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Dies
ist eine continuation-in-part-Anmeldung der anhängigen Patentanmeldung Serial
No. 07/609,803, angemeldet am 5. November 1990.
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Technischer
Hintergrund der Erfindung
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Diese
Erfindung wurde mit staatlicher Unterstützung unter den Bewilligungsnummern
CA 30647, CA 42396 und CA 12582, gewährt vom National Cancer Institute,
gemacht.
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1. Technisches
Gebiet der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich allgemein auf humane, mit Epstein-Barr-Virus
transformierte B-Lymphoblastoid-Zelllinien.
Insbesondere bezieht sich die vorliegende Erfindung auf solche Zelllinien,
die Antikörper
produzieren können,
welche zur unmittelbaren Behandlung von Tumoren oder zum Züchten von
Anti-Idiotyp-Antikörpern
zur Verwendung als Ersatzantigene oder als diagnostische Reagentien
verwendet werden können.
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2. Beschreibung des Standes
der Technik
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Die
hier zur Beschreibung des Hintergrunds der Erfindung und zur Bereitstellung
weiter Einzelheiten für
ihre Ausführung
zitierten Veröffentlichungen
und andere Zitatstellen sind nummeriert und in der beigefügten Bibliographie
zusammengefaßt.
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Die
Möglichkeit,
daß variable
Bereiche der Immunglobuline als externe Antigene wirken können, wurde
zuerst von Jerne in seiner Theorie des Idiotypnetzwerks (1) erkannt.
Nach dieser Theorie führt
die Erkennung von Idiotypen an der Antigenbindungsstelle oder am
Gerüst
des AB1 zur Produktion der Antiidiotypen (Anti-Ids oder AB2) beta
bzw. alpha. Solche "Innenbild"-Antiidiotypen simulieren
durch ihre Komplementarität mit
der ursprünglichen
Antigenbindungsstelle das ursprüngliche
Antigen und verhalten sich biologisch oft gleichartig. Das Konzept
des Innenbilds bezieht sich auf die Tatsache, daß einige AB2-Moleküle als Ersatzantigene
wirken können
und ihre Verabreichung zur Produktion von Anti-Antiidiotyp-Antikörpern führen kann,
die dem AB1 gleiche Eigenschaften aufweisen.
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Die
Immunisierung unter Verwendung von Anti-Ids als Ersatzantigene hat
großes
Interesse bei den Forschern hervorgerufen, von denen viele mit AB2-Vakzinen
zur aktiven spezifischen Immunisierung gegen Viren, Bakterien und
andere Pathogene experimentiert haben (2, 3). Dieser Ansatz ist
nützlich,
wenn herkömmliche
Vakzine oder Antikörper
nicht verfügbar
oder schwierig herzustellen sind, oder wenn das entsprechende Antigen
kein geeignetes Produkt für
die Gentechnik ist. Außerdem
können
Anti-Ids als Immunmodulatoren zum Steigern der Immunität gegen
Krebs und als Immunsuppressiva zur Vermeidung der Abstoßung transplantierter
Organe und des Fortschreitens von Autoimmunerkrankungen angewendet
werden.
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Ganglioside
sind Glycosphingolipide, die grundlegende Membranbausteine in humanen
Geweben sind. Bei der malignen Umwandlung normaler Zellen erfahren
Ganglioside charakteristische Veränderungen und sind daher erwünschte Zielantigene
zur Behandlung von Krebs. Das Melanom synthetisiert eine große Zahl
von Gangliosiden und diente daher als brauchbares Modell zur Beurteilung
des Potentials von Gangliosiden als Ziele für die Immuntherapie. Es wurde
eine Anzahl von tumorbezogenen Gangliosiden des humanen Melanoms
und deren Immunogenizität
bestimmt (12–29).
Eine Anzahl von Untersuchungen hat außerdem gezeigt, daß aktive
Immunisierung mit Gangliosid-Antigenen zu längerem Überleben von Melanompatienten
führt (4,
5). Nichtsdestoweniger ist diese Technik vielfach unzureichend,
weil nämlich
die Gangliosidantigene häufig selten
oder knapp sind.
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In
der Natur kommen tumorbezogene Antigene meist nur in geringer Konzentration
vor und sind in größeren Mengen
relativ schwer zu reinigen. Dagegen können Anti-Ids von Hybridomzellen
bei niedrigen Kosten über
lange Zeit sekretiert werden. Des Weiteren kann die heutige Genverfahrenstechnik
zur Synthese der Anti-Id-Peptide benutzt werden, während sie
auf Gangliosidepitope nicht anwendbar ist. Früher für die aktive spezifische Immuntherapie
entwickelte Anti-Ids verwendeten monoklonale Antikörper der
Maus (MuMAbs) als Immunogen (6–11).
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Neben
ihrer Verwendung als Ersatzantigene wurden monoklonale Mausantikörper auch
zur Bestimmung und Charakterisierung vieler Antigenmoleküle auf menschlichen
Krebszellen eingesetzt. Monoklonale Antikörper der Maus haben einige
Vorteile gegenüber
solchen des Menschen, darunter eine hohe Affinität für Tumorantigene, eine höhere Sekretion
durch Aszites-Hybridom und eine hohe Antigendichte auf den Tumorzellen.
Neuere klinische Tests mit Mausmonoklonalen haben jedoch hinsichtlich
der therapeutischen Verwendung gezeigt, daß humane monoklonale Antikörper (HuMAbs)
zu bevorzugen sein könnten,
weil wiederholte Injektion von MuMAbs bei scheinbar allen Patienten
Anti-Maus-Ig-Antikörper
hervorruft. Dies führt
zur Bildung von Immunkomplexen und Immun reaktionen mit potentiell
gefährlichen
Komplikationen. Außerdem
können HuMAbs
Epitope erkennen, die vom Immunsystem der Maus übersehen werden.
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Die
Entwicklung von HuMAbs, die mit Gangliosid-Antigenen auf humanen
Krebszellen reagieren und der Nachweis ihrer Antitumorwirkung auf
klinischem Niveau wurde bereits mitgeteilt (23, 12). Patienten mit
Rezidivmelanom erhielten intratumorale Injektionen von HuMAb für das Gangliosid
GD2 oder GM2. Man beobachtete teilweise oder völlige Regression bei etwa 70%
der Patienten. Bei jenen Melanompatienten, bei denen die Immuntherapie
unwirksam war, wurde das Zielantigen GD2 oder GM2 nicht auf den
Tumorzellen exprimiert. Zwei als L55 und L72 identifizierte HuMAbs
wurden aus humanen B-Lymphoblastoid-Zelllinien hergestellt, die
durch das Epstein-Barr-Virus transformiert waren (29). Beide Antikörper L55
und L72 waren mit einer Vielzahl von Tumorzellen reaktiv.
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Weil
Menge und Art der Ganglioside auf menschlichen Tumorzellen bei verschiedenen
Krebspatienten weitgehend heterogen sind, ist es wünschenswert,
durch Untersuchung einer Biopsie vor der Behandlung festzustellen,
welche Ganglioside auf den Krebszellen des Patienten vorherrschen,
um unnötige
Verabreichung von HuMAb zu vermeiden.
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Zum
Nachweis von Menge und Art der auf einen bestimmten Tumor vorhandenen
Ganglioside wurden drei verschiedene immunologische Bestimmungsmethoden
(assay) angewendet. Sie umfassen die Immunadhärenz (IA); die direkte Immunfluoreszenz
mit fluoreszierend gemachten Mikrokugeln, die IA-Absorption und eine
biochemische Bestimmung. Jede dieser Bestimmungsmethoden hat gewisse
Beschränkungen
und Vorteile. Der Immunassay erfordert Suspensionen von Einzelzellen
aus den Tumorgeweben der Biopsie. Es ist jedoch oft schwierig, le bensfähige Tumorzellpopulationen
mit hoher Ausbeute zu erhalten. Unter dem Lichtmikroskop könnten auch
Tumorzellen von Monozyten und Makrophagen nicht leicht unterschieden
werden. Die biochemische Bestimmung erfordert keine intakten Zellen.
Jedoch wird für
die Extraktion der Ganglioside und die Messung der Sialinsäure in der
Glykolipidpräparation
ein relativ großes
Tumorvolumen benötigt.
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Das
gebräuchlichste
immunologische Verfahren zur Bestimmung der Antigenexpression auf
Biopsieproben unter Verwendung von monoklonalen Antikörpern der
Maus ist die immunhistochemische Färbung von Gewebeschnitten.
Dieses empfindliche Verfahren ist jedoch nicht leicht auf Kombinationen
von humanen monoklonalen Antikörpern
und humanen Geweben anwendbar. Indirekte Färbung von humanem Tumorgewebe mit
dem zweiten Antikörper
(anti-humanem Ig) führt
gewöhnlich
zu hohem Untergrund durch nichtspezifische Bindung an überschüssiges endogenes
humanes Ig. Direkte Immunfärbung
mit biotinylierten humanen monoklonalen Antikörpern kann diesen hohen Untergrund überwinden
(30). Dieses Verfahren ist jedoch gewöhnlich weniger empfindlich
und ist am wirksamsten, wenn auf der Zelloberfläche ein Antigen hoher Dichte
vorliegt.
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Zur
Zeit besteht ein fortwährendes
Bedürfnis
für die
Entwicklung weiterer humaner Zelllinien, die einen Antikörper produzieren
können,
der hinsichtlich der auf den Tumoren vorliegenden Gangliosiden immunogen ist.
Die von den neuen Zelllinien produzierten Anti-Gangliosid-Antikörper werden
zur direkten Behandlung von Tumoren und auch zur Herstellung von
Anti-Ids zur Verwendung als Ersatzantigene oder als diagnostische
Reagentien brauchbar sein.
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EP-A-0
480 440 beschreibt einen humanen monoklonalen Antikörper gegen
Melanomzellen. Es bezieht sich nicht auf den Antikörper dieser
Erfindung. EP-A-0 492 409 beschreibt einen humanen monoklonalen Antikörper, der
ein auf der Oberfläche
gewisser Melanomzellen vorliegendes Gangliosid erkennen kann. Es beschreibt
nicht diese Erfindung.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Erfindungsgemäß wurde
eine humane B-Lymphoblastoid-Zelllinie
entwickelt, die einen Anti-Gangliosid-Antikörper sekretiert, der mit einer
Vielzahl von Tumoren reaktiv ist und dessen Wirksamkeit bei der
Behandlung des Melanoms gezeigt wurde. Die erfindungsgemäße Zelllinie
ist als L612 identifiziert und wird unterhalten an der Division
of Surgical Oncology an der University of California an der Los
Angeles School of Medicine. Die L612-Zelllinie wurde hinterlegt
bei der American Type Culture Collection (Rockville, Maryland) unter der
ATCC Zugangsnummer CRL 10724.
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Als
ein Merkmal der vorliegenden Erfindung wird die Zelllinie L612 zur
Produktion eines IgM-kappa-Antikörpers
verwendet, der mit Tumorantigen reaktiv ist. Wenn er durch intraläsionale
Injektion verabreicht wurde, hat sich der L612-Antikörper als wirksam bei der Behandlung
von Melanomtumoren gezeigt.
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Als
ein anderes Merkmal der vorliegenden Erfindung wird der L612-Antikörper zur
Herstellung von monoklonalen Anti-Id-Antikörpern der Maus verwendet, die
als Ersatzantigene brauchbar sind oder in diagnostischen Verfahren
verwendet werden können.
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Die
oben beschriebenen Merkmale sowie viele andere Merkmale und zugehörige Vorteile
der vorliegenden Erfindung werden augenfällig, wenn die Erfindung mit
Bezug auf die folgende eingehende Beschreibung besser verstanden
wird.
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Zusammenfassung
der Zeichnungen
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1 ist die Nukleotid/Aminosäuresequenz
für den
variablen Bereich der schweren Kette des L612-Antikörpers. Die
komplementären
determinanten Bereiche sind unterstrichen.
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2 ist die Nukleotid/Aminosäuresequenz
für den
variablen Bereich der leichten Kette des L612-Antkörpers. Die
komplementären
determinanten Bereiche sind unterstrichen.
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Eingehende
Beschreibung der Erfindung
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Die
erfindungsgemäße Zelllinie
ist eine B-Lymphoblastoid-Zelllinie,
die mittels der Transformationstechnik mit Epstein-Barr-Virus transformiert
wurde. Die erfindungsgemäße Zelllinie
ist als L612 identifiziert und wird unterhalten an der Division
of Surgical Oncology an der University of California an der Los
Angeles School of Medicine. Die L612-Zelllinie wird hinterlegt bei der American
Type Culture Collection (Rockville, Maryland) unter der ATCC Zugangsnummer
CRL 10724.
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Die
Zelllinie L612 wurde in Kultur aus Lymphozyten mittels der gleichen
Transformationstechnik mit Epstein-Barr-Virus dargestellt, die zur
Herstellung zweier anderer humaner monoklonaler Anti-Gangliosid-Antikörper, L55
(Anti-GM2) und L72 (Anti-GD2) angewendet worden war (26–27 und
29). Bei der Darstellung der Zelllinie L612 folgte man dem gleichen
Transformationsverfahren, wie es im einzelnen in (29) ausgeführt ist. Die
zur Darstellung der früheren
Zelllinien L55 und L72 wie auch der vorliegenden L612-Zelllinie
angewendete Transformationstechnik mit Epstein-Barr-Virus ist ein
herkömmliches
Verfahren, das wohl bekannt ist und von Forschern auf diesem Gebiet
angewendet wird.
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Das
zur Darstellung der Zelllinie L612 im Einzelnen angewendete Verfahren
ist das folgende:
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Regionale
Lymphknoten wurden einer Brustkrebspatientin während der Mastektomie entnommen. Lymphozyten
wurden von diesen Lymphknoten abgetrennt, indem diese zunächst in
kleine Stücke
geschnitten und in Hankscher ausgewogener Salzlösung (HBSS) suspendiert wurden.
Die Suspension wurde durch ein Edelstahlsieb passiert, um große Gewebeklumpen
abzutrennen, und in Ficoll-Dichtegradientenlösung zentrifugiert, um die
Lymphozyten zu konzentrieren und abzutrennen. Zum Entfernen der
T-Lymphozyten wurde die Methode der Bildung von E-Rosetten angewendet
und die Fraktion der B-Lymphozyten wurde dreimal mit HBSS gewaschen
und dann 20 h mit Epstein-Barr-Virus
(EBV) in RPMI 1640 mit 10% fötalem
Kalbsserum inkubiert. Die Zellen wurden nach dem Verfahren der Grenzverdünnung kloniert
und mittels des oben beschriebenen IA-Bestimmungsverfahrens (29) auf Antikörperproduktion
geprüft.
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Als
Ziele wurden eine humane Brustkrebs-Zelllinie, MDA-MB 436 (31) und
eine humane Melanomzelllinie, UCLA-SO-M12 (32), verwendet. Während die
Klone, die für
die Brustkrebs-Zelllinie
436 positive Antikörper
sekretierten, sehr bald nach Darstellung die Produktion der Antikörper einstellten,
setzten jene, die auf die Melanomzelllinie M12 reagierten, die Produktion
der Antikörper
fort und waren stabil. Die Antikörper
sekretierenden Klone wurden an RPMI 1640 mit stufenweise geringerer
Konzentration an fötalem
Kalbsserum gewöhnt.
Die Klone wurden dann 7 mal in serumfreiem Medium mit Wachstumsfaktor
(FDA-genehmigtes serumfreies Medium der HB-Serie, bezogen von Irvine
Scientific. Co.) (Irvine, CA) rekloniert. Die Verdoppelungszeit der
Zelllinie L612 ist kleiner als ein Tag. Die Zelllinie sekretiert
mehr als 20 μg/ml
monoklonalen Antikörper IgM-kappa.
Der L612-Antikörper im
verbrauchten Medium wurde wie vorstehend beschrieben (25) gereinigt. Außerdem wird
der von der Zelllinie L612 produzierte Antikörper nach irgendeinem der herkömmlichen,
zur Entfernung und Reinigung der Antikörper von Zellkulturen angewendeten
Verfahren isoliert.
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Der
gereinigte L612-Antikörper
wurde mit verschiedenen humanen Tumorgeweben auf Reaktivität geprüft. Der
L612-Antiköper hatte
eine starke zytotoxische Aktivität
gegenüber
antigenpositiven humanen Tumorzellen in Gegenwart des Komplements.
Die Reaktivität
wurde sowohl mit dem Bestimmungsverfahren Immunadhärenz (IA)
als auch mit Immunadhärenzadsorption
(IAA) geprüft.
Die Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengefaßt.
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Tabelle
I
Reaktivität
von L612 mit humanen Krebs- und Nichtkrebsgeweben
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Insgesamt
21 Melanombiopsien, Peripherblutlymphozyten (PBLs) von 32 verschiedenen
Spendern und Erythrozyten von weiteren 44 Spendern wurden geprüft. 13 der
21 Melanomgewebe (62%) waren antigenpositiv, dagegen waren keine
der PBLs (0/32) und Erythrozyten (0/44) positiv. Kultivierte humane
maligne Zelllinien wurden ebenfalls auf Anwesenheit des Antigens
geprüft
(Tabelle I). Von den 16 mit direkter IA geprüften Melanomzelllinien waren
12 (75%) positiv. Die positive Reaktivität der anderen Krebszelllinien
war wie folgt: Lungenkrebs 4/4, Brustkrebs 5/7, Gastrointestinalkrebs
2/7, andere Krebstypen 1/4. Selbst mit der empfindlichen IA-Absorptionsmethode
war jedoch keine der 11 mit Epstein-Barr-Virus transformierten,
zu den geprüften Melanomzelllinien
autologen B-Zelllinien positiv. Obwohl der Prozentsatz positiver
Proben beim Melanom geringer als bei Lungenkrebs war, war beim Melanom
die Gesamtreaktivität
je Probe viel größer als
bei anderen histologischen Krebstypen. Von den geprüften Melanomzelllinien
zeigten M15 und M12 die höchste
Reaktivität.
Behandlung der Zellen mit Neuraminidase beseitigte die Antigenizität der Zelllinien
völlig,
während
Behandlung mit Trypsin dies nicht tat.
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Die
Reaktivität
des L612-Antikörpers
mit verschiedenen authentischen Glykolipiden wurde ebenfalls bestimmt.
Die Glykolipide und ihr jeweiliger Antigentiter bezüglich L612-Antikörper sind
in Tabelle II gelistet. Tabelle
II
Neutrale
Glycolipide | Antigentiter |
GbOse3-Cer (CTH) | 0 |
GbOse4-Cer (Globoside) | 0 |
GgOse4-Cer (Asialo-GM1) | 0 |
Ganglioside | |
I3NeuAc-Gal-Cer(GM4) | 64 |
II3NeuAc-Lac-Cer(GM3) | 64 |
II3NeuGc-Lac-Cer(GM3) | 0 |
II3NeuAc-GgOse3-Cer(GM2) | 0 |
II3NeuAc-GgOse4-Cer(GM1) | 0 |
IV3NeuAc-nLcOse4-Cer(SPG) | 16 |
IV3NeuGc-nLcOse4-Cer(SPG) | 0 |
II3NeuAc2-Lac-Cer(GD3) | 0 |
II3NeuAc2-GgOse3-Cer(GD2) | 0 |
| 0 |
IV3NeuAc-, II3NeuAc-GgOse3-Cer(GD1a) | 0 |
II3NeuAc2-GgOse4-Cer(GD1b) | 0 |
IV3NeuAc-, II3NeuAc2-GgOse4-Cer(GT1b) | 0 |
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Die
authentischen Glykolipide (5 nmol) wurden mittels des IA-Inhibierungstests
auf L612-Antigenaktivität
geprüft.
Drei Ganglioside, GM4, GM3 und
SPG, zeigten positive Reaktivität,
von denen jedoch zwei, GM4 und GM3, stärkere
Bindung (1 : 64) als SPG (1 : 16) zeigten. Andere Ganglioside, darunter
II3NeuGc-Lac-Cer, IV3NeuGc-nLcOse4-Cer, GM2, GM1a, GD3, GD2, GD1a, GD1b und GT1b, und
neutrale Glykolipide, darunter GbOse3-Cer,
GbOse4-Cer und GgOse4-Cer,
zeigten keine antigene Aktivität.
Um die obigen Ergebnisse zu bestätigen
wurden ELISA und Enzym-Immunfärbung
auf DC-Platten mit authentischen Glykolipiden durchgeführt. Die
mit ELISA und Enzym-Immunfärbung
erhaltenen Ergebnisse entsprachen denen des IA-Inhibierungstests.
ELISA wurde unter Verwendung von 15 authentischen, an Mikrotüpfelplattennäpfchen gebundenen
Glykolipiden durchgeführt.
Wieder zeigten die drei Ganglioside GM3,
GM4 und SPG eine klare Bindungsaktivität auf Festphasen-ELISA.
Keines der übrigen
Glykolipide zeigte Reaktivität.
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Es
wurde auch Enzym-Immunfärbung
auf DC-Platten mit GM4, GM3,
SPG, GD3, GD2, GM2, N-Glyceryl-GM3,
CDH, Globosid und Asialo-GM1 (lug) durchgeführt. Stark
positiv waren GM3 und GM4.
Mit SPG wurde geringere Reaktivität beobachtet. Sehr schwache
Reaktivität
beobachtete man mit GM2. Andere Glykolipide wurden
nicht gefärbt.
Die Ergebnisse dieser drei unterschiedlichen Typen von Immunassays
zeigen, daß HuMAb
L612 den endständigen
Zucker der Ganglioside, wie GM3 und GM4, detektiert, die einen NeuAc-α2-3-Galaktoserest
haben.
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Die
Immunfärbung
von Gefrierschnitten mit HuMAb L612 zeigte eine starke Spezifität für neoplastisches
Gewebe, darunter Melanom, Kolon-Adenokarzinom und Lungenadenokarzinom.
HuMAb stellt einen hervorragenden Marker zur Identifizierung gewisser
neoplastischer Gewebetypen bereit. Es wurde gezeigt, daß HuMAb
L612 an Nierenzellkarzinome bindet (35).
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Die
DNA-Sequenz der variablen Bereiche sowohl der leichten als auch
der schweren Ketten des L612-Antikörpers wurde durch Polymerasekettenreaktion
(PCR) bestimmt. Zur Herstellung der gesamten RNA aus der L612-B-Lymphoblastenlinie
wurde das Verfahren mit Guanidinthiocyanat/Cäsiumchlorid (34) angewendet.
Zehn μg
der RNA wurden mit 60 pmol 3'-Primer der mu-schweren
oder der kappa-leichten Kette gemischt und 10 min auf 70°C erwärmt. Das
Gemisch wurde dann zu 50 μl
einer Reverse-Transkriptase-Reaktionslösung zugefügt, die 10 μl 5 × Reverse-Transkriptase-Puffer
(BRL), 4 μl
dNTP-Mischung, 10 mmol/l (Endkonzentration 200 μmol/l dATP, dCTP, dGTP und dTTP)
und 3 μl
mit 600 Einheiten reverse Transkriptase (Superscript, BRL) enthielt.
Das Gemisch wurde 1 h bei 37°C
inkubiert.
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Eine
Standard-PCR wurde dann ausgeführt
mit: 97 μl
PCR-Gemisch wurde
zu 3 μl
RNS-cRNS-Gemisch zugefügt.
Das PCR- Gemisch
enthielt 10 × PCR-Puffer
(Perkin-Elmer, CA), 10 mmol/l dNTPs-Mischung mit 60 μmol/l Endkonzentration
jeder dNTP, 5 Einheiten Tap-Polymerase (Perkin-Elmer) und 60 μmol/l der
entsprechenden 5'-
und 3'-Primer der
schweren und leichten Kette. Das Gemisch wurde in einem Perkin-Elmer/Cetus-Thermozyklusgerät 35 Verstärkungszyklen
von 1 min bei 91°C,
2 min bei 52°C,
1,5 min bei 72°C und
nachfolgender Schlußinkubation
von 10 min bei 72°C
unterworfen. Mit einem Aliquot des PCR-Produkts wurde auf 2%-Agarosegel die richtige
Produktgrößenbande
verifiziert. Die Primer für
die mu-schwere und die kappa-leichte Kette erzeugten ein cDNA-Produkt
mit 495 bzw. 603 Basenpaaren. Wenn das Gel ein Einzelprodukt richtiger
Größe anzeigte,
wurde der Rest des PCR-cDNA-Produkts der PCR unterworfen, um mehr
Produkt zu gewinnen.
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Die
Gelprodukte wurden isoliert, zusammengeführt, einer Phenol-Chloroform-Extraktion
und Ethanolfällung
unterworfen. Die DNA wurde dann mit passenden Restriktionsenzymen
digeriert, extrahiert, gefällt
und mit GeneClean (Biol01, CA) gereinigt. Die DNA wurde in geeignet
geschnittene Restriktionsstellen des Bluescript-Vektors (Stratagene,
CA) eingebunden. Zehn unabhängig
Klone des variablen Bereichs der mu-Kette und vier unabhängige Klone
des variablen Bereichs der kappa-Kette wurden isoliert und sequenziert.
Zum Aussieben und Verifizieren der Klone der schweren Kette wurde
eine JH-Sonde für die schere Kette verwendet. Die
Sequenzierung erfolgte mittels des Dideoxynukleotidverfahrens mit
T7-DNA-Polymerase (Sequenase, USB, Cleveland, OH) nach Vorschrift
des Herstellers. Die verwendeten Primer waren die folgenden:
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Führende Primer
(3 Primer) der mu-schweren Kette (29):
GGGAATTCATGGACTGGACCTGGAGG(AG)TC(CT)TCT(GT)C;
GGGAATTCATGGAG(CT)TTGGGCTGA(CG)CTGG(CG)TTT(CT)T; und GGGAATTCATG(AG)A(AC)(AC)(AT)ACT(GT)TG(GT)(AT)(CG)C(AT)(CT)(CG)C T(CT)CTG.
Dies umfaßt
eine EcoRI-Restriktionsstelle (unterstrichen) zur Erleichterung
des Klonens. Der Primer für
die J-Region der schweren mu-Kette war CCRAGCTTAGACGAGGGGGAARAGGGTT.
Dies enthält
eine Hind-III-Stelle (unterstrichen). Führende Primer für die leichte
kappa-Kette waren
wie folgt (2 Primer) (30): GACATCGAGCTCACCCAGTCTCCA und GAAATTGAGCTCACGAGTCTCCA.
Diese Primer enthalten eine Sac-I-Stelle (unterstrichen). Der Primer
für die
J-Region der leichten kappa-Kette war GCGCCGTCTAGAACTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTTTGTGACGGGCAAG.
Dieser Primer enthält
eine Xba-Stelle (unterstrichen).
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Die
Nukleotidsequenz der geklonten cDNA und die kodierte Aminosäuresequenz
für den
variablen Bereich der schweren Kette ist in SEQ ID NO: 1 dargelegt.
Die obige Aminosäuresequenz
des variablen Bereichs der schweren Kette ist in SEQ ID NO: 2 dargelegt.
Die Nukleotidsequenz der geklonten cDNA und die kodierte Aminosäuresequenz
für den
variablen Bereich der leichten Kette ist in SEQ ID NO: 3 dargelegt.
Die obige Aminosäuresequenz
des variablen Bereichs der leichten Kette ist in SEQ ID NO: 4 dargelegt.
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Die
Nukleotid/Aminosäuresequenz
für den
variablen Bereich der schweren Kette ist auch in 1 gezeigt. Die komplementären determinanten
Bereiche (CDRs) 1, 2 und 3 sind unterstrichen. Die Nukleotid/Aminosäuresequenz
für den
variablen Bereich der leichten Kette ist auch in 2 gezeigt. Die komplementären determinanten
Bereiche (CDRs) 1, 2 und 3 sind ebenfalls unterstrichen.
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Der
erfindungsgemäße L612-Antikörper wird
Patienten zur Behandlung von Tumoren verabreicht, welche II3NeuAc-Lac-Cer(GM3)-Gangliosid,
GM4 oder IV3NeuAc-nLcOse4-Cer (SPG) enthalten. Das Gangliosid GM3 umfaßt
einen endständigen
Zucker mit einem NeuAc-α2-3-Galaktoserest.
Jedes herkömmliche, zur
Verabreichung von Antikörpern
an Patienten zur Behandlung solcher Gewebe angewendete Verfahren
kann angewendet werden. Diese Verfahren umfassen intravenöse oder
intraperitoneale Injektion und intraläsionale Injektion. Die intraläsionale
Injektion ist ein bevorzugtes Verfahren der Verabreichung für Hauttumorrezidive.
Der L612-Antikörper
und die den Antikörper
produzierende Zelllinie können
durch bekannte Verfahren abgewandelt oder verändert werden, um andere Immunglobulin-Isotypen
und diese produzierende Zellen zu bilden, welche Tumorzellen wirksam
binden und töten
können
(33). Die im Einzelfall angewendete Dosis wird abhängig von
der Antigenizität
des Tumors variieren und kann mit bekannten Verfahren für die Verabreichung
von Antikörpern
wie L55 und L72 bestimmt werden. Der monoklonale Antikörper L612
reagiert stark mit Biopsieproben humaner Melanomtumore. Er reagiert
auch weniger stark mit humanen Tumorbiopsieproben von Lungenkrebs,
Brustkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs,
Kolonkrebs und Nierenkrebs. Unter den mit dem monoklonalen Antikörper L612
geprüften
Zelllinien wurde die UCLASO-M12-Melanom-Zelllinie als reaktivste
identifiziert. Die UCLASO-M12-Zelllinie wird bei der Division of
Surgical Oncology an der University of California an der Los Angeles
School of Medicine unterhalten.
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Der
HuMAb L612 wurde als therapeutischer Wirkstoff zur Behandlung des
malignen Melanoms der Haut verwendet. Für die Anwendung beim Menschen
wurde HuMAb L612 gereiningt wie vorbeschrieben (25). In früheren Untersuchungen
wurde gezeigt, daß die
intraläsionale
Injektion des humanen anti-GD2-HuMAb L72 eine
Regression des Hautmelanoms herbeiführen kann (23). Im vorliegenden
Beispiel wird die Wirkung von HuMAb L612 und HuMAb L72 verglichen.
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Die
84 Jahre alte Frau unterzog sich einer chirurgischen Exzision einer
rasch wachsenden Hautmelanomläsion
(1,9 × 1,6
cm) auf ihrer linken Wange. Die pathologische Untersuchung des Gewebeausschnitts
ergab ein Melanom im Clark-Stadium
IV. Die Gangliosidexpression der Biopsie der Läsion wurde für GM3 mäßig positiv
und für
GD2 negativ gefunden. Zwei Wochen nach dem
Eingriff entwickelte sich an der Einschnittstelle ein Rezidiv. Die
oberen Läsionen
wurden wöchentlich
mit 1 ml HuMAb L612, die unteren Läsionen mit 1 ml HuMAb L72 behandelt.
Nach einem Monat (3 Behandlungen) beobachtete man Nekrose und Erweichung
der mit HuMAb L612 behandelten Läsionen.
Dagegen zeigten die mit HuMAb L72 behandelten Läsionen keine Wirkung und waren
vielmehr weiter fortgeschritten. Die Patientin verschied schließlich wegen
ausgedehnter Metastasen in Leber und Gehirn.
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Der
L612-Antikörper
ist auch verwendbar zur Erzeugung von Hybridomen, die wiederum zur
Erzeugung von Anti-Ids zur Verwendung als Ersatzantigene oder als
diagnostische Reagentien eingesetzt werden können. Die Herstellung von Hybridomen
und die nachfolgende Erzeugung von Anti-Ids werden im folgenden Verfahrensbeispiel
beschrieben.
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BALB/c-Mäuse wurden
mit subkutaner Injektion von 200 μg
gereinigten monoklonalen Antikörpers L612
in komplettem Freundschem Adjuvans immunisiert. Nach zwei Wochen
wurde den Tieren eine weitere verstärkende subkutane Injektion
von L612 in inkomplettem Freundschem Adjuvans injiziert. Elf Tage
danach wurde den Mäusen
200 μg L612
in Salzlösung
intraperitoneal injiziert. Nach drei Tagen wurde die Milz entfernt und
die Splenozyten mit der Myelomzelllinie SP2/O nach dem Standardverfahren
zur Erzeugung von Hybridomen verschmolzen.
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Nach
Selektion mit HAT-Medium wurden die Näpfchen mit der Hybridomkultur
mit ELISA auf Antikörper
geprüft.
Anti-Ids (AB2) sekretierende Hybridome wurden durch ihre starke
Bin dungsreaktivität
für HuMAb L612
und fehlende Reaktivität
für drei
andere humane IgMs, L55, L72 und Humanserum-IgM, identifiziert.
Die als Antigen verwendeten nicht verwandten Proteine umfaßten fötales Rinderserum
und humanes Serumalbumin. 50 μl
der IgMs oder der Proteine (50 μg/ml)
wurden auf eine ELISA-Platte mit 96 Näpfchen aufgetragen und dienten
als Antigene zum Nachweis von AB2. Wie vorbeschrieben (19) wurden
peroxidasekonjugiertes Anti-Maus-IgG + IgM der Ziege als Nachweissonde
für AB2
mit nachfolgendem Nährboden
und Messung der Extinktion bei 490 nm verwendet.
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Die
HAT-Selektion von ungefähr
2500 Hybridomkultur-Näpfchen,
die wie oben beschrieben hergestellt worden waren, ergab 40 Hybridome,
die Antikörper
mit ausgeprägter
Reaktivität
für L612-HuMAb,
aber ohne Reaktivität
für drei
humane Vergleichs-IgMs und zwei nicht verwandte Serumprotein-Antigene
sekretierten. Um festzustellen, ob diese Anti-L612-Antikörper vom gegen die Antigen-Kombinationsstelle
des L612 gerichteten AB2-beta-Typ oder an Peptidbereiche außerhalb
der Antigen-Kombinationsstelle des L612 gebundene AB2-alpha-Antikörper waren,
wurde die inhibierende Aktivität
dieser Anti-L612-Antikörper
gegen die Bindung des L612 an GM3-positive Zielzelllinien oder an
das gereinigte Antigen, das Gangliosid GM3, mittels dreier Bestimmungssysteme
geprüft:
IA-Inhibierung, Zell-ELISA-Inhibierung und GM3-ELISA-Inhibierung. Von den 40 geprüften Antikörpern inhibierten
sieben die L612-Bindung an eine antigenpositive Melanom-Zielzelllinie (UCLASO-M12)
und an GM3 zu mehr als 50 der Bestimmungen, während 12 andere schwache oder
keine inhibierende Aktivität
hatten.
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Von
den sieben inhibierenden Anti-Ids wurde eine als 4C10 bezeichnete
zum Klonen als das bevorzugte beta-Typ-Anti-Id zur Verwendung bei
der Behandlung von Tumoren ausgewählt. Aus der nicht inhibierenden
Gruppe wurde das als 18C6 iden tifizierte Anti-Id zum Klonen als
bevorzugtes alpha-Typ-Anti-Id
zur Verwendung für
immundiagnostische Bestimmungen ausgewählt. Beide Anti-Ids, 4C10 und
18C6, wurden mit Isotyp-Antiglobulinen geprüft und man fand, daß sie zur
Klasse IgG1 gehören
und kappa-leichte Ketten enthalten.
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Die
mit 4C10 und 18C6 geklonten Hybridomzelllinien wurden in FCS-haltigem
RP-MI-1640-Medium gezüchtet
und sekretierten 5 – 10 μg/ml Antikörper in
den Überstand
der Kultur. Die Titer der Anti-Ids in diesen Kultur-Überständen gegen
L612 nach ELISA lagen zwischen 1 : 200 und 1 : 1000/106 Hybridome.
Das Anti-Id 18C6 zeigte geringe Inhibierung der Bindung von HuMAb
L612 an Zielzellen im IA-Assay und an das Gangliosid GM3 in ELISA,
während
4C10 bei gleicher Antikörperkonzentration
sowohl im ELISA als auch im IA-Assay starke Inhibierung zeigte.
In einer Vergleichsbestimmung inhibierten 4C10 und 18C6 die Bindung
eines nicht verwandten Antigensystems, HuMAb L72, an M14-Zielzellen
oder an GD2-Antigen
nicht. Das Fehlen der Bindungsinhibierung des 18C6 deutet auf eine
Bindungsstelle am L612-Antikörper
außerhalb
der Kombinationsstelle für
GM3-Antigen. Die spezifische Bindungsinhibierung des 4C10 deutet
an, daß seine
Bindungsstelle innerhalb oder nahe bei der Antigen-Kombinationsstelle
liegt.
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Die
Hybridomzelllinien, welche die monoklonalen Anti-Ids 4C10 und 18C6
sekretieren, werden bei der Division of Surgical Oncology der University
of California an der Los Angeles School of Medicine unterhalten.
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Das
4C10-Anti-Id und andere gegen L612 aufgestellte Anti-Ids vom beta-Typ
können
für sich
oder in Kombination mit anderen Wirkstoffen zur Behandlung von Tumoren
verwendet werden. Sie sind bevorzugt für die Verwendung bei der Behandlung
von Melanomtumoren. Diese Anti-Ids vom beta-Typ können auch
als Immunmodulatoren zur Verstärkung
der Immunität
gegen Krebs, zur Unterdrückung
der Abstoßung
transplantierter Organe und von Autoimmunerkrankungen angewendet
werden.
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Die
beta-Anti-Ids können
mit jedem der zur Einführung
von Antikörpern
in Patienten angewendeten herkömmlichen
Verfahren verabreicht werden. Diese Verfahren umfassen subkutane,
intravenöse
und intratumorale Injektion. Die beta-Typ-Anti-Ids werden bevorzugt mit KLH konjugiert
und in einem geeigneten Träger, wie
komplettem Freundschem Adjuvans, emulgiert. Die im Einzelfall für die beta-Typ-Anti-Ids
angewendeten Dosen variieren abhängig
vom zu behandelnden Tumor und zahlreichen anderen Faktoren. Die
Dosishöhen werden
nach bekannten Verfahren und allgemein anerkannten und angewendeten
Grundsätzen
für die
Behandlung von Patienten mit Antigen-Immunwirkstoffen oder monoklonalen
Antikörpern
festgesetzt.
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Die
immunogene Brauchbarkeit der beta-Typ-Anti-Ids für L612-Antikörper wurde
wie folgt gezeigt:
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Fünf syngene
Balb/c-Mäuse
wurden mit gereinigtem 4C10-KLH geimpft. Zum Vergleich wurden vier Mäuse mit
Maus-IgG1-KLH und eine Maus mit KLH allein geimpft. Die immunisierten
Sera wurden mit ELISA unter Verwendung von gereinigtem GM3 als Antigenquelle
und mit dem IA-Assay unter Verwendung der antigenpositiven Melanomzelllinie
M12 überwacht.
Im ELISA wurde peroxidasekonjugiertes Antimaus-IgM + IgG der Ziege
(Boehringer Mannheim) als zweiter Antikörper verwendet.
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Bei
drei der fünf
Immunisierungen mit 100 μg
4C10-KLH wurde ein meßbarer
Antikörper
(AB3) erzeugt. Die immunisierten Sera banden an GM3, aber nicht
an CDH (Asialo-GM3). Sera der fünf
mit IgG-KLH oder mit KLH allein geimpften Mäuse reagierten auf keines der
Glykolipide. Bei weiterer Analyse zur Bestimmung der Ig-Klasse des
AB3 (ELISA und DC-Immunfärbung) wurde
die Reaktivität überwiegend
als IgM identifiziert.
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Um
die artspezifischen natürlichen
Antikörper,
die mit dem M12-Zellen im IA-Assay reagieren könnten, auszuschließen, wurden
die immunisierten Maussera durch humane rote Blutkörperchen
bei 9°C über Nacht vorabsorbiert.
Mit einer 1 : 10-Verdünnung
der absorbierten Sera wurde ein IA-Wert von 4+ erhalten. Vergleichssera
gaben selbst bei Verdünnung
1 : 2 keine Reaktivität.
Zur Bestätigung,
daß die
positive Reaktivität gegen
das GM3-Antigen auf der Zelloberfläche gerichtet war, wurde IA-Inhibierung
mit GM3 (10 μg),
CDH (10 μg),
4C10 (10 μg)
und nicht verwandtem IgG1 (10 μg),
gereinigt aus Balb/c Hybridom-Rszites, durchgeführt. Während die Reaktivität durch
GM3 oder gereinigtes 4C10 völlig
inhibiert wurde, erhielt man mit CDH oder nicht verwandtem IgG1
keine Inhibierung.
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Die
obigen Beispiele zeigen, daß beta-Typ-Anti-Ids
AB3-Antikörper erzeugen,
die mit Melanomtumoren immunreaktiv sind. Dementsprechend sind diese
beta-Typ-Anti-Ids, die sich als Antwort auf den L612-Antikörper bilden,
als Immunisierungsmittel für
die Behandlung von Melanomen wirksam.
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Die
als Antwort auf den L612-Antikörper
erzeugten alpha-Typ-Anti-Ids
können
in immundiagnostischen Verfahren, wie einem dreistufigen Zell-ELISA-Verfahren
und einer dreistufigen Immunperoxidasefärbung von Tumorgewebeschnitten,
angewendet werden. Praktische Beispiele folgen.
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Dreistufiger
Zell-ELISA
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Auf
eine Mikrotüpfelplatte
mit 960 Näpfchen
und U-Boden (Immulon-1, Dynatec) wurden lebensfähige M12-Zellen (1 × 105) nach Preblocking mit 1% BSA-PBS aufgetragen.
50 μl L612
(100 μg/ml)
wurden zugesetzt und 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Waschen
des Gemischs zum Entfernen von ungebundenem HuMAb L612 wurden die
Zellen mit monoklonalem Maus-Anti-Id 18C6 (100 μg/ml) 1 h bei Raumtemperatur
inkubiert. Nach Waschen wurden 50 μl peroxidasekonjugierter Ziegen-Anti-Maus-IgG-Antikörper (1/10000
verdünnt)
(Jackson Immuno Research) zugesetzt und die Platte 30 min inkubiert.
Nach Waschen mit PBS-Lösung wurde
der Träger
für Peroxidase
zugesetzt und die Bindungsaktivität als Funktion der Extinktion
bei 490 nm mit einem kinetischen Vmax Mikroplatten-Lesegerät bestimmt.
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Wenn
die Antigen-Kombinationsstellen des L612 durch auf den Tumorzellen
exprimiertes GM3 besetzt sind, sollte das zellgebundene HuMAb L612
seine Bindungsaktivität
für beta-Anti-Id vermindert haben,
aber dennoch die volle Bindungsaktivität für alpha-Anti-Id behalten. Das
oben beschriebene Verfahren bestätigte diesen
Vorgang unter Verwendung von kultivierten M12-Melanomzellen, welche
eine hohe Dichte des entsprechenden Antigens exprimieren.
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Der
oben beschriebene Zellbindungsassay stellt eine modifizierte Form
der ELISA-Technik dar. Um die Spezifität der positiven Reaktion festzustellen,
wurden einige Vergleichsprüfungen
eingebunden. Die antigangliosiden HuMAbs umfaßten L55 (IgM-Anti-GM2) und
L72 (IgM-Anti-GD2), die beide eine starke Bindungsfähigkeit
an die an GM2 und GD2 reiche M14-Melanomzelllinie
haben (26, 27). Das Anti-Id 18C6 reagierte stark auf M12-Zellen
nach Vorinkubation mit HuMAb L612, reagierte aber nicht auf M14-Zellen,
die mit L55- oder L72- HuMAb
vorinkubiert waren. Bei anderen Vergleichen, darunter Maus-Anti-Id
allein, L612 oder L612 plus (Anti-Id beta), reagierte das peroxidasekonjugierte
Anti-Maus-Ig auch nicht.
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Der
Zell-ELISA wurde dann auf einige andere humane Tumorzelllinien angewendet.
Ein zweistufiger Zellbindungsassay (HuMAb + peroxidasekonjugiertes
Anti-human-IgM) wurde mit dem dreistufigen Zellbindungsassay verglichen,
um die Gültigkeit
des dreistufigen Assays zu ermitteln. Der dreistufige Assay hatte
eine mit dem zweistufigen parallele Reaktivität und war für fast jede Zelllinie etwas
empfindlicher. Diese Daten deuten an, daß der ELISA-Extinktionswert
des dreistufigen Assays Unterschiede der Dichte der GM3-Antigene an der Zelloberfläche genau
widerspiegelt und mit den zweistufigen in vitro-Assays eng korreliert.
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Dreistufige
Immunperoxidasefärbung
von Gewebeschnitten
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4 μm dicke Gewebeschnitte
wurden von frisch eingefrorenen Geweben in OTC-Verbindung geschnitten,
sofort in kaltem Formaldehydpuffer (12 g Tris-Puffer, 9 g Natriumchlorid,
40 ml 37% Formaldehyd, pH 7,9) fixiert und luftgetrocknet. Die Platten
wurden 5 min in Tris-Puffer getaucht und dann 10 min mit Wasserstoffperoxid
behandelt, um endogene Peroxidaseaktivität zu löschen.
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Nach
5 min Waschen in fließendem
Wasser wurden die Schnitte 20 min mit 5% normalem Humanserum überschichtet.
Dann wurde HuMAb L612 (10 μg
IgM in 200 μl)
aufgetragen und 45 min inkubiert. Die Platten wurden 5 min in Tris-Puffer
gewaschen, das gereinigte Anti-Id 18C6 (10 μg IgG1 in 200 μl) aufgetragen
und 30 min inkubiert.
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Nach
erneutem Waschen der Platten wurde der dritte Antikörper, ein
biotinyliertes Ziegen-Anti-Maus-IgG (Vector Laboratories, San Francisco)
in Verdünnung
1/100 aufgetragen und 25 min inkubiert. Nach Waschen wurde peroxidasekonjugiertes
Streptavidin (Verdünnung
1/1000) (Zymed Laboratories, San Francisco) aufgetragen und 20 min
inkubiert. Nach Waschen wurden die Platten 5 min in Substratlösung mit
6 ml Aminoethylcarbazol, 50 ml 0,02 mol/l Natriumacetatpuffer (pH
5,1) und 0,4 ml frisch bereitetem 3% Wasserstoffperoxid eingetaucht.
Die Platten wurden noch einmal in Leitungswasser gewaschen, mit
Hämatoxylin
gegengefärbt
und es wurden auf den gefärbten
Schnitten mit Glyceringelatine Deckgläschen angebracht. Der dreistufige
Immunperoxidaseassay wurde erfolgreich zum Nachweis der Bindung
von L612-Antikörper an
biopsiechirurgische schnellgefrorene Tumorgewebe angewendet.
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Nachdem
so beispielhafte erfindungsgemäße Ausführungsformen
beschrieben wurden, sollte der Fachmann beachten, daß die Offenbarungen
darin nur beispielhaft sind und daß verschiedene andere Alternativen,
Anpassungen und Abwandlungen innerhalb des erfindungsgemäßen Bereichs
vorgenommen werden können.
Zum Beispiel kann der L612-Antikörper
zur Herstellung chimärer
Antikörper
verwendet werden, die ebenfalls für unterschiedliche Behandlungen
oder als diagnostische Reagentien brauchbar sind. Demgemäß ist die
vorliegende Erfindung nicht auf die speziellen, hier veranschaulichten
Ausführungsformen,
sondern nur durch die folgenden Ansprüche beschränkt.
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