DD295985A5

DD295985A5 - Anti-Tumorzell-Mittel

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Publication number: DD295985A5
Authority: DD
Publication date: 1991-11-21

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung neuer anti-Tumorzell-Mittel, die geeignet sind, einen Weg zur Tumortherapie auf der Basis natürlicher IgM-Antikörper aufzuzeigen. Die erfindungsgemäî hergestellten natürlichen humanen Antikörper (hmAK) CB-P1 bis -P3 - gewonnen aus den Hybridomazelllinien H-CB-P1, H-CB-P2 und H-CB-P3 (ZIM-0517 bis -0519) - weisen anti-Tumor-Aktivitäten auf und rufen unter nach Komplementbeteiligung eine Zelllyse hervor. Die Anwendungsgebiete der Erfindung sind die Medizin und die Pharmazeutische Industrie{Tumortherapie; anti-Tumorzell-Mittelmonoklonale Antikörper, mAK; humane monoklonale Antikörper, hmAK, natürliche hmAK, IgM; Lymphozyten von gesunden Spendern; Hybridomzelllinien H-CB-P1, H-CB-P2 und H-CB-P3 (ZIM-0517 bis -0519)}

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung neuer anti-Tumorzell-Mittel, die geeignet sind, einen neuen Weg zur Tumortherapie auf der Basis naturlicher IgM-Antikorper aufzuzeigen. Die Anwendungsgebiete der Erfindung sind die Medizin und die pharmazeutische Industrie.

Charakterisierung des bekannten Standes der Technik

Die von KÖHLER und MILSTEIN (NATURE, 256,1975,495-497) entwickelte Technik der Herstellung muriner monoklonaler Antikörper (mAk) gestattet die Entwicklung spezifischer Immunglobuline, unter anderem auch gegen Tumormatenal des Menschen So werden in den DE-OS 3413340 und 3413341 (YOSHIMURA, M., et al.) mAK mit spezifischer Wirkung auf Oberflachenantigene der Human-Harnblasen- sowie Prostata-Krebszelle beschrieben, wobei sich die mAk zur Identifizierung der Karzinome und als Mittel zur Behandlung eignen sollen. Gemäß DE-OS 3629640 (BOSSLET, K , et al.) wird die Verwendung von mAkzurTherapie von Tumoren vorgeschlagen. Danach sollen die mAk u.a. die Eigenschaft besitzen. Wachstumshormone Tumor Angiogenesis Factor oder Transforming Growth Factor von Pancreas-Tumorzellen — zu blockieren Therapieversuche mit murinen monoklonalen Antikörpern beim Tumorpatienten jedoch sind wegen der Xenogenitat der Abwehrstoffe der Maus als zumindest problematisch einzuschätzen (OLDHAM, R , et al, CANCER, 54,1984, 2795-2806) und zeigten auch keinen überzeugenden Erfolg (SEARS, H., et al., J. BIOL. RESP. MOD., 3, 1984,138-150, GODMAN, G., et al., J CLIN ONCOL, 3,1985, 340-352).

Bei den Versuchen, humane monoklonale Antikörper gegen Tumorantigene zu entwickeln, wurde bisher immerauf das in vivo sensibilisierte Lymphozytenmatenal von Tumorpatienten selbst zurückgegriffen (meist aus regionaren Lymphknoten). Dabei wurden eine Reihe von humanen monoklonalen Antikörpern der IgG- und IgM-Klasse entwickelt (HELLSTROM, K. E., et al., DD-AP 266028) Diese Antikörper scheinen aber meist lediglich in dem Patienten zu wirken, dessen Lymphozyten fur die Hybridomtechmk verwendet wurden (spezifische Abwehr) Ein Konzept zur Tumorabwehr mit humanen monoklonalen Antikörpern ist bis heute ein ungelöstes Problem.

Ziel der Erfindung

Das Ziel der Erfindung ist es, der Medizin, speziell der Tumortherapie, neue Mittel mit anti-Tumorzell-Aktivitat zur Verfugung zu stellen

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Verfahren zu entwickeln, nach denen sich Mittel herstellen lassen, die zur Tumortherapie geeignet sind Erfmdungsgemaß wurde die Aufgabe dadurch gelost, daß als Wirkstoff menschliche monoklonale Antikörper (hmAk) eingesetzt werden, die anti-Tumorzell-Aktivitaten aufweisen Überraschenderweise hat sich gezeigt, daß Hybribidomzellinien, die aus menschlichen Lymphozyten von gesunden Spendern (ohne nachgewiesenes Tumorgeschehen) durch Fusion mit einer Maus-Myelomzelle gewonnen werden, natürliches humanes monoklonales IgM sezermeren, das zur Hemmung des Wachstums menschlicher Tumorzellen fuhrt und nach Komplementaktivierung eine Zellyse hervorruft Zunächst werden Hybridomzellinien erzeugt, aus denen in anschließenden Verfahrensschritten hmAk gewonnen werden können, die anti Tumorzeil Aktivitäten besitzen Dazu werden menschliche Lymphozyten von gesunden Spendern mit einer Maus-Myelomzellinie fusioniert und aus den derart gewonnen Hybridomzellinien Zeilklone mit anti-Tumorzell-Aktivitat selektiert, zur Züchtung eingesetzt und aus dem Zellkulturuberstand hmAk isoliert Dabei finden Lymphozyten aus dem Milzgewebe des adulten und aus dem Lebergewebe des fetalen Organismus Verwendung Die aus adultem Gewebe durch Fusion mit der Maus-Myelomzellinie gewonnenen Hybridomalinien werden als H-CB-P1 und H-CB-P2, die aus fetalem Lebergewebe erhaltene Linie als H-CB-P3 bezeichnet Die Linien sezermeren menschliches monoklonales IgM (lambda)-CB-P1, CB-P2 und (kappa) CB-P3, das überraschenderweise polyspezifische Aktivität gegenüber Autoantigenen und bakteriellen Antigenen besitzt und in verschiedenen In-vitro-Assays eine Hemmung des Wachstums menschlicher Tumorzellen anzeigt und nach Komplementaktivierung eine Zell-Lyse hervorruft

Die Hybridomzellinien H-CB-P1, H-CB-P2 und H-CB-P3 sind m der Hinterlegungsstelle des Zentralinstituts fur Molekularbiologie (ZIM) der AdW der DDR, Berlin-Buch, unter den Nummern ZIM-0517, ZIM-0518 und ZIM-0519 hinterlegt worden Der Erfindung liegt der Gedanke zugrunde, daß neben dem zellularen auch ein humorales Basis-Abwehrsystem der Tumorabwehr im gesunden Organismus existiert

Es wurden, erfmdungsgemaß, Lymphozyten aus menschlichem adulten Milz- bzw fetalen Lebermatenal gewonnen und mit der Maus Myelomzellinie P3 X63 Ag8 653 (KEARNEY, J , et al., J IMMUNOL 123,1979,1548-1550) mittels Polyethylenglykol (PEG)-Fusion hybridisiert (JAHN, S , et al, HYBRIDOMA, 6,1987,679-688) Die Hybridomzellinien wurden kloniert und rekloniert. Es wurden Mensch-Maus-Heterohybndoma etabliert, die stabil große Mengen an menschlichem IgM (lambda bzw kappa) in den Zellkulturuberstand sezernieren

Die Zellkulturuberstande wurden im ELISA nach bekannten Verfahren auf ihre Reaktivität mit verschiedenen Antigenen hin untersucht (JAHN, S , et al , BIOMED BIOCHIM ACTA, 45,1986, 467-476, KIESSIG, S , et al, ALLERG IMMUNOL , 33,1987, 79-87)

Die anti-Tumorzell-Aktivitat wurde an folgenden menschlichen Tumorlinien nachgewiesen CoIo 205 (ATCC, CCL222), Sw620 (ATCC, CCL227), NCI-H69 (ATCC, HTB-119), Daudi (ATCC, CCL213), Raji (ATCC, CCL86) Die Zellkulturuberstande der H-CB-P1, H-CB-P2 und H-CB-P3 enthalten humanes monoklonales IgM, das mit Tumorlinien in folgenden Assays reagiert 1 Bindung an die Zelloberflache (indirekte Immunfluoreszenz, Durchflußzytometrie) (FALCK, P , et al Z KLIN MED ,42,1987, 2281-2284), 2 Beeinflussung des Wachstums der Tumorzellinien in vitro (Wachstumsverlangsamung, Synzytienbildung, Veränderung des Adharenzverhaltens), 3 Inhibierung der Proliferation menschlicher Tumorzellinien in vitro (verringerter Einbau von ³H-Thymidin), 4 Komplementvermittelte Lyse von menschlichen Tumorzellinien, ⁶¹Cr-Freisetzungstest)

Ausfuhrungsbeispiele

Beispiel 1. H-CB-P1 und H-CB-P2 (ZIM-0517 und-0518)

Die Hybridoma H-CB-P1 und H-CB-P2 wurden durch Fusion von Lymphozyten aus der Milz einer zwölfjährigen Patientin mit idiopathischerThrombozytopenie mit Maus-Myelomzellen P3X63 Ag8 653 gewonnen Die Hybridoma produzieren über zwei Jahre in der In-vitro-Kultur (RPM11640 mit 10% fetalem Kalberserum [FKS] ohne Antibiotika) (JAHN, S , et al, J IMMUNOL METH , 107,1988,59-66) konstant bis zu 100 pg/ml humanes IgM (lambda) Der Anteil der Zellen mit Ig-Produktion betrug stets mehr als 90% Die Zellen wurden mehrfach rekloniert Sie sind mycoplasmenfrei

Beispiel 2 H CB-P3 (ZIM 0519)

Die Hybridomalinie H-CB-P3 wurde durch Fusion von Lymphozyten aus fetalem Lebergewebe (medizinisch indizierter Schwangerschaftsabbruch in der 24 Woche) mit Maus-Myelomzellen P 3XAg 8 653 etabliert Die Produktion von menschlichem IgM (kappa) war über mehrere Monate stabil (10цд/тІ) Die Linie wurde zweimal rekloniert Sie ist mycoplasmenfrei

Beispiel 3. Hemmung des Tumorwachstums

Alle Antikörper hemmten in Konzentrationsbereichen 10 bis 1 цд/ті das In-vitro-Wachstum menschlicher Tumor-Zeil Linien (CoIo205, Sw620, H69, Daudi, Raji)

Morphologische Untersuchungen zeigten verstärkte Synzytienbildung, erhöhte Adharenzneigung, verlangsamtes Wachstum Die Tumor-Zeil Linien wurden über 4 Tage in vitro in Anwesenheit der monoklonalen IgM-Antikorper im Kulturmedium (RPM11640 mit 10% FKS) inkubiert (je zwei Parallelkulturen in 24 well Platten) Als Kontrolle fungierte der konditionierte KulturuberstandderFusionslmie P3X63Ag8 653, der kein Immunglobulm enthalt sowie die Zellkulturuberstande verschiedener Human IgM-produzierender Hybridoma-Linien ohne anti-Tumorzell-Bindungsaktivitat.

Beispiel 4: Komplementvermittelte Zellyse

In Anwesenheit von Meerschweinchenkomplement wurden die Tumorzellen mit und ohne Antikörper CB-P1, CB-P2 undCB-P3 inkubiert. Das Meerschweinchenkomplement wurde wegen seiner Eigenzytotoxizität jeweils vorher austitriert, damit keine Tumorzellen alteriert werden. Die Tumorzellen wurden mit ⁶¹Cr markiert. Die ⁵¹Cr-Freisetzung wurde nach vierstündiger Inkubation bei 37°C und 5% CO₂ bestimmt. Dabei zeigte sich eine komplementabhängige Zellyse abhängig von der Antikörperkonzentration (0,8-3,3 pg/ml), dokumentiert durch die Freisetzung von 25-92% des zur Markierung verwendeten ⁵¹Cr, wobei dieser Effekt sich auf die Tumor-Zellinien beschränkte, die auch in der Immunfluoreszenz eine Reaktion mit den Antikörpern CB-P1, CB-P2 und CB-P3 zeigten. Es wurden also keine Tumorzellen solcher Linien lysiert, denen gegenüber eine Bindung der Antikörper fluoreszenzmikroskopisch nicht detektierbar war (K562 und MoIt 4).

Als Kontrolle fungierte der konditionierte Kulturüberstand der Fusionslinie P3X63 Ag8.653, der kein Immunglobulin enthält sowie die Zellkulturüberstände verschiedener Human-lgM-produzierender Hybridoma-Linien ohne anti-Tumorzell-Bindungsaktivität.

Beispiel 5: Hemmung der Zeilproliferation

Die Tumorzellen wurden, wie im Beispiel 3 beschrieben, mit und ohne Antikörper CB-P1, CB-P2 und CB-P3 inkubiert, über vier Tage wurde zu den entsprechenden Kulturen jeweils 1 цСі ³H-Thymidin für 18 Stunden gegeben. Anschließend wurde der Einbau von ³H-Thymidin in die Tumorzell-DNS (Desoxyribonukleinsäure) am Scintillationszähler bestimmt. Die Antikörper H-CB-P1,H-CB-P2 und H-CB-P3 verursachten im Vergleich zu den Kontrollen (Inkubation mit nicht-reaktiven IgM-Antikörpern und konditioniertem Zellkulturüberstand der Fusionslinie P3X63 Ag8.653, der kein Immunglobulin enthält) eine Prolifertionshemmung mit dem Faktor 60-100 (Beispiel: CoIo 205-Einbau in 18 Stunden 120000cpm [unbehandelt], in Gegenwart von H-CB-P1 (Konzentration 5 цд/ті) бОООсрт.

Beispiel 6: Zubereitung der anti-Tumorzell-Mittel

Die humanen monoklonalen IgM Antikörper CB-P1, CB-P2 oder CB-P3 werden mit Komplement gemischt (IgM-Endkonzentration 2,5pg/ml). Als Komplementquellen dienten Seren von gesunden Spendern der Blutgruppe AB. Die Seren wurden nach der Präparation für 15 min mit humanen Tumorzellen (Konzentration 2 χ 10⁶ Zellen/ml) bei 4⁰C inkubiert, um die spontane Zytotoxizität zu reduzieren. Das Komplement wurde in einer Endverdünnung von 1:4 in RPMI 1640 (Kulturmedium) eingesetzt. Mit diesem Mittel (IgM, Komplement, Kulturmedium) wurden die Tumorzellen bei 37°C und einer 5% CO₂/95% Luft Atmosphäre in vitro inkubiert, der Anteil zerstörter Zellen dokumentiert, wie in Beispiel 4 beschrieben. Als Kontrolle fungierte IgM aus Hybridoma ohne Bindungsaktivität gegenüber den Tumorzellen. Eine Chromfreisetzung von 13-23% beweist die Tumor-Zytotoxizität des erhaltenen Mittels.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung neuer anti-Tumorzell-Mittel, dadurch gekennzeichnet, daß als Wirkstoff natürliche humane monoklonale Antikörper (hmAk) eingesetzt werden, die anti-Tumorzell-Aktivitäten aufweisen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die hmAk in Gegenwart von Komplement Anwendung finden.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß hmAk der Bezeichnung CB-P1, CB-P2 und CB-P3 eingesetzt werden, die von Hybridomzellinien der Bezeichnung H-CB-P1 (ZIM-0517), H-CB-P2 (ZIM-0518) und H-CB-P3 (ZIM-0519) sezerniert werden.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß Hybridomzellinien durch Fusion von humanen Lymphozyten mit einer Maus-Myelomzellinie gewonnen werden, wobei nach der Fusion Hybride abgetrennt und Klone mit anti-Tumorzeil-Aktivitäten selektiert, kloniert und rekloniert werden, bis die Hybridome H-CB-P1, H-CB-P2 und H-CB-P3 erhalten werden, die stabil menschliches IgM (lambda bzw. kappa) sezernieren.

5. Verfahren nach Anspruch 1, 3 und 4, dadurch gekennzeichnet, daß aus Lymphozyten des adulten Milzgewebes die Hybridome H-CB-P1 sowie H-CB-P2 und aus Lymphozyten des fetalen Lebergewebes das Hybridom H-CB-P3 gewonnen werden.

6. Anti-Tumorzell-Mittel, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Wirkstoff natürliche humane monoklonale Antikörper (hmAk) enthalten, die anti-Tumorzell-Aktivitäten aufweisen.

7. Anti-Tumorzell-Mittel nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die hmAk in Gegenwart von Komplement Anwendung finden.

8. Anti-Tumorzell-Mittel nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß sie hmAk der Bezeichnung CB-P1, CB-P2 und CB-P3 enthalten, die von Hybridomzellinien der Bezeichnung H-CB-P1 (ZIM-0517), H-CB-P2 (ZIM-0518) und H-CB-P3 (ZIM-0519) sezerniert werden.

9. Anti-Tumorzell-Mittel nach Anspruch 6 und 8, dadurch gekennzeichnet, daß Hybridomzellinien durch Fusion von humanen Lymphozyten mit einer Maus-Heteromyelomzellinie gewonnen werden, wobei nach der Fusion Hybride abgetrennt und Klone mit anti-Tumorzell-Aktivität selektiert, kloniert und rekloniert werden, die stabil menschliches IgM (lambda bzw. kappa) sezernieren.

10. Anti-Tumorzell-Mittel nach Anspruch 6,8 und 9, dadurch gekennzeichnet, daß aus Lymphozyten des adulten Milzgewebes die Hybridome H-CB-P1 sowie H-CB-P2 und aus Lymphozyten des fetalen Lebergewebes das Hybridom H-CB-P3 gewonnen werden.