JPS6057253A - 抗インシユリン抗体及びインシユリンの検出法 - Google Patents
抗インシユリン抗体及びインシユリンの検出法Info
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- JPS6057253A JPS6057253A JP59062080A JP6208084A JPS6057253A JP S6057253 A JPS6057253 A JP S6057253A JP 59062080 A JP59062080 A JP 59062080A JP 6208084 A JP6208084 A JP 6208084A JP S6057253 A JPS6057253 A JP S6057253A
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- cell line
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/26—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against hormones ; against hormone releasing or inhibiting factors
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- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明の抗インシュリン抗体分泌細胞ラインは、インシ
ュリンで免疫されたリンパ節細胞と骨髄腫細胞ライン５
Ｐ２１０７Ａ！１１４ とを融合させて得られたもので
ある。このような細胞ライン作成の目的は、インシュリ
ンに対する免疫応答を研究および試験するための、特異
性の明らかな抗インシュリン単りローン性抗体を製造す
ることである。本発明の抗体による試験はテストキット
の製造に応用できる。これらの抗体はヒトのインシュリ
ンレイルの診断試薬として有用である。
ュリンで免疫されたリンパ節細胞と骨髄腫細胞ライン５
Ｐ２１０７Ａ！１１４ とを融合させて得られたもので
ある。このような細胞ライン作成の目的は、インシュリ
ンに対する免疫応答を研究および試験するための、特異
性の明らかな抗インシュリン単りローン性抗体を製造す
ることである。本発明の抗体による試験はテストキット
の製造に応用できる。これらの抗体はヒトのインシュリ
ンレイルの診断試薬として有用である。
本発明は柚々の異なるタイプのインシュリン、特に動物
またはヒトに由来するインシュリン、例えば、ヒトイン
シュリン、牛インシュリン、豚インシュリン、マウスイ
ンシュリン、ニワトリインシュリン並びにラット、ウサ
ギ、魚、モルモットおよび羊インシュリンに応用可能で
ある。
またはヒトに由来するインシュリン、例えば、ヒトイン
シュリン、牛インシュリン、豚インシュリン、マウスイ
ンシュリン、ニワトリインシュリン並びにラット、ウサ
ギ、魚、モルモットおよび羊インシュリンに応用可能で
ある。
抗体産生細胞ラインからの単りローン性抗インリン、例
えばヒト、牛、豚、ラット、ニワトリ、魚、モルモット
、羊およびマウスのインシュリンの検出に有用である。
えばヒト、牛、豚、ラット、ニワトリ、魚、モルモット
、羊およびマウスのインシュリンの検出に有用である。
さらに、本発明の単クローン性抗体（ｍＡｈ）は、診断
手段の補助としてヒトの血中インシュリンレベルを検出
するために有用である。
手段の補助としてヒトの血中インシュリンレベルを検出
するために有用である。
本発明に関連する先行技術として次のものがある。
Ｆ３ｃｈｒｏｅｒ、 Ｊｏｙｃｅ Ａ、等［インシュリ
ンに対する抗体応答のＨ−２−結合Ｉｒ遺伝子調節（Ｈ
−２−Ｌｉｎｈｅｄ、 工ｒ Ｃｒｅｎｅ Ｃｏｎｔｒ
ｏｌ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｒｅ５ｐｏｎｓｅｓｔ
ｏ Ｉｎ５ｕｌｉｎ ）Ｊ 、Ｊ、ｏｆ Ｉｍｍｕ−ル
ｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ、 １２３（２）、 ８月、１９７
９年、第６７０−６７５頁。
ンに対する抗体応答のＨ−２−結合Ｉｒ遺伝子調節（Ｈ
−２−Ｌｉｎｈｅｄ、 工ｒ Ｃｒｅｎｅ Ｃｏｎｔｒ
ｏｌ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｒｅ５ｐｏｎｓｅｓｔ
ｏ Ｉｎ５ｕｌｉｎ ）Ｊ 、Ｊ、ｏｆ Ｉｍｍｕ−ル
ｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ、 １２３（２）、 ８月、１９７
９年、第６７０−６７５頁。
Ｂｃｈｒｏｅｒ、 Ｊｏｙｃｅ Ａ、等［内分泌研究に
おける単クローン性抗体（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎ
ｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎＥｎｄｏｃｒｉｎｇ Ｒｅ５ｅ
ａｒｃｈ ） Ｊ 、 ＦｅｌｌｏｗｓおよびＥｂａｎ
ｂａｒｔｈ著、ラバンプレス社、ニューヨーク。
おける単クローン性抗体（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎ
ｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎＥｎｄｏｃｒｉｎｇ Ｒｅ５ｅ
ａｒｃｈ ） Ｊ 、 ＦｅｌｌｏｗｓおよびＥｂａｎ
ｂａｒｔｈ著、ラバンプレス社、ニューヨーク。
１９８１年、第１６７、−１７９頁。この文献の抗体は
本発明で使用する細胞ラインより劣る細胞ラインから生
産された四種の抗体のセットである。
本発明で使用する細胞ラインより劣る細胞ラインから生
産された四種の抗体のセットである。
５ｃｈｒＯｅγ、 Ｊｏｙｃｅ Ａ、等［単クローン性
抗体の使用によるインシュリン分子上の゛抗原決定基の
検討（Ｍａｐｐｉｎｔｌ Ｅｐｉｔｏｐｅ、？ｏｎ ｔ
ｈｅ ＩＭｔｂｌｉｎ Ｍｏ１ｅｃｕｌｅＵｓｉｎ９
Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ＡｎｔｉｂｏｃＬｉｅｓ ）Ｊ
、ＥＷγ、Ｊ。
抗体の使用によるインシュリン分子上の゛抗原決定基の
検討（Ｍａｐｐｉｎｔｌ Ｅｐｉｔｏｐｅ、？ｏｎ ｔ
ｈｅ ＩＭｔｂｌｉｎ Ｍｏ１ｅｃｕｌｅＵｓｉｎ９
Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ＡｎｔｉｂｏｃＬｉｅｓ ）Ｊ
、ＥＷγ、Ｊ。
Ｉｒｒｍｕｂｎｏｌ、 、１９８３年−蛋白質分子上の
抗原決定基に対する抗体の結合部位について、特にイン
シュリンの高親和性抗原−抗体相互作用の分子的基礎知
識は殆んど知られていない。本発明はインシュリンの抗
原構造に対する単クローン性抗体（ｍＡｊ！＋）の開発
および用途を開示するものである。本発明の抗体は抗イ
ンシュリン抗体であり、インシュリンで免疫されたリン
パ節細胞と骨髄腫細胞ラインＳＰ ２１０−Ａｙ １４
との融合により得られた細胞ラインから分泌されるも
のである。この細胞ラインおよび相当する単クローン性
抗体はＡＥ９Ｄ６．ＤＢ９Ｇ８．ＣＣ９Ｃ１０゜Ｃｅ２
Ｏ２，ＢＥ３Ｆ９およびＧＥ９Ｈ９と命名される。
抗原決定基に対する抗体の結合部位について、特にイン
シュリンの高親和性抗原−抗体相互作用の分子的基礎知
識は殆んど知られていない。本発明はインシュリンの抗
原構造に対する単クローン性抗体（ｍＡｊ！＋）の開発
および用途を開示するものである。本発明の抗体は抗イ
ンシュリン抗体であり、インシュリンで免疫されたリン
パ節細胞と骨髄腫細胞ラインＳＰ ２１０−Ａｙ １４
との融合により得られた細胞ラインから分泌されるも
のである。この細胞ラインおよび相当する単クローン性
抗体はＡＥ９Ｄ６．ＤＢ９Ｇ８．ＣＣ９Ｃ１０゜Ｃｅ２
Ｏ２，ＢＥ３Ｆ９およびＧＥ９Ｈ９と命名される。
これらノ・イプリド−マから分泌されるｍＡｂは特定イ
ンシュリンのアミノ酸配列を認識し、それによりヒトの
インシュリンレベルを測定するための診断試薬として役
立つ。これらの抗インシュリン抗体はまた、インシュリ
ンの抗原位置の位置決定（マツピング）を可能ならしめ
る。これらの単クローン性抗体は交叉反応性を有するか
ら、糖尿病の治療のための使用に適する。特に、糖尿病
の治療は血流中に投与された豚や牛のインシュリンを使
用する。本発明のテストキットは、これら種々のインシ
ュリンの識別を可能とし、従って、生体に注射された外
来インシュリン（牛および豚）の量から区別して生体に
より分泌されたヒトインシュリンのレベルを測定するこ
とができる。
ンシュリンのアミノ酸配列を認識し、それによりヒトの
インシュリンレベルを測定するための診断試薬として役
立つ。これらの抗インシュリン抗体はまた、インシュリ
ンの抗原位置の位置決定（マツピング）を可能ならしめ
る。これらの単クローン性抗体は交叉反応性を有するか
ら、糖尿病の治療のための使用に適する。特に、糖尿病
の治療は血流中に投与された豚や牛のインシュリンを使
用する。本発明のテストキットは、これら種々のインシ
ュリンの識別を可能とし、従って、生体に注射された外
来インシュリン（牛および豚）の量から区別して生体に
より分泌されたヒトインシュリンのレベルを測定するこ
とができる。
６種の抗インシュリンｍｏｂが開発された。これら７７
ＬＡ ｈの種々の動物種のインシュリンもしくは化学修
飾されたインシュリンに対する免疫学的交叉反応性も決
定された。これら７７ＬＡｈはインシュリン分子の特定
のアミノ酸配列に結合する。抗体ＡＥ９Ｄ６は、ヒトイ
ンシュリンＡ−ＪＪＩのスレオニン−セリン−イソロイ
シフ （Ｔｈｒ−Ｆ３ｅｒ−１１ｅ ）のアミノ酸配列
を含む部分を識別する。他の５種のｍＡｂも同様に特異
的に反応するが厳密な対応特異配列はまだ決定されてい
ない。
ＬＡ ｈの種々の動物種のインシュリンもしくは化学修
飾されたインシュリンに対する免疫学的交叉反応性も決
定された。これら７７ＬＡｈはインシュリン分子の特定
のアミノ酸配列に結合する。抗体ＡＥ９Ｄ６は、ヒトイ
ンシュリンＡ−ＪＪＩのスレオニン−セリン−イソロイ
シフ （Ｔｈｒ−Ｆ３ｅｒ−１１ｅ ）のアミノ酸配列
を含む部分を識別する。他の５種のｍＡｂも同様に特異
的に反応するが厳密な対応特異配列はまだ決定されてい
ない。
生体の免疫システム、特に抗体産生白血球細胞は血液流
中の外来物質に反応することにより機能する。ある種の
蛋白質である抗体（もしくは免疫グロブリン）が生体中
に侵入した外来蛋白質と結合してこれを中和する。これ
らの抗原と呼ばれる外来蛋白質は対応する抗体の生産を
ひき起し、この抗体か結合して抗原抗体複合体を形成す
る。抗体分子は、抗原の特徴的構造または抗原決定基（
ｅｐｉｔｏｐｅ ）に特異的がっ相補的な結合部位を有
する。
中の外来物質に反応することにより機能する。ある種の
蛋白質である抗体（もしくは免疫グロブリン）が生体中
に侵入した外来蛋白質と結合してこれを中和する。これ
らの抗原と呼ばれる外来蛋白質は対応する抗体の生産を
ひき起し、この抗体か結合して抗原抗体複合体を形成す
る。抗体分子は、抗原の特徴的構造または抗原決定基（
ｅｐｉｔｏｐｅ ）に特異的がっ相補的な結合部位を有
する。
ＭＨＣに結合したＩｒ遺伝子のコントロール下にあるこ
とが知られている免疫応答を誘発するインシュリンは、
物理的および化学的特性が比較的知られた蛋白質である
。インシュリンモノマーは、８間ジスルフィッド結合で
結合された二本の鎖よりなる。
とが知られている免疫応答を誘発するインシュリンは、
物理的および化学的特性が比較的知られた蛋白質である
。インシュリンモノマーは、８間ジスルフィッド結合で
結合された二本の鎖よりなる。
Ａ鎖は二つのシスティン７および１１０間の鋼内ジスル
フィットゝ結合により形成されたループ部分で区切られ
た二つのラセン部を有し、Ｂ鎖はアミン末端およびカル
ボキシ末端の折り畳みシートセグメントと中央部に結合
したラセン部分よりなり、Ａ−鎖のカルボキシ末端側ラ
セン部分とからみ合っている。
フィットゝ結合により形成されたループ部分で区切られ
た二つのラセン部を有し、Ｂ鎖はアミン末端およびカル
ボキシ末端の折り畳みシートセグメントと中央部に結合
したラセン部分よりなり、Ａ−鎖のカルボキシ末端側ラ
セン部分とからみ合っている。
外来物質という意味での典型的抗原とは言えないものの
、インシュリンは他の分子に結合可能な表面構造の特徴
を有している。本発明の抗インシュリン抗体はインシュ
リンの表面構造に特異的に結合する抗体として最初に開
発されたものである。
、インシュリンは他の分子に結合可能な表面構造の特徴
を有している。本発明の抗インシュリン抗体はインシュ
リンの表面構造に特異的に結合する抗体として最初に開
発されたものである。
インシュリンレベルの正確な測定にとっては、これらの
単クローン性抗体の二重結合性は重要である。一種の７
７ＬＡ７５単独ではインシュリンレベルの測定にとって
十分でなく、特異性を調べるためには二種のｍＡｂの使
用が好ましい。本発明の６種の単クローン性抗体の任意
の二種以上の組合せを用いて下記記載の二重結合アッセ
イを行なうことが可能である。このようにして、ｍＡ／
）の組合せにより、生体による体内インシュリン分泌を
外来インシュリン（投与された牛または豚インシュリン
）と区別することができる。
単クローン性抗体の二重結合性は重要である。一種の７
７ＬＡ７５単独ではインシュリンレベルの測定にとって
十分でなく、特異性を調べるためには二種のｍＡｂの使
用が好ましい。本発明の６種の単クローン性抗体の任意
の二種以上の組合せを用いて下記記載の二重結合アッセ
イを行なうことが可能である。このようにして、ｍＡ／
）の組合せにより、生体による体内インシュリン分泌を
外来インシュリン（投与された牛または豚インシュリン
）と区別することができる。
本発明の方法は、公知の任意のクローニング方法で実施
できる。次にそのような方法の一例を示すが本発明はこ
れのみに限定されるものではない。
できる。次にそのような方法の一例を示すが本発明はこ
れのみに限定されるものではない。
ＢＡＬＢ／Ｃマウスをヒトまたは牛インシュリンで免疫
し、リンパ節細胞または肺臓細胞のいずれかを取り出す
。次いでこれらインシュリンで免疫された細胞をミエロ
ーマ細胞ラインｓｐ２７ｏ−Ａｇ１４と融合させる。融
合した細胞をマイクロタイタープレートのウェルにまい
て、ＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよ
びチミジンを含む細胞用培地）中にて・・イブリッドで
ない即ち、融合しなかった細胞を死滅させる。生き残っ
たハイプリドーマのうち、一部のもののみが目的の抗体
を生産する。したかつて、細胞の増殖が認められるウェ
ルにつき、ラジオイムノアッセイにより免疫源に対する
結合性の有無を調べ、次いで正常腹腔マクロファージで
の限界希釈法によるクローン化を行なう。クローン化し
た抗インシュリン抗体産生細胞ラインは、次いで組織培
養法で増殖させ、凍結保存して将来の使用に供するが、
またはフリスタン（ｐｒｉｓｔａｎｓ）で前処理したマ
ウスに注射して大量の抗体もしくは抗体含有上澄を得る
ための細胞源として使用する。
し、リンパ節細胞または肺臓細胞のいずれかを取り出す
。次いでこれらインシュリンで免疫された細胞をミエロ
ーマ細胞ラインｓｐ２７ｏ−Ａｇ１４と融合させる。融
合した細胞をマイクロタイタープレートのウェルにまい
て、ＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよ
びチミジンを含む細胞用培地）中にて・・イブリッドで
ない即ち、融合しなかった細胞を死滅させる。生き残っ
たハイプリドーマのうち、一部のもののみが目的の抗体
を生産する。したかつて、細胞の増殖が認められるウェ
ルにつき、ラジオイムノアッセイにより免疫源に対する
結合性の有無を調べ、次いで正常腹腔マクロファージで
の限界希釈法によるクローン化を行なう。クローン化し
た抗インシュリン抗体産生細胞ラインは、次いで組織培
養法で増殖させ、凍結保存して将来の使用に供するが、
またはフリスタン（ｐｒｉｓｔａｎｓ）で前処理したマ
ウスに注射して大量の抗体もしくは抗体含有上澄を得る
ための細胞源として使用する。
各抗体の親和性の同定
各抗体と、それらの産生に用いたインシュリンとの親和
性は、ラジオイムノアッセイ（Ｒ工Ａ）変法において該
抗体の１２５■−インシュリンに対する結合のコールド
インヒビジョンにより決定した。
性は、ラジオイムノアッセイ（Ｒ工Ａ）変法において該
抗体の１２５■−インシュリンに対する結合のコールド
インヒビジョンにより決定した。
免疫血清を一定希釈し、標識インシュリンの濃度または
未標識インシュリンと標識インシュリンとの混合物の濃
度を変えることにより作成したとき、二種の結合曲線は
同一であった。これにより、この方法において１２５ニ
ーインシユリンは未標識インシュリンと変らぬ反応性を
持つことが確認された。２７〜７５％の標識インシュリ
ンを結合したバイブリドゝ−マ腹水の希釈物（ＰＢＳ中
の１％ ＢＳＡ。
未標識インシュリンと標識インシュリンとの混合物の濃
度を変えることにより作成したとき、二種の結合曲線は
同一であった。これにより、この方法において１２５ニ
ーインシユリンは未標識インシュリンと変らぬ反応性を
持つことが確認された。２７〜７５％の標識インシュリ
ンを結合したバイブリドゝ−マ腹水の希釈物（ＰＢＳ中
の１％ ＢＳＡ。
０．０２％ナトリウムアジドで希釈）２０μｌを未標識
インシュリン（’／４１ｏｇ１ｏ希釈列による、１ｏ。
インシュリン（’／４１ｏｇ１ｏ希釈列による、１ｏ。
倍濃度範囲）２０μｌと、各濃度につき６本の試験管で
混合し、３７ｔｌ’で１時間インキュベートした。１２
５エーインシュリ：／’ｔ １０−１５Ｘ １ Ｏ３Ｃ
Ｐｍ ’を含む液２０μｌを加えた。混合物を攪拌し、
４Ｃで一夜放置して平衡状態にもたらした。ヒトＡＢ血
清を担体として８０μｍ３／１１Ｌｌ含む２７％ポリエ
チレングリコール５０μｌを加えて免疫複合体を沈殿さ
せた。混合物を１０００ＸＣで１時間遠心分離した。上
澄を吸引して除き、沈殿の放射能をガンマ線計数器で測
定した。最大沈殿可能１２５ニーインシユリンの計測は
、各アッセイにつき高濃度抗体サンプルを用いて決定し
た。バックグラウンド結合（５−１５％）は三種のコン
トロールを用いて測定した：希釈液のみ、１：５希釈の
ＮＭＳ（正常マウス血清）、および１：５希釈のＰ５−
Ｘ６３−Ａｙ ８腹水。各コールドインシュリン濃度に
おける結合パーセントを結合したインシュリン濃度の計
算に用い、次いで結合インシュリンと遊離インシュリン
の比率の計算に用いた。親和性は直線回帰プログラムを
使用して線の負傾斜から決定した。
混合し、３７ｔｌ’で１時間インキュベートした。１２
５エーインシュリ：／’ｔ １０−１５Ｘ １ Ｏ３Ｃ
Ｐｍ ’を含む液２０μｌを加えた。混合物を攪拌し、
４Ｃで一夜放置して平衡状態にもたらした。ヒトＡＢ血
清を担体として８０μｍ３／１１Ｌｌ含む２７％ポリエ
チレングリコール５０μｌを加えて免疫複合体を沈殿さ
せた。混合物を１０００ＸＣで１時間遠心分離した。上
澄を吸引して除き、沈殿の放射能をガンマ線計数器で測
定した。最大沈殿可能１２５ニーインシユリンの計測は
、各アッセイにつき高濃度抗体サンプルを用いて決定し
た。バックグラウンド結合（５−１５％）は三種のコン
トロールを用いて測定した：希釈液のみ、１：５希釈の
ＮＭＳ（正常マウス血清）、および１：５希釈のＰ５−
Ｘ６３−Ａｙ ８腹水。各コールドインシュリン濃度に
おける結合パーセントを結合したインシュリン濃度の計
算に用い、次いで結合インシュリンと遊離インシュリン
の比率の計算に用いた。親和性は直線回帰プログラムを
使用して線の負傾斜から決定した。
種変異競合アッセイは、上記と厳密に同様に行なったが
、ｍＡｈとそのヨウ１化免疫源との結合の競合相手には
異なる種類のインシュリン（変異インシュリンという）
を使用した。変異インシュリンの各濃度は１０倍づつ増
加する１００万倍濃度範囲で結合阻止の試験のため使用
した。非放射仕種変異インシュリン、１２５■−インシ
ュリンおよび抗体希釈混合物は、４Ｃ−夜の代りに２ｃ
で１時間だけインキュベートした。次に、混合物を上記
同様に処理し、データは結合ノミ−セント対インヒビタ
ーの濃度の関係として表わした（１００％結合とはイン
ヒビターの不存在下における結合とする）。各カーブか
ら５０％阻止点を決定し、■５０比をめるため、１２５
ニー免疫源に対する結合を５０チ阻止するに要した種変
異インシュリンの濃度を、同じく５０％阻止を与える非
放射性免疫源の濃度で割った値を算出した。
、ｍＡｈとそのヨウ１化免疫源との結合の競合相手には
異なる種類のインシュリン（変異インシュリンという）
を使用した。変異インシュリンの各濃度は１０倍づつ増
加する１００万倍濃度範囲で結合阻止の試験のため使用
した。非放射仕種変異インシュリン、１２５■−インシ
ュリンおよび抗体希釈混合物は、４Ｃ−夜の代りに２ｃ
で１時間だけインキュベートした。次に、混合物を上記
同様に処理し、データは結合ノミ−セント対インヒビタ
ーの濃度の関係として表わした（１００％結合とはイン
ヒビターの不存在下における結合とする）。各カーブか
ら５０％阻止点を決定し、■５０比をめるため、１２５
ニー免疫源に対する結合を５０チ阻止するに要した種変
異インシュリンの濃度を、同じく５０％阻止を与える非
放射性免疫源の濃度で割った値を算出した。
二重結合アッセイは、親和性を利用して精製したｍＡｂ
または４０％（ＮＨ４）２Ｓ０４分画を２回行った腹水
の１：１００希釈したもの１００μノを４〜１６時間ポ
リビニルプレートのウェルへ結合させた。次いでプレー
トを６回ＰＢＳ／ＴＷ２０で洗い、次いでウェルの非特
異的部位をＫＬＨ溶液（ＰＢＳ／ＴＷ２０中の０．１％
ＫＬＨ）にて２２Ｃで６０分間飽和すせた。ＫＬＨ（キ
イホール・リムペット・ヘモシアニン）を非特異的部位
を飽和させる蛋白質に選んだ理由は、ノ；ツクグラウン
ド結合が最も小さいためである。１μｌ／ｍｌの牛イン
シュリン１００μｌを加えて全ての結合部位を飽和させ
た。予備試験によれば、全抗体結合部位を飽和させるの
に１００ｎｌ／ｍｌｌのインシュリンで十分であったが
、１０倍過剰量でも同様の結合が得られ、従って引き続
く全てのアッセイにおいてこの濃度を用いた。
または４０％（ＮＨ４）２Ｓ０４分画を２回行った腹水
の１：１００希釈したもの１００μノを４〜１６時間ポ
リビニルプレートのウェルへ結合させた。次いでプレー
トを６回ＰＢＳ／ＴＷ２０で洗い、次いでウェルの非特
異的部位をＫＬＨ溶液（ＰＢＳ／ＴＷ２０中の０．１％
ＫＬＨ）にて２２Ｃで６０分間飽和すせた。ＫＬＨ（キ
イホール・リムペット・ヘモシアニン）を非特異的部位
を飽和させる蛋白質に選んだ理由は、ノ；ツクグラウン
ド結合が最も小さいためである。１μｌ／ｍｌの牛イン
シュリン１００μｌを加えて全ての結合部位を飽和させ
た。予備試験によれば、全抗体結合部位を飽和させるの
に１００ｎｌ／ｍｌｌのインシュリンで十分であったが
、１０倍過剰量でも同様の結合が得られ、従って引き続
く全てのアッセイにおいてこの濃度を用いた。
未結合インシュリンはＰＢＳ／ＴＷ２０による５回の洗
浄で除去した。第二単クローン性抗体（第二ｍＡｂ）と
して、ＥＬ工ＳＡアッセイにはビオチン化ｍＡｂ、 Ｒ
ＩＡにはヨウ素化ｍＡｈを１００μＡ加えたが、ビオチ
ン化抗体では１ ：１０００希釈（８３ｎ、！？抗体／
ウェル）〔予備試験においてｉ ： ｉ ｏｏ。
浄で除去した。第二単クローン性抗体（第二ｍＡｂ）と
して、ＥＬ工ＳＡアッセイにはビオチン化ｍＡｂ、 Ｒ
ＩＡにはヨウ素化ｍＡｈを１００μＡ加えたが、ビオチ
ン化抗体では１ ：１０００希釈（８３ｎ、！？抗体／
ウェル）〔予備試験においてｉ ： ｉ ｏｏ。
ないしｉ：５ｏｏｏの希釈で、ＫＬＨをインシュリンの
代りに用いるバックグランドコントロールに比して容易
に検出しうるＥＬＩＳＡ値を与えることが判明した〕、
放射標識抗体では７Ｘ１０’ないし１．２ｘ１０５Ｃｐ
ｍ（７−１１２ｎｙ抗体／ウェル）を用いた。こうして
−楔結合させた。プレートをＰＢＳ／ＴＷ２０で５回洗
浄し、ガンマ線計数器で計測するかまたはＥＬＩＳＡ法
で検定を行った。ビオチン化ｒｒＬＡｈは二重結合アッ
セイにおいてイン７ュリンの代りにＫＬＨを用いたとき
高いバックグラウンドを与えることがあるので、各アッ
セイにおける各抗体の対に対して、ビオチン化第二ｍｏ
ｂとともに高濃度（１００倍過剰量）のインシュリンを
含むコントロールを用意し、過剰量のインシュリン添加
でＥＬＩＳＡ値の変化したもののみを二重結合法におけ
る陽性と判断した。各抗体の対につきＲＩＡで２−５回
、そしてＥＬＩＳＡで２−５回試験した。バックグラウ
ンドより２倍より大きいＲＩＡ値のみを有意と判定し、
１２５１一抗体（２−７５Ｘ１０３ＣＰｒｒＬ）の０．
２−２７ｒＬＦの結合を検出した。４９２ｎｍのＥＬＩ
ＳＡ値はバックグラウンドゝに比して０．１ないし１．
９０． Ｄ、高い値に分布した。二重結合試験のデータ
は表１に記載する。
代りに用いるバックグランドコントロールに比して容易
に検出しうるＥＬＩＳＡ値を与えることが判明した〕、
放射標識抗体では７Ｘ１０’ないし１．２ｘ１０５Ｃｐ
ｍ（７−１１２ｎｙ抗体／ウェル）を用いた。こうして
−楔結合させた。プレートをＰＢＳ／ＴＷ２０で５回洗
浄し、ガンマ線計数器で計測するかまたはＥＬＩＳＡ法
で検定を行った。ビオチン化ｒｒＬＡｈは二重結合アッ
セイにおいてイン７ュリンの代りにＫＬＨを用いたとき
高いバックグラウンドを与えることがあるので、各アッ
セイにおける各抗体の対に対して、ビオチン化第二ｍｏ
ｂとともに高濃度（１００倍過剰量）のインシュリンを
含むコントロールを用意し、過剰量のインシュリン添加
でＥＬＩＳＡ値の変化したもののみを二重結合法におけ
る陽性と判断した。各抗体の対につきＲＩＡで２−５回
、そしてＥＬＩＳＡで２−５回試験した。バックグラウ
ンドより２倍より大きいＲＩＡ値のみを有意と判定し、
１２５１一抗体（２−７５Ｘ１０３ＣＰｒｒＬ）の０．
２−２７ｒＬＦの結合を検出した。４９２ｎｍのＥＬＩ
ＳＡ値はバックグラウンドゝに比して０．１ないし１．
９０． Ｄ、高い値に分布した。二重結合試験のデータ
は表１に記載する。
抗体産生細胞ライン
本発明で使用される細胞ラインは表２に記載されている
。
。
テストキット
細胞ラインおよびその産生ずるｍＡｂの使用のためのギ
ットは慣用技術を使用して実験室で容易に考案できる。
ットは慣用技術を使用して実験室で容易に考案できる。
これらは交叉特異性または各インシュリンレベルの定量
に応じて構成することができ、特定種類のインシュリン
の存在の試験を行なうための本発明の一般目的のために
適合させることができる。
に応じて構成することができ、特定種類のインシュリン
の存在の試験を行なうための本発明の一般目的のために
適合させることができる。
表に
重結合アッセイ′の結果
２３４５６
１ ＨＨＨＭＬ
２Ｈ−一−−−Ｌ
３ Ｌ Ｌ −−Ｈ
４ＨＬＬ ＭＨ
５ＨＬ Ｌ ｆ（Ｈ
６ＬＬＬＬ、Ｍ
ｍ＝ 第２ｍＡｈを化学標識したときは糺合は検出され
なかった。但しこのｍＡ／＋を第１にプレートにコート
したときは、結合が検出された。
なかった。但しこのｍＡ／＋を第１にプレートにコート
したときは、結合が検出された。
手続補正書
昭和５９年６り／ｐ日
特許庁長官 若杉和夫 殿
１、事件の表示 １
昭和５９年特許願第６２０８０ 号
２、発明の名称
抗インシュリン抗体及びインシュリンの検出法６、補正
をする者 事件との関係 特許出願人 住所 名 称 アメリカ合衆国 ４、代理人 明細書の〔発明の詳細な説明〕ｍ、ｉ、明細書第５頁第
１８行の「命名される。」を次のように補正する。
をする者 事件との関係 特許出願人 住所 名 称 アメリカ合衆国 ４、代理人 明細書の〔発明の詳細な説明〕ｍ、ｉ、明細書第５頁第
１８行の「命名される。」を次のように補正する。
［命名される。なお、これらの細胞はＡ Ｔ’ ＣＧ（
Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏ１
１ｅｃｔｉｏｎ ）に寄にされ、次表に示す寄託番号が
与えられて℃・る。
Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏ１
１ｅｃｔｉｏｎ ）に寄にされ、次表に示す寄託番号が
与えられて℃・る。
細胞ライン ＡＴＣＧ寄託番号
ＡＥ９Ｄ６ ＨＢ−１２５
ＤＢ９０８ ＨＢ−１２４
ＣＧ９Ｃ１０ＨＢ−１２３
Ｃ（，７Ｃ７ＨＢ−１２６
ＢＥ３Ｆ９ ＨＢ−１ろろ
ＣＥ９Ｈ９ＨＢ−１２７
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （１）次の細胞ライン： ＡＥ９Ｄ６．ＤＢ９Ｇ８゜Ｃ
Ｃ９Ｃ１０，Ｃｅ２Ｏ２，ＢＥ３Ｆ９．およびＧＥ９Ｈ
９よりなる群から選ばれる細胞ラインから分泌される抗
インシュリン抗体を用いてインシュリンを正確に検出す
る方法。 （２） Ａ Ｅ ９ Ｄ ６の細胞ラインから分泌され
る抗インシュリン抗体を用いてインシュリンＡ−鎖を検
出する特許請求の範囲第１項記載の方法。 （３）細胞ラインがＤＢ９（１，８である特許請求の範
囲第１項記載の方法。 （４）細胞ラインがＣＣ９Ｃ１０である特許請求の範囲
第１項記載の方法。 （５）細胞ラインがｃｅ７ｃ７である特許請求の範囲第
１項記載の方法。 （６） 細胞ラインがＢＥ３Ｆ９である特許請求の範囲
第１項記載の方法。 （力 細胞ラインがＧＥ９Ｈ９である特許請求の範囲第
１項記載の方法。 （８）ＡＥ９Ｄ６．ＤＢ９Ｇ８．ＣＣ９Ｃ１０，Ｃ（，
７Ｃ７゜ＢＥ３Ｆ９．およびＧＥ９Ｈ９よりなる群から
選ばれるインシュリンの存在を検出するために用いられ
る細胞ラインから分泌された抗インシュリン抗体。 （９） ＡＥ９Ｄ６．ＤＢ９Ｇ８．ＣＣ９Ｃ１０，Ｃｅ
２Ｏ２゜ＢＥ３Ｆ９．およびＣＥ９Ｈ９よりなる群から
選ばれる細胞ラインから分泌された特許の特異性をｍｌ
複数の単クローン性抗体を組合せて使用することよりな
る、外部から投与したインシュリンと区別してヒト体内
由来のインシュリンレベルを測定する特許請求の範囲第
１項記載の方法。 （１０） ＡＥ９Ｄ６．ＤＢ９Ｇ８．ＣＣ９Ｃ１０，Ｃ
ｅ２Ｏ２゜ＢＥ３Ｆ９およびＣＥ９Ｈ９よりなる群から
選ばれる細胞ラインから単りローン性抗インシュリン抗
体を得、この抗体一種以上よりなる一対を測定すべきイ
ンシュリンと接触させ、ラジオイムノアッセイ、二重結
合アッセイまたは生物学的に可能な任意のアッセイ法に
より各抗体の親和性を決定することよりなる、ヒトイン
シュリンレ（ルを測定する特許請求の範囲第１項記載の
方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US48014283A | 1983-03-29 | 1983-03-29 | |
| US480142 | 1983-03-29 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6057253A true JPS6057253A (ja) | 1985-04-03 |
Family
ID=23906818
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59062080A Pending JPS6057253A (ja) | 1983-03-29 | 1984-03-29 | 抗インシユリン抗体及びインシユリンの検出法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6057253A (ja) |
| CH (1) | CH666490A5 (ja) |
| DE (1) | DE3411472A1 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60188327A (ja) * | 1984-03-08 | 1985-09-25 | Sekisui Chem Co Ltd | ブタインスリンもしくはヒトインスリンに対する単クロ−ン性抗体およびその製造方法 |
| JPH0210159A (ja) * | 1988-02-29 | 1990-01-12 | Boehringer Mannheim Gmbh | 螢光偏光免疫検定法原理によるタンパク質の測定方法およびハイブリッドクローン |
| JP2014117255A (ja) * | 2012-12-19 | 2014-06-30 | Tosoh Corp | インシュリン認識抗体およびそれを用いたインシュリン吸着剤 |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6196985A (ja) * | 1984-10-19 | 1986-05-15 | Taisho Pharmaceut Co Ltd | 細胞クロ−ンの製造方法 |
| JPH0198968A (ja) * | 1987-10-12 | 1989-04-17 | Tosoh Corp | ヒス・インスリンの測定方法 |
| DE4025725A1 (de) * | 1990-08-14 | 1992-02-20 | Boehringer Mannheim Gmbh | Monoklonale antikoerper, die mit human- und ratteninsulin bindefaehig sind |
| AU5446700A (en) * | 1999-05-28 | 2000-12-18 | Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The | A combined growth factor-deleted and thymidine kinase-deleted vaccinia virus vector |
-
1984
- 1984-03-28 DE DE3411472A patent/DE3411472A1/de not_active Withdrawn
- 1984-03-29 JP JP59062080A patent/JPS6057253A/ja active Pending
- 1984-03-29 CH CH1592/84A patent/CH666490A5/de not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| J.IMMUNOL=1979 * |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60188327A (ja) * | 1984-03-08 | 1985-09-25 | Sekisui Chem Co Ltd | ブタインスリンもしくはヒトインスリンに対する単クロ−ン性抗体およびその製造方法 |
| JPH0210159A (ja) * | 1988-02-29 | 1990-01-12 | Boehringer Mannheim Gmbh | 螢光偏光免疫検定法原理によるタンパク質の測定方法およびハイブリッドクローン |
| JP2014117255A (ja) * | 2012-12-19 | 2014-06-30 | Tosoh Corp | インシュリン認識抗体およびそれを用いたインシュリン吸着剤 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE3411472A1 (de) | 1984-10-18 |
| CH666490A5 (de) | 1988-07-29 |
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