EP0547076A1 - Cd58 spezifischer monoklonaler antikörper und dessen verwendung - Google Patents

Cd58 spezifischer monoklonaler antikörper und dessen verwendung

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EP0547076A1
EP0547076A1 EP91914802A EP91914802A EP0547076A1 EP 0547076 A1 EP0547076 A1 EP 0547076A1 EP 91914802 A EP91914802 A EP 91914802A EP 91914802 A EP91914802 A EP 91914802A EP 0547076 A1 EP0547076 A1 EP 0547076A1
Authority
EP
European Patent Office
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cells
cell
mak
antibody
supernatant
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP91914802A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Anni Barbara Endler-Jobst
Stefan Meuer
Reiner Wallich
Percy Knolle
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BASF SE
Original Assignee
BASF SE
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Filing date
Publication date
Application filed by BASF SE filed Critical BASF SE
Publication of EP0547076A1 publication Critical patent/EP0547076A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2824—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD58
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the invention relates to a new monoclonal antibody against the human CD58 molecule and its production and use.
  • mice The fusion of mouse myeloma cells with spleen cells from immunized mice (Koehler and Milstein, Nature 256: 495-497 (1975)) was the first indication of the possibility of obtaining continuous cell lines which produce so-called monoclonal antibodies (mAbs), which then in turn can be used for a wide variety of scientific studies.
  • mAbs monoclonal antibodies
  • the CD58 glycoprotein is expressed on a number of human body cells. It was launched in 1987 as a natural ligand for CD2, a
  • CD58-specific mAbs With the help of CD58-specific mAbs, it is possible to detect CD58-positive cells and to inhibit the cytolytic activity of T cells. Two such antibodies are already commercially available:
  • the invention relates to the CD58-specific mAb AICD58.1 and the hybridoma cell line which forms this mAb (ECACC No. AICD.58.1 / 90082401).
  • the preparation of the mAK was based on known methods (e.g. Monoclonal Antibodies, Kennet et al., Plenum Press: 363 (1980) and Selected Methods in Cellular Immunology, Mishell and Shiigi: 351 (1980)).
  • mice are immunized several times with phytohaemagglutinin (PHA) -stimulated human T cell blasts.
  • PHA phytohaemagglutinin
  • the spleen cells of the immunized animals are isolated and fused with cells of a myeloma cell line.
  • the cultures obtained are examined for their content of specific antibodies.
  • the supernatants of growing hybridomas are tested using indirect immunofluorescence for the detection of CD58 molecules on the surface of K562 cells (ATCC CCL 243) in the fluorescence-activated cell sorter (FACS). Suitable cultures are used to isolate colonies derived from single cells using the "limiting dilution cloning" method. In this way, m ridome, who produce specific bodies, receives for human beings Molecule.
  • the supernatants of the hybridomas are in the immunoprecipitation (Monoclonal Antibodies: Principles and Practice,
  • AICD58.1 A specific antibody for the hybridoma identified in the human CD58 molecule was named AICD58.1.
  • This hybridoma cell line is available from the European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), PHLS Center for Applied Microbiology and Research, Porton Down, Salisbury SP4 OJ6, in Great Britain on August 24, 1990 under the number No. AICD.58.1 / 90082401.
  • the MAK is isolated from CD58 by purification from ascitis or from in vitro culture supernatants of the cell line AICD58.1
  • the MAK AICD58.1 is an antibody with the isotype IgG2a. As was shown in competition experiments, he recognizes a different epitope of the CD58 molecule than the mAK TS2 / 9 and G26.
  • CD58 antibodies also differs in its isotype from the known CD58 antibodies. This opens up the possibility of detecting soluble CD58 molecules from body fluids and cell culture supernatants in a suitable test system. With the AICD58.1 mAb, CD58-positive cells can be identified, the cytolytic activity of T cells inhibited and cell-cell interactions influenced.
  • the CD58 molecule is one of the proteins that mediate the adhesion of different cell populations.
  • the process of adhesion plays a central role in inflammatory diseases such as rheumatoid arthritis, diabetes mellitus, systemic lupus erythematosus, atherosclerosis or multiple sclerosis.
  • the antibody can therefore be used to treat these diseases and to prevent graft rejection.
  • Soluble LFA3 can be removed by affinity chromatography using the mAK AICD58.1.
  • peripheral human blood cells from any healthy donor were stimulated with 50 ⁇ g / ml PHA in 50 ml culture medium (RPMI 1640 plus) for 4 days at 37 ° C.
  • the stimulated cells thus obtained were divided into aliquots of 2 ⁇ 10 7 cells on the 5th day and frozen.
  • the aliquots were thawed, cultured overnight in RPMI 1640 plus and injected intraperitoneally the following morning to Balb / c mice (2 ⁇ 107 cells / 500 ⁇ l PBS) and the process was repeated four times with an interval of 14 days.
  • the spleens were removed from the immunized mice 3 days after the last injection.
  • RPMI 1640 plus is RPMI 1640 supplemented with 10 mM L-glutamine, 1000 units penicillin / ml, 100 ⁇ g Streptomyc in / ml and 10% fetal calf serum. b) Preparation of a spleen cell suspension
  • the spleens were ground into a single cell suspension by pressing the organs through a stainless steel sieve (pore size 100 ⁇ m). The cell suspension was transferred to RPMI 1640 plus, washed three times with RPMI 1640 plus and resuspended therein. c) Myeloma cell growth Myeloma cells from the Ag8.653 (ATCC
  • CRL 1580 is used.
  • the cells are resistant to 20 ⁇ g / ml 8-azaguanine and (due to the absence of the enzyme HGPRTase) can no longer grow in RPMI 1640 plus, which also contains hypoxanthine, aminopterin and thymidine (HAT). Until the merger, the
  • the spleen cell suspension (5 x 10 7 cells) was mixed with the myeloma cells (10 7 cells) and washed with serum-free medium RPMI 1540. The cells were then resuspended in 30 ml serum-free medium and centrifuged in a 50 ml conical polypropylene tube at 800 rpm for 5 minutes. The supernatant was aspirated to 200 ⁇ l and 1.5 ml of a 37 ° C. warm solution of polyethylene glycol (PEG) with the molecular weight 1500 were carefully added to the cell pellet within 3 min. The cell pellet was mixed with the PEG by tapping gently. Then 1.5 ml of serum-free medium (37 ° C.) were added within 30 seconds.
  • PEG polyethylene glycol
  • Example 2 a) Identification of CD58-specific mAK 10 6 ⁇ 562 cells which are 100% positive for the expression of CD58 were in 1 ml phosphate buffer (PBS) containing 1% (v / v) bovine serum albumin (BSA ) and 0.1% (v / v) sodium azide had been added, taken up and centrifuged at 400 xg for 10 min at 4 ° C. The supernatant was discarded and the cell pellet was taken up in 100 ⁇ l culture supernatant of a hybridoma and incubated at 4 ° C. for 30 min. 3 ml of PBS were then added and the cells were centrifuged as described above.
  • PBS phosphate buffer
  • BSA bovine serum albumin
  • the supernatant was discarded again and the cell pellet was incubated in 100 ⁇ l of a fluorescence-labeled AK (F (ab) 2 fragment of a goat anti-mouse immunoglobulin antibody, Dako, 1:40 dilution) at 4 ° C. for 30 min. After washing (see above) the cells were in
  • the isotype of the MAK AICD58.1 was determined using indirect immunofluorescence. 10 6 k562 cells were incubated with cell culture supernatant of the corresponding hybridoma and then with fluorescein-labeled isotype-specific antisera (for implementation see a)). It was shown that the AICD58.1 is an igG2a mAb.
  • Balb / c mice received for conditioning the peritoneum 0.5 ml of pristane ® ip After 10 days, the treated animals was added a suspension of 0 7 hybridoma cells in 0.5 ml PBS ip administered per animal. After 9 more days, the peritoneum of the mice was cannulated and the cell-containing liquid was collected. The cellular components were separated from the removed ascitis fluid by centrifugation (5 min, 5000 rpm). The supernatant, which contained the monclonal antibodies, was frozen in aliquots at -70 ° C. until purification.
  • the columns were then rinsed again with binding buffer for 15 min.
  • the mAK was eluted with 0.1 M citrate buffer with different pH values. First eluted with citrate buffer pH 6.0 for 20 min, then with pH 4.5 buffer.
  • the MAK AICD58.1 was eluted from the column.
  • a photometer analyzed the eluted fractions at 280 nm.
  • the fractions containing the antibody were pooled, the pH was adjusted to 7.0 with 1 N sodium hydroxide solution and concentrated in vacuo with the aid of collodion tubes (exclusion size 12 KD) Dialyzed overnight against PBS at 4 ° C and finally frozen at -70 ° C.
  • nitrocellulose was then incubated with the MAK AICD58.1 for 2 h at RT. After washing the membrane thoroughly, the incubation with a peroxidase-labeled anti-mouse immunoglobulin antibody followed.
  • the nitrocellulose membrane was then washed again and then incubated with diaminobenzidine (0.5 mg / ml PBS pH 7.4) and H 2 O 2 (0.02% v / v). Nickel sulfate (0.03% w / v) was added for reinforcement.
  • the marked bands were identical to those that were detected when incubated with the CD58-specific mAK TS2 / 9.
  • Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), 10 mM ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) and 10 mM sodium fluoride (NaF), 1% Triton ® X-100, 0.15 M NaCl, 0.5% Na-oesoxycholate, 1 mM phenylmethanesulfonyl fluoride, 20 mM iodoacetamide and 2 ⁇ g / ml trypsin inhibitor lysed.
  • EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid
  • EGTA ethylene glycol tetraacetic acid
  • NaF sodium fluoride
  • Triton ® X-100 0.15 M NaCl
  • Na-oesoxycholate 1 mM phenylmethanesulfonyl fluoride
  • 20 mM iodoacetamide 20 ⁇ g / ml trypsin inhibitor lysed.
  • the cell lysate was washed three times for 2 h at 4 ° C with 50 ul protein A-Sepharose ® -4CL prepurified.
  • the tube with the lysate and 50 ml of Protein-A-Sepharose ® -4Cl was clamped in an overhead rotator. The specific absorption took place in 5 h with CNBr-activated Sepharose ® beads which had been loaded with mAK AICD58.1.
  • the beads with the bound antigen were then washed twice in 0.01 M NaH 2 PO 4 , 10 mM EDTA, 10 mM EGTA, 10 mM NaF, 1% Triton® X-100, 0.5 M NaCl and 0.005% SDS.
  • the radioactive immune complexes were then applied to an SDS gradient flat gel (5 to 15%) and separated by molecular weight in the electrophoresis overnight at 70 V under reducing conditions. The molecular weight of the precipitated proteins was determined by autoradiography from the dried gels.
  • the AICD58.1 m delivered the same bands as the mAK TS2 / 9.
  • AICD58.1 therefore recognizes a different epitope of the CD58 molecule than the two mAbs: TS2 / 9 and G26.

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Description

CD58 spezifischer monoklonaler Antikörper und dessen Verwendung Beschreibung Die Erfindung betrifft e en neuen monoklonalen Antikörper gegen das humane CD58-Molekül sowi dessen Herstellung und Verwendung.
Die Fusion von Maus-Myelomzellen mit Milzzellen von immunisierten Mäusen (Köhler und Milstein, Nature 256:495-497 (1975)) war der erste Hinweis auf die Möglichkeit, kontinuierliche Zellinien zu erhalten, die sogenannte monoklonale Antikörper (mAK) produzieren, die dann wiederum für die unterschiedlichsten wissenschaftlichen Untersuchungen eingesetzt werden können.
Das Glykoprotein CD58 wird auf einer Reihe von humanen Körperzellen exprimiert. Es wurde 1987 als natürlicher Ligand von CD2, einem
Oberflächenprotein von T-Lymphozyten, identifiziert (Natur 326:298
(1987)). Mit Hilfe von CD58 spezifischen mAK ist es möglich, CD58-positive Zellen nachzuweisen sowie die zytolytische Aktivität von T-Zellen zu inhibieren. Zwei solcher Antikörper sind bereits kommerziell erhältlich:
TS 2/9 ( C HB 205) und G26 (Behringwerke AG, Marburg).
Gegenstand der Erfindung sind der CD58-spezifische mAK AICD58.1 sowie die diesen mAk-bildende Hybridomzellinie (ECACC No. AICD.58.1/90082401). Die Herstellung des mAK erfolgte in Anlehnung an bekannte Methoden (z.B. Monoclonal Antibodies, Kennet et al., Plenum Press: 363 (1980) und Selected Methods in Cellular Immunology, Mishell and Shiigi: 351 (1980)).).
Zur Gewinnung des mAK werden Balb/c Mäuse mit Phytohämagglutinin (PHA)- stimulierten humanen T-Zellblasten mehrmals immunisiert. Die Milzzellen der immunisierten Tiere werden isoliert und mit Zellen einer Myelomzellinie fusioniert Die erhaltenen Kulturen werden auf ihren Gehalt an spezifischen Antikörpern untersucht. Dazu werden die überstände wachsender Hybridome mit Hilfe der indirekten Immunfluoreszenz zum Nachweis von CD58 Molekülen auf der Oberfläche von K562 Zellen (ATCC CCL 243) im Fluoreszenz aktivierten Zellsorter (FACS) getestet. on geeigneten Kulturen werden nach der Methode des "Limiting Dilution Cloning" Kolonien isoliert, die sich von Einzelzellen ableiten. Auf diesem Wege erhält m ridome, die spezifische An körper produzieren, so auch für das human Molekül. Die überstände der Hybridome werden in der Immunpräzipitation (Monoclonal Antibodies: Principles and Practice,
J. Goding Academic Press, Inc. (1985)) und im Western-Blot untersucht (Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 76:4350 (1979)). Ein in er Fluoreszenz-Analyse und in der Immunpräzipitation als Produzent
spezifischer Antikörper für das humane CD58 Molekül identifiziertes Hybridom erhielt die Bezeichnung AICD58.1. Diese Hybridomzell inie ist bei European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), PHLS Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, Salisbury SP4 OJ6, in Großbritannien am 24.08.1990 unter der Nummer No. AICD.58.1/ 90082401 hinterlegt worden. Die Isolierung des mAK gegen CD58 erfolgt durch die Aufreinigung aus Ascitis oder aus in vitro Kulturüberständen der Zellinie AICD58.1
Der mAK AICD58.1 ist ein Antikörper mit dem Isotyp lgG2a. Wie sich bei Kompetitionsversuchen zeigte, erkennt er ein anderes Epitop des CD58 Moleküls als die mAK TS2/9 und G26.
Weiter unterscheidet er sich in seinem Isotyp von den bekannten CD58-Antikörpern. Damit wird die Möglichkeit eröffnet, lösliche CD58-Moleküle aus Körperflüssigkeiten und Zellkulturüberständen in einem geeigneten Test- System nachzuweisen. Mit dem AICD58.1 mAK können CD58-positive Zellen identifiziert, die zytolytische Aktivität von T-Zellen inhibiert sowie Zell-Zell-Interaktionen beeinflußt werden.
Das CD58-Molekül gehört zu den Proteinen, die die Adhäsion unterschied- licher Zellpopulationen vermitteln. Der Vorgang der Adhäsion spielt eine zentrale Rolle bei entzündlichen Erkrankungen, wie Rheumatoide Arthritis, Diabetis mellitus, Systemischer Lupus Erythematodes, Atherosklerose oder Multiple Sklerose. Der Antikörper kann daher zur Behandlung dieser Krankheiten sowie zur Verhinderung der Transplantatabstoßung verwendet werden. Durch Affinitätschromatographie mit Hilfe des mAK AICD58.1 kann lösliches LFA3 entfernt werden.
Die nachfolgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern: Beispiel 1
Herstellung des mAK AICD58.1 a) Immunisierung von Balb/c Mäusen
108 periphere humane Blutzellen eines beliebigen gesunden Spenders wurden mit 50 μg/ml PHA in 50 ml Kulturmedium (RPMI 1640 plus) 4 Tage bei 37°C stimuliert. Die so erhaltenen stimulierten Zellen wurden am 5. Tag in Aliquots von 2 x 107 Zellen aufgeteilt und eingefroren. Die Aliquots wurden aufgetaut, über Nacht in RPMI 1640 plus kultiviert und am folgenden Morgen Balb/c Mäusen intraperitoneal injiziert (2 x 107 Zellen/500μl PBS) und der Vorgang viermal im Abstand von 14 Tagen wiederholt. 3 Tage nach der letzten Injektion wurden die Milzen der immunisierten Mäuse entnommen.
"RPMI 1640 plus" ist RPMI 1640 supplementiert mit 10 mM L-Glutamin, 1000 Einheiten Penicillin/ml, 100 μg Streptomyc in/ml und 10 % foetalem Kälberserum. b) Präparation einer Milzzellsuspension
Die Milzen wurden zu einer Einzelzellsuspension zerkleinert, indem die Organe durch ein Sieb aus rostfreiem Stahl (Porenweite 100 μm) gepreßt wurden. Die Zellsuspension wurde in RPMI 1640 plus überführt, dreimal mit RPMI 1640 plus gewaschen und darin resuspendiert. c) Wachstum der Myelomzellen Als Fusionspartner wurden Myelomzellen der Linie Ag8.653 (ATCC
CRL 1580) verwendet. Die Zellen sind gegen 20 μg/ml 8-Azaguanin resistent und können (aufgrund des Fehlens des Enzyms HGPRTase) in RPMI 1640 plus, das zusätzlich Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin (HAT) enthält nicht mehr wachsen. Bis zur Fusion wurde die
Myelomzellin in 1640 plus kultiviert. Zur Fusion wurden die Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase verwendet. d) Die Fusion erfolgte in Anlehnung an ein Standardprotokoll, (Mono- klonale Antikörper J.H. Peters, H. Baumgarten, M. Schulze Springer- Vertrag (1985), Seite 32, Selected Methods in Cellular Immunology, Mishell and Shiigi (1980), Seite 351).
Die Milzzellsuspension (5 x 107 Zellen) wurde mit den Myelomzellen (107 Zellen) gemischt und mit serumfreien Medium RPMI 1540 gewaschen. Die Zellen wurden dann in 30 ml serumfreien Medium resuspendiert und in einem 50 ml konischen Polypropylen-Röhrchen bei 800 Upm 5 min zentrifugiert. Der überstand wurde bis auf 200 μl abgesaugt und auf das Zellpellet wurden vorsichtig innerhalb von 3 min 1,5 ml einer 37°C warmen Lösung von Polyethylenglykol (PEG) mit dem Molekulargewicht 1500 gegeben. Das Zellpellet wurde durch leichtes Klopfen mit dem PEG vermischt. Dann wurden innerhalb von 30 sec. 1,5 ml serumfreies Medium (37°C) zugegeben. Nach weiteren 30 sec. wurden nochmals 1,5 ml serumfreies Medium zugesetzt und nach weiteren 30 sec. wurden schließlich noch 10 ml serumfreies Medium über einen Zeitraum von 3 min hinzugege ben. Anschließend wurde die Suspension 5 min bei 1200 Upm und Raumtemperatur zentrifugiert. Das Zellpellet wurde dann in HAT-haltigem Kulturmedium in einer Konzentration von 1 x 106 Zellen/ml resuspendiert und in 0,2 ml Anteilen auf Mikrotiterplatten verteilt. 50.000 peritoneale mononukleare Mauszellen wurden als sog. "Feeder-Zellen" jedem Napf zugesetzt. e) Selektionieren und Anzucht der Hybridome Nach der Zellfusion wurden die Zellen im HAT-Medium bei 37°C mit 7 % CO2 in feuchter Atmosphäre kultiviert. Die Kulturen wurden zweimal in der Woche durch Ersetzen des halben Mediums durch frisches HAT-Medium gefüttert. Nach 3 bis 4 Wochen wurden überstände der Hybridomzell- kulturen auf das Vorhandensein von spezifischen mAK gegen CD58 unter- sucht. Solche Hybridome, deren überstände ein positives Resultat ergaben, wurden mit Hilfe der "Limiting-Dilution Cloning" Technik kloniert. Dabei wurden im Mittel 0,5 Zellen pro Napf einer 96 Mikro- titerplatte ausgesät. 105 Mäusethymozyten wurden als "Feeder-Zellen" zugegeben. Die nach diesem Klonierungsverfahren selektionierten Antikörper-produzierenden Zellen wurden vermehrt, 107 Zellen in foetalem Kälberserum mit 10 % Dimethylsulfoxid eingefroren und in flüssigem Stickstoff aufbewahrt.
Testen der überstände
Beispiel 2 a) Identifikation CD58 spezifischer mAK 106 κ562-Zellen, die 100 % positiv sind für die Expression von CD58, wurden in 1 ml Phosphat-Puffer (PBS), der mit 1 % (v/v) Rinder- Serumalbumin (BSA) und 0, 1 % (v/v) Natriumazid ergänzt worden war, aufgenommen und bei 400 x g 10 min bei 4°C zentrifugiert. Der überstand wurde verworfen und das Zellpellet in 100 μl Kulturüberstand eines Hybridoms aufgenommen und 30 min bei 4°C inkubiert. Anschließend wurden 3 ml PBS zugefügt und die Zellen wie oben beschrieben zentrifugiert. Der überstand wurde wieder verworfen und das Zellpellet in 100 μl eines fluoreszenzmarkierten AK(F(ab)2-Fragments eines Ziege anti- Maus Immunglobulin Antikörpers, Dako, 1:40 Verdünnung) 30 min bei 4°C inkubiert. Nach dem Waschen (s.o.) wurden die Zellen in
PBS/1 % Formalin aufgenommen, im FACS getestet und mit den bis jetzt bekannten CD58 spezifischen mAK TS2/9 und G26 verglichen. Es zeigte s i ch, daß der überstand des Hybri doms AICD58. 1 und di e überstänee der zwei letztgenannten mAK identische Resultate lieferten. b) Isotyp-Bestimmung:
Mit Hilfe der indirekten Immunfluoreszenz wurde der Isotyp des mAK AICD58.1 bestimmt. 106 k562-Zellen wurden mit Zellkulturüberstand des entsprechenden Hybridoms und anschließend mit Fluoreszein markierten Isotyp-spezifischen Antiseren inkubiert (Durchführung siehe a)). Es zeigte sich, daß der AICD58.1 ein igG2a mAK ist.
Beispiel 3
Produktion des Antikörpers a) in Zellkultur (in vitro) 2 x 107 Hybridom-AICD58.1-Zellen wurden in Kulturflaschen mit 175 cm2 Wachstumsfläche ausgesät und der zellfreie überstand gesammelt. Aus diesem überstand wurde dann der mAK AICD58.1 aufgereinigt. b) in der Maus als Ascitis (in vivo)
Balb/c Mäuse erhielten zur Konditionierung des Peritoneums 0,5 ml Pristan® i.p. Nach 10 Tagen wurde den vorbehandelten Tieren eine Suspension von 07 Hybridomzellen in 0,5 ml PBS pro Tier i.p. appliziert. Nach 9 weiteren Tagen wurde mit einer Kanüle des Peritoneum der Mäusen angestochen und die zellhaltige Flüssigkeit gesammelt. Von der entnommenen Ascitisflüssigkeit wurden die zellulären Bestandteile durch Zentrifugation abgetrennt (5 min, 5000 Upm). Der überstand, der die monklonalen Antikörper enthielt, wurde bis zur Aufreinigung in Aliquots bei -70°C eingefroren.
Beispiel 4
Reinigung des Antikörpers Ascitis von Balb/c Mäusen, denen AICD58.1 Hybridomzellen injiziert worden waren (vgl. Beispiel 3), wurde 1:3 in Bindungspuffer (1,5 M
Natriumchlorid, 0,75 M Glycin) verdünnt, der pH auf 8,9 eingestellt und filtriert (Filter mit 0,22 μm Porengröße). Eine 4 ml Protein-A-Sepharose® 4 CL Säule wurde 20 min mit Bindungspuffer äquilibriert. Der verdünnte Ascitis wurde auf die Säule aufgegeben (6 ml verdünnter Ascitis war das Maximum). Wenn der Antikörper aus Kulturüberständen aufgereinigt wurde, wurden entsprechende Mengen Natriumchlorid (1,5 M) und Glycin (0,75 M) den überständen zugegeben und die überstände auf pH 8,9 eingestellt und filtriert. Bis zu einem Liter eines solchen Überstandes konnte auf die Säule aufgegeben werden. Säule und Elutionsbedingungen sind dieselben, wie oben.
Die Säulen wurden hinterher nochmals mit Bindungspuffer 15 min gespült. Die Elution des mAK erfolgte mit 0,1 M Citratpuffer mit unterschiedlichen pH Werten. Zuerst wurde 20 min mit Citratpuffer pH 6,0 eluiert, dann mit Puffer pH 4,5. Hierbei wurde der mAK AICD58.1 von der Säule eluiert.
Während des Elutionsvorganges analysierte ein Photometer die eluierten Fraktionen bei 280 nm. Die Fraktionen, die den Antikörper enthielten, wurden gepoolt, der pH mit 1 N Natronlauge auf 7,0 eingestellt und mit Hilfe von Collodiumhülsen (Ausschlußgröße 12 KD) im Vakuum ankonzentriert, über Nacht gegen PBS bei 4°C dialysiert und schließlich bei -70°C eingefroren.
Beispiel 5
Western-Blot
Der Western-Blot mit dem mAK AICD58.1 wurde in Anlehnung an das Protokoll aus der Veröffentlichung von H. Towbin et al. (Proc. Natl. Acad. Sei.
U.S.A. 76:4350 (1979)) durchgeführt. Dazu wurden 5 x 107 k562 Zellen 1 h bei 4°C lysiert und dann 15 min bei 15000 x g zentrifugiert. Das
Äquivalent von 107 Zellen wurde unter reduzierenden Bedingungen auf ein 10 %iges SDS-Polyacrylamid-Flachgel aufgetragen. Die elektrophoretische Auftrennuπg erfolgte über Nacht bei 70 V. Anschließend wurden die Proteine bei 70 V 4 h auf eine Nitrozellulosemembran (Schleicher und Schüll) geblottet. Freie Bindungsstellen auf der Nitrozellulosemembran wurden dann mit PBS/5 % Milchpulver 2 h bei Raumtemperatur (RT) abgeblockt.
Anschließend wurde die Nitrozellulose mit dem mAK AICD58.1 2 h bei RT inkubiert. Nach gründlichem Waschen der Membran schloß sich die Inkubation mit einem Peroxidase-markiertem anti-Maus-Immunglobulin-Antikörper an. Danach wurde die Nitrozellulosemembran wieder gewaschen und dann mit Diaminobenzidin (0,5 mg/ml PBS pH 7,4) und H2O2 (0,02 % v/v) inkubiert. Zur Verstärkung wurde Nickelsulfat (0,03 % w/v) zugesetzt. Die markierten Banden waren identisch mit denen, die bei der Inkubation mit dem CD58 spezifischen mAK TS2/9 nachgewiesen wurden. Be i sp i e l 6
Immunpräzipitation Oberflächenproteine von 4 x 107 PHA-T-ZelIblasten (Tag 5 nach Stimulation) wurden mit Hilfe der Glukose-Oxidase-Technik mit 1 m Ci Na125I 15 min bei RT markiert. Dazu wurden der Zellsuspension 5 μl Glukose (50 mM), 7 μl Lactoperoxidase (100 nM), 1 μl Na125I und 4 U Glukose-Oxidase (1300 u/ml) zugesetzt. Die Mischung wurde nach 15 min mit 10 ml PBS/2 % fötalem
Kälberserum/0,1 % Natriumazid gewaschen. Die Zellen wurden dann nochmals in PBS, pH 8,3, gewaschen und anschließend in 0,01 M NaH2PO4, 10 mM
Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 10 mM Ethylenglykoltetraessigsäure (EGTA) und 10 mM Natriumfluorid (NaF), 1 % Triton® X-100, 0,15 M NaCl, 0,5 % Na-Oesoxycholat, 1 mM Phenylmethansulfonylfluorid, 20 mM lodacetamid und 2 ug/ml Trypsininhibitor lysiert. Nach einem Zentrifugationsschritt (10 min/1500 x g), bei dem die Zellkerne abgetrennt wurden, wurde das Zell-Lysat dreimal 2 h bei 4°C mit 50 μl Protein-A-Sepharose®-4CL vorgereinigt. Dazu wurde das Röhrchen mit dem Lysat und 50 ml der Protein-A- Sepharose®-4Cl in einen überkopfrotierer eingespannt. Die spezifische Absorption erfolgte in 5 h mit CNBr-aktivierten Sepharose® Beads, die mit mAK AICD58.1 beladen worden waren. Die Beads mit dem gebundenen Antigen wurden dann zweimal in 0,01 M NaH2PO4, 10 mM EDTA, 10 mM EGTA, 10 mM NaF, 1 % Triton® X-100, 0, 5 M NaCl und 0,005 % SDS gewaschen. Die radioaktiven Immunkomplexe wurden anschließend auf ein SDS-Gradienten-Flachgel (5 bis 15 %) aufgetragen und nach dem Molekulargewicht in der Elektropho se über Nacht bei 70 V unter reduzierenden Bedingungen aufgetrennt. Das Molekulargewicht der präzipitierten Proteine wurde mittels Autoradiographie von den getrockneten Gelen bestimmt. Der AICD58.1 m lieferte die gleichen Banden wie der mAK TS2/9.
Beispiel 7
Kompetitionsversuche 106 k562 Zellen wurden mit 100μl überstand des AICD58.1 Hybridoms 30 min bei 4°C vorinkubiert. Anschließend wurden die Zellen gewaschen und mit überständen der ID58 spezifischen Hybridome G26 (IgM), bzw. TS2/9 (IgGl) inkubiert, wobei der Nachweis des zweiten mAK über ein mit Fluoreszein gelabeltes Isotyp-spezifisches Antiserum führte. Es zeigte sich, daß AICD58.1 nicht die Bindung von G26, bzw. TS2/9 blockiert, daß sich aber die zwei letztgenannten mAK gegenseitig blockierten.
AICD58.1 erkennt also ein anderes Epitop des CD58 Moleküls als die beiden mAK: TS2/9 und G26.

Claims

Patentansprüche
1. Monoklonaler CD58-Antikörper, erhältlich aus der Hybridzell inie ECACC No. AICD.58.1/90082401
2. Hybridzell inie ECACC No. AICD.58.1/90082401.
3. Diagnostikum, enthaltend den monoklonalen Antikörper gemäß Anspruch 1. 4. Therapeutikum, enthaltend den monoklonalen Antikörper gemäß
Anspruch 1.
5. Verfahren zur Herstellung eines monoklonalen CD58-Antikörpers, dadurch gekennzeichnet, daß man die Hybridzellinie ECACC No. AICD.
58.1/90082401 in vitro oder in vivo vermehrt und aus dem überstand bzw. dem Ascites den Antikörper in bekannter Weise isoliert.
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