DE69433378T2

DE69433378T2 - Humane b-lymphoblastoiden zellinie welche anti-gangliosid-antikörper sekretiert

Info

Publication number: DE69433378T2
Application number: DE69433378T
Authority: DE
Inventors: Reiko F. Irie
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 1993-02-26
Filing date: 1994-02-09
Publication date: 2004-10-14
Anticipated expiration: 2014-02-10
Also published as: JP2011209287A; AU6238094A; JP4796682B2; CA2156857C; WO1994019457A1; DE69433378D1; DK0687295T3; ATE255633T1; EP0687295B1; JPH08507209A; PT687295E; CA2156857A1; US5419904A; EP0687295A4; AU687791B2; ES2211877T3; EP0687295A1

Description

Dies ist eine continuation-in-part-Anmeldung der anhängigen Patentanmeldung Serial No. 07/609,803, angemeldet am 5. November 1990.
Technischer Hintergrund der Erfindung
Diese Erfindung wurde mit staatlicher Unterstützung unter den Bewilligungsnummern CA 30647, CA 42396 und CA 12582, gewährt vom National Cancer Institute, gemacht.
1. Technisches Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich allgemein auf humane, mit Epstein-Barr-Virus transformierte B-Lymphoblastoid-Zelllinien. Insbesondere bezieht sich die vorliegende Erfindung auf solche Zelllinien, die Antikörper produzieren können, welche zur unmittelbaren Behandlung von Tumoren oder zum Züchten von Anti-Idiotyp-Antikörpern zur Verwendung als Ersatzantigene oder als diagnostische Reagentien verwendet werden können.
2. Beschreibung des Standes der Technik
Die hier zur Beschreibung des Hintergrunds der Erfindung und zur Bereitstellung weiter Einzelheiten für ihre Ausführung zitierten Veröffentlichungen und andere Zitatstellen sind nummeriert und in der beigefügten Bibliographie zusammengefaßt.
Die Möglichkeit, daß variable Bereiche der Immunglobuline als externe Antigene wirken können, wurde zuerst von Jerne in seiner Theorie des Idiotypnetzwerks (1) erkannt. Nach dieser Theorie führt die Erkennung von Idiotypen an der Antigenbindungsstelle oder am Gerüst des AB1 zur Produktion der Antiidiotypen (Anti-Ids oder AB2) beta bzw. alpha. Solche "Innenbild"-Antiidiotypen simulieren durch ihre Komplementarität mit der ursprünglichen Antigenbindungsstelle das ursprüngliche Antigen und verhalten sich biologisch oft gleichartig. Das Konzept des Innenbilds bezieht sich auf die Tatsache, daß einige AB2-Moleküle als Ersatzantigene wirken können und ihre Verabreichung zur Produktion von Anti-Antiidiotyp-Antikörpern führen kann, die dem AB1 gleiche Eigenschaften aufweisen.
Die Immunisierung unter Verwendung von Anti-Ids als Ersatzantigene hat großes Interesse bei den Forschern hervorgerufen, von denen viele mit AB2-Vakzinen zur aktiven spezifischen Immunisierung gegen Viren, Bakterien und andere Pathogene experimentiert haben (2, 3). Dieser Ansatz ist nützlich, wenn herkömmliche Vakzine oder Antikörper nicht verfügbar oder schwierig herzustellen sind, oder wenn das entsprechende Antigen kein geeignetes Produkt für die Gentechnik ist. Außerdem können Anti-Ids als Immunmodulatoren zum Steigern der Immunität gegen Krebs und als Immunsuppressiva zur Vermeidung der Abstoßung transplantierter Organe und des Fortschreitens von Autoimmunerkrankungen angewendet werden.
Ganglioside sind Glycosphingolipide, die grundlegende Membranbausteine in humanen Geweben sind. Bei der malignen Umwandlung normaler Zellen erfahren Ganglioside charakteristische Veränderungen und sind daher erwünschte Zielantigene zur Behandlung von Krebs. Das Melanom synthetisiert eine große Zahl von Gangliosiden und diente daher als brauchbares Modell zur Beurteilung des Potentials von Gangliosiden als Ziele für die Immuntherapie. Es wurde eine Anzahl von tumorbezogenen Gangliosiden des humanen Melanoms und deren Immunogenizität bestimmt (12–29). Eine Anzahl von Untersuchungen hat außerdem gezeigt, daß aktive Immunisierung mit Gangliosid-Antigenen zu längerem Überleben von Melanompatienten führt (4, 5). Nichtsdestoweniger ist diese Technik vielfach unzureichend, weil nämlich die Gangliosidantigene häufig selten oder knapp sind.
In der Natur kommen tumorbezogene Antigene meist nur in geringer Konzentration vor und sind in größeren Mengen relativ schwer zu reinigen. Dagegen können Anti-Ids von Hybridomzellen bei niedrigen Kosten über lange Zeit sekretiert werden. Des Weiteren kann die heutige Genverfahrenstechnik zur Synthese der Anti-Id-Peptide benutzt werden, während sie auf Gangliosidepitope nicht anwendbar ist. Früher für die aktive spezifische Immuntherapie entwickelte Anti-Ids verwendeten monoklonale Antikörper der Maus (MuMAbs) als Immunogen (6–11).
Neben ihrer Verwendung als Ersatzantigene wurden monoklonale Mausantikörper auch zur Bestimmung und Charakterisierung vieler Antigenmoleküle auf menschlichen Krebszellen eingesetzt. Monoklonale Antikörper der Maus haben einige Vorteile gegenüber solchen des Menschen, darunter eine hohe Affinität für Tumorantigene, eine höhere Sekretion durch Aszites-Hybridom und eine hohe Antigendichte auf den Tumorzellen. Neuere klinische Tests mit Mausmonoklonalen haben jedoch hinsichtlich der therapeutischen Verwendung gezeigt, daß humane monoklonale Antikörper (HuMAbs) zu bevorzugen sein könnten, weil wiederholte Injektion von MuMAbs bei scheinbar allen Patienten Anti-Maus-Ig-Antikörper hervorruft. Dies führt zur Bildung von Immunkomplexen und Immun reaktionen mit potentiell gefährlichen Komplikationen. Außerdem können HuMAbs Epitope erkennen, die vom Immunsystem der Maus übersehen werden.
Die Entwicklung von HuMAbs, die mit Gangliosid-Antigenen auf humanen Krebszellen reagieren und der Nachweis ihrer Antitumorwirkung auf klinischem Niveau wurde bereits mitgeteilt (23, 12). Patienten mit Rezidivmelanom erhielten intratumorale Injektionen von HuMAb für das Gangliosid GD2 oder GM2. Man beobachtete teilweise oder völlige Regression bei etwa 70% der Patienten. Bei jenen Melanompatienten, bei denen die Immuntherapie unwirksam war, wurde das Zielantigen GD2 oder GM2 nicht auf den Tumorzellen exprimiert. Zwei als L55 und L72 identifizierte HuMAbs wurden aus humanen B-Lymphoblastoid-Zelllinien hergestellt, die durch das Epstein-Barr-Virus transformiert waren (29). Beide Antikörper L55 und L72 waren mit einer Vielzahl von Tumorzellen reaktiv.
Weil Menge und Art der Ganglioside auf menschlichen Tumorzellen bei verschiedenen Krebspatienten weitgehend heterogen sind, ist es wünschenswert, durch Untersuchung einer Biopsie vor der Behandlung festzustellen, welche Ganglioside auf den Krebszellen des Patienten vorherrschen, um unnötige Verabreichung von HuMAb zu vermeiden.
Zum Nachweis von Menge und Art der auf einen bestimmten Tumor vorhandenen Ganglioside wurden drei verschiedene immunologische Bestimmungsmethoden (assay) angewendet. Sie umfassen die Immunadhärenz (IA); die direkte Immunfluoreszenz mit fluoreszierend gemachten Mikrokugeln, die IA-Absorption und eine biochemische Bestimmung. Jede dieser Bestimmungsmethoden hat gewisse Beschränkungen und Vorteile. Der Immunassay erfordert Suspensionen von Einzelzellen aus den Tumorgeweben der Biopsie. Es ist jedoch oft schwierig, le bensfähige Tumorzellpopulationen mit hoher Ausbeute zu erhalten. Unter dem Lichtmikroskop könnten auch Tumorzellen von Monozyten und Makrophagen nicht leicht unterschieden werden. Die biochemische Bestimmung erfordert keine intakten Zellen. Jedoch wird für die Extraktion der Ganglioside und die Messung der Sialinsäure in der Glykolipidpräparation ein relativ großes Tumorvolumen benötigt.
Das gebräuchlichste immunologische Verfahren zur Bestimmung der Antigenexpression auf Biopsieproben unter Verwendung von monoklonalen Antikörpern der Maus ist die immunhistochemische Färbung von Gewebeschnitten. Dieses empfindliche Verfahren ist jedoch nicht leicht auf Kombinationen von humanen monoklonalen Antikörpern und humanen Geweben anwendbar. Indirekte Färbung von humanem Tumorgewebe mit dem zweiten Antikörper (anti-humanem Ig) führt gewöhnlich zu hohem Untergrund durch nichtspezifische Bindung an überschüssiges endogenes humanes Ig. Direkte Immunfärbung mit biotinylierten humanen monoklonalen Antikörpern kann diesen hohen Untergrund überwinden (30). Dieses Verfahren ist jedoch gewöhnlich weniger empfindlich und ist am wirksamsten, wenn auf der Zelloberfläche ein Antigen hoher Dichte vorliegt.
Zur Zeit besteht ein fortwährendes Bedürfnis für die Entwicklung weiterer humaner Zelllinien, die einen Antikörper produzieren können, der hinsichtlich der auf den Tumoren vorliegenden Gangliosiden immunogen ist. Die von den neuen Zelllinien produzierten Anti-Gangliosid-Antikörper werden zur direkten Behandlung von Tumoren und auch zur Herstellung von Anti-Ids zur Verwendung als Ersatzantigene oder als diagnostische Reagentien brauchbar sein.
EP-A-0 480 440 beschreibt einen humanen monoklonalen Antikörper gegen Melanomzellen. Es bezieht sich nicht auf den Antikörper dieser Erfindung. EP-A-0 492 409 beschreibt einen humanen monoklonalen Antikörper, der ein auf der Oberfläche gewisser Melanomzellen vorliegendes Gangliosid erkennen kann. Es beschreibt nicht diese Erfindung.
Zusammenfassung der Erfindung
Erfindungsgemäß wurde eine humane B-Lymphoblastoid-Zelllinie entwickelt, die einen Anti-Gangliosid-Antikörper sekretiert, der mit einer Vielzahl von Tumoren reaktiv ist und dessen Wirksamkeit bei der Behandlung des Melanoms gezeigt wurde. Die erfindungsgemäße Zelllinie ist als L612 identifiziert und wird unterhalten an der Division of Surgical Oncology an der University of California an der Los Angeles School of Medicine. Die L612-Zelllinie wurde hinterlegt bei der American Type Culture Collection (Rockville, Maryland) unter der ATCC Zugangsnummer CRL 10724.
Als ein Merkmal der vorliegenden Erfindung wird die Zelllinie L612 zur Produktion eines IgM-kappa-Antikörpers verwendet, der mit Tumorantigen reaktiv ist. Wenn er durch intraläsionale Injektion verabreicht wurde, hat sich der L612-Antikörper als wirksam bei der Behandlung von Melanomtumoren gezeigt.
Als ein anderes Merkmal der vorliegenden Erfindung wird der L612-Antikörper zur Herstellung von monoklonalen Anti-Id-Antikörpern der Maus verwendet, die als Ersatzantigene brauchbar sind oder in diagnostischen Verfahren verwendet werden können.
Die oben beschriebenen Merkmale sowie viele andere Merkmale und zugehörige Vorteile der vorliegenden Erfindung werden augenfällig, wenn die Erfindung mit Bezug auf die folgende eingehende Beschreibung besser verstanden wird.
Zusammenfassung der Zeichnungen
1 ist die Nukleotid/Aminosäuresequenz für den variablen Bereich der schweren Kette des L612-Antikörpers. Die komplementären determinanten Bereiche sind unterstrichen.
2 ist die Nukleotid/Aminosäuresequenz für den variablen Bereich der leichten Kette des L612-Antkörpers. Die komplementären determinanten Bereiche sind unterstrichen.
Eingehende Beschreibung der Erfindung
Die erfindungsgemäße Zelllinie ist eine B-Lymphoblastoid-Zelllinie, die mittels der Transformationstechnik mit Epstein-Barr-Virus transformiert wurde. Die erfindungsgemäße Zelllinie ist als L612 identifiziert und wird unterhalten an der Division of Surgical Oncology an der University of California an der Los Angeles School of Medicine. Die L612-Zelllinie wird hinterlegt bei der American Type Culture Collection (Rockville, Maryland) unter der ATCC Zugangsnummer CRL 10724.
Die Zelllinie L612 wurde in Kultur aus Lymphozyten mittels der gleichen Transformationstechnik mit Epstein-Barr-Virus dargestellt, die zur Herstellung zweier anderer humaner monoklonaler Anti-Gangliosid-Antikörper, L55 (Anti-GM2) und L72 (Anti-GD2) angewendet worden war (26–27 und 29). Bei der Darstellung der Zelllinie L612 folgte man dem gleichen Transformationsverfahren, wie es im einzelnen in (29) ausgeführt ist. Die zur Darstellung der früheren Zelllinien L55 und L72 wie auch der vorliegenden L612-Zelllinie angewendete Transformationstechnik mit Epstein-Barr-Virus ist ein herkömmliches Verfahren, das wohl bekannt ist und von Forschern auf diesem Gebiet angewendet wird.
Das zur Darstellung der Zelllinie L612 im Einzelnen angewendete Verfahren ist das folgende:
Regionale Lymphknoten wurden einer Brustkrebspatientin während der Mastektomie entnommen. Lymphozyten wurden von diesen Lymphknoten abgetrennt, indem diese zunächst in kleine Stücke geschnitten und in Hankscher ausgewogener Salzlösung (HBSS) suspendiert wurden. Die Suspension wurde durch ein Edelstahlsieb passiert, um große Gewebeklumpen abzutrennen, und in Ficoll-Dichtegradientenlösung zentrifugiert, um die Lymphozyten zu konzentrieren und abzutrennen. Zum Entfernen der T-Lymphozyten wurde die Methode der Bildung von E-Rosetten angewendet und die Fraktion der B-Lymphozyten wurde dreimal mit HBSS gewaschen und dann 20 h mit Epstein-Barr-Virus (EBV) in RPMI 1640 mit 10% fötalem Kalbsserum inkubiert. Die Zellen wurden nach dem Verfahren der Grenzverdünnung kloniert und mittels des oben beschriebenen IA-Bestimmungsverfahrens (29) auf Antikörperproduktion geprüft.
Als Ziele wurden eine humane Brustkrebs-Zelllinie, MDA-MB 436 (31) und eine humane Melanomzelllinie, UCLA-SO-M12 (32), verwendet. Während die Klone, die für die Brustkrebs-Zelllinie 436 positive Antikörper sekretierten, sehr bald nach Darstellung die Produktion der Antikörper einstellten, setzten jene, die auf die Melanomzelllinie M12 reagierten, die Produktion der Antikörper fort und waren stabil. Die Antikörper sekretierenden Klone wurden an RPMI 1640 mit stufenweise geringerer Konzentration an fötalem Kalbsserum gewöhnt. Die Klone wurden dann 7 mal in serumfreiem Medium mit Wachstumsfaktor (FDA-genehmigtes serumfreies Medium der HB-Serie, bezogen von Irvine Scientific. Co.) (Irvine, CA) rekloniert. Die Verdoppelungszeit der Zelllinie L612 ist kleiner als ein Tag. Die Zelllinie sekretiert mehr als 20 μg/ml monoklonalen Antikörper IgM-kappa. Der L612-Antikörper im verbrauchten Medium wurde wie vorstehend beschrieben (25) gereinigt. Außerdem wird der von der Zelllinie L612 produzierte Antikörper nach irgendeinem der herkömmlichen, zur Entfernung und Reinigung der Antikörper von Zellkulturen angewendeten Verfahren isoliert.
Der gereinigte L612-Antikörper wurde mit verschiedenen humanen Tumorgeweben auf Reaktivität geprüft. Der L612-Antiköper hatte eine starke zytotoxische Aktivität gegenüber antigenpositiven humanen Tumorzellen in Gegenwart des Komplements. Die Reaktivität wurde sowohl mit dem Bestimmungsverfahren Immunadhärenz (IA) als auch mit Immunadhärenzadsorption (IAA) geprüft. Die Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengefaßt.
Tabelle I Reaktivität von L612 mit humanen Krebs- und Nichtkrebsgeweben
Insgesamt 21 Melanombiopsien, Peripherblutlymphozyten (PBLs) von 32 verschiedenen Spendern und Erythrozyten von weiteren 44 Spendern wurden geprüft. 13 der 21 Melanomgewebe (62%) waren antigenpositiv, dagegen waren keine der PBLs (0/32) und Erythrozyten (0/44) positiv. Kultivierte humane maligne Zelllinien wurden ebenfalls auf Anwesenheit des Antigens geprüft (Tabelle I). Von den 16 mit direkter IA geprüften Melanomzelllinien waren 12 (75%) positiv. Die positive Reaktivität der anderen Krebszelllinien war wie folgt: Lungenkrebs 4/4, Brustkrebs 5/7, Gastrointestinalkrebs 2/7, andere Krebstypen 1/4. Selbst mit der empfindlichen IA-Absorptionsmethode war jedoch keine der 11 mit Epstein-Barr-Virus transformierten, zu den geprüften Melanomzelllinien autologen B-Zelllinien positiv. Obwohl der Prozentsatz positiver Proben beim Melanom geringer als bei Lungenkrebs war, war beim Melanom die Gesamtreaktivität je Probe viel größer als bei anderen histologischen Krebstypen. Von den geprüften Melanomzelllinien zeigten M15 und M12 die höchste Reaktivität. Behandlung der Zellen mit Neuraminidase beseitigte die Antigenizität der Zelllinien völlig, während Behandlung mit Trypsin dies nicht tat.

Die Reaktivität des L612-Antikörpers mit verschiedenen authentischen Glykolipiden wurde ebenfalls bestimmt. Die Glykolipide und ihr jeweiliger Antigentiter bezüglich L612-Antikörper sind in Tabelle II gelistet. Tabelle II

Neutrale Glycolipide	Antigentiter
GbOse₃-Cer (CTH)	0
GbOse₄-Cer (Globoside)	0
GgOse₄-Cer (Asialo-GM₁)	0
Ganglioside
I³NeuAc-Gal-Cer(GM₄)	64
II³NeuAc-Lac-Cer(GM₃)	64
II³NeuGc-Lac-Cer(GM₃)	0
II³NeuAc-GgOse₃-Cer(GM₂)	0
II³NeuAc-GgOse₄-Cer(GM₁)	0
IV³NeuAc-nLcOse₄-Cer(SPG)	16
IV³NeuGc-nLcOse₄-Cer(SPG)	0
II³NeuAc₂-Lac-Cer(GD₃)	0
II³NeuAc₂-GgOse₃-Cer(GD₂)	0
	0
IV³NeuAc-, II³NeuAc-GgOse₃-Cer(GD_1a)	0
II³NeuAc₂-GgOse₄-Cer(GD_1b)	0
IV³NeuAc-, II³NeuAc₂-GgOse₄-Cer(GT_1b)	0

Die authentischen Glykolipide (5 nmol) wurden mittels des IA-Inhibierungstests auf L612-Antigenaktivität geprüft. Drei Ganglioside, GM₄, GM₃ und SPG, zeigten positive Reaktivität, von denen jedoch zwei, GM₄ und GM₃, stärkere Bindung (1 : 64) als SPG (1 : 16) zeigten. Andere Ganglioside, darunter II³NeuGc-Lac-Cer, IV³NeuGc-nLcOse₄-Cer, GM₂, GM_1a, GD₃, GD₂, GD_1a, GD_1b und GT_1b, und neutrale Glykolipide, darunter GbOse₃-Cer, GbOse₄-Cer und GgOse₄-Cer, zeigten keine antigene Aktivität. Um die obigen Ergebnisse zu bestätigen wurden ELISA und Enzym-Immunfärbung auf DC-Platten mit authentischen Glykolipiden durchgeführt. Die mit ELISA und Enzym-Immunfärbung erhaltenen Ergebnisse entsprachen denen des IA-Inhibierungstests. ELISA wurde unter Verwendung von 15 authentischen, an Mikrotüpfelplattennäpfchen gebundenen Glykolipiden durchgeführt. Wieder zeigten die drei Ganglioside GM₃, GM₄ und SPG eine klare Bindungsaktivität auf Festphasen-ELISA. Keines der übrigen Glykolipide zeigte Reaktivität.
Es wurde auch Enzym-Immunfärbung auf DC-Platten mit GM₄, GM₃, SPG, GD₃, GD₂, GM₂, N-Glyceryl-GM₃, CDH, Globosid und Asialo-GM₁ (lug) durchgeführt. Stark positiv waren GM₃ und GM₄. Mit SPG wurde geringere Reaktivität beobachtet. Sehr schwache Reaktivität beobachtete man mit GM₂. Andere Glykolipide wurden nicht gefärbt. Die Ergebnisse dieser drei unterschiedlichen Typen von Immunassays zeigen, daß HuMAb L612 den endständigen Zucker der Ganglioside, wie GM₃ und GM₄, detektiert, die einen NeuAc-α2-3-Galaktoserest haben.
Die Immunfärbung von Gefrierschnitten mit HuMAb L612 zeigte eine starke Spezifität für neoplastisches Gewebe, darunter Melanom, Kolon-Adenokarzinom und Lungenadenokarzinom. HuMAb stellt einen hervorragenden Marker zur Identifizierung gewisser neoplastischer Gewebetypen bereit. Es wurde gezeigt, daß HuMAb L612 an Nierenzellkarzinome bindet (35).
Die DNA-Sequenz der variablen Bereiche sowohl der leichten als auch der schweren Ketten des L612-Antikörpers wurde durch Polymerasekettenreaktion (PCR) bestimmt. Zur Herstellung der gesamten RNA aus der L612-B-Lymphoblastenlinie wurde das Verfahren mit Guanidinthiocyanat/Cäsiumchlorid (34) angewendet. Zehn μg der RNA wurden mit 60 pmol 3'-Primer der mu-schweren oder der kappa-leichten Kette gemischt und 10 min auf 70°C erwärmt. Das Gemisch wurde dann zu 50 μl einer Reverse-Transkriptase-Reaktionslösung zugefügt, die 10 μl 5 × Reverse-Transkriptase-Puffer (BRL), 4 μl dNTP-Mischung, 10 mmol/l (Endkonzentration 200 μmol/l dATP, dCTP, dGTP und dTTP) und 3 μl mit 600 Einheiten reverse Transkriptase (Superscript, BRL) enthielt. Das Gemisch wurde 1 h bei 37°C inkubiert.
Eine Standard-PCR wurde dann ausgeführt mit: 97 μl PCR-Gemisch wurde zu 3 μl RNS-cRNS-Gemisch zugefügt. Das PCR- Gemisch enthielt 10 × PCR-Puffer (Perkin-Elmer, CA), 10 mmol/l dNTPs-Mischung mit 60 μmol/l Endkonzentration jeder dNTP, 5 Einheiten Tap-Polymerase (Perkin-Elmer) und 60 μmol/l der entsprechenden 5'- und 3'-Primer der schweren und leichten Kette. Das Gemisch wurde in einem Perkin-Elmer/Cetus-Thermozyklusgerät 35 Verstärkungszyklen von 1 min bei 91°C, 2 min bei 52°C, 1,5 min bei 72°C und nachfolgender Schlußinkubation von 10 min bei 72°C unterworfen. Mit einem Aliquot des PCR-Produkts wurde auf 2%-Agarosegel die richtige Produktgrößenbande verifiziert. Die Primer für die mu-schwere und die kappa-leichte Kette erzeugten ein cDNA-Produkt mit 495 bzw. 603 Basenpaaren. Wenn das Gel ein Einzelprodukt richtiger Größe anzeigte, wurde der Rest des PCR-cDNA-Produkts der PCR unterworfen, um mehr Produkt zu gewinnen.
Die Gelprodukte wurden isoliert, zusammengeführt, einer Phenol-Chloroform-Extraktion und Ethanolfällung unterworfen. Die DNA wurde dann mit passenden Restriktionsenzymen digeriert, extrahiert, gefällt und mit GeneClean (Biol01, CA) gereinigt. Die DNA wurde in geeignet geschnittene Restriktionsstellen des Bluescript-Vektors (Stratagene, CA) eingebunden. Zehn unabhängig Klone des variablen Bereichs der mu-Kette und vier unabhängige Klone des variablen Bereichs der kappa-Kette wurden isoliert und sequenziert. Zum Aussieben und Verifizieren der Klone der schweren Kette wurde eine J_H-Sonde für die schere Kette verwendet. Die Sequenzierung erfolgte mittels des Dideoxynukleotidverfahrens mit T7-DNA-Polymerase (Sequenase, USB, Cleveland, OH) nach Vorschrift des Herstellers. Die verwendeten Primer waren die folgenden:
Führende Primer (3 Primer) der mu-schweren Kette (29):
GGGAATTCATGGACTGGACCTGGAGG(AG)TC(CT)TCT(GT)C; GGGAATTCATGGAG(CT)TTGGGCTGA(CG)CTGG(CG)TTT(CT)T; und GGGAATTCATG(AG)A(AC)(AC)(AT)ACT(GT)TG(GT)(AT)(CG)C(AT)(CT)(CG)C T(CT)CTG. Dies umfaßt eine EcoRI-Restriktionsstelle (unterstrichen) zur Erleichterung des Klonens. Der Primer für die J-Region der schweren mu-Kette war CCRAGCTTAGACGAGGGGGAARAGGGTT. Dies enthält eine Hind-III-Stelle (unterstrichen). Führende Primer für die leichte kappa-Kette waren wie folgt (2 Primer) (30): GACATCGAGCTCACCCAGTCTCCA und GAAATTGAGCTCACGAGTCTCCA. Diese Primer enthalten eine Sac-I-Stelle (unterstrichen). Der Primer für die J-Region der leichten kappa-Kette war GCGCCGTCTAGAACTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTTTGTGACGGGCAAG. Dieser Primer enthält eine Xba-Stelle (unterstrichen).
Die Nukleotidsequenz der geklonten cDNA und die kodierte Aminosäuresequenz für den variablen Bereich der schweren Kette ist in SEQ ID NO: 1 dargelegt. Die obige Aminosäuresequenz des variablen Bereichs der schweren Kette ist in SEQ ID NO: 2 dargelegt. Die Nukleotidsequenz der geklonten cDNA und die kodierte Aminosäuresequenz für den variablen Bereich der leichten Kette ist in SEQ ID NO: 3 dargelegt. Die obige Aminosäuresequenz des variablen Bereichs der leichten Kette ist in SEQ ID NO: 4 dargelegt.
Die Nukleotid/Aminosäuresequenz für den variablen Bereich der schweren Kette ist auch in 1 gezeigt. Die komplementären determinanten Bereiche (CDRs) 1, 2 und 3 sind unterstrichen. Die Nukleotid/Aminosäuresequenz für den variablen Bereich der leichten Kette ist auch in 2 gezeigt. Die komplementären determinanten Bereiche (CDRs) 1, 2 und 3 sind ebenfalls unterstrichen.
Der erfindungsgemäße L612-Antikörper wird Patienten zur Behandlung von Tumoren verabreicht, welche II³NeuAc-Lac-Cer(GM₃)-Gangliosid, GM₄ oder IV³NeuAc-nLcOse₄-Cer (SPG) enthalten. Das Gangliosid GM₃ umfaßt einen endständigen Zucker mit einem NeuAc-α2-3-Galaktoserest. Jedes herkömmliche, zur Verabreichung von Antikörpern an Patienten zur Behandlung solcher Gewebe angewendete Verfahren kann angewendet werden. Diese Verfahren umfassen intravenöse oder intraperitoneale Injektion und intraläsionale Injektion. Die intraläsionale Injektion ist ein bevorzugtes Verfahren der Verabreichung für Hauttumorrezidive. Der L612-Antikörper und die den Antikörper produzierende Zelllinie können durch bekannte Verfahren abgewandelt oder verändert werden, um andere Immunglobulin-Isotypen und diese produzierende Zellen zu bilden, welche Tumorzellen wirksam binden und töten können (33). Die im Einzelfall angewendete Dosis wird abhängig von der Antigenizität des Tumors variieren und kann mit bekannten Verfahren für die Verabreichung von Antikörpern wie L55 und L72 bestimmt werden. Der monoklonale Antikörper L612 reagiert stark mit Biopsieproben humaner Melanomtumore. Er reagiert auch weniger stark mit humanen Tumorbiopsieproben von Lungenkrebs, Brustkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Kolonkrebs und Nierenkrebs. Unter den mit dem monoklonalen Antikörper L612 geprüften Zelllinien wurde die UCLASO-M12-Melanom-Zelllinie als reaktivste identifiziert. Die UCLASO-M12-Zelllinie wird bei der Division of Surgical Oncology an der University of California an der Los Angeles School of Medicine unterhalten.
Der HuMAb L612 wurde als therapeutischer Wirkstoff zur Behandlung des malignen Melanoms der Haut verwendet. Für die Anwendung beim Menschen wurde HuMAb L612 gereiningt wie vorbeschrieben (25). In früheren Untersuchungen wurde gezeigt, daß die intraläsionale Injektion des humanen anti-GD₂-HuMAb L72 eine Regression des Hautmelanoms herbeiführen kann (23). Im vorliegenden Beispiel wird die Wirkung von HuMAb L612 und HuMAb L72 verglichen.
Die 84 Jahre alte Frau unterzog sich einer chirurgischen Exzision einer rasch wachsenden Hautmelanomläsion (1,9 × 1,6 cm) auf ihrer linken Wange. Die pathologische Untersuchung des Gewebeausschnitts ergab ein Melanom im Clark-Stadium IV. Die Gangliosidexpression der Biopsie der Läsion wurde für GM₃ mäßig positiv und für GD₂ negativ gefunden. Zwei Wochen nach dem Eingriff entwickelte sich an der Einschnittstelle ein Rezidiv. Die oberen Läsionen wurden wöchentlich mit 1 ml HuMAb L612, die unteren Läsionen mit 1 ml HuMAb L72 behandelt. Nach einem Monat (3 Behandlungen) beobachtete man Nekrose und Erweichung der mit HuMAb L612 behandelten Läsionen. Dagegen zeigten die mit HuMAb L72 behandelten Läsionen keine Wirkung und waren vielmehr weiter fortgeschritten. Die Patientin verschied schließlich wegen ausgedehnter Metastasen in Leber und Gehirn.
Der L612-Antikörper ist auch verwendbar zur Erzeugung von Hybridomen, die wiederum zur Erzeugung von Anti-Ids zur Verwendung als Ersatzantigene oder als diagnostische Reagentien eingesetzt werden können. Die Herstellung von Hybridomen und die nachfolgende Erzeugung von Anti-Ids werden im folgenden Verfahrensbeispiel beschrieben.
BALB/c-Mäuse wurden mit subkutaner Injektion von 200 μg gereinigten monoklonalen Antikörpers L612 in komplettem Freundschem Adjuvans immunisiert. Nach zwei Wochen wurde den Tieren eine weitere verstärkende subkutane Injektion von L612 in inkomplettem Freundschem Adjuvans injiziert. Elf Tage danach wurde den Mäusen 200 μg L612 in Salzlösung intraperitoneal injiziert. Nach drei Tagen wurde die Milz entfernt und die Splenozyten mit der Myelomzelllinie SP2/O nach dem Standardverfahren zur Erzeugung von Hybridomen verschmolzen.
Nach Selektion mit HAT-Medium wurden die Näpfchen mit der Hybridomkultur mit ELISA auf Antikörper geprüft. Anti-Ids (AB2) sekretierende Hybridome wurden durch ihre starke Bin dungsreaktivität für HuMAb L612 und fehlende Reaktivität für drei andere humane IgMs, L55, L72 und Humanserum-IgM, identifiziert. Die als Antigen verwendeten nicht verwandten Proteine umfaßten fötales Rinderserum und humanes Serumalbumin. 50 μl der IgMs oder der Proteine (50 μg/ml) wurden auf eine ELISA-Platte mit 96 Näpfchen aufgetragen und dienten als Antigene zum Nachweis von AB2. Wie vorbeschrieben (19) wurden peroxidasekonjugiertes Anti-Maus-IgG + IgM der Ziege als Nachweissonde für AB2 mit nachfolgendem Nährboden und Messung der Extinktion bei 490 nm verwendet.
Die HAT-Selektion von ungefähr 2500 Hybridomkultur-Näpfchen, die wie oben beschrieben hergestellt worden waren, ergab 40 Hybridome, die Antikörper mit ausgeprägter Reaktivität für L612-HuMAb, aber ohne Reaktivität für drei humane Vergleichs-IgMs und zwei nicht verwandte Serumprotein-Antigene sekretierten. Um festzustellen, ob diese Anti-L612-Antikörper vom gegen die Antigen-Kombinationsstelle des L612 gerichteten AB2-beta-Typ oder an Peptidbereiche außerhalb der Antigen-Kombinationsstelle des L612 gebundene AB2-alpha-Antikörper waren, wurde die inhibierende Aktivität dieser Anti-L612-Antikörper gegen die Bindung des L612 an GM3-positive Zielzelllinien oder an das gereinigte Antigen, das Gangliosid GM3, mittels dreier Bestimmungssysteme geprüft: IA-Inhibierung, Zell-ELISA-Inhibierung und GM3-ELISA-Inhibierung. Von den 40 geprüften Antikörpern inhibierten sieben die L612-Bindung an eine antigenpositive Melanom-Zielzelllinie (UCLASO-M12) und an GM3 zu mehr als 50 der Bestimmungen, während 12 andere schwache oder keine inhibierende Aktivität hatten.
Von den sieben inhibierenden Anti-Ids wurde eine als 4C10 bezeichnete zum Klonen als das bevorzugte beta-Typ-Anti-Id zur Verwendung bei der Behandlung von Tumoren ausgewählt. Aus der nicht inhibierenden Gruppe wurde das als 18C6 iden tifizierte Anti-Id zum Klonen als bevorzugtes alpha-Typ-Anti-Id zur Verwendung für immundiagnostische Bestimmungen ausgewählt. Beide Anti-Ids, 4C10 und 18C6, wurden mit Isotyp-Antiglobulinen geprüft und man fand, daß sie zur Klasse IgG1 gehören und kappa-leichte Ketten enthalten.
Die mit 4C10 und 18C6 geklonten Hybridomzelllinien wurden in FCS-haltigem RP-MI-1640-Medium gezüchtet und sekretierten 5 – 10 μg/ml Antikörper in den Überstand der Kultur. Die Titer der Anti-Ids in diesen Kultur-Überständen gegen L612 nach ELISA lagen zwischen 1 : 200 und 1 : 1000/10⁶ Hybridome. Das Anti-Id 18C6 zeigte geringe Inhibierung der Bindung von HuMAb L612 an Zielzellen im IA-Assay und an das Gangliosid GM3 in ELISA, während 4C10 bei gleicher Antikörperkonzentration sowohl im ELISA als auch im IA-Assay starke Inhibierung zeigte. In einer Vergleichsbestimmung inhibierten 4C10 und 18C6 die Bindung eines nicht verwandten Antigensystems, HuMAb L72, an M14-Zielzellen oder an GD2-Antigen nicht. Das Fehlen der Bindungsinhibierung des 18C6 deutet auf eine Bindungsstelle am L612-Antikörper außerhalb der Kombinationsstelle für GM3-Antigen. Die spezifische Bindungsinhibierung des 4C10 deutet an, daß seine Bindungsstelle innerhalb oder nahe bei der Antigen-Kombinationsstelle liegt.
Die Hybridomzelllinien, welche die monoklonalen Anti-Ids 4C10 und 18C6 sekretieren, werden bei der Division of Surgical Oncology der University of California an der Los Angeles School of Medicine unterhalten.
Das 4C10-Anti-Id und andere gegen L612 aufgestellte Anti-Ids vom beta-Typ können für sich oder in Kombination mit anderen Wirkstoffen zur Behandlung von Tumoren verwendet werden. Sie sind bevorzugt für die Verwendung bei der Behandlung von Melanomtumoren. Diese Anti-Ids vom beta-Typ können auch als Immunmodulatoren zur Verstärkung der Immunität gegen Krebs, zur Unterdrückung der Abstoßung transplantierter Organe und von Autoimmunerkrankungen angewendet werden.
Die beta-Anti-Ids können mit jedem der zur Einführung von Antikörpern in Patienten angewendeten herkömmlichen Verfahren verabreicht werden. Diese Verfahren umfassen subkutane, intravenöse und intratumorale Injektion. Die beta-Typ-Anti-Ids werden bevorzugt mit KLH konjugiert und in einem geeigneten Träger, wie komplettem Freundschem Adjuvans, emulgiert. Die im Einzelfall für die beta-Typ-Anti-Ids angewendeten Dosen variieren abhängig vom zu behandelnden Tumor und zahlreichen anderen Faktoren. Die Dosishöhen werden nach bekannten Verfahren und allgemein anerkannten und angewendeten Grundsätzen für die Behandlung von Patienten mit Antigen-Immunwirkstoffen oder monoklonalen Antikörpern festgesetzt.
Die immunogene Brauchbarkeit der beta-Typ-Anti-Ids für L612-Antikörper wurde wie folgt gezeigt:
Fünf syngene Balb/c-Mäuse wurden mit gereinigtem 4C10-KLH geimpft. Zum Vergleich wurden vier Mäuse mit Maus-IgG1-KLH und eine Maus mit KLH allein geimpft. Die immunisierten Sera wurden mit ELISA unter Verwendung von gereinigtem GM3 als Antigenquelle und mit dem IA-Assay unter Verwendung der antigenpositiven Melanomzelllinie M12 überwacht. Im ELISA wurde peroxidasekonjugiertes Antimaus-IgM + IgG der Ziege (Boehringer Mannheim) als zweiter Antikörper verwendet.
Bei drei der fünf Immunisierungen mit 100 μg 4C10-KLH wurde ein meßbarer Antikörper (AB3) erzeugt. Die immunisierten Sera banden an GM3, aber nicht an CDH (Asialo-GM3). Sera der fünf mit IgG-KLH oder mit KLH allein geimpften Mäuse reagierten auf keines der Glykolipide. Bei weiterer Analyse zur Bestimmung der Ig-Klasse des AB3 (ELISA und DC-Immunfärbung) wurde die Reaktivität überwiegend als IgM identifiziert.
Um die artspezifischen natürlichen Antikörper, die mit dem M12-Zellen im IA-Assay reagieren könnten, auszuschließen, wurden die immunisierten Maussera durch humane rote Blutkörperchen bei 9°C über Nacht vorabsorbiert. Mit einer 1 : 10-Verdünnung der absorbierten Sera wurde ein IA-Wert von 4+ erhalten. Vergleichssera gaben selbst bei Verdünnung 1 : 2 keine Reaktivität. Zur Bestätigung, daß die positive Reaktivität gegen das GM3-Antigen auf der Zelloberfläche gerichtet war, wurde IA-Inhibierung mit GM3 (10 μg), CDH (10 μg), 4C10 (10 μg) und nicht verwandtem IgG1 (10 μg), gereinigt aus Balb/c Hybridom-Rszites, durchgeführt. Während die Reaktivität durch GM3 oder gereinigtes 4C10 völlig inhibiert wurde, erhielt man mit CDH oder nicht verwandtem IgG1 keine Inhibierung.
Die obigen Beispiele zeigen, daß beta-Typ-Anti-Ids AB3-Antikörper erzeugen, die mit Melanomtumoren immunreaktiv sind. Dementsprechend sind diese beta-Typ-Anti-Ids, die sich als Antwort auf den L612-Antikörper bilden, als Immunisierungsmittel für die Behandlung von Melanomen wirksam.
Die als Antwort auf den L612-Antikörper erzeugten alpha-Typ-Anti-Ids können in immundiagnostischen Verfahren, wie einem dreistufigen Zell-ELISA-Verfahren und einer dreistufigen Immunperoxidasefärbung von Tumorgewebeschnitten, angewendet werden. Praktische Beispiele folgen.
Dreistufiger Zell-ELISA
Auf eine Mikrotüpfelplatte mit 960 Näpfchen und U-Boden (Immulon-1, Dynatec) wurden lebensfähige M12-Zellen (1 × 10⁵) nach Preblocking mit 1% BSA-PBS aufgetragen. 50 μl L612 (100 μg/ml) wurden zugesetzt und 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Waschen des Gemischs zum Entfernen von ungebundenem HuMAb L612 wurden die Zellen mit monoklonalem Maus-Anti-Id 18C6 (100 μg/ml) 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Waschen wurden 50 μl peroxidasekonjugierter Ziegen-Anti-Maus-IgG-Antikörper (1/10000 verdünnt) (Jackson Immuno Research) zugesetzt und die Platte 30 min inkubiert. Nach Waschen mit PBS-Lösung wurde der Träger für Peroxidase zugesetzt und die Bindungsaktivität als Funktion der Extinktion bei 490 nm mit einem kinetischen V_max Mikroplatten-Lesegerät bestimmt.
Wenn die Antigen-Kombinationsstellen des L612 durch auf den Tumorzellen exprimiertes GM3 besetzt sind, sollte das zellgebundene HuMAb L612 seine Bindungsaktivität für beta-Anti-Id vermindert haben, aber dennoch die volle Bindungsaktivität für alpha-Anti-Id behalten. Das oben beschriebene Verfahren bestätigte diesen Vorgang unter Verwendung von kultivierten M12-Melanomzellen, welche eine hohe Dichte des entsprechenden Antigens exprimieren.
Der oben beschriebene Zellbindungsassay stellt eine modifizierte Form der ELISA-Technik dar. Um die Spezifität der positiven Reaktion festzustellen, wurden einige Vergleichsprüfungen eingebunden. Die antigangliosiden HuMAbs umfaßten L55 (IgM-Anti-GM2) und L72 (IgM-Anti-GD2), die beide eine starke Bindungsfähigkeit an die an GM2 und GD2 reiche M14-Melanomzelllinie haben (26, 27). Das Anti-Id 18C6 reagierte stark auf M12-Zellen nach Vorinkubation mit HuMAb L612, reagierte aber nicht auf M14-Zellen, die mit L55- oder L72- HuMAb vorinkubiert waren. Bei anderen Vergleichen, darunter Maus-Anti-Id allein, L612 oder L612 plus (Anti-Id beta), reagierte das peroxidasekonjugierte Anti-Maus-Ig auch nicht.
Der Zell-ELISA wurde dann auf einige andere humane Tumorzelllinien angewendet. Ein zweistufiger Zellbindungsassay (HuMAb + peroxidasekonjugiertes Anti-human-IgM) wurde mit dem dreistufigen Zellbindungsassay verglichen, um die Gültigkeit des dreistufigen Assays zu ermitteln. Der dreistufige Assay hatte eine mit dem zweistufigen parallele Reaktivität und war für fast jede Zelllinie etwas empfindlicher. Diese Daten deuten an, daß der ELISA-Extinktionswert des dreistufigen Assays Unterschiede der Dichte der GM3-Antigene an der Zelloberfläche genau widerspiegelt und mit den zweistufigen in vitro-Assays eng korreliert.
Dreistufige Immunperoxidasefärbung von Gewebeschnitten
4 μm dicke Gewebeschnitte wurden von frisch eingefrorenen Geweben in OTC-Verbindung geschnitten, sofort in kaltem Formaldehydpuffer (12 g Tris-Puffer, 9 g Natriumchlorid, 40 ml 37% Formaldehyd, pH 7,9) fixiert und luftgetrocknet. Die Platten wurden 5 min in Tris-Puffer getaucht und dann 10 min mit Wasserstoffperoxid behandelt, um endogene Peroxidaseaktivität zu löschen.
Nach 5 min Waschen in fließendem Wasser wurden die Schnitte 20 min mit 5% normalem Humanserum überschichtet. Dann wurde HuMAb L612 (10 μg IgM in 200 μl) aufgetragen und 45 min inkubiert. Die Platten wurden 5 min in Tris-Puffer gewaschen, das gereinigte Anti-Id 18C6 (10 μg IgG1 in 200 μl) aufgetragen und 30 min inkubiert.
Nach erneutem Waschen der Platten wurde der dritte Antikörper, ein biotinyliertes Ziegen-Anti-Maus-IgG (Vector Laboratories, San Francisco) in Verdünnung 1/100 aufgetragen und 25 min inkubiert. Nach Waschen wurde peroxidasekonjugiertes Streptavidin (Verdünnung 1/1000) (Zymed Laboratories, San Francisco) aufgetragen und 20 min inkubiert. Nach Waschen wurden die Platten 5 min in Substratlösung mit 6 ml Aminoethylcarbazol, 50 ml 0,02 mol/l Natriumacetatpuffer (pH 5,1) und 0,4 ml frisch bereitetem 3% Wasserstoffperoxid eingetaucht. Die Platten wurden noch einmal in Leitungswasser gewaschen, mit Hämatoxylin gegengefärbt und es wurden auf den gefärbten Schnitten mit Glyceringelatine Deckgläschen angebracht. Der dreistufige Immunperoxidaseassay wurde erfolgreich zum Nachweis der Bindung von L612-Antikörper an biopsiechirurgische schnellgefrorene Tumorgewebe angewendet.
Nachdem so beispielhafte erfindungsgemäße Ausführungsformen beschrieben wurden, sollte der Fachmann beachten, daß die Offenbarungen darin nur beispielhaft sind und daß verschiedene andere Alternativen, Anpassungen und Abwandlungen innerhalb des erfindungsgemäßen Bereichs vorgenommen werden können. Zum Beispiel kann der L612-Antikörper zur Herstellung chimärer Antikörper verwendet werden, die ebenfalls für unterschiedliche Behandlungen oder als diagnostische Reagentien brauchbar sind. Demgemäß ist die vorliegende Erfindung nicht auf die speziellen, hier veranschaulichten Ausführungsformen, sondern nur durch die folgenden Ansprüche beschränkt.
BIBLIOGRAPHIE

1. Jerne NK. Towards a network theory of the immune system. Ann. Immunol. (Paris) 125C: 373–389, 1974.
2. Dalgleish AG. Kennedy RC. Anti-idiotype antibodies as immunogens: idiotype-based vaccines. Vaccine 6: 215–220, 1962.
3. Sikorska HM. Therapeutic applications of antiidiotypic antibodies. J Biol Res Mod 7: 327–358, 1988.
4. Livingston PO, Natoli EJ, Calves MJ, Stockert E, Oettgen HF, Old LJ. Vaccines containing purified GM2 ganglioside elicit GM2 antibodies in melanoma patients. Proc Natl Acad Sci USA 84: 2911–2915, 1987.
5. Livingston PO. Experimental and clinical studies with active specific immunotherapy. In "Immunity to Cancer II." Eds MS Mitchell, Pub Alan L Liss, Inc, NY.
6. Herlyn D, Wettendorff M, Schmoll E. Anti-idiotype immunization of cancer patients: modulation of immune response. Proc Natl Acad Sci 84: 8055–8059, 1987.
7. Bhattacharya-Chatterjee M, Pride MW, Seon BK, Kohler H. Idiotype vaccines against human T-cell acute lymphoblastic leukemia. I. Generation and characterization of biologically active monoclonal anti-idiotypes. J Immunol 139: 1354–1360, 1987.
8. Viale G, Grassi F, Pelagi M, Alzani R, Menard S, Miotti S, Buffa R, Gina A, Siccardi AG. Anti-human tumor antibodies induced in mice and rabbits by "internal image" anti-idiotype monoclonal immunoglobulins. J Immunol 139: 4250–4255, 1987.
9. Chen H, Mittelman A, Yamada M. Association of restricted specificity of anti-anti-idiotypic antibodies with prolonged survival of melanoma patients. Proc Amer Assoc Clin Oncol 8: A1125, 1989.
10. Kahn M, Hellstrom I, Estin CD, Hellstrom KE. Monoclonal anti-idiotypic antibodies related to the p97 melanoma antigen. Cancer Res 49: 3157–3162, 1989.
11. Barth A, Waibel R, Stahei RA. Monoclonal antiidiotypic antibody mimicking a tumor-associated sialoglycoprotein antigen induces humoral immune response against human small cell lung carcinoma. Int J Cancer 43: 896–900, 1989.
12. Irie RF, Matsuki T, Morton DL. Human monoclonal antibody to ganglioside GM2 for melanoma treatment. Lancet 1: 786–787, 1989.
13. Tsuchida T, Saxton RE, Morton DL, Irie RF. Gangliosides of human melanoma II. Cancer, 623: 1166–1174, 1989.
14. Ravindranath MH, Morton DL, Irie RF. An epitope common to ganglioside O-acetyl AD3 recognized by antibodies in melanoma patients after active specific immunotherapy. Cancer Res 49: 3691–3897, 1989.
15. Hoon DBS, Ando I, Sviland G, Tsuchida T, Okun E, Morton DL, Irie RF. Ganglioside GM2 expression on human melanoma cells correlates with sensitivity to lymphokine-activated killer cells. Int J Cancer 43: 857–862, 1989.
16. Hoon DBS, Irie RF, Cochran AJ. Gangliosides from human melanoma immodulate response of T-cells to interleukin-2. Cell Immunol 111: 410–419, 1988.
17. Ravindranath MH, Paulson JC, Irie RF. Human melanoma antigen o-acetylated ganglioside GD3 is recognized by cancer autennarius lectin.l J Biol Chem 263: 2079–2086, 1988.
18. Tsuchida T, Ravindranath MH, Saxton RE, Irie RF. Gangliosides of human melanoma: Altered expression in vivo and in vitro. Cancer Res 4?: 1278–1281, 1987.
19. Tai T, Sze LL, Kawashima I, Saxton RE, Irie RF. Monoclonal antibody detects monosialoganglioside having sialic acid 2–3 Galactosyl residue. J Biol Chem 262: 6803–6807, 1987.
20. Ando I, Hoon DSB, Suzuki Y, Saxton RE, Golub SH, Irie RF. Ganglioside GM2 on the K56 cell line is recognized as a target structure by human natural killer cells. Int J Cancer 40: 12–17, 1987.
21. Tsuchida T, Saxton RE, Irie RF. Gangliosides of human melanoma: GM2 and tumorigenicity. J Natl Cancer Inst 78: 55–60, 1987.
22. Tsuchida T, Saxton RE, Morton DL, Irie RF. Gangliosides of human melanoma. J Natl Cancer Inst 78: 45–54, 1987.
23. Irie RF, Morton DL. Regression of cutaneous metastatic melanoma by intralesional injection with human monoclonal antibody to ganglioside GD2. Proc Natl Acad Sci 83: 8694–8698, 1986.
24. Katano M, Irie RF. Suppressed growth of human melanoma in nude mice by human monoclonal antibody to ganglioside GD2. Immunology Letters 8: 169–174, 1984.
25. Katano M, Saxton RE, Irie RF. Human monoclonal antibody to tumor-associated ganglioside GD2. J Clin Lab Immunol 15: 119–126, 1984.
26. Tai T, Paulson JC, Cahan LD, Irie RF. Ganglioside GM2 as a human tumor antigen (OFA-I-1). Proc Natl Acad Sci, USA 80: 5392–5396, 1983.
27. Cahan LD, Irie RF, Singh R, Cassidenti A, Paulson JC. Identification of human neuroectodermal tumor antigen (OFA-I-1) as ganglioside GD2. Proc Natl Acad Sci 79: 7629–7633, 1982.
28. Tai T, Cahan LD, Tsuchida T, Saxton RE, Irie RF, Morton DL. Immunogenicity of melanoma-associated gangliosides in cancer patients. Int J Cancer 35: 607–612, 1985.
29. Irie RF, Sze L1, Saxton RE. Human antibody to OFA-I, tumor antigen produced in vitro by EBV-transformed human B-lymphoblastoic cell lines. Proc Natl Acad Sci 79: 5666–5670, 1982.
30. Yano T, Yasumoto K, Nagashima A, Murakami H, Hashizume S and Nomoto K (1988) Immunohistological characterization of human monoclonal antibody against lung cancer. J Surg Oncol. 39, 108.
31. Higuchi, M, DS Robinson, R Cailleau, RF Irie, and DL Morton. 1980. A serologic study of cultured breast cancer cell lines: lack of antibody response to tumour specific membrane antigens in patients. Clin. Exp. Immunol. 39: 90.
32. Irie RF, Irie K, and Morton DL. 1976. A membrane antigen common to human cancer and fetal brain tissue. Cancer Res. 36: 3510.
33. Steplewski, et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, U.S.A., 82: 8653, 1985.
34. Chromczynski P, and Sacchi N. 1987. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. Biochem. 162: 156–159.
35. Hoon, DSB., Okun E, Banez M, Irie RF, and Morton DL. 1991. Interleukin-4 alone and gamma interferon or α-tumor necrosis factor inhibits cell growth and modulates cell surface antigens on human renal cell carcinomas. Cancer Res. 51: 5687–5693.

Sequenzauflistung

Claims

Humane B-Lymphoblastoid-Zelllinie, welche in der American Type Culture Collection unter der ATCC Zugangsnummer CRL 10724 hinterlegt ist.
Zusammensetzung eines Stoffes enthaltend einen Anti-Gangliosid-Antikörper, welcher durch eine Zelllinie nach Anspruch 1 und Isotypen von diesem sekretiert wird.
Verwendung eines durch eine Zelllinie nach Anspruch 1 sekretierten Antikörpers bei der Herstellung einer Zusammensetzung zur Behandlung von Tumorgewebe, der die gangliosiden Antigene II³NeuAc-Lac-Cer(GM₃), GM4 oder IV³NeuAc-nLcOse₄-Cer(SPG) enthält, welche an L612 binden.
Verwendung eines Antikörpers nach Anspruch 3, wobei das Tumorgewebe ein Melanom-Tumorgewebe ist.
Zusammensetzung eines Stoffes nach Anspruch 2, wobei die Zusammensetzung des Stoffes im Wesentlichen aus dem Antikörper und dem Antikörperisotypus und einem pharmazeutisch zulässigen Träger besteht.
Verwendung eines Antikörpers nach Anspruch 3 oder 4, wobei die Zusammensetzung zur Behandlung von Tumorgewe ben durch intraläsionale Injektion verabreichbar ist.
Zusammensetzung eines Stoffes mit einem Antikörper, der einen variablen Bereich einer schweren Kette umfasst, welcher die unter SEQ ID NO: 2 dargelegte Aminosäuresequenz umfasst.
Zusammensetzung eines Stoffes mit einem Antikörper, der einen variablen Bereich einer leichten Kette umfasst, welcher die unter SEQ ID NO: 4 dargelegte Aminosäuresequenz umfasst.
Zusammensetzung eines Stoffes nach Anspruch 7, wobei der Antikörper einen variablen Bereich einer leichten Kette umfasst, welcher die unter SEQ ID NO: 4 dargelegte Aminosäuresequenz umfasst.
Zusammensetzung eines Stoffes mit einem Antikörper, der einen variablen Bereich einer schweren Kette umfasst, welcher die in 1 dargelegten komplementären determinierenden Bereiche umfasst.
Zusammensetzung eines Stoffes mit einem Antikörper, der einen variablen Bereich einer leichten Kette umfasst, welcher die in 2 dargelegten komplementären determinierenden Bereiche umfasst.
Zusammensetzung eines Stoffes nach Anspruch 10, wobei der Antikörper einen variablen Bereich einer leichten Kette umfasst, welcher die in 2 dargelegten komplementären determinierenden Bereiche umfasst.
Nukleotidsequenz, die zumindest einen Teil eines Antikörpers kodiert, wobei die Nukleotidsequenz eine aus den unter SEQ ID NO: 2 und SEQ ID NO: 4 dargelegten Aminosäuresequenzen ausgewählte Sequenz kodiert.