有利的。合适地，不稳定肽接头对由重组宿主产生的蛋白酶基本上具有抗性，所述重组宿主是例如细菌，例如大肠杆菌或例如属于曲霉属(Aspergillus)、酵母属(Saccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、汉逊酵母属(Hansenula)或毕赤酵母属(Pichia)的酵母或霉菌；例如酿酒酵母或巴斯德毕赤酵母。

合适地，重组宿主是酵母或霉菌。合适地，酵母属于酵母属、克鲁维酵母属、汉逊酵母属、毕赤酵母属、念珠菌属(Candida)或球拟酵母属(Torulopsis)。合适地，霉菌属于曲霉属、枝顶孢属(Acremonium)、链格孢属(Alternaria)、金孢属(Chrysosporium)、枝孢属(Cladosporium)、网柄菌属(Dictyostelium)、镰刀菌属(Fusarium)、毛霉属(Mucor)、青霉属(Penicillium)、根霉属(Rhizopus)、葡萄穗霉属(Stachybotrys)、木霉属(Trichoderma)和毛癣菌属(Trichophyton)。

胃肠道和消化酶

胃肠道(GIT)是器官系统，负责消耗和消化食物、吸收营养和排出废物。在人类和其他哺乳动物中，胃肠道由食道、胃、小肠(十二指肠、空肠和回肠)和大肠(盲肠、结肠、直肠和肛管)组成。各种病原体可能定殖并且各种疾病可能出现在GIT的不同区域。肠道(与胃肠道相对)由小肠和大肠组成。

胃肠道的不同部分各自含有消化酶的复杂混合物。蛋白酶通过使连接氨基酸残基的肽键分裂(蛋白水解)而参与将多肽链消化成较短的片段。一些使末端氨基酸从蛋白质链上脱离(外肽酶)，另一些则攻击蛋白质的内部肽键(内肽酶)。蛋白水解可能是高度混杂的，以至于广泛范围的蛋白质底物被水解。将肠道中大量摄入的多肽切割成更小的多肽片段的蛋白酶就是这种情况。

许多蛋白酶通常与底物上的单个氨基酸(不稳定位点)结合，因此仅对该残基具有特异性。存在于肠道中的蛋白酶包括胰蛋白酶、胰蛋白酶样蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胰凝乳蛋白酶样蛋白酶、羧肽酶、弹性蛋白酶、氨肽酶、羧肽酶和肠肽酶。胰蛋白酶样蛋白酶切割赖氨酸或精氨酸残基后的肽键。胰凝乳蛋白酶样蛋白酶切割疏水性残基(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、亮氨酸和蛋氨酸)后的肽键。特别是酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。

特别是在口服药物的情况下，可能希望结合多肽基本上对一种或多种(例如所有)肠道蛋白酶具有抗性，而不稳定肽接头(如果使用)对一种或多种(例如所有)肠道蛋白酶不稳定。

合适地，构建体中的多肽基本上对一种或多种蛋白酶具有抗性，并且合适地，不稳定肽接头(如果存在)对一种或多种蛋白酶不稳定，其中所述一种或多种蛋白酶存在于小肠或大肠中，更合适地存在于空肠、回肠和/或盲肠中。基本上抗性的多肽当暴露于一种或多种蛋白酶时基本上保留了中和能力和/或效力。

这样的蛋白酶包括来源于胃肠道共生微生物区系或病原性细菌的蛋白酶，例如其中蛋白酶是细胞膜附着的蛋白酶、分泌的蛋白酶以及在细胞裂解时释放的蛋白酶。这样的蛋白酶还可以包括IBD炎性蛋白酶，例如MMP3、MMP10和MMP12。合适地，一种或多种蛋白酶是丝氨酸蛋白酶。合适地，一种或多种蛋白酶选自肠肽酶、胰蛋白酶、胰蛋白酶样蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和胰凝乳蛋白酶样蛋白酶。

合适地，多肽当被口服递送时并在暴露于肠道之后(例如，在暴露于小肠和/或大肠的蛋白酶和/或IBD炎性蛋白酶之后)基本上保留了中和能力和/或效力。小肠和/或大肠的蛋白酶或在小肠和/或大肠中产生的蛋白酶包括来源于肠道共生微生物区系和/或病原性细菌的蛋白酶，例如其中蛋白酶是细胞膜附接的蛋白酶、排泄的蛋白酶和细胞裂解释放的蛋白酶)。最合适地，蛋白酶是胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶。

合适地，肠道是狗、猪、大鼠、豚鼠、仓鼠、兔、人、食蟹猴或小鼠。小肠合适地由十二指肠、空肠和回肠组成。大肠合适地由盲肠、结肠、直肠和肛管组成。

当合适地多肽或构建体的至少10％、更合适地20％、更合适地30％、更合适地40％、更合适地50％、更合适地60％、更合适地70％、更合适地80％、更合适地90％、更合适地95％、更合适地100％的原始中和能力在暴露于存在于小肠和/或大肠中的蛋白酶和/或IBD炎性蛋白酶后；在给定温度下暴露给定时间段后得以保留时，多肽基本上保留了中和能力。这个概念在本文中被称为“存活％”。

合适地，多肽在37摄氏度暴露于存在于小肠和/或大肠中的蛋白酶和/或IBD炎性蛋白酶例如高达至少2、更合适地高达至少3、更合适地高达至少4、更合适地高达至少5、更合适地高达至少5.5、更合适地高达至少6、更合适地高达至少12、更合适地高达至少14或更合适地高达至少16小时后基本上保留中和能力。

当合适地多肽或构建体的至少10％、更合适地至少20％、更合适地至少30％、更合适地至少40％、更合适地至少50％、更合适地至少60％、更合适地至少70％、更合适地至少80％、更合适地至少90％、更合适地至少95％、更合适地至少100％的原始中和能力在暴露于人粪便上清液或小鼠小肠液后；在给定温度下暴露给定时间段后得以保留时，多肽基本上保留中和能力。这个概念在本文中被称为“存活％”。

合适地，多肽在37摄氏度暴露于人粪便上清液或小鼠小肠液例如高达至少2、更合适地高达至少3、更合适地高达至少4、更合适地高达至少5、更合适地高达至少5.5、更合适地高达至少6、更合适地高达至少12、更合适地高达至少14或更合适地高达至少16小时后基本上保留中和能力。

自身免疫性疾病和/或炎性疾病

本发明提供的组合物和构建体尤其可用于预防或治疗自身免疫性疾病和/或炎性疾病。合适地，自身免疫性疾病和/或炎性疾病是炎性肠病和/或粘膜炎，最合适地是炎性肠病(例如克罗恩病、渍疡性结肠炎或检查点抑制剂诱导的结肠炎，最合适地是渍疡性结肠炎或克罗恩病)。

当免疫系统对正常身体组织有不良应答时，自身免疫性疾病发生。自身免疫性障碍可能导致对身体组织的损害、异常器官生长和/或器官功能的变化。所述障碍可能仅影响一个器官或组织类型或者可能影响多个器官和组织。通常被自身免疫性障碍影响的器官和组织包括血液成分诸如红细胞、血管、结缔组织、内分泌腺诸如甲状腺或胰腺、肌肉、关节和皮肤。炎性疾病是特征在于炎症的疾病。许多炎性疾病是自身免疫性疾病并且反之亦然。

GIT自身免疫性疾病和/或炎性疾病

影响儿童和成人的慢性炎性肠病(IBD)克罗恩病和渍疡性结肠炎是GIT(胃肠道)的自身免疫性疾病和炎性疾病的示例(Hendrickson等人2002，通过引用以其整体并入本文中)。渍疡性结肠炎被定义为其中炎性应答和形态变化保持局限于结肠的病状。95％的患者中涉及直肠。炎症在很大程度上限于粘膜并且包括渍疡、水肿和出血的可变严重性以及结肠长度的连续损害(Hendrickson等人2002，通过引用以其整体并入本文中)。渍疡性结肠炎通常表现为存在粪便中混合血液和粘液以及较低的腹部绞痛，其在排便期间最严重。在临床上，腹泻存在血液和粘膜将渍疡性结肠炎与不存在血液的肠易激综合征区分开。与渍疡性结肠炎不同，克罗恩病的呈现通常不明显，其导致晚期诊断。诸如损害的位置、程度和严重性的因素决定胃肠道症状的程度。具有回肠结肠损害的患者通常具有餐后腹痛以及右下腹压痛和偶发炎性肿块。与胃十二指肠克罗恩病相关联的症状包括早饱、恶心、呕吐、上腹部疼痛或吞咽困难。肛周疾病以及肛赘(anal tags)、深度肛裂和瘘是常见的(Hendrickson等人2002，通过引用以其整体并入本文中)。

GIT的其他疾病包括例如炎性疾病粘膜炎(适当的药物和辐射诱导的粘膜炎)，其中炎性损伤存在于粘膜中而破坏上皮紧密连接。在粘膜炎中，病损可能发生在从口腔到肛门的任何地方，对于口腔和食道病损，可以使用含有该组合物的漱口水或乳膏制剂。对于肛门和直肠病损，含有该组合物的栓剂、乳膏或泡沫剂将适合于局部应用。该组合物将通过在炎症部位吸收到血流中或通过淋巴清除和随后进入血流而从固有层或其他炎症部位中清除。因此，该组合物将通过血流到达肝脏，并通过肾脏中的肾小球过滤而被清除。因此，本发明的组合物将在疾病例如自身免疫性肝炎、II型糖尿病和肾小球肾炎中发挥治疗作用是有充分理由的。

合适地，本发明的组合物用于治疗或预防GIT的自身免疫性疾病和/或炎性疾病。

合适地，本发明的组合物用于治疗选自以下的GIT的自身免疫性疾病和/或炎性疾病：克罗恩病、渍疡性结肠炎、肠易激病、II型糖尿病、肾小球肾炎、自身免疫性肝炎、干燥综合征(Sjogren's syndrome)、乳糜泻和药物或辐射诱导的粘膜炎、食管炎和检查点抑制剂诱导的结肠炎(更合适地克罗恩病、渍疡性结肠炎或检查点抑制剂诱导的结肠炎，最合适地渍疡性结肠炎或克罗恩病)。

组合物的口服递送将理想地治疗其中TNF-α(或TNF-α受体)和/或IL-7R(或IL-7或L-TSLP)促成至少一部分病理学的炎性疾病，并且更合适地，其中免疫球蛋白链可变结构域可以进入这些细胞因子具有生物活性所在的组织中。

皮肤的自身免疫性疾病和/或炎性疾病

银屑病是使人衰弱的自身免疫性皮肤病。斑块状银屑病是该病最常见的形式，其特征是红色皮肤覆盖着银色鳞屑。从组织学上看，该情况是银屑病斑块内角质形成细胞的无序分化和过度增殖之一，伴有炎性细胞浸润(Ortonne，1999)。银屑病皮损是各种形状的炎性、红色、界限分明的斑块，具有特征性的银色光泽鳞屑。术语银屑病包括银屑病和银屑病的症状，包括红斑、皮肤增厚/升高和鳞屑。

用于治疗银屑病的生物剂包括抗TNF-α疗法(例如对抗TNF的单克隆抗体，例如阿达木单抗和英夫利昔单抗，或TNF-α受体融合蛋白，例如依那西普)、针对CD11a的人源化抗体(依法利珠单抗)或与CD2结合的药剂，例如阿法西普(alefacept)(从而阻断CD2 LFA3相互作用)。应该注意，并非此处列出的所有生物剂都已被批准用于治疗银屑病。

本发明的组合物可以被掺入乳膏/软膏或其他局部载剂中以施用至其中TNF-α(或TNF-α受体)和/或IL-7R(或IL-7或L-TSLP)促成这种病损的病理学的炎性皮损。

合适地，本发明的组合物用于治疗选自天疱疮、银屑病、湿疹和硬皮病中的皮肤自身免疫性疾病和/或炎性疾病。

在一个实施方案中，本发明的多肽或构建体用于合适地通过局部递送至和/或通过皮肤来治疗或预防特应性皮炎，合适地呈霜剂、纳米颗粒、软膏或水凝胶的形式。

治疗用途和递送

合适地，本发明的组合物用作药物，合适地通过口服施用，合适地用于治疗或预防GIT疾病和/或治疗或预防疾病例如自身免疫性疾病和/或炎性疾病，例如炎性肠病。合适地，本发明的构建体用作药物，合适地通过口服施用。本发明的组合物还可用于通过口服施用来治疗或预防其他医学病症，例如代谢紊乱，例如肥胖症。在一个实施方案中，本发明的组合物旨在在肠道中具有局部效应。在一个实施方案中，本发明的组合物不用于通过以治疗有效量递送到循环中来治疗或预防疾病。

在本发明的一个方面，提供了治疗自身免疫性疾病和/或炎性疾病的方法，所述方法包括向有需要的人施用治疗有效量的本发明组合物。合适地，自身免疫性疾病和/或炎性疾病是炎性肠病和/或粘膜炎。

抗TNF-α结合多肽和抗IL-7R结合多肽可以被共同配制在本发明的组合物中，或者可以被分别配制并分别、依次或同时施用。

TNF-α结合多肽和IL-7R结合多肽可以通过相同途径或不同途径被施用。例如，TNF-α结合多肽可以被口服施用，而IL-7R结合多肽可以被直肠施用。

在本发明的一个方面，提供了与IL-7R结合多肽一起用于治疗或预防自身免疫性疾病和/或炎性疾病的TNF-α结合多肽。在另一方面，提供了与TNF-α结合多肽一起用于治疗或预防自身免疫性疾病和/或炎性疾病的IL-7R结合多肽。

在本发明的另一方面，提供了治疗自身免疫性疾病和/或炎性疾病的方法，所述方法包括向有需要的人施用TNF-α结合多肽以及IL-7R结合多肽。还提供了治疗自身免疫性疾病和/或炎性疾病的方法，所述方法包括向有需要的人施用IL-7R结合多肽以及TNF-α结合多肽。

在本发明的另一方面，提供了组合物，其包含TNF-α结合多肽和IL-7R结合多肽，用于治疗或预防炎性肠病和/或粘膜炎。

在本发明的另一方面，提供了组合物，其包含TNF-α结合多肽和IL-7R结合多肽，用于治疗或预防炎性肠病和/或粘膜炎，其中所述组合物被口服施用。

在本发明的另一方面，提供了包含TNF-α结合多肽和IL-7R结合多肽的组合物在制备用于治疗或预防自身免疫性疾病和/或炎性疾病(合适地炎性肠病和/或粘膜炎)的药物中的用途。

在本发明的另一方面，提供了包含TNF-α结合多肽和IL-7R结合多肽的组合物在制备用于通过口服施用治疗或预防自身免疫性疾病和/或炎性疾病(合适地炎性肠病和/或粘膜炎)的药物中的用途。

在本发明的另一方面，提供了治疗或预防炎性肠病和/或粘膜炎的方法，所述方法包括向有需要的人施用包含TNF-α结合多肽和IL-7R结合多肽的组合物。

在本发明的另一方面，提供了治疗或预防炎性肠病和/或粘膜炎的方法，所述方法包括向有需要的人口服施用包含TNF-α结合多肽和IL-7R结合多肽的组合物。

在上述实施方案中，炎性疾病合适地是粘膜炎或食管炎，并且炎性肠病合适地是克罗恩病、渍疡性结肠炎或检查点抑制剂诱导的结肠炎，最合适地是渍疡性结肠炎或克罗恩病。此外，在上述实施方案中，TNF-α结合多肽合适地是包含抗体片段的多肽，和/或IL-7R结合多肽合适地是包含抗体片段的多肽。更合适地，TNF-α结合多肽和IL-7R结合多肽都是包含抗体片段的多肽。更合适地，两种多肽都是ICVD。

一种结合多肽与另一种结合多肽“一起”施用意味着每种结合多肽的治疗窗彼此重叠。这意味着，例如，治疗有效量的每种结合多肽同时存在于受试者体内。在一个具体实施方案中，治疗有效量的每种结合多肽同时存在于需要治疗的部位。

本发明的组合物的治疗有效量是在向受试者单剂或多剂施用时在显著程度上中和受试者中所选靶的生物效应的有效量。治疗有效量可以根据各种因素而变化，例如个体的疾病状态、年龄、性别以及体重，以及构建体在个体中引发希望的应答的能力。治疗有效量还是其中构建体的治疗有益的效应胜过其任何毒性或不利效应的量。本发明的组合物可以被掺入适合于向受试者口服施用的药物组合物中。

本发明的组合物可以被配制用于口服递送。本发明的组合物可以是各种形式。这些包括例如液体、半固体和固体剂型，例如液体溶液、分散液或悬浮液、片剂、丸剂和散剂。优选固体剂型。合适地，本发明的组合物以片剂的形式提供，更合适地以微型片剂的形式提供。合适地，本发明的构建体以片剂的形式提供，更合适地以微型片剂的形式提供，用于治疗渍疡性结肠炎或克罗恩病。更合适地，本发明的构建体以具有肠溶衣的用于口服施用的微型片剂形式提供。

为了治疗嗜酸细胞性食管炎，呈锭剂形式递送是特别优选的。为了治疗特应性皮炎，呈霜剂形式递送是特别优选的。

该组合物可以包含药学上可接受的赋形剂，并且可以合适地以可摄入的片剂、口含片、锭剂、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆、糯米纸囊剂(wafer)等形式使用。

通常，该组合物包含药学上可接受的赋形剂例如载剂以形成药物组合物。药学上可接受的载剂的实例包括水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、右旋糖、甘油、乙醇等及其组合中的一种或多种。药学上可接受的载剂还可以包含少量增强本发明的多肽或构建体的保存期或有效性的辅助物质，诸如湿润剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂。药物组合物可以包含抗粘剂、粘合剂、包衣、崩解剂、风味剂、着色剂、润滑剂、吸附剂、防腐剂、甜味剂、冻干赋形剂(包括冻干保护剂)或压缩助剂。合适地，本发明组合物中的多肽在被掺入药物组合物中之前被冻干。

本发明的组合物也可以提供有肠溶衣。肠溶衣是施加在口服药品上的聚合物阻隔物，其帮助防止多肽受胃的低pH的影响。用于肠溶衣的材料包括脂肪酸、蜡、虫胶、塑料和植物纤维。合适的肠溶衣组分包括丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸共聚物、醋酸琥珀酸纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、醋酸羟丙基甲基纤维素琥珀酸酯(醋酸琥珀羟丙甲纤维素)、聚醋酸乙烯邻苯二甲酸酯(PVAP)、甲基丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸共聚物、海藻酸钠和硬脂酸。合适的肠溶衣包括pH依赖性释放聚合物。这些是在胃中存在的高酸性pH下不可溶但是在较低酸性pH下快速溶解的聚合物。因此，合适地，肠溶衣在胃的酸性胃液(pH～3)中不溶解，但是在小肠中(pH高于6)或在结肠中(pH高于7.0)存在的较高pH环境中溶解。pH依赖性释放聚合物被选择成使得本发明的组合物大约在剂量到达肠道的目标区域的时间被释放。。

本发明的药物组合物可以在缓冲液中配制，以便在5-50g/l之间、或更合适地15-40g/l之间或更合适地25-30g/l之间的浓度下使组合物的pH稳定。合适的缓冲液组分的实例包括生理盐，诸如柠檬酸钠和/或柠檬酸。合适地，缓冲液含有100-200mM、更合适地125-175mM的生理盐，诸如氯化钠。合适地，缓冲液被选择成具有与组合物的pH或患者的生理pH接近的pKa。

药物组合物中多肽的示例性浓度的范围可以是约1mg/mL至约200mg/ml、或约50mg/mL至约200mg/mL、或约150mg/mL至约200mg/mL。

本发明的药物组合物的水性配制品可以在pH缓冲溶液中，例如在范围是约4.0至约7.0、或约5.0至约6.0、或可替代地约5.5的pH下制备。合适的缓冲液的实例包括磷酸、组氨酸、柠檬酸、琥珀酸、醋酸缓冲液和其他有机酸缓冲液。根据例如缓冲液和配制品的所需张力，缓冲液浓度可以是约1mM至约100mM、或约5mM至约50mM。

药物组合物的张力可以通过包含张力调节剂来改变。此类张力调节剂可以带电的或不带电的化学物质。典型的不带电的张力调节剂包括糖或糖醇或其他多元醇，优选地海藻糖、蔗糖、甘露醇、甘油、1，2-丙二醇、棉子糖、山梨醇或乳糖醇(尤其是海藻糖、甘露醇、甘油或1，2-丙二醇)。典型的带电的张力调节剂包括盐，诸如钠离子、钾离子或钙离子与氯离子、硫酸根离子、碳酸根离子、亚硫酸根离子、硝酸根离子、乳酸根离子、琥珀酸根离子、醋酸根离子或马来酸根离子的组合(尤其是氯化钠或硫酸钠)；或氨基酸诸如精氨酸或组氨酸。合适地，水性配制品是等渗，但是高渗或低渗溶液可以是合适的。术语“等渗”代表具有与它所比较的某一其他溶液相同的张力的溶液，诸如生理盐溶液或血清。张力剂可以以约5mM至约350mM的量，例如以1mM至500nM的量使用。合适地，至少一种等渗剂被包含在组合物中。

表面活性剂也可以添加到药物组合物中，以减少配制的构建体的聚集和/或使配制品中颗粒的形成最小化和/或减少吸附。示例性表面活性剂包括聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯(Tween)、聚氧乙烯烷基醚(Brij)、烷基苯基聚氧乙烯醚(Triton-X)、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物(泊洛沙姆，普朗尼克(Pluronic))和十二烷基硫酸钠(SDS)。合适的聚氧乙烯山梨醇酐-脂肪酸酯的实例是聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80。表面活性剂的示例性浓度的范围可以是约0.001％至约10％w/v。

还可以添加冻干保护剂，以便保护多肽在冷冻过程期间免受去稳定化条件的影响。例如，已知的冻干保护剂包括糖(包括葡萄糖、蔗糖、甘露糖和海藻糖)；多元醇(包括甘露醇、山梨醇和甘油)；以及氨基酸(包括丙氨酸、甘氨酸和谷氨酸)。可以包含约10mM至500mM的量的冻干保护剂。

用于施用本发明的药物组合物的剂量范围是产生所需治疗效果的那些剂量范围。所需的剂量范围取决于药物组合物或构建体的准确性质、肠道的目标区域、配制品的性质、患者的年龄、患者状况的性质、程度或严重性、禁忌症(如果有的话)以及主治医师的判断。这些剂量水平的变化可以使用标准经验惯例来调节以进行优化。

合适地，本发明的药物组合物的每日剂量的范围是50ng-50mg/kg体重，诸如50ug-40mg/kg体重，诸如5-30mg/kg体重。单位剂量可以从小于100mg变化，但是通常在250-2000mg/剂的区域内，其可以每日施用或更频繁地施用，例如2、3或4次/天或较低频次地施用，例如每两天一次或每周一次。

TNF-α结合多肽和IL-7R结合多肽当存在于本发明的组合物中并且当彼此不连接时，可以以TNF-α结合多肽比IL-7R结合多肽的摩尔比20∶1至1∶20，例如15∶1至1∶15，更合适地10∶1至1∶10，更合适地5∶1至1∶5，更合适地3∶1至1∶3，更合适地2∶1至1∶2，更合适地1.5∶1至1∶1.5，最合适地约1∶1存在。

疾病的治疗还包括治疗其恶化、改善其症状并且还包括治疗从疾病症状缓解的患者以防止疾病症状复发。

组合疗法

本发明的药物组合物还可以包含一种或多种活性剂(例如，适用于治疗疾病例如本文提及的那些疾病的活性剂)。在本发明的范围内的是，在用于治疗自身免疫性疾病和/或炎性疾病的治疗性方法中使用本发明的药物组合物作为治疗细菌性疾病、自身免疫性疾病和/或炎性疾病中通常使用的其他确定疗法的辅助或与其联合。

对于炎性肠病(诸如克罗恩病或渍疡性结肠炎)的治疗，可能的组合包括与例如选自包括以下的列表中的一种或多种活性剂的组合：5-氨基水杨酸或其前药(诸如柳氮磺胺吡啶、奥柳氮或bisalazide)；皮质类固醇(例如，泼尼松龙、甲基泼尼松龙或布地奈德)；免疫抑制剂(例如，环孢菌素、他克莫司、甲氨蝶呤、硫唑嘌呤或6-巯基嘌呤)；抗TNF-α抗体(例如，英夫利昔单抗、阿达木单抗、赛妥珠单抗或戈利木单抗)；抗IL12/IL23抗体(例如，优特克单抗(ustekinumab))；抗IL-23p19特异性抗体(例如布雷库单抗(brazikumab)、瑞莎珠单抗(risankizumab)或米吉珠单抗(mirikizumab))，抗IL6R抗体或小分子IL12/IL23抑制剂(例如，阿匹莫德)；抗抑瘤素M抗体，抗α-4-β-7抗体(例如，维多珠单抗)；MAdCAM-1阻断剂(例如，PF-00547659)；针对细胞粘附分子α-4-整联蛋白的抗体(例如，那他珠单抗)；针对IL2受体α亚基的抗体(例如，达利珠单抗或巴利昔单抗)；JAK1抑制剂(例如，非戈替尼或乌帕替尼)；JAK3抑制剂(例如，托法替尼或R348)；Syk抑制剂及其前药(例如，福坦替尼和R-406)；磷酸二酯酶-4抑制剂(例如，替托司特)；HMPL-004；益生菌；德沙拉秦(Dersalazine)；塞马莫德/CPSI-2364；以及蛋白激酶C抑制剂(例如，AEB-071)。最合适的组合剂是JAK1抑制剂(例如，非戈替尼或乌帕替尼)；JAK3抑制剂(例如，托法替尼或R348)、抗IL12/IL23抗体(例如，优特克单抗)；抗IL-23p19特异性抗体(例如布雷库单抗、瑞莎珠单抗或米吉珠单抗)或抗α-4-β-7抗体(例如维多珠单抗)。

因此，本发明的另一个方面提供了与一种或多种另外的活性剂(例如以上所述的一种或多种活性剂)组合的本发明的药物组合物。在本发明的另一个方面，药物组合物或构建体与选自以上列表中的至少一种活性剂依次地、同时地或单独地被施用。

类似地，本发明的另一个方面提供了一种组合产品，其包含：

(A)本发明的药物组合物；和

(B)一种或多种其他活性剂，

其中组分(A)和组分(B)中的每一种与药学上可接受的助剂、稀释剂或载剂混合配制。在本发明的此方面中，组合产物可以是单一(组合)配制品或组分试剂盒(kit-of-parts)。因此，本发明的此方面涵盖一种组合配制品，其包含与药学上可接受的助剂、稀释剂或载剂混合的本发明的药物组合物或构建体和另一种治疗剂。

本发明还涵盖一种组分试剂盒，其包括以下组分：

(i)与药学上可接受的助剂、稀释剂或载剂混合的本发明的药物组合物；和

(ii)包含与药学上可接受的助剂、稀释剂或载剂混合的一种或多种其他活性剂的配制品，所述组分(i)和(ii)各自呈适合于彼此组合施用的形式提供。

因此，组分试剂盒的组分(i)是与药学上可接受的助剂、稀释剂或载剂混合的以上组分(A)。类似地，组分(ii)是与药学上可接受的助剂、稀释剂或载剂混合的以上组分(B)。一种或多种其他活性剂(即，以上组分(B))可以是以上关于细菌感染例如难辨梭状芽孢杆菌(Clostridium difficile)感染、自身免疫性疾病和/或炎性疾病诸如IBD(例如，克罗恩病和/或渍疡性结肠炎)的治疗提及的剂中的任一种。如果组分(B)是多于一种另外的活性剂，这些另外的活性剂可以被彼此配制或与组分(A)一起配制或者它们可以被单独配制。在一个实施方案中，组分(B)是一种其他治疗剂。在另一个实施方案中，组分(B)是两种其他治疗剂。本发明的此方面的组合产物(组合制剂或组分试剂盒)可以用于自身免疫性疾病(例如，本文提及的自身免疫性疾病)的治疗或预防。

载体和宿主

如本文所用，术语“载体”意图是指能够转运其所连接的另一核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，所述质粒是指可以将另外的DNA区段连接到其中的环状双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中另外的DNA区段可以连接到病毒基因组中。某些载体能够在它们被引入到其中的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和游离型哺乳动物和酵母载体)。其他载体(例如，非游离型哺乳动物载体)可以在引入到宿主细胞中之时被整合到宿主细胞的基因组中，并且因此与宿主基因组一起复制。另外，某些载体能够指导与其可操作连接的基因的表达。此类载体在本文中被称为“重组表达载体”(或者简单地，“表达载体”)。通常，在重组DNA技术中有用的表达载体通常呈质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是最常使用的载体形式。然而，本发明旨在包括此类其他形式的表达载体，诸如病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)，它们具有相同的功能，以及噬菌体和噬菌粒系统。本发明还涉及核苷酸序列，其编码本发明组合物中的多肽。如本文所用，术语“重组宿主细胞”(或简单地“宿主细胞”)意图是指已经将重组表达载体引入其中的细胞。此类术语不仅意图是指特定的受试者细胞，而且是指这种细胞的后代。

在本发明的一个方面，提供了包含编码本发明的构建体的多核苷酸的载体或包含所述多核苷酸的cDNA。在本发明的另一方面，提供了用所述载体转化的宿主细胞，其能够表达本发明的构建体。合适地，宿主细胞是酵母，例如属于曲霉属、酵母属、克鲁维酵母属、汉逊酵母属或毕赤酵母属的酵母，例如酿酒酵母、大肠杆菌或巴斯德毕赤酵母。

制备方法

可以使用例如Green和Sambrook 2012中公开的技术来获得和操作包含多肽的多肽和构建体。

单克隆抗体可以使用杂交瘤技术，通过将产生特异性抗体的B细胞与由于其在组织培养物中生长的能力并且不存在抗体链合成而被选择的骨髓瘤(B细胞癌)细胞融合来产生(

等人，1975和Nelson等人，2000，通过引用以其整体并入本文中)。

针对确定的抗原的单克隆抗体可以例如通过以下获得：

a)将从先前用确定的抗原免疫化的动物的外周血获得的淋巴细胞用永生细胞并且优选用骨髓瘤细胞永生化，以便形成杂交瘤，

b)培养形成的永生化细胞(杂交瘤)并且回收产生具有所需特异性的抗体的细胞。

可替代地，不需要使用杂交瘤细胞。因此，单克隆抗体可以通过包括以下步骤的方法获得：

a)将从动物的淋巴细胞、尤其是外周血淋巴细胞(合适地，先前用确定的抗原免疫化)获得的DNA或cDNA序列克隆到载体中，尤其是克隆到噬菌体中并且更特别地丝状噬菌体中，

b)在允许产生抗体的条件下用以上载体转化原核细胞，

c)通过将它们经受抗原-亲和力选择来选择抗体，

d)回收具有所需特异性的抗体。

用于对骆驼进行免疫化、克隆在血液中循环的B细胞的VHH库(Chomezynnski等人，1987)并且使用噬菌体、酵母或核糖体展示从免疫(Arbabi-Ghahroudi等人1997)和非免疫(Tanha等人2002)文库中分离抗原特异性VHH的方法是已知的(WO92/01047，Nguyen等人2001和Harmsen等人2007)。这些参考文献通过引用以其整体并入本文中。

可以分离抗体片段诸如scFv和Fv片段并在大肠杆菌中表达(Miethe等人2013，Skerra等人1988和Ward等人1989，通过引用以其整体并入本文中)。

可以对编码多肽的DNA或cDNA进行突变，其对于多肽的氨基酸序列是沉默的，但是对特定宿主中的翻译提供优选密码子。用于核酸在例如大肠杆菌、巴斯德毕赤酵母和酿酒酵母中的翻译的优选密码子是已知的。

多肽的突变可以例如通过对编码多肽的核酸进行置换、添加或缺失来实现。对编码多肽的核酸进行的置换、添加或缺失可以通过许多方法来引入，包括例如易错PCR、混编、寡核苷酸定向诱变、组装PCR、PCR诱变、体内诱变、盒式诱变、递归系综诱变(recursiveensemble mutagenesis)、指数系综诱变(exponential ensemble mutagenesis)、位点特异性诱变(Ling等人1997，通过引用以其整体并入本文中)、基因重组装、基因位点饱和诱变(GSSM)、合成连接重组装(SLR)或这些方法的组合。对核酸进行的修饰、添加或缺失也可以通过包括以下的方法引入：重组、递归序列重组、硫代磷酸酯修饰的DNA诱变、含有尿嘧啶的模板诱变、缺口二重诱变(gapped duplex mutagenesis)、点错配修复诱变(pointmismatch repair mutagenesis)、修复-缺陷型宿主菌株诱变、化学诱变、放射诱变、缺失诱变、限制-选择诱变、限制-纯化诱变、系综诱变、嵌合核酸多聚体产生或其组合。

具体地，可以使用人工基因合成(Nambiar等人1984，Sakamar等人，1988，Wells等人1985和Grundstrom等人1985，通过引用以其整体并入本文中)。编码多肽的基因可以通过例如固相DNA合成来合成产生。整个基因可以从头合成而不需要前体模板DNA。为了获得所需的寡核苷酸，将构建嵌段按产物序列所需的顺序依次偶联至生长寡核苷酸链。在完成链组装时，将产物从固相释放至溶液，脱保护并收集。产物可以通过高效液相色谱法(HPLC)分离以获得所需的高纯度寡核苷酸(Verma等人，1998)

免疫球蛋白链可变结构域诸如VH和VHH的表达可以使用合适的表达载体诸如原核细胞诸如细菌，例如大肠杆菌来实现(例如根据WO94/04678中公开的方案，所述文献以引用的方式并入本文中并且在下文进一步详细描述)。免疫球蛋白链可变结构域诸如VH和VHH的表达也可以使用真核细胞例如昆虫细胞、CHO细胞、Vero细胞或合适地酵母细胞，诸如属于曲霉属、酵母属、克鲁维酵母属、汉森酵母属或毕赤酵母属的酵母来实现。合适地，使用酿酒酵母(例如，根据WO94/025591中公开的方案，所述文献以引用的方式并入本文中并且在下文进一步详细描述)。

具体地，VHH可以根据WO94/04678中公开的方法使用大肠杆菌，通过包括以下步骤的方法来制备：

a)在Bluescript载体(Agilent Technologies)中克隆编码VHH的DNA或cDNA序列(例如从骆驼的淋巴细胞获得或合成产生)，任选地包含His-标签，

b)在使用对于含有XhoI位点的VHH具有特异性的5’引物和含有具有以下序列的SpeI位点的3’引物扩增之后回收克隆的片段，

TC TTA ACT AGT GAG GAG ACG GTG ACC TG(SEQ ID NO：13)，

c)在用XhoI和SpeI限制性酶消化载体之后在Immuno PBS载体中克隆在相中回收的片段(Huse等人1989，通过引用以其整体并入本文中)，

d)用步骤c的重组Immuno PBS载体通过转染而转化宿主细胞，尤其是大肠杆菌，

e)例如通过亲和力纯化，诸如通过在使用蛋白质A、阳离子交换或镍-亲和力树脂(如果VHH包含His-标签)的柱上进行色谱法来回收VHH编码序列的表达产物。

可替代地，免疫球蛋白链可变结构域诸如VH和VHH可通过包括以下步骤的方法来获得：

a)获得编码具有确定的特异性抗原结合位点的VHH的DNA或cDNA序列，

b)使用含有起始密码子和Hindlll位点的5’引物和含有终止密码子的具有XhoI位点的3’引物来扩增获得的DNA或cDNA，

c)将扩增的DNA或cDNA重组到质粒pMM984的Hindlll(位置2650)和XhoI(位置4067)位点中(Merchlinsky等人1983，通过引用以其整体并入本文中)，

d)用重组质粒来转染允许细胞，尤其是NB-E细胞(Faisst等人1995，通过引用以其整体并入本文中)，

e)回收获得的产物。

另外，免疫球蛋白链可变结构域诸如VHH或VH可以使用大肠杆菌或酿酒酵母根据Frenken等人2000和WO99/23221(以引用的方式整体并入本文中)中公开的方法产生，如下所述：

在从免疫化美洲驼取血液样品并且经由Ficoll(中性的高度支化、高质量亲水性多糖，其在水溶液中快速溶解-Pharmacia)不连续梯度离心而富集淋巴细胞群体、通过酸性硫氰酸胍萃取而分离总RNA(Chomezynnski等人，1987)和第一链cDNA合成(例如，使用cDNA试剂盒，诸如RPN 1266(Amersham))之后，使用在WO99/23221的第22页和23页上详细描述的特异性引物通过PCR而扩增编码VHH和VH片段和短或长铰链区的部分的DNA片段。在用PstI和HindIII或BstEII消化PCR片段之后，将具有约300与450bp之间的长度的DNA片段经由琼脂糖凝胶电泳纯化，并且分别在大肠杆菌噬菌粒载体pUR4536或游离型酿酒酵母表达载体pUR4548中连接。pUR4536来源于pHEN(Hoogenboom等人1991，通过引用以其整体并入本文中)并且含有lacI^q基因和独特限制性位点以允许美洲驼VHH和VH基因的克隆。pUR4548来源于pSY1(Harmsen等人1993，通过引用以其整体并入本文中)。经由PCR从此质粒取出leu2基因中的BstEII位点，并且将在SUC2信号序列与终止子之间的克隆位点替代以便有利于VH/VHH基因片段的克隆。VH/VHH在C末端处具有c-myc标签以用于检测。将各个大肠杆菌JM109菌落转移到含有增补有1％葡萄糖和100mg L^-1氨苄西林的150ml2TY培养基的96孔微量滴定板中。在过夜生长(37℃)之后，在含有100mg L^-1氨苄西林和0.1mM IPTG的2TY培养基中复制板。在再次过夜温育并且任选地冷冻和解冻之后，将细胞离心并造粒，并且可以在ELISA中使用上清液。将各个酿酒酵母菌落转移至含有选择性基本培养基(包含0.7％酵母氮基、2％葡萄糖，增补有必需氨基酸和碱基)的测试管中，并且在30℃下生长48h。随后，将培养物在YPGal培养基(包含1％酵母提取物、2％细菌蛋白胨和5％半乳糖)中稀释十倍。在生长24h和48h之后，将细胞造粒并且可以在ELISA中分析培养上清液。任选地测量600nm处的吸光度(OD600)。

另外，可以使用如下程序使用酿酒酵母或巴斯德毕赤酵母来产生免疫球蛋白链可变结构域诸如VH/VHH：

分离编码VH/VHH的天然存在的DNA序列或获得编码VH/VHH的合成产生的DNA序列，包含5'-UTR、信号序列、终止密码子并且侧接SacI和HindIII位点(这种合成序列可以如上概述产生或者例如可以从商业供应商诸如Geneart(Life Technologies)订购)。

使用限制性位点将VH/VHH基因转移至多拷贝整合(MCI)载体pUR8569或pUR8542，如下所述。使用以下，用SacI和HindIII切割编码VHH的任选地包含在穿梭载体、盒或其他合成基因构建体和MCI载体内的DNA序列：25ul VHH DNA(Geneart质粒或MCI载体)、1ul SacI、1ul HindIII、3ul的用于双重消化的合适缓冲液诸如NEB缓冲液1(New England Biolabs)，在37℃下进行过夜。用1xTAE缓冲液在1.5％琼脂糖凝胶上运行25ul的编码VHH的消化DNA和25ul的消化MCI载体，并且然后例如使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)进行凝胶提取。如下设定消化的MCI载体和编码VH/VHH的消化的DNA的连接：100ng载体、30ng VHH基因、1.5ul 10×连接酶缓冲液、1ul T4 DNA连接酶和ddH₂O。然后在16℃下进行连接过夜。

接下来转化大肠杆菌细胞。对于化学感受态XL-1蓝色细胞，将200ul热感受态XL-1蓝色细胞解冻并且在冰上添加5ul连接混合物，持续约30分钟，接着在42℃下进行热休克，持续90秒。然后添加增补有2％葡萄糖的800ul Luria-Bertani低盐培养基，并且在37℃下回收细胞，持续2小时。将细胞铺板在Luria-Bertani琼脂和氨苄西林(100ug/ml)板上并且在37℃下保持过夜。对于电感受态TG1大肠杆菌细胞，使用电穿孔杯。在电穿孔杯中：在冰上将50ul电感受态TG1细胞和1ul连接混合物解冻，持续约15分钟。将所述杯置于支撑物中并加脉冲。添加500ul的2TY培养基并且在37℃下回收细胞，持续30分钟。将100ul细胞铺板在含有氨苄西林(100ug/ml)和2％葡萄糖的Luria-Bertani琼脂板上。将板在37℃下保持过夜。

如上详细描述将VH/VHH基因克隆到大肠杆菌中之后，可以用线性化的MCI载体转化酿酒酵母或巴斯德毕赤酵母。在进行转化之前，进行一些步骤：(i)应通过消化将DNA从环状改变为线性的，否则DNA不能被整合到酵母基因组中，以及(ii)应通过乙醇沉淀将消化的DNA的杂质清除。另外，在转化过程期间，将酵母细胞制成半透性的，以使得DNA可以穿过膜。

为了酵母转化进行的准备：对由表达VH/VHH基因的选择的大肠杆菌菌落制备的midi-prep进行HpaI消化，如下所述。制备含有20ng midi-prep、5ul HpaI、10ul适当缓冲液诸如NEB4缓冲液(BioLabs)和ddH₂O的100ul溶液。

在室温下用HpaI切割DNA过夜。接下来进行乙醇沉淀(并且将来自HpaI消化的5ul样品置于一侧)。将300ul 100％乙醇添加到95ul HpaI消化的midiprep中，涡旋并在全速下旋转5分钟。当存在团粒时仔细倾析，添加100ul 70％乙醇，然后在全速下再次旋转5分钟。对样品再次进行倾析，并且保持在50-60℃下，直至团粒干燥。将团粒重悬浮在50ul ddH₂O中。在5ul HpaI消化的样品旁边的凝胶上运行5ul。

酵母转化：制备YNBglu板。使用10g琼脂+425ml水(杀菌的)、25ml过滤20×YNB(3.35g YNB(酵母氮基)，在25ml杀菌的H₂O中)和50ml无菌20％葡萄糖并且倒入培养皿中。从母板中选取一个酵母菌落并在30℃下在3ml YPD(酵母浸出粉胨葡萄糖)中生长过夜。在第二天制备约600ml YPD并且用275ml、225ml和100ml YPD填充3个烧瓶。将27.5ul酵母YPD培养物添加到第一烧瓶中并轻微混合。从第一烧瓶中取75ml并将其置于第二烧瓶中，轻微混合。从第二烧瓶中取100ml并置于第三烧瓶中，轻微混合。生长，直至达到1与2之间的OD660。将在4个Falcon管上达到此OD的烧瓶分开，每个中±45ml。在4200rpm下旋转2分钟。丢弃上清液。将在两个Falcon管中的团粒溶解在45ml H₂O中(将管的数量从4个降低至2个)。在4200rpm下旋转2分钟。将团粒溶解在45ml H₂O中(从2个管至1个管)。在4200rpm下旋转2分钟。将团粒轻微溶解在5ml醋酸锂(LiAc)(100mM)中，并且旋转几秒。仔细丢弃一些LiAc，但是保留管中一半以上的LiAc。对细胞进行涡旋，将载体DNA煮沸5分钟并在冰水中快速冷却。添加到含有以下的15ml管中：240ul PEG、50ul细胞、36uLiAc(1M)、25ul载体DNA、45ul乙醇沉淀的VH/VHH。在每个步骤之后轻微混合(对空白样品进行同样处理，只是没有乙醇沉淀的VH/VHH)。在30℃下温育30分钟，将管轻微倒置3-4次，然后在42℃下热休克20-25分钟。在高达6000rpm下旋转短暂的时间。轻微取出上清液并且添加250ul ddH₂O并混合。在YNBglu板上对它们全部划条纹，直至板干燥，并且在30℃下生长4-5天。最后，通过以下来制备YNBglu板：将板分为6个等份，将各份编号为1至6，接种最大菌落并且划出1号。对从大到小的1至6个其他菌落重复以上过程。在30℃下长大，持续3-4天，直至产生菌落。使用葡萄糖作为碳源来生长VH/VHH菌落，并且通过添加0.5％半乳糖打开半乳糖-7-启动子来诱导VH/VHH表达。进行3mL小规模培养以测试菌落，并且选择示出VH或VHH的最佳表达的菌落。然后在纯化中使用此菌落。

纯化：通过用强阴离子树脂(诸如Capto S)进行阳离子交换色谱法来纯化VH/VHH。在第1天，在5ml YPD培养基(YP培养基+2％葡萄糖)中接种表达VH/VHH的选择的酵母菌落，并且在30℃下在25mL密封的无菌管中过夜生长细胞(在180rpm下振荡)。在第2天，在50mL新鲜制备的YP培养基+2％葡萄糖+0.5％半乳糖中稀释5ml过夜培养物，在30℃下在250ml充气的带挡板烧瓶中生长细胞，持续两个晚上(在180rpm下振荡)。在第4天，在离心机中在4200rpm下向下旋转细胞，持续20min。使用强阴离子树脂进行阳离子交换纯化步骤：将含有配体的上清液的pH调节至3.5。用50mL ddH₂O洗涤0.75ml树脂(+/-0.5mL浆液)/50mL上清液，接着用结合缓冲液洗涤三次。将洗涤的树脂添加到上清液中并且在4℃下在振荡器上温育悬浮液1.5小时。通过在500g下离心2分钟将树脂结合的VH/VHH造粒并且用洗涤缓冲液对其洗涤。倾析上清液并且用10mL结合缓冲液重悬浮树脂。将过滤器置于PD-10柱中，将树脂倒入柱中并且使树脂沉降一会，然后将过滤器添加在树脂上。等到所有的结合缓冲液运行通过。用6x0.5ml洗脱缓冲液洗脱VH/VHH。在eppendorf管中收集洗脱级分。用Nanodrop测量6个洗脱级分的蛋白质浓度。汇集含有VHH的级分并且将溶液转移到3,500Da截留透析膜中。在4℃下相对于3L PBS透析纯化的蛋白质溶液过夜。在第5天，在4℃下相对于2L新鲜PBS透析纯化的蛋白质溶液，再持续2小时。最后，通过BCA计算最终浓度。

虽然在VH/VHH的情况下进行讨论，但是以上所述的技术也可以用于scFv、Fab、Fv和其他抗体片段(如果需要的话)。

多个抗原结合片段(合适地VH/VHH)可以通过使氨基酸残基与有机衍生剂反应进行化学交联来融合，诸如由Blattler等人1985所述(通过引用以其整体并入本文中)。可替代地，抗原结合片段可以在DNA水平下在基因上融合，即所形成的多核苷酸构建体，其编码包含一个或多个抗原结合片段的完整多肽构建体。经由基因途径使多个抗原结合片段接合的一种方式是直接或经由肽接头而使编码抗原结合片段的序列连接。例如，第一抗原结合片段的羧基末端可以与下一个抗原结合片段的氨基末端连接。此连接模式可以延伸，以便连接抗原结合片段以用于构建三功能性、四功能性构建体等。用于产生多价(诸如二价)VHH多肽构建体的方法在WO 96/34103(以引用的方式整体并入本文)中公开。

合适地，多肽可以根据WO02/48382中公开的方法在真菌，诸如酵母(例如，酿酒酵母或巴斯德毕赤酵母)中产生，其包括在包含碳源的培养基上生长真菌，其中所述碳源的50-100wt％是乙醇。在酿酒酵母中大规模生产VHH片段在Thomassen等人2002(通过引用以其整体并入本文中)中描述。

在本发明的一个方面，提供了制备本发明组合物的方法，所述方法包括以下步骤：使用合适的宿主表达编码TNF-α结合多肽的多核苷酸，以及在合适的宿主中表达编码IL-7R结合多肽的多核苷酸并将两种多肽添加到组合物中。在本发明的另一方面，提供了制备本发明构建体的方法，所述方法包括使用合适的宿主表达编码本发明构建体的多核苷酸的步骤。

本发明的其他实施方案在以下条款中阐述。

条款

1.一种组合物，包含TNF-α结合多肽和IL-7R结合多肽。

2.根据条款1所述的组合物，其中：

(a)所述TNF-α结合多肽包含三个互补决定区(CDR1-CDR3)，其中CDR1包含与SEQID NO：1具有60％或更大序列同一性的序列，CDR2包含与SEQ ID NO：2具有50％或更大序列同一性的序列并且CDR3包含与SEQ ID NO：3具有60％或更大序列同一性的序列；以及

(b)所述IL-7R结合多肽包含三个互补决定区(CDR1-CDR3)，其中CDR1包含与SEQID NO：9具有60％或更大序列同一性的序列，CDR2包含与SEQ ID NO：10具有50％或更大序列同一性的序列并且CDR3包含与SEQ ID NO：11具有60％或更大序列同一性的序列。

3.根据条款1或2所述的组合物，其中包含抗体片段的多肽是免疫球蛋白链可变结构域。

4.根据条款1至3中任一项所述的组合物，其中所述TNF-α结合多肽以10^-7M或更小的Kd与TNF-α结合，并且所述IL-7R结合多肽以10^-7M或更小的Kd与IL-7R结合。

5.根据条款1至4中任一项所述的组合物，其中所述TNF-α结合多肽在L929测定中以100nM或更低的EC50中和人TNF-α细胞毒性，并且所述IL-7R结合多肽以100nM或更低的EC50中和在人淋巴细胞中IL-7R依赖性的、IL-7诱导的STAT5磷酸化。

6.根据条款1至5中任一项所述的组合物，其中所述TNF-α结合多肽和所述IL-7R结合多肽是连接的。

7.根据条款6所述的组合物，其中所述TNF-α结合多肽和所述IL-7R结合多肽通过对蛋白酶不稳定的肽接头而连接。

8.根据条款7所述的组合物，其中所述对蛋白酶不稳定的肽接头包含K和/或R残基。

9.根据条款1至8中任一项所述的组合物，其中所述多肽对存在于小肠或大肠中的一种或多种蛋白酶基本上具有抗性。

10.一种药物组合物，包含根据条款1至9中任一项所述的组合物及药学上可接受的赋形剂。

11.根据条款1至10中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含肠溶包衣。

12.根据条款1至11中任一项所述的组合物，其中所述组合物适合于口服施用。

13.根据条款1至12中任一项所述的组合物，用于治疗或预防自身免疫性疾病和/或炎性疾病。

14.一种与IL-7R结合多肽一起用于治疗或预防自身免疫性疾病和/或炎性疾病的TNF-α结合多肽。

15.一种与TNF-α结合多肽一起用于治疗或预防自身免疫性疾病和/或炎性疾病的IL-7R结合多肽。

现在将通过以下非限制性实施例进一步描述本发明。

实施例

实施例1至3提供了关于特异性IL-7R结合多肽特性的信息。实施例4和5提供了关于涉及联合使用的IL-7R结合多肽和TNF-α结合多肽的实验的信息。实施例6详述了包含IL-7R结合多肽和TNF-α结合多肽的构建体的生产。

实施例1：与现有技术的IL-7R结合多肽相比，IL-7R结合多肽ID-A40U、V7R-2E9和ID-A62U的效力

大肠杆菌中产生的IL-7R结合多肽ID-A40U(SEQ ID NO：24)和V7R-2E9(SEQ IDNO：25)的抑制效力和功效(最大抑制)在L-7/IL-7R中和ELISA中进行了体外测定，并与临床抗IL-7R抗体mAb829(也称为“GSK2618960”，Ellis等人2019中公开的抗IL-7Rα单克隆抗体)比较。

在300nM下开始并且使用3.2稀释因子，在1％BSA(在2x测定浓度下)中制备ICVD的7点稀释系列。在ELISA中使用mAb829对比物抗体作为阳性对照，浓度范围在10nM与0.088nM(2x测定浓度)之间。针对每个ICVD稀释液制备足够一式三份的体积，同时针对mAb829制备足够2个一式三份(2个板)的体积。将85μL(或170μL)的每个ICVD(或mAb829)稀释液与85μL(或170μL)的10ng/mL IL-7(2x测定浓度)混合。将85μL的IL-7与85μL的封闭缓冲液混合，以在每个板中具有IL-7(1x)完全结合信号。还将单独的封闭缓冲液添加到每个板中作为空白。然后使用生物素化抗hIL-7，接着用Extravidin-HRP测量结合的IL-7。在30分钟之后停止TMB反应。

使用ELISA信号空白校正的A₄₅₀数据和'log(抑制剂)相对于应答--可变斜率(四个参数)’拟合曲线并生成EC₅₀来在Graphpad prism中生成EC₅₀值。

此外，在体外，在人淋巴细胞中测试了ID-A40U和V7R-2E9抑制IL-7与IL-7Rα结合并阻碍STAT5磷酸化的能力。人外周血单核细胞(PBMC)通过IL-7R信号传导刺激细胞内STAT5磷酸化来对外源性IL-7产生应答，但是此应答可以通过防止IL-7/IL-7R结合的IL-7Rα特异性ICVD来消除。

从人血沉棕黄层中分离淋巴细胞富集群体并且储存在90％FBS10％DMSO中在液氮中。将细胞解冻并在完全RPMI-1640中静置以便恢复。在恢复之后，将细胞以100μl 2.5x10⁵个细胞/孔铺板在圆底96孔板中，并且在没有FBS的完全RPMI中饥饿1h。在饥饿之后，将所需浓度的ICVD添加到每个孔(50μL/孔)中，并且将板在室温下温育15min。然后将50μL/孔的IL-7添加到每个孔中，并且将板在37℃5％CO₂下温育15min。通过将板在冰上快速冷却来停止反应，接着离心并取出上清液。然后对细胞进行处理以用于固定、透化和pSTAT5细胞内染色。将细胞在冰上与100μL/孔Cytofix/Cytoperm溶液(BD Bioscience#554722)一起温育20min，用150μl/孔1x Perm/洗涤缓冲液(BD Bioscience#554723)洗涤两次，在冰上与200μL/孔Perm缓冲液III(BD Bioscience#558050)一起温育30min并且用150μL/孔1x PBS 2％BSA(FACS缓冲液)洗涤两次。随后将细胞在室温下用25μL/孔pSTAT5抗体([47/Stat5(pY694)](A488)(BD Bioscience#612598))或同种型对照小鼠IgG1([B11/6](FITC)(Abcam#ab91356))染色1h。通过添加150μL/孔的FACS缓冲液来停止反应。在1次洗涤/离心步骤之后，将细胞最终重悬浮在200μL/孔的FACS缓冲液中，并且在CytoFlex流式细胞仪(Beckman Coulter)中获取数据。使用FlowJo软件进行数据分析。

这些实验的结果与比较物一起显示在表1a中。

表1a

在单独的实验中，对ID-A62U(SEQ ID NO：16)(产生于酿酒酵母中)连同比较物一起进行了相同的IL-7/IL-7R中和ELISA。结果显示在表1b中。ID-A62U包含相对于ID-A40U的E1D和R45L突变。

表1b

测试了V7R-2E9中和L-TSLP/TSLP-R复合物与IL-7Rα的结合的能力。将96孔板用0.25μg/mL重组人IL-7Rα-His₆-Fc+5μg/mL BSA涂覆并且然后封闭。将V7R-2E9连续稀释并且与重组人L-TSLP(15ng/mL最终浓度)和人TSLP-R(20ng/mL最终浓度)1∶1∶1混合。然后将混合物温育30分钟以允许结合，之后添加到IL-7Rα涂覆的板上。在2小时温育后，用50μL/孔0.3μg/mL生物素化兔抗hTSLP抗体，并且然后用50μL/孔1/2000 Extravidin-HRP检测结合的L-TSLP，并且使用GraphPad Prism确定通过ICVD对L-TSLP/TSLP-R复合物与IL-7Rα的结合进行的中和的水平。结果显示在下表1c中。

表1c

总之，ID-A62U和ID-A40U表现出与对比物临床抗IL-7R抗体mAb829相比相当或更大的效力。值得注意的是，属于同一ICVD家族的ID-A40U和ID-A62U都保持高效力，即使它们没有相同的序列(ID-A62U相对于ID-A40U包含E1D和R45L突变)并且是使用不同的生物生产的。

实施例2：ICVD-IL-7R结合亲和力的Biacore估计

在Biacore研究中将ID-A40U的结合动力学与mAb829临床抗体进行比较。将IL-7Rα-His₆-Fc直接涂覆在Biacore传感器板(用于mAb829分析)上或通过抗人IgG Fc(用于ICVD分析)捕获，并且将ICVD/Ab流过板以检测结合。ID-A40U具有7.8x10^-11M的亲和力(K_D)，并且mAb829具有5.67x10^-10M的稍微更低的亲和力(K_D)。结果指示ID-A40U显示与抗原的强烈结合。ID-A62U包含相对于ID-A40U的E1D和R45L突变。

实施例3：对胃肠道提取物的耐受性

肠上清液中的离体温育可以预测ICVD在食蟹猴和人的肠道中的稳定性。主要小肠蛋白酶胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的活性在哺乳动物物种中是保守的，而大肠中存在的蛋白酶可能通过宿主物种特异性肠道微生物区系产生。为了生成反映这两种环境的测试基质，制备汇集的小鼠小肠上清液和汇集的粪便上清液。这两种基质对于非选择的非工程化ICVD是高度消化性的。

先前已经显示抗TNF-αICVD ID-38F在这些基质中具有高稳定性(参见WO2016/156465)，并且此特性预测ID-38F在运输通过肠道期间具有高稳定性。

测试V7R-2E9和ID-A40U在来自鼠和人两者的胃肠道提取物中的存活率。将ICVD在37℃下与小鼠小肠上清液一起温育6小时，并且与人粪便上清液一起温育16小时。通过以上在实施例1详述的IL-7/IL-7R中和ELISA来测量存活率。两种构建体在所测试的消化性基质中均显示良好的存活率(图1，其中“SI”＝小鼠小肠液，并且“HF”＝人粪便上清液)。

在单独实验中，测试ID-A62U以及ID-A41U(不稳定的对比物ICVD)在相同人粪便上清液测定中的存活率。与ID-A41U的大约40％存活率相比，ID-A62U展示大约100％存活率(图2，ID-A62U标记为‘A62U’并且ID-A41U标记为‘A41U’)。

这些是涉及延长温育时间段的严格测试。因此，预期这些ICVD中的任一个在胃肠道环境中存活非常良好。

实施例4：研究TNF-α结合多肽和IL-7R结合多肽的单独和联合施用对离体培养的IBD组织中信号传导蛋白磷酸化的抑制效应

进行了一项研究，以研究TNF-α结合多肽和IL-7R结合多肽对从UC患者获得的发炎结肠粘膜组织的离体培养物中磷蛋白生物标志物水平和炎性细胞因子自发产生的抑制效应。测试的多肽都是ICVD。ICVD是ID-A62U(上文实施例1-3中讨论的结合IL-7R的ICVD)和ID-38F(WO2016/156465中公开的结合TNF-α的ICVD)。将单个ICVD的效果与两种ICVD的混合物和阴性对照ICVD(“ID-2A”，一种不与任何靶结合的无关ICVD)进行比较，以评估组合不同抗细胞因子机制的效果。

将来自四名不同UC患者各自的活检与不同的ICVD(对照ID-2A 50nM、ID-38F50nM、ID-A62U 50nM或ID-38F+ID-A62U，各50nM)一起孵育24小时，治疗后，在磷蛋白抗体阵列上分析组织裂解物。生成的直方图(图3-4)提供了每个活检(4个/治疗)获得的组合的磷酸化强度数据的可视化表示。不同ICVD治疗的抑制效应表现为从用对照ICVD ID-2A治疗的活检的主要高磷酸化强度值转变为用抗TNF-α或抗-IL-7R ICVD或两者的组合治疗的活检的相对低磷酸化强度值。这些平均结果显示ID-A62U和ID-38F对组织磷酸化水平的总体抑制效应一致，其中当两种ICVD组合时效果更大。目前尚不清楚哪种磷蛋白在该分析中可能更重要，因此评估了每个活检中治疗对蛋白质磷酸化的总体效果。

图5中显示的结果显示了对每位患者的四个活检测量的总磷酸化强度值。对于每个活检，通过将阵列上所有45种蛋白质测量的强度值加在一起来计算总磷酸化水平。对于每位患者，显示了针对每个治疗测量的总磷酸化水平。三名患者(UC2748、UC2749和UC2750)表现出显著的抑制作用(联合使用时约50％)，而第四名UC2747也表现出显著的抑制作用，但应答总体上较差。

ID-38F加ID-A62U治疗的联合抑制效果超过了单一ICVD所达到的效果，并导致对大多数磷蛋白的抑制接近最大。由于在该实验中观察到出乎意料的高水平抑制，需要进一步探索联合药剂在UC组织中的协同效应的确切证据。然而，IL-7R结合多肽和TNF-α结合多肽对UC组织中炎性生物标志物的显著抑制的证据是令人鼓舞的，并且表明当较低浓度的多肽组合时具有可观察到的协同作用的良好潜力。

总的来说，这些结果证明了共同施用的抗TNF-α多肽和抗IL-7R多肽的至少加和效应和潜在的协同效应。

实施例5：研究TNF-α结合多肽和IL-7R结合多肽的单独和联合施用对IBD组织的离体培养物中细胞因子的产生的抑制效应

图6-8显示了不同治疗对以上实施例4中讨论的活检中平均自发细胞因子产生的效应。ID-38F或ID-A62U单独治疗可抑制IL-8、TNFα和IL-17F的产生，但对其他细胞因子几乎没有影响。然而，当ID-38F和ID-A62U组合使用时，对IL-1β、IL-6、IL-8、IL-17A和IL-33的抑制效应明显大于单独ICVD所见的抑制效应。该组合对TNFα和IL-17F产生的抑制效应不大于上述单独ICVD的抑制效应。

总之，本研究中三名患者获得的结果表明，单独使用ID-38F或ID-A62U治疗可抑制某些促炎细胞因子(IL-8、TNFα、IL-17F)的产生。对其他细胞因子的抑制效应是小的/部分的，这可能反映了本研究选择的ICVD的次最大浓度。重要的是，当两种ICVD组合使用时，对包括IL-1β、IL-6、IL-8、IL-17A和IL-33在内的大多数细胞因子产生的抑制效应增加。

实施例6：包含通过不稳定接头连接的TNF-α结合多肽和IL-7R结合多肽的异双头的产生、切割和测试

由具有中央赖氨酸(K)残基(以产生胰蛋白酶可切割位点)的柔性(G₄S)₂接头(SEQID NO：21)分隔的ID-38F和ID-A62U组合产生了名为“FU3K”的双头构建体。

FU3K在SacI/HindIII片段上克隆到载体pUR9013中，以促进稳定的多拷贝整合到酿酒酵母表达菌株的染色体中。这是按照标准克隆程序实现的。使用这种整合和表达系统，FU3K处于半乳糖诱导型启动子的控制之下，并且通过酵母交配因子α信号序列而实现双头分泌。在50mL诱导培养物中评估来自酵母染色体的FU3K表达。全长FU3K在小规模酵母培养物中表达良好。

FU3K与胰蛋白酶在37℃一起孵育导致ID-38F和ID-A62U单体臂的快速分离。通过SDS PAGE进行分析(图9，其中泳道是时间(分钟)，St＝标准(未添加胰蛋白酶)，L＝分子量标志物，每个泳道上样体积相等)。与未切割的FU3K双头(约27kDa)和切割的单体(约13.5kDa)相对应的条带清晰可见。这证实了FU3K具有良好的形式，在暴露于人体小肠中的胰蛋白酶或结肠中的微生物胰蛋白酶样蛋白酶时快速释放两个单体臂。

使用上面实施例1中描述的方法进行IL-7/IL-7R ELISA。消化前FU3K对IL-7R的效力与ID-A62U相同，消化后FU3K对IL-7R保持高(亚纳摩尔)效力(图10，ID-A62U标记为“A62U”)。

进行生物素化Humira竞争ELISA以对TNFα测量ID-38F和Humira的重叠表位的竞争。将ELISA板用磷酸盐缓冲盐水(1x PBS)中的250μg/mL牛血清白蛋白(BSA)中的100ng/mL人TNFα包被，并用1x PBS中的1％BSA封闭。将生物素化阿达木单抗与所有标准品和样品按1∶1混合，在将混合物添加到板之前，给出最终浓度为2nM的生物素化阿达木单抗。使用ExtrAvidin-辣根过氧化物酶来检测结合的生物素化阿达木单抗，并使用TMB Microwell底物进行可视化，然后用0.5M H₂SO₄终止并在450nm处读数。

在该竞争ELISA中发现，消化前和消化后的FU3K与ID-38F一样有效(图11)。

FU3K的两个单体臂在人粪便上清液中孵育(如以上实施例2所述进行)4小时后显示出保留了母体单体ID-38F和ID-A62U的有利稳定性特征(图12)。

这些数据表明，FU3K是合适的形式，以将高浓度的这些单体中的每一种作为双重疗法直接递送到人结肠。

其他方面

此申请中涉及的所有参考文献，包括专利和专利申请都在最大可能程度上以引用的方式并入本文中。

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序列表

<110> 韦斯夸尔德有限公司

<120> 组合物

<130> VHS-P2586PCT

<160> 43

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 1

Ser His Trp Met Tyr

1 5

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 2

Glu Ile Asn Thr Asn Gly Leu Ile Thr His Tyr Gly Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 3

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 3

Asn Gln His Gly Leu Asn

1 5

<210> 4

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 4

Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser

20 25 30

<210> 5

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 5

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Leu Glu Trp Leu Ser

1 5 10

<210> 6

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 6

Arg Phe Thr Val Ser Arg Asn Asn Ala Ala Asn Lys Met Tyr Leu Glu

1 5 10 15

Leu Thr Arg Leu Glu Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Arg

20 25 30

<210> 7

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 7

Lys Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 8

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 8

Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Ser His

20 25 30

Trp Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Ser Glu Ile Asn Thr Asn Gly Leu Ile Thr His Tyr Gly Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asn Asn Ala Ala Asn Lys Met Tyr

65 70 75 80

Leu Glu Leu Thr Arg Leu Glu Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Gln His Gly Leu Asn Lys Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 9

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 9

Ser Asp Ala Met Gly

1 5

<210> 10

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 10

Ala Ile Gly Trp Ser Gly Ala Val Thr His Tyr Ser Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 11

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 11

Asp Tyr Asp Thr Asp Val Trp Gln Tyr

1 5

<210> 12

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 12

Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Ser Ser Ile Ser Thr Phe Ser

20 25 30

<210> 13

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 13

Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Leu Glu Phe Leu Ala

1 5 10

<210> 14

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 14

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln

1 5 10 15

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Arg Tyr Tyr Cys Ala Glu

20 25 30

<210> 15

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 15

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 16

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 16

Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Ser Ser Ile Ser Thr Phe Ser Ser Asp

20 25 30

Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Leu Glu Phe Leu

35 40 45

Ala Ala Ile Gly Trp Ser Gly Ala Val Thr His Tyr Ser Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Arg Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Glu Asp Tyr Asp Thr Asp Val Trp Gln Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Gln Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 17

<211> 351

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 17

gatgttcaat tggttgaatc tggtggtggt ttggttcaac caggtggttc tttgaaattg 60

tcttgtgctg cttctggttt cgatttctct tctcattgga tgtactgggt tagacaagct 120

ccaggtaaag aattggaatg gttgtctgaa atcaacacca acggtttgat tacccattat 180

ggtgattctg tcaagggtag attcactgtc tctagaaaca atgctgctaa caagatgtac 240

ttggaattga ccagattgga accagaagat actgccttgt attactgcgc tagaaatcaa 300

catggtttga acaaaggtca aggtactcaa gttaccgttt cctcataatg a 351

<210> 18

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 18

gatgttcaat tggttgaatc tggtggtggt ttggttcaag ccggtggttc tttgagattg 60

tcttgtgaat cttctatctc caccttctca tctgatgcta tgggttggtt tagacaagct 120

ccaggtaaag aattggaatt tttggctgct attggttgga gtggtgctgt tactcattat 180

tccgattctg ttaaaggtcg tttcaccatt tctagagata acgctaagaa caccgtctac 240

ttgcaaatga actctttgag agctgaagat accggtagat attactgcgc tgaagattac 300

gatactgatg tttggcaata ttggggtcaa ggtactcaag ttactgtctc ctcatgataa 360

<210> 19

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 19

Asp Asp Asp Asp Lys

1 5

<210> 20

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 20

Gly Gly Gly Gly Ser Asp Asp Asp Asp Lys Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 21

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 21

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Lys Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

Gly Gly Gly Gly Ser

20

<210> 22

<211> 159

<212> PRT

<213> 智人

<400> 22

Met Phe Pro Phe Ala Leu Leu Tyr Val Leu Ser Val Ser Phe Arg Lys

1 5 10 15

Ile Phe Ile Leu Gln Leu Val Gly Leu Val Leu Thr Tyr Asp Phe Thr

20 25 30

Asn Cys Asp Phe Glu Lys Ile Lys Ala Ala Tyr Leu Ser Thr Ile Ser

35 40 45

Lys Asp Leu Ile Thr Tyr Met Ser Gly Thr Lys Ser Thr Glu Phe Asn

50 55 60

Asn Thr Val Ser Cys Ser Asn Arg Pro His Cys Leu Thr Glu Ile Gln

65 70 75 80

Ser Leu Thr Phe Asn Pro Thr Ala Gly Cys Ala Ser Leu Ala Lys Glu

85 90 95

Met Phe Ala Met Lys Thr Lys Ala Ala Leu Ala Ile Trp Cys Pro Gly

100 105 110

Tyr Ser Glu Thr Gln Ile Asn Ala Thr Gln Ala Met Lys Lys Arg Arg

115 120 125

Lys Arg Lys Val Thr Thr Asn Lys Cys Leu Glu Gln Val Ser Gln Leu

130 135 140

Gln Gly Leu Trp Arg Arg Phe Asn Arg Pro Leu Leu Lys Gln Gln

145 150 155

<210> 23

<211> 63

<212> PRT

<213> 智人

<400> 23

Met Phe Ala Met Lys Thr Lys Ala Ala Leu Ala Ile Trp Cys Pro Gly

1 5 10 15

Tyr Ser Glu Thr Gln Ile Asn Ala Thr Gln Ala Met Lys Lys Arg Arg

20 25 30

Lys Arg Lys Val Thr Thr Asn Lys Cys Leu Glu Gln Val Ser Gln Leu

35 40 45

Gln Gly Leu Trp Arg Arg Phe Asn Arg Pro Leu Leu Lys Gln Gln

50 55 60

<210> 24

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 24

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Ser Ser Ile Ser Thr Phe Ser Ser Asp

20 25 30

Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Leu

35 40 45

Ala Ala Ile Gly Trp Ser Gly Ala Val Thr His Tyr Ser Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Arg Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Glu Asp Tyr Asp Thr Asp Val Trp Gln Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Gln Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 25

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 25

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Ser Ser Ile Ser Thr Phe Ser Ser Asp

20 25 30

Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Leu

35 40 45

Ala Ala Ile Gly Trp Ser Gly Ala Val Thr His Tyr Ser Asp Ser Val

50 55 60

Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Gly Arg Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Glu Asp Tyr Asp Thr Asp Val Trp Gln Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Gln Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 26

<211> 254

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 26

Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Ser His

20 25 30

Trp Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Ser Glu Ile Asn Thr Asn Gly Leu Ile Thr His Tyr Gly Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asn Asn Ala Ala Asn Lys Met Tyr

65 70 75 80

Leu Glu Leu Thr Arg Leu Glu Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Gln His Gly Leu Asn Lys Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Lys Gly Gly

115 120 125

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly

130 135 140

Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Ser

145 150 155 160

Ser Ile Ser Thr Phe Ser Ser Asp Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala

165 170 175

Pro Gly Lys Glu Leu Glu Phe Leu Ala Ala Ile Gly Trp Ser Gly Ala

180 185 190

Val Thr His Tyr Ser Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg

195 200 205

Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala

210 215 220

Glu Asp Thr Gly Arg Tyr Tyr Cys Ala Glu Asp Tyr Asp Thr Asp Val

225 230 235 240

Trp Gln Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

245 250

<210> 27

<211> 768

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 27

gatgttcaat tggttgaatc tggtggtggt ttggttcaac caggtggttc tttgaaattg 60

tcttgtgctg cttctggttt cgatttctct tctcattgga tgtactgggt tagacaagct 120

ccaggtaaag aattggaatg gttgtctgaa atcaacacca acggtttgat tacccattat 180

ggtgattctg tcaagggtag attcactgtc tctagaaaca atgctgctaa caagatgtac 240

ttggaattga ccagattgga accagaagat actgccttgt attactgcgc tagaaatcag 300

catggtttga acaaaggtca aggtactcaa gttactgttt cttctggtgg aggcggttca 360

ggcggaggtg gctctaaggg cggtggcgga agtggtggag gcggttcaga agttcaatta 420

gttgagagtg gtggcggttt agtacaagct ggtggttcat taagattgtc ctgcgaatct 480

tctatctcca ccttttcatc tgatgctatg ggttggttca gacaagcacc tggaaaagag 540

ttagaattct tggctgctat tggttggagt ggtgctgtta ctcattactc tgattcagtt 600

aagggtcgtt tcaccatctc aagagataat gctaagaaca ccgtctactt gcagatgaat 660

tctttgagag ctgaagatac aggtaggtac tattgtgctg aagattacga tactgatgtc 720

tggcaatatt ggggacaagg cacccaagtt acagttagtt cttaatga 768

<210> 28

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> Xaa是Ser或Asp

<400> 28

Xaa Asp Ala Met Gly

1 5

<210> 29

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> Xaa是Ile或Thr

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> Xaa是Gly或Asn

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (7)..(7)

<223> Xaa是Ala或Thr

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (12)..(12)

<223> Xaa是Ser或Gly

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (16)..(16)

<223> Xaa是Gln或Lys

<400> 29

Ala Xaa Xaa Trp Ser Gly Xaa Val Thr His Tyr Xaa Asp Ser Val Xaa

1 5 10 15

Gly

<210> 30

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> Xaa是Asp或Val

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (9)..(9)

<223> Xaa是Tyr或His

<400> 30

Asp Tyr Xaa Thr Asp Val Trp Gln Xaa

1 5

<210> 31

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<220>

<221> 变体

<222> (1)..(15)

<223> 所述残基可出现1至15次

<220>

<221> 变体

<222> (2)..(10)

<223> 可以不存在所述Gly残基，或可以存在所述Gly残基中的一些或全部

<220>

<221> 变体

<222> (12)..(15)

<223> 可以不存在所述Ser残基，或可以存在所述Ser残基中的一些或全部

<400> 31

Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ser Ser Ser

1 5 10 15

<210> 32

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<220>

<221> 变体

<222> (1)..(5)

<223> 所述残基可出现1至8次

<400> 32

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 33

<211> 65

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<220>

<221> 变体

<222> (1)..(65)

<223> 所述残基可出现1至5次

<220>

<221> 变体

<222> (1)..(15)

<223> 所述残基可出现0至10次

<220>

<221> 变体

<222> (2)..(10)

<220>

<221> 变体

<222> (12)..(15)

<220>

<221> 变体

<222> (16)..(30)

<223> 所述残基可出现0至10次

<220>

<221> 变体

<222> (17)..(25)

<220>

<221> 变体

<222> (27)..(30)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (31)..(35)

<223> Xaa是Lys或Arg

<220>

<221> 变体

<222> (32)..(35)

<223> 可以不存在所述Xaa残基，或可以存在所述Xaa残基中的一些或全部

<220>

<221> 变体

<222> (36)..(50)

<223> 所述残基可出现0至10次

<220>

<221> 变体

<222> (37)..(45)

<220>

<221> 变体

<222> (47)..(50)

<220>

<221> 变体

<222> (51)..(65)

<223> 所述残基可出现0至10次

<220>

<221> 变体

<222> (52)..(60)

<220>

<221> 变体

<222> (62)..(65)

<400> 33

Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ser Ser Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ser Ser Ser Xaa Xaa

20 25 30

Xaa Xaa Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ser

35 40 45

Ser Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ser Ser

50 55 60

Ser

65

<210> 34

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<220>

<221> 变体

<222> (1)..(5)

<223> 所述残基可出现1至5次

<220>

<221> 变体

<222> (7)..(11)

<223> 所述残基可出现1至5次

<400> 34

Gly Gly Gly Gly Ser Lys Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10

<210> 35

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> Xaa是Lys或Arg

<220>

<221> 变体

<222> (2)..(12)

<223> 所述残基可出现1至10次

<220>

<221> 变体

<222> (3)..(11)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (13)..(13)

<223> Xaa是Lys或Arg

<400> 35

Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Xaa

1 5 10

<210> 36

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 36

Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Lys

1 5 10

<210> 37

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 37

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Lys

1 5 10

<210> 38

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 38

Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10

<210> 39

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 39

Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg

1 5 10

<210> 40

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 40

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg

1 5 10

<210> 41

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 41

Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10

<210> 42

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> Xaa是Lys或Arg

<220>

<221> 变体

<222> (2)..(12)

<223> 所述残基可出现1至10次

<220>

<221> 变体

<222> (3)..(11)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (13)..(13)

<223> Xaa是Lys或Arg

<220>

<221> 变体

<222> (14)..(24)

<223> 所述残基可出现1至10次

<220>

<221> 变体

<222> (15)..(23)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (25)..(25)

<223> Xaa是Lys或Arg

<400> 42

Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Xaa Gly Gly Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Xaa

20 25

<210> 43

<211> 61

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<220>

<221> 变体

<222> (1)..(61)

<223> 所述残基可出现1至5次

<220>

<221> 变体

<222> (1)..(15)

<223> 所述残基可出现0至10次

<220>

<221> 变体

<222> (2)..(10)

<220>

<221> 变体

<222> (12)..(15)

<220>

<221> 变体

<222> (16)..(30)

<223> 所述残基可出现0至10次

<220>

<221> 变体

<222> (17)..(25)

<220>

<221> 变体

<222> (27)..(30)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (31)..(31)

<223> Xaa是选自Trp, Phe, Tyr, Leu和Met中的1至5个残基

<220>

<221> 变体

<222> (32)..(46)

<223> 所述残基可出现0至10次

<220>

<221> 变体

<222> (33)..(41)

<220>

<221> 变体

<222> (43)..(46)

<220>

<221> 变体

<222> (47)..(61)

<223> 所述残基可出现0至10次

<220>

<221> 变体

<222> (48)..(56)

<220>

<221> 变体

<222> (58)..(61)

<400> 43

Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ser Ser Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ser Ser Ser Xaa Gly

20 25 30

Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ser Ser Ser Gly Gly

35 40 45

Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ser Ser Ser

50 55 60

Claims

1.一种组合物，包含TNF-α结合多肽和IL-7R结合多肽，其中所述IL-7R结合多肽包含三个互补决定区(CDR1-CDR3)和四个框架区(FR1-FR4)，并且其中CDR1包含与SEQ ID NO:9具有60％或更大序列同一性的序列，CDR2包含与SEQ ID NO:10具有50％或更大序列同一性的序列并且CDR3包含与SEQ ID NO:11具有60％或更大序列同一性的序列。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述TNF-α结合多肽包含三个互补决定区(CDR1-CDR3)和四个框架区(FR1-FR4)，其中CDR1包含与SEQ ID NO:1具有60％或更大序列同一性的序列，CDR2包含与SEQ ID NO:2具有50％或更大序列同一性的序列并且CDR3包含与SEQID NO:3具有60％或更大序列同一性的序列。

3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述TNF-α结合多肽包含三个互补决定区(CDR1-CDR3)和四个框架区(FR1-FR4)，其中CDR1包含与SEQ ID NO:1具有80％或更大序列同一性的序列，CDR2包含与SEQ ID NO:2具有80％或更大序列同一性的序列并且CDR3包含与SEQID NO:3具有80％或更大序列同一性的序列。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述IL-7R结合多肽包含三个互补决定区(CDR1-CDR3)和四个框架区(FR1-FR4)，其中CDR1包含与SEQ ID NO:9具有80％或更大序列同一性的序列，CDR2包含与SEQ ID NO:10具有80％或更大序列同一性的序列并且CDR3包含与SEQ ID NO:11具有80％或更大序列同一性的序列。

5.根据权利要求4所述的组合物，其中：

(a)所述TNF-α结合多肽包含三个互补决定区(CDR1-CDR3)和四个框架区(FR1-FR4)，其中CDR1包含SEQ ID NO:1，CDR2包含SEQ ID NO:2，以及CDR3包含SEQ ID NO:3；以及

(b)所述IL-7R结合多肽包含三个互补决定区(CDR1-CDR3)和四个框架区(FR1-FR4)，其中CDR1包含SEQ ID NO:9，CDR2包含SEQ ID NO:10，以及CDR3包含SEQ ID NO:11。

6.根据权利要求5所述的组合物，其中：

(a)所述TNF-α结合多肽包含三个互补决定区(CDR1-CDR3)和四个框架区(FR1-FR4)，其中CDR1由SEQ ID NO:1组成，CDR2由SEQ ID NO:2组成以及CDR3由SEQ ID NO:3组成；以及

(b)所述IL-7R结合多肽包含三个互补决定区(CDR1-CDR3)和四个框架区(FR1-FR4)，其中CDR1由SEQ ID NO:9组成，CDR2由SEQ ID NO:10组成以及CDR3由SEQ ID NO:11组成。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的组合物，其中所述多肽是抗体或抗体片段。

8.根据权利要求7所述的组合物，其中所述多肽各自包含免疫球蛋白链可变结构域或由其组成。

9.根据权利要求8所述的组合物，其中所述多肽各自选自VHH、VH或VL。

10.根据权利要求9所述的组合物，其中所述多肽各自选自VHH或VH。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的组合物，其中所述TNF-α结合多肽以10^-7M或更小的K与TNF-α结合，并且所述IL-7R结合多肽以10^-7M或更小的Kd与IL-7R结合。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的组合物，其中所述TNF-α结合多肽在L929测定中以100nM或更低的EC50中和人TNF-α细胞毒性，并且所述IL-7R结合多肽以100nM或更低的EC50在人淋巴细胞中中和IL-7R依赖性的、IL-7诱导的STAT5磷酸化。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的组合物，其中

(a)所述TNF-α结合多肽包含与SEQ ID NO:8具有至少75％同一性的序列或由其组成，并且

(b)所述IL-7R结合多肽包含与SEQ ID NO:16具有至少75％同一性的序列或由其组成。

14.根据权利要求13所述的组合物，其中

(a)所述TNF-α结合多肽包含SEQ ID NO:8或由其组成，并且

(b)所述IL-7R结合多肽包含SEQ ID NO:16或由其组成。

15.根据权利要求1至14中任一项所述的组合物，其中所述TNF-α结合多肽和所述IL-7R结合多肽是连接的。

16.根据权利要求15所述的组合物，其中所述TNF-α结合多肽和所述IL-7R结合多肽通过对蛋白酶不稳定的肽接头而连接。

17.根据权利要求16所述的组合物，其中所述对蛋白酶不稳定的肽接头包含K和/或R残基。

18.根据权利要求17所述的组合物，其中所述对蛋白酶不稳定的接头包含形式-(G₄S)_x-K-(G₄S)_y-的序列(SEQ ID NO:34)或由其组成，其中x和y各自独立地是1至5。

19.根据权利要求18所述的组合物，其中所述对蛋白酶不稳定的接头包含形式-(G₄S)₂-K-(G₄S)₂-的序列(SEQ ID NO:21)或由其组成。

20.根据权利要求1至19中任一项所述的组合物，其中所述多肽对存在于小肠或大肠中的一种或多种蛋白酶基本上具有抗性。

21.根据权利要求20所述的组合物，其中所述蛋白酶是胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶。

22.一种药物组合物，包含根据权利要求1至21中任一项所述的组合物及药学上可接受的赋形剂。

23.根据权利要求1至22中任一项所述的组合物，作为药物使用。

24.根据权利要求23所述使用的组合物，其中所述组合物用于治疗或预防自身免疫性疾病和/或炎性疾病。

25.根据权利要求1至22中任一项所述的组合物在制备用于治疗或预防自身免疫性疾病和/或炎性疾病的药物中的用途。

26.一种治疗或预防自身免疫性疾病和/或炎性疾病的方法，包括向有需要的人施用根据权利要求1至22中任一项所述的组合物。

27.根据权利要求24至26中任一项所述使用的组合物、用途或方法，其中所述自身免疫性疾病和/或炎性疾病是炎性肠病和/或粘膜炎。

28.根据权利要求24至26中任一项所述使用的组合物、用途或方法，其中所述自身免疫性疾病和/或炎性疾病是特应性皮炎。

29.根据权利要求23至28中任一项所述使用的组合物、用途或方法，其中所述组合物用于口服施用。

30.根据权利要求23至28中任一项所述使用的组合物、用途或方法，其中所述组合物用于局部施用。

31.一种用于治疗或预防自身免疫性疾病和/或炎性疾病的TNF-α结合多肽，连同IL-7R结合多肽，其中所述IL-7R结合多肽包含三个互补决定区(CDR1-CDR3)和四个框架区(FR1-FR4)，并且其中CDR1包含与SEQ ID NO:9具有60％或更大序列同一性的序列，CDR2包含与SEQ ID NO:10具有50％或更大序列同一性的序列并且CDR3包含与SEQ ID NO:11具有60％或更大序列同一性的序列。

32.一种与TNF-α结合多肽一起用于治疗或预防自身免疫性疾病和/或炎性疾病的IL-7R结合多肽，其中所述IL-7R结合多肽包含三个互补决定区(CDR1-CDR3)和四个框架区(FR1-FR4)，并且其中CDR1包含与SEQ ID NO:9具有60％或更大序列同一性的序列，CDR2包含与SEQ ID NO:10具有50％或更大序列同一性的序列并且CDR3包含与SEQ ID NO:11具有60％或更大序列同一性的序列。