DE69029858T2 - Behandlung von einer autoimmun-krankheit - Google Patents

Behandlung von einer autoimmun-krankheit

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Description

    Hintergrund
  • Autoimmunkrankheiten umfassen eine breite Vielfalt von Störungen, zu denen gehören: entzündliche Erkrankungen des Zentralnervensystems wie multiple Sklerose und perivenöse Enzephalomyelitis sowie bestimmte Neuropathien wie entzündliche entmyelinisierende Polyradiculoneuropathie; bestimmte cardiovaskuläre Erkrankungen wie rheumatisches Fieber und einige Formen von Myocarditis wie Chagas- Krankheit; autoimmune Hautkrankheiten wie Pemphigus vulgaris und pemphigoider Blasenausschlag; allgemeiner Lupus erythematodes (SLE); Sclerodermie; autoimmune hämolytische Anämie; idiopathische Purpura thrombopenica; autoimmune Neutropenie; Sperma- und testiculäre Autoimmunität; Autoimmunkrankheiten der Skelettmuskeln wie Myasthenia gravis; Dermatomyositis und Polymyositis; Basedow- Krankheit, Thyreoiditis und autoimmune Endocrinopathien wie autoimmune Addison-Krankheit und autoimmunes polyglanduläres Syndrom vom Typ I und vom Typ II; perniziöse Anämie; insulinabhängige Diabetes, autoimmune Lebererkrankungen wie chronisch aktive Hepatitis und primäre biliäre Zirrhose, autoimmune Nierenerkrankungen wie Glomerulonephritis, tubulointerstitielle Nephritis, Anti-GBM-Nephritis und anti-tubuläre Basalmembran- Krankheit; autoimmune Augenerkrankungen wie phycoantigenische Uveitis, sympathische Ophthalmie, Narben-Pemphigus, Moorens Ulkus, Skleritis und anteriore und posteriore Uveitis; verschiedene Bindegewebserkrahkungen, rheumatoide Arthritis, einige entzündliche Darmerkrankungen; Sjörgren-Syndrom; Cryoglobulinämie. Alle Autoimmunkrankheiten werden durch anomale Immunantworten bei den betroffenen Individuen gegen autologe Antigene verursacht. Die Autoimmun-Antikörper binden an autologe Antigene in den Körperflüssigkeiten oder an der Oberfläche von Zellen. Dies führt zu einem breiten Bereich von Immunmechanismen, die zu Gewebeschäden und Änderung bei Zeilfunktionen und zu verschiedenen Erscheinungsformen von Autoimmunkrankheiten führen.
  • Für die Mehrheit der Autoimmunkrankheiten gibt es keine wirkungsvollen Behandlungen. Die verfügbaren Behandlungen bieten Schmerzerleichterung oder beinhalten die Verwendung entzündungshemmender Arzneimittel, die die Krankheitssymptome verringern. Immunsuppressive Arzneimittel, wie zelltötende Steroide, werden auch verwendet, um die Gesamtaktivität des Immunsystems zu unterdrücken.
  • In jüngster Zeit wurden für Oberflächenantigene an T-Lymphozyten (T- Zellen) oder aktiven Immunozyten spezifische monoklonale Antikörper als therapeutische Mittel für Autoimmunkrankheiten in Tier- Modellsystemen und in klinischen Versuchen am Menschen untersucht. Einige Beispiele sind monoklonale Antikörper gegen (1) CD4 antigen on helper T cells, Wofsy, D. und Seaman, W.E. J. Exp. Med. 161:378 (1985); Waldor, M.K, et al. Science 227:415 (1985), Shizuru, J.A. et al. Science 240:659 (1987); (2) Ia antigen on macrophages/monocytes, B cells and active T cells, Steinman, L. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:7111(1981); Sriram, 5. und Steinman, L. J. Exp. Med. 158:1362 (1983); McDevitt, H.O. et al. Ciba Found. Symp. 129:84 (1987); und (3) Interleukin-2 receptors on activated T cells, Kelley, V.E. et al. J. Immunol, 140:59 (1988); Strom, T.B. et al. Pro. Clin. Biol. Res. 224:227 (1986). Von diesen monoklonalen Antikörpern wurde gezeigt, daß sie in der Lage sind, in vivo Lymphozyten, welche die Oberflächenantigene, mit denen die Antikörper reagieren, tragen, zu zerstören oder herunterzuregulieren. Man glaubt, daß die Immunmechanismen, die zu der spezifischen Zielzell-Verarmung führen, antikörper-abhängige zelluläre Zytotoxizität (ADCC), komplementabhängige Zytolyse und wahrscheinlich einige andere Mechanismen umfassen. Die für Oberflächenantigene an T-Zellen oder aktivierten Immunozyten spezifischen Antikörper können die gesamten Immunsysteme, und daher die Antikörper-Antworten gegen die autologen Antigene, unterdrücken. Diese allgemeine Immunsuppression erleichtert bei Patienten die Schwere der Autoimmunkrankheiten.
  • Eine allgemeine Immunsuppression, die von der Verarmung von T- Zellen oder aktivierten T-Zellen herrührt, kann jedoch eine Therapie mit so schädlichen Nebenwirkungen sein, daß sie für viele Patienten die Vorteile überwiegen. T-Zellen spielen zentrale Rollen bei der Entwicklung, Reifüng und Regulierung verschiedener Zweige des Immunsystems einschließlich zytotoxischer T-Zellen, Antikörper-Antwort und phagozytischer einkerniger und polymorphkerniger Zellen. Es ist daher wunschenswert, eine Therapie zu entwickeln, die die mit Autoimmunkrankheiten in Zusammenhang stehenden Antikörper herunterreguliert oder selektiv beseitigt.
  • Bei Patienten mit rheumatoider Arthritis beispielsweise haben einige IgG-Spezies abnorme Epitope, die die Produktion von IgG und IgM, die als Rheumafaktoren bekannt sind, induzieren. Diese Autoimmun-IgG binden unter Bildung von Immunkomplexen an die Rheumafaktoren, was zur Pathogenese rheumatoider Arthritiserkrankungen fährt. Bei vielen anderen Autoimmunkrankheiten wird die Immunglobulin-Produktion von IgG- und IgM-Isotypen stimuliert, und bei manchen Autoimmunkrankheiten kann die Produktion anderer Isotypen stimuliert werden. Es wäre sehr wünschenswert, die Synthese der mit bestimmten Autoimmunkrankheiten in Zusammenhang stehenden Isotypen selektiv zu unterdrücken, und insbesondere der Isotypen IgG und IgM, die am häufigsten mit derartigen Erkrankungen im Zusammenhang stehen.
    • Zusammenfassung der Erfmdung
  • Die Erfindung betrifft die Behandlung von Autoimmunkrankheiten durch selektives Unterdrücken oder Beseitigen von B-Zellen, die Immunglobulin der Isotyp-Klasse, die mit einer Autoimmunkrankheit in Zusammenhang steht, erzeugen, oder durch selektives Unterdrücken oder Beseitigen von Vorläufern dieser Zellen. Die Erfinder konnten die Aminosäuresequenz des extrazellulären Epitops der B-Zellen-Membrangebundenen Form von IgM oder IgG, das an der ausgeschiedenen Form des Immunoglobulins nicht vorhanden ist, bestimmen und haben dann erkannt, daß Krankheiten durch Zielen auf diese Epitope, die an der Oberfläche der B-Zellen exprimiert werden, mittels Antikörpern und verwandten Produkten behandelt werden können.
  • Die bevorzugte Ausführungsform umfaßt das Behandeln von Autoimmun-Erkrankungen durch Zielen auf Epitope, die für die Form von IgG- und Igm-Isotypen, die auf der B-Zellenoberfläche exprimiert werden, eindeutig sind, und die Antikörper und verwandten Produkte, die zum Zielen auf diese Epitope verwendet werden können. Bei einer andere Ausführungsform der Erfindung werden B-Zellen, die einen Antikörper eines bestimmten Isotyps exprimieren und sezernieren (ausscheiden oder absondern) beseitigt oder unterdrückt, indem man ein Produkt verabreicht, das eine für die B-Zelle Isotyp-spezifische Immunantwort stimuliert (z. B. die Erzeugung eines Antikörpers, der spezifisch an die B-Zelle bindet).
  • Die Immunglobulin-Isotypen des Menschen sind IgG (mit vier Unterklassen), IgA (mit zwei Unterklassen), IgM, IgD und IgE. IgG verursacht Zuführung zur Phagozytose und zelluläre Zytotoxizität und durchdringt die Plazenta, IgA wirkt auf die Schleimhautoberfläche, IgM ist sehr wirksam bei der Komplement-Bindung und IgE vermittelt Degranulierung von Mastzellen und basophilen Granulozyten. Die Wirkungsweise von IgD wird noch nicht gut verstanden. Die schweren Ketten von IgG, IgA, IgM, IgD und IgE werden jeweils als die γ-, α-, µ-, δ- und ε-Kette bezeichnet. Die zellen-gebundene Form eines jeden dieser Immunglobulin-Isotypen wird auf der B-Zellen-Oberfläche exprimiert, und die B-Zellen, die eine sezernierte (ausgeschiedene), lösliche Form jenes Isotyps erzeugen, exprimieren auch die zellengebundene Form des bestimmten Isotyps.
  • Ausgehend von den C-Enden der schweren Ketten der zellen-gebundenen Formen der Immunglobuline erstrecken sich Membrananker-Peptide. Diese Membrananker-Peptide spannen sich ein in die Zellmembran- Lipid-Doppelschicht, wodurch sie das assozuerte Immunglobulin an der Zellmembran-Oberfläche befestigen. Die extrazellulären Segmente dieser Peptide sind eindeutig für verschiedene Isotypen, neigen aber dazu, unter verschiedenen Unterklassen eines bestimmten Isotyps sehr ähnlich zu sein. Das extrazelluläre Segment jedes Immunglobulin-Isotyps bildet, ganz oder teilweise, Epitope, die für die B-Zellen, die jenen Isotyp exprimieren, eindeutig sind. Diese für den membran-gebundenen Immunglobulin-Isotyp spezifischen (membrane-bound immunoglobuline isotype-specific, "migis"), extrazellulären Epitope sind auf der ausgeschiedenen, löslichen Form der Immunglobuline, die nicht durch die Membrananker-Peptide an die Zellenoberfläche gebunden sind, nicht vorhanden.
  • Die Antikörper und anderen verwandten Produkte der Erfindung binden an die migis-Epitope, und bevorzugt an die migis-µ- oder migis-γ- Epitope, die auf der B-Zellenoberfläche vorhanden sind. Die B-Zellen, die den bestimmten Isotyp, z. B. IgG oder IgM, erzeugen, können dann durch eine Anzahl von Inununmechanismen beseitigt oder kontrolliert werden.
  • Ruhende B-Zellen, die immunkompetent, aber noch nicht aktiviert sind, exprimieren IgM und IgD. Einmal aktiviert und damit betraut, Antikörper auszuscheiden, können diese B-Zellen jeden der fünf Isotypen exprimieren. Dementsprechend wird ein Produkt, das auf das migis-µ-Epitop zielt, ruhende, immunkompetente B-Zellen beseitigen oder unterdrücken und, als ein Ergebnis, Verarmung oder Unterdrückung von B-Zellen, die alle fünf der Immunglobulin-Isotypen erzeugen, bewirken. Die Immunsuppression ist jedoch auf die Antikörper-Erzeugung beschrännt, was die Funktionen von T-Zellen und Makrophagen und Granulozyten nicht beeinträchtigt.
  • Die Antikörper der Erfindung umfassen sowohl polyklonale als auch monoklonale Antikörper. Um eine immunogene Reaktion auf die verabreichten Antikörper zu vermeiden oder zu mimmieren, können mehrere verwandte Produkte einschließlich chimären Antikörpern (die eine Kombination aus einem tierischen variablen Bindungs-Bereich und einem menschlichen konstanten Bereich sind), Einzelstrang-Antikörpern, menschlichen Antikörpern oder Fragmenten von menschlichen oder chimären Antikörpern verwendet werden. Es können auch Antikörper verwendet werden, bei denen der gesamte konstante Bereich und der größte Teil des variablen Bereichs menschlichen Ursprung ist und nur die Antigen-Bindungsstelle tierischen Ursprungs ist. Auch mehrere andere abgeleitete Produkte der Antikörper der Erfindung, die nachstehend beschrieben sind, können bei der Therapie verwendet werden.
  • Die Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die Zeichnungen weiter beschrieben werden.
    • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • Fig. 1A zeigt die DNA-Gensequenz eines Segments einer menschlichen γ-1-Kette, wobei die Sequenz eines ersten Membran-Exons, von dem vorgeschlagen wird, daß es für das Membrananker-Peptid codiert, unterstrichen ist und die flankierenden Nucleotidsequenzen nicht unterstrichen sind. Fig. 1B zeigt die DNA-Gensequenz eines Segments der menschlichen γ-1-Kette, wobei die Sequenz emes zweiten Membran-Exons, von dem vorgeschlagen wird, daß es für das Membrananker-Peptid codiert, unterstrichen ist und die flankierenden Nucleotidsequenzen nicht unterstrichen sind.
  • Fig. 2A zeigt die Nucleotidsequenzen der zwei in den Figuren 1A, 1B gezeigten Membran-Exons der menschlichen γ-1-Kette (wobei einige der flankierenden Sequenzen durch kleine Buchstaben gezeigt sind) sowie die entsprechenden Nucleotidsequenzen für menschliche γ-2-, γ-3- und γ-4-Ketten.
  • Fig. 2B zeigt die abgeleiteten Aminosäure-Sequenzen, für die die in Fig. 1A gezeigten Membran-Exons codieren, wobei das vorgeschlagene extrazelluläre Segment angegeben ist.
  • Fig. 3A zeigt die Sequenz eines Segments einer cDNA einer menschlichen γ-1-Kette von mRNA von IM9-Zellen, das die CH3-Domäne mit dem in Fig. 1A gezeigten Membran-Exon, mit dem in Fig. 1B gezeigten Membran-Exon, mit dem 3'-unübersetzten Bereich verbindet.
  • Fig. 3B zeigt die Donor/Akzeptor-Splicingstellen des in Fig. 3A gezeigten cDNA-Segments
  • Genaue Beschreibung der bevorzugten Ausführungsform und Art und Verfahren ihrer Herstellung und Verwendung Membrananker-Peptide sind Teile der schweren Ketten der assoziierten Isotypen und verankern die Isotypen an der Zellenoberfläche. Für IgM bzw. IgG haben diese Ankerpeptide Längen von 41 und 71 Aminosäuren. Diese Membrananker-Peptide können in drei Segmente eingeteilt werden, wobei jedes Segment bezüglich der Plasmamembran unterschiedlich angeordnet ist. Die mittleren Segmente aus 25 ungeladenen und hydrophoben Resten sind in der Membran-Lipid-Doppelschicht. Das C-terminale hydrophile Segment des Membrananker-Peptids von IgM hat drei Reste, während das entsprechende C-terminale hydrophile Segment von IgG 28 Reste hat. Es wird vorgeschlagen, daß diese C-terminalen Segmente intrazellulär sind.
  • Das IgM-Segment in Richtung des N-Endes enthält 13 Aminosäure-Reste; während das entsprechende IgG-Segment 18 Reste enthält. Diese Segmente in Richtung des N-Endes sind hochgradig sauer und hydrophil, und daher wird vorgeschlagen, daß sie an der extrazellulären Oberfläche der Plasmamembran sind. Weil die Segmente am N-Ende wahrscheinlich extrazellulär sind, sind sie wahrscheinlich exponiert und für Antikörper zugänglich und können zum Ziel genommen werden, wodurch sie ein Mittel zur Zerstörung von B-Zellen, die einen bestimmten Isotyp erzeugen, liefern. Diese extrazellulären Segmente bilden, ganz oder teilweise, Epitope, die hierin als die migis-Epitope bezeichnet werden.
  • Die vorgeschlagenen Sequenzen der Membrananker-Peptide von IgG (Unterklassen 1 bis 4) wurden mittels der nachstehend dargelegten Verfahren bestimmt. Die Sequenzen der Membrananker-Peptide von IgD und IgM wurden früher veröffentlicht, aber, wie nachstehend erörtert wird, wurde gezeigt, daß die veröffentlichte Sequenz von menschlichem IgM teilweise unrichtig war. Die Sequenz des migis-Segments von IgA erscheint in der internationalen Anmeldung Nr. PCT/US90/03532, und die Sequenz einer Isoforin des migis-Segments von IgE erscheint in der veröffentlichten internationalen Anmeldung Nr. PCT/US88/04706. Die Sequenz eines vorgeschlagenen migis-Segments einer zweiten Isoform von IgE ist:
  • GLAGG SAQSQ RAPDR VLCHS GQQQG LPRAA GGSVP HPRCH CGAGR ADWPG PPELD VCVEE AEGEA PW.
  • Die Sequenz eines vorgeschlagenen migis-Segments einer dritten Isoform von IgE ist:
  • GAAVP LSHAA GEAPD LPRLH QRPPA PRLGR GHSRS TRPSF FSASA.
  • Peptide, die die extrazellulären migis-Epitope enthalten, oder Segmente oder immunologische Äquivalente dieser Peptide können als Immunogene verwendet werden. Derartige immunogene Peptide können nach üblichen Verfahren synthetisiert werden, wie mittels des RaMP-Systems (Dupont DeNemours & Co.), das Fmoc-Chemie anwendet. Alternativ können rekombinante Peptide oder schwere Ketten (oder Teile davon) vom Immunglobulinen, die das migis-Epitop enthalten, durch Biosynthese hergestellt werden, indem man in E. coli oder eukaryotischen Zellen die Gensegmente, die die codierenden Sequenzen dieser Peptide enthalten, exprimiert.
  • Wenn man ein synthetisches Peptidsegment als ein Immunogen verwendet, ist es üblicherweise wirkungsvoller, es an einen Protein-Träger zu konjugieren, beispielsweise an Hepatitis B-Oberflächenantigen, Kernantigen oder bevorzugt Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin (keyhole lympit hemocyanin KLH). Wenn das Peptidsement keinen Lysin-Rest hat oder wenn sich der Lysin-Rest im Mittelteil des Segments befindet, ist es wünschenswert, einen Lysin-Rest an das C-terminale Ende anzufügen. Weil das N-Ende bereits eine α-Aminogruppe hat, wird das modifizierte synthetische Peptid zum Verbinden zwei verfügbare Aminogruppen haben.
  • An jedes Molekül des Trägerproteins können viele Peptid-Moleküle konjugiert werden. Bei KLH ist ein bevorzugtes Molverhältnis für Peptid/KLH 10. Das Konjugations-Verfahren ist sehr gut etabliert. Es können Vernetzer (cross linker) wie Glutaraldehyd oder Bis(sulfosuccinimidyl)suberat oder bevorzugt Disulfosuccinimidyltartrat (Katalog Nr. 21579, 20591, Pierce Chemical Co., Rockford, IL) verwendet werden.
  • Als Immunogene können diese Peptide unter Verwendung des nachstehend näher beschriebenen Protokolls zur Herstellung monoklonaler Antikörper, die für sie spezifisch sind, verwendet werden. Monoklonale Antikörper zu dem migis-Epitop der menschlichen E-Kette wurden hergestellt, indem im wesentlichen das gleiche, nachstehend beschriebene Protokoll verwendet wurde. Siehe internationale Anmeldung Nr. PCT/US88/04706. Der Erfolg bei der Herstellung monoklonaler Antikörper zu einem Epitop auf dem ε-Ketten-migis-Segment, das 15 Aminosäuren lang ist, zeigt an, daß man auch in der Lage sein sollte, derartige Antikörper zu den migis-µ- oder migis-γ-Segmenten herzustellen, wobei erstere von vergleichbarer Länge sind und letztere länger sind als das migis-ε-Segment. Es wird auch festgestellt, daß die Herstellung von Antikörpern gegen dieses Segment der menschlichen δ-Kette (IgD) berichtet worden ist. Siehe Blattner, F.R. et al., Nature, 307:417-422 bei 418 (1984).
  • Die immunogenen Peptide der Erfindung können auch verwendet werden, um zur Herstellung polyklonaler Antikörper zu den extrazellulären migis-Epitopen Kaninchen, Ziegen, Ratten oder Mäuse (oder selbst einen anderen Menschen) zu immunisieren. Monoklonale Antikörper, die mit den Peptiden der Erfindung reagieren, können außerdem auf positive spezifische Reaktivität mit einen spezifischen Isotyp tragenden Zellen abgesucht werden. Die monoklonalen Antikörper können dann in vivo angewendet werden. Gegen Peptide der Erfindung hergestellte polyklonale Antikörper enthalten jedoch im allgemeinen fast vollständig Antikörper, die mit dem synthetischen Peptid, aber nicht mit den natürlichen Molekülen reagieren. Es muß geprüft werden, ob die gegen synthetische Peptide hergestellten polyklonalen Antikörper mit unversehrten Zellen reagieren können.
  • Bei der Herstellung monoklonaler Antikörper ist es nicht notwendig, die synthetischen oder rekombinanten Peptide sowohl bei der Immunisierung als auch der Antikörper-Identifizierung zu verwenden. Beispielsweise kann bei der Immunisierung von Mäusen zur Herstellung von Milz-Zellen für die Verschmelzung mit Myelomzellen das Immunogen das aus der Plasmamembran immunglobulin-tragender Myelomzellen, wie der IgG exprimierenden IM-9-Zellinie, isolierte Membran-gebundene Immunglobulin sein, oder es können die Myelomzellen selbst sein. Auch Transfektome, die durch Transfizieren von Maus-Myelomzellen mit Genen schwerer und leichter Ketten menschlicher Immunoglobuline entwickelt werden, und die auf ihren Zellenoberflächen Membran-gebundene Immunglobuline exprimieren, können als Immunogene verwendet werden. Zur anfänglichen Identifizierung monoklonaler Antikörper nach der Immunisierung werden bevorzugt die vorgenannten künstlich hergestellten Peptide, konjugiert an Eieralbumin oder Rinderserumalbumin, die bei der Immunisierung nicht als Trägerproteine verwendet werden, verwendet.
  • Lymphozyten aus der Milz oder den Lymphknoten immuner Mäuse und Ratten können auch zur Herstellung von Hybridomen, die für die migis-Epitope spezifische monoklonale Antikörper ausscheiden, verwendet werden. Ein bevorzugtes Protokoll zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern ist die Verschmelzung immuner Milz-Zellen von Mäusen mit nicht ausscheidenden Maus-Myelomzellen wie NS-1- oder SP2/0-Zellen unter Verwendung von Polyethylenglykol.
  • Ein bevorzugtes Immunisierungsprotokoll zur Herstellung monoklonaler Antikörper besteht darin, jeder Maus 50 µg des Konjugats aus KLH und den rekombinanten oder synthetischen Peptiden der Erfindung in vollständigem Freund'schem Adjuvans zu injizieren. Zwei und vier Wochen später wird die gleiche Antigen-Menge subkutan in unvollständigem Freund'schem Akjuvans gegeben. Nach etwa 6 Wochen wird die vierte Antigen-Injektion intraperitoneal in Kochsalzlösung gegeben. Die Mäuse werden 4 Tage nach der letzten Injektion geopfert, und die Milz-Zellen werden entfernt, um Einzelzellsuspensionen für die Verschmelzung mit Myelomzellen herzustellen.
  • Ein ähnliches Protokoll kann zur Immunisierung mit gereinigten, natürlichen, menschlichen Membran-gebundenen Immunglobulinen (mit anhängenden Membrananker-Peptidsegementen), die aus der Plasmamembran von Immunglobulin tragenden, menschlichen Myelomzellen, wie IM-9-Zellen, isoliert wurden, verwendet werden. Wenn menschliche Immunglobulin tragende Zellen als das Immunogen verwendet werden, werden 1 x 10&sup7; Zellen intraperitoneal in zwei Wochenintervallen injiziert.
  • Das Verschmelzungsverfahren mit Polyethylenglykol und verschiedene andere Verfahren, die Klonieren und Hybridom-Züchtung betreffen, sind gut etabliert. Das bevorzugte Protokoll ist das gut bekannte, das von Hudson L. und Hay F.C. beschrieben wurde (Practical Immunology, 2. Ausgabe, Seiten 303 bis 313, 1980, Blackwell Publishing Co., Boston).
  • Das Absuchen von Hybridomen auf monoklonale Antikörper (oder die Identifizierung polyklonaler Antikörper), die mit den migis-Epitopen der Erfindung reaktiv sind, kann mittels eines Festphasen-Enzymimmunoassays (enzyme linked immunosorbent assay ELISA) unter Verwendung des synthetischen Peptids als das Festphasen-Antigen durchgeführt werden. Ein bevorzugtes Festphasen-Antigen ist das Konjugat eines Membrananker-Peptids mit einem Trägerprotein, das von dem in dem Immunogen verwendeten verschieden ist, wie Rinderserumalbumin oder Eialbumin. Dann werden für die migis-Peptide des IgG- oder IgM-Isotyps spezifische monoklonale Antikörper unter Verwendung von Immunfluoreszenz-Strömungszytometrischer Analysen hinsichtlich spezifischer Bindung an B-Zellinien und B-Zellen, die die bestimmten Isotypen exprimieren, abgesucht.
  • Im allgemeinen werden die migis-Epitop-spezifischen monoklonalen Antikörper, die zuerst erhalten werden, von Mäusen stammen und daher können sich bei der Therapie von Menschen immunogen oder allergen sein. Es ist daher wünschenswert, chimäre Antikörper (mit einem tierischen variablen Bereich und einem menschlichen konstanten Bereich) herzustellen oder menschliche Immunglobulin-Expressionsbibliotheken (Stratagene Corp., La Jolla, Kalifornien) zu verwenden, um Fragmente menschlicher Antikörper (VH, VL, FV, Fd, Fab oder F(ab')&sub2; zu erzeugen und dann unter Verwendung von Techniken, die denen zur Erzeugung chimärer Antikörper ähnlich sind, vollständig menschliche Antikörper aufzubauen. Zusätzlich kann man Antikörper erzeugen, bei denen der gesamte konstante Bereich und der größte Teil des variablen Bereichs vom Menschen abgeleitet ist und nur die Antigen-Bindungsstelle von einem Säugetier abgeleitet ist (s. Riechmann, L. et al. Nature 332:323-327 (1988). Außerdem kann man Einzel-Peptidketten-Antikörper erzeugen, bei denen die FV-Bereiche der schweren und leichten Kette verbunden sind. S. Huston, J.S. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1983). Alle der vollständig oder teilweise menschlichen Antikörper sind weniger innnunogen als die Säugetier-Äquivalente, und die Fragmente und Einzelketten-Antikörper sind weniger immunogen als vollständige Antikörper. Bei all diesen Antikörper-Typen ist es daher weniger wahrscheinlich, daß sie eine Immun- oder allergische Antwort hervorrufen. Es wird festgestellt, daß eines Immunantwort die Wirkungen der verabreichten Antikörper verringern könnte, bevor derartige Antikörper dahingehend wirken könnten, die IgG oder IgM exprimierenden B-Zellen zu tinterdrücken oder zu beseitigen.
  • Monoklonale Antikörper, die für die extrazellulären migis-Epitope des IgM- oder IgG-Isotyps spezifisch sind, können zur Verringerung oder Beseitigung der diese Isotypen exprimierenden B-Zellen mittels ADCC, komplement-vermittelter Zytolyse oder anderer zytolytischer oder regulatorischer Immunmechanismen verwendet werden. Beispielsweise können Antikörper bestinunter IgG-Unterklassen, wie Mäuse-IgG2a und Menschen-IgG&sub1; und IgG&sub3;, ADCC vermitteln, die von bestinunten, einen Fc-Rezeptor tragenden, phagozytischen Leukozyten ausgeführt wird. Die Anwendung derartiger Maus-IgG2a-Antikörper, chimärer Antikörper, die menschliche γ-1- oder γ-3-Ketten tragen, oder menschlicher IgG&sub1;- oder IgG&sub3;-Antikörper kann verwendet werden, um B-Zellen eines bestimmten Isotyps herabzuregulieren oder aufzulösen. Diese Antikörper können zur Unterdrückung des Immunsystems angewendet werden, weil sie Lysis eines wesentlichen Teils der B-Zellen, die Immunglobulin der Ziel-Isotyp-Klasse exprimieren, verursachen und folglich die Produktion des Immunglobulin-Isotyps wesentlich verringern werden. Die monoklonalen Antikörper der Erfindung können auch als Zielfindungsmittel für zytotoxische Zellen verwendet werden.
  • Die monoklonalen Antikörper der Erfindung können auch als Trägermittel zytotoxischer Arzneimittel zur Anlieferung einer Effektorsubstanz verwendet werden, indem man die monoklonalen Antikörper an diese Substanzen konjugiert. Ein Toxin-Antikörper-Konjugat wird B-Zellen, die die Isotypen IgM oder IgG erzeugen, binden und direkt abtöten. Diese Toxine sind zytolytische oder zytotoxische Mittel, zu denen zytotoxische Steroide, Gelonin, Abrin, Rizin, Pseudomonas-Toxin, Diphtherie-Toxin, antivirales Pokeweed-Peptid, Tricathecums, radioaktive Nuclide und membranauflösende Enzyme (wie Phospholipase) gehören. Der Antikörper und das Mittel können mittels chemischer oder gentechnologischer Verfahren konjugiert werden. Die Toxin-Antikörper-Konjugate können allein oder in Kombination mit den freien Antikörpern der Erfindung verwendet werden.
  • Die Antikörper der Erfindung (und die Toxin-Konjugate, Fragmente und anderen Derivate) werden systemisch und bevorzugt intravenös verabreicht. Sie können in irgendeinem pharmazeutisch annehmbaren Träger verabreicht werden. Gegen einen Isotyp kann gleichzeitig mehr als ein Antikörper verabreicht werden. Beispielsweise können, um Immunsuppression zu erzielen, gleichzeitig unterschiedliche Kombinationen von Anti-migis-µ- und Anti-migis-γ-Antikörpern verwendet werden.
  • Eine andere therapeutische Alternative beinhaltet aktive Immunisierung, bei der für die migis-Epitope (bevorzugt die migis-µ- oder migis-γ-Epitope) spezifische Antikörper endogen in vivo erzeugt werden. Die endogen erzeugten Antikörper binden die migis-Epitope und verursachen die Zerstörung der assoziierten B-Zellen. Die Erzeugung derartiger Antikörper kann entweder durch Verabreichen eines immunogenen, migis-tragenden Membrananker-Peptids der Erfindung oder durch einen Paratop-spezifischen, anti-idiotypen Antikörper stimuliert werden. Anti-idiotype Antikörper gegen das Paratop der Antikörper der Erfindung ähneln konformationsmäßig den extrazellulären migis-Epitopen. Diese anti-idiotypen Antikörper können verwendet werden, um aktiv gegen die migis-Epitope zu immunisieren und die endogene Bildung von Antikörpern gegen die migis-Epitope zu stimulieren. Derartige Paratop-spezifischen, anti-idiotypen Antikörper werden einem Patienten in einer immunogenen Menge verabreicht, die ausreicht, um die Bildung von Antikörpern gegen B-Zellen, die den Ziel-Isotyp exprimieren, zu stimulieren. Diese anti-idiotypen Antikörper werden bevorzugt als chimäre Antikörper oder menschliche Antikörper verabreicht, um irgendeine Immunantwort gegen sie zu minimieren. Sie können auch irgendeines der Antikörper-Fragmente VH, VL, FV, Fd, Fab oder F(ab')&sub2; (die ebenfalls chimärer oder menschlicher Natur sein können) sein.
  • Granulozyten-Monozyten-Kolonie-Stimulierungsfaktor (granulocyte monocyte-colony stimulation factor, GM-CSF) oder der Monozyten-Kolonie-Stimulierungsfaktor (monocyte-colony stimulation factor, M-CSF), sind dafür bekannt, daß sie die Proliferation von Leukozyten, einschließlich den ADCC vermittelnden, stimulieren. In in vitro Experimenten wurde gezeigt, daß GM-CSF und M-CSF die ADCC-Aktivität bei Tumorzellen, die durch monoklonale Antikörper, welche für auf den Tumorzellen exprimierte Oberflächenantigene spezifisch sind, vermittelt wird, steigern. Die therapeutische Wirkung spezifischer monoklonaler Antikörper der Erfindung, Konjugate oder polyklonaler Antikörper bei der Unterdrückung der Immunantwort könnte vielleicht gesteigert werden, indem man sie mit Faktoren kombiniert, die die ADCC-Aktivitäten steigern.
  • Es können abgeleitete (Derivat-) Antikörper hergestellt werden, die zytotoxische Zellen wie Makrophagen oder zytotoxische T-Zellen zu den das Ziel-Immunglobulin exprimierenden B-Zellen hinziehen. Zu diesen Derivat-Antikörpern gehören bi-spezifische Antikörper mit einer Spezifität für einen Rezeptor einer zytotoxischen Zelle und einer Spezifität für die Ziel-Ig exprimlerenden B-Zellen. Derartige hybride bi-spezifischen Antikörper können zwei untefschiedliche Fab-Teile haben, wobei der eine Fab-Teil eine Antigen-Spezifität für die Ziel-migis-Epitope (bevorzugt die migis-Epitope der µ- oder γ-Kette) hat und der andere Fab-Teil eine Antigen-Spezifität für ein oberflächenantigen einer zytotoxischen Zelle, wie CD3 oder CD8, hat. Die bi-spezifischen Antikörper der Erfindung können ein einzelner Antikörper mit zwei Spezifitäten oder ein Heteroaggregat von zwei oder mehreren Antikörpern oder Antikörper-Fragmenten sein. Siehe z. B. C. Reading, U.S. Patent Nr.4,474,893 und Nr.4,714,681; Segal et al., U.S. Patent Nr.4,676,980.
  • Die monoklonalen Antikörper der Erfindung können zwar für in vivo Anwendungen verwendet werden, aber sie können auch für extrakorporale ex vivo Anwendungen verwendet werden. Die IgM oder IgG tragenden B-Zellen im Kreislauf der Patienten können mittels einer Affinitätsmatrix (an einer festen Phase immobilisierter Antikörper), die an die monoklonalen Antikörper der Erfindung konjugiert ist, entfernt werden.
  • Eine andere Anwendung der Antikörper der Erfindung ist zur Bestimmung von Anzahlen und relativen Anteilen von B-Lymphozyten, die bestimmte Isotypen tragen, in gemischten Leukozyten-Populationen. Die migis-spezifischen Antikörper werden mit Zellen, die sezernierte Immunglobuline tragen, nicht auf dem Weg über die Fc-Rezeptoren derartiger Zellen reagieren. Zu derartigen Zellen gehören Makrophagen und aktivierte T-Zellen. Das Profil der B-Zellen kann den Immunstatus des Individuums anzeigen und ob weitere Unterdrückung wünschenswert ist. Die gleiche Information kann auch anzeigen, wie viel Antikörper notwendig ist, um emen wesentlichen Anteil von B-Zellen, die einen bestimmten Isotyp tragen, zu entfernen. Zu diesem Zweck können Antikörper in Standardassays verwendet werden, die zur Bestimmung von Zelloberflächen-Antigenen verwendet werden. Im allgemeinen werden die Antikörper mit einer Probe der zu testenden Leukozyten unter Bedinungen in Kontakt gebracht, die es den Antikörpern erlauben, Isotyp tragende Zellen in der Probe zu binden. Dann werden die Zellen auf Antikörper-Bindung untersucht. Diese kann mittels üblicher Zellen-Färbeverfahren durchgeführt werden, z. B. kann ein fluoreszierend markierter zweiter Antikörper verwendet werden, um die Bindung von Antikörper nachzuweisen.
    • A. Sequenz des migis-Segments von menschlichem IgM
  • Die Sequenz des migis-Segments von menschlichem IgM wurde früher veröffentlicht von Rabbits, T. H. et al. (1981) Nucl. Acids Res. 9:4509-4524, der angab, daß sie die gleiche ist wie das korrespondierende Segment von Maus-IgM, welche wie folgt ist:
  • Maus-IgM EGEVN AEEEG FEN
  • Unter Verwendung der nachstehend beschriebenen cDNA-Sequenzierung wurde jedoch hergeleitet, daß die Sequenz des extrazellulären migis- Segments von menschlichem IgM tatsächlich die folgende ist:
  • Menschliches IgM EGEVS ADEEG FEN
  • Die Merkmale und Eigenschaften der verschiedenen Segmente des gesamten menschlichen IgM-Membrananker-Peptids sind nachstehend in Tabelle I gezeigt. TABELLE I
  • * Die Zahlen stellen die Anzahl von Aminosäureresten dar.
  • Die Nucleotid-Sequenz in dem Membranbereich menschlicher µmRNA wurde nach dem folgenden Verfahren bestimmt. Die gesamte mRNA wurde aus einkernigen Zellen von peripherem Blut eines normalen Donors und aus einer menschliches Oberflächen-IgM exprimierenden Zellinie, RPMI-1788 (erhalten von der ATCC, Rockville, Maryland) nach den in Molecular Cloning (Sambrook, Fritch und Maniatis, Cold Spring Harbor, 1989) beschriebenen Techniken isoliert. Zwei Oligonudeotide wurden synthetisiert und als die Primer für die PCR verwendet auf der Basis der bekannten DNA-Sequenzen, die von Rabbitts, T. H. et al., Nucleic Acids Research 9:4509-4514 (1981) veröffentlicht worden waren. Die Primer hatten die Sequenzen:
  • 5'-Ende: 5'CCAACAGGGTCACCGAGAG3'
  • 3'-Ende: 5'CCTTGAACAAGGTGACGGT3' (komplementär).
  • Die vervielfachten DNA-Produkte wurden kloniert und die Sequenzen der Gen-Segmente sowohl für den normalen Donor als auch für die RMPI-1788-Zellen wurden bestimmt. Sie waren:
  • AG GGG GAG GTG AGC GCC GAC GAG GAG GGC TTT GAG AAC. Aus dieser Sequenz wurde die Aminosäure- Sequenz des extrazellulären migis-µ-Segments (vorstehend gezeigt) hergeleitet. Die Bedingungen und Temperaturen der PCR waren denjenigen ähnliich, die beim Sequenzieren der migis-γ-Segmente, das im nachfolgenden Abschnitt B (ii) erläutert ist, verwendet wurden.
    • B. Membrananker-Peptide der menschlichen γ-Kette (i) Extrazelluläre migis-γ-Segmente
  • Die DNA-Gensequenzen der Membrananker-Segmente von menschlichem γ-1, γ-2, γ-3, γ-4 wurden nach den nachstehend beschriebenen Verfahren bestimmt. Zwei Membran-Exons codieren für diese DNA-Sequenzen. In den Figuren 1A bzw. 1B sind die genomischen Nucleotid-Sequenzen, die den zwei Nlembran-Exons von menschlichem γ-1 entsprechen, unterstrichen. Die Großbuchstaben in Fig. 2A bezeichnen die DNA-Gensequenz dieser zwei Membran-Exons für menschliche γ-1, γ-2, γ-3 und γ-4, wobei die flankierenden Nucleotid-Sequenzen durch Kleinbuchstaben angegeben sind. Fig. 2B zeigt die abgeleiteten Aminosäure-Sequenzen, die durch die Exons von Fig. 2A codiert werden. Fig. 3A zeigt die DNA-Sequenz eines Gen- Segments einer menschlichen γ-1-Kette, die die zwei Membran-Exons und einige flannierende Sequenzen beinhaltet. Fig. 3B stellt die Donorund Akzeptor-Spleißstellen, die bei der Bildung des in Fig. 3A gezeigten Segments beteiligt sind, dar.
  • Auf der Basis der DNA-Gensequenzen, MRNA-Sequenzen und der identifizierten Spleißmechanismen wurden die vorhergesagten Aminosäure-Sequenzen der Membrananker-Peptide der menschlichen γ- 1, γ-2, γ-3 und γ-4, die in Fig. 28 gezeigt sind, bestimmt. Durch Vergleich mit den Sequenzen von Membrananker-Peptiden anderer bekannter Immunglobuline kann die hydrophobe Ausdehnung (stretch), die sich vermutlich durch die Membran-Lipid-Doppelschicht hindurchspannt, identifiziert werden. Diese Sequenz von 25 Aminosäure- Resten ist LWTTI TIFIT LFLLS VCYSA TVTFF. An dem N- terminalen Ende dieser hydrophoben Ausdehnung ist das Seginent, von dem vorgeschlagen wird, daß es das migis-Epitop bildet. So ist für alle menschlichen γ-Ketten die Sequenz von 18 Aminosäure-Resten (wie in Fig. 2B gezeigt), die das extrazelluläre migis-Epitop, ganz oder teilweise, bilden:
  • ELQLE ESCAE AQDGE LDG:
  • Auf der Basis der Tatsache, daß diese vorgeschlagenen migis-Segmente vielfache saure Reste haben, die nahelegen, daß sie hydrophil sind, glaubt man, daß sie extrazellulär und für Antikörper zugänglich sind. Da die migis-Segmente für menschliche γ-1, γ-2, γ-3 und γ-4 identisch sind, ist es wahrscheinlich, daß ein monoklonaler Antikörper hergestellt werden kann, der Zellen-gebundene, aber nicht ausgeschiedene IgG irgendeiner der vier Unterklassen erkennen kann.
    • (ii) Sequenzierung des menschlichen migis-γ-Segments
  • Die vorgeschlagene Sequenz der Membrananker-Peptide menschlicher γ- Ketten wurde nach den nachstehend dargelegten Verfahren bestimmt. Die γ-1, γ-2, γ-3 und γ-4 enthaltenden genomischen DNA-Klone konnten von einer DNA-Genbank erhalten werden, wie λ FIX Phagen- Bibliothek genomischer DNA der menschlichen Lungenfibroblast-Linie WI38, die von Strategene (LaJolla, Kalifornien) zur Verfügung gestellt wurde. Es wurden die menschlichen γ-1, γ-2, γ-3 und γ-4 DNA- Gensegmente, die ursprünglich von Dr. Sherrie Morrison (früher Columbia University und jetzt University of California, Los Angeles) zur Verfügung gestellt wurden, verwendet. Die menschliche B-Zellinie IM9, die IgG&sub1; auf der Oberfläche exprimiert, wurde von der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, erhalten. Als Quelle für MRNA zur Untersuchung menschlicher γ-Ketten-Sequenzen wurden einkernige Zellen peripheren Bluts aus normalen Blutdonoren verwendet. Die verschiedenen verwendeten Restriktionsenzyme waren von Boehringer Mannheim, New England Biolabs und Bethesda Research Laboratories. Der Erase-a-base Kit (lösche eine Base-Ausrüstung) der zum Aufbau von Deletions-Einsätzen verwendet werden kann, wurde von Promega Corp. erhalten. Die Didesoxysequenzierung doppelsträngiger Matrizen (templates) wurde unter Verwendung des T7- Sequenzierungs-Kits von Pharmacia/LKB durchgeführt. Der Bluescript- Vektor wurde von Strategene Cloning Systems erhalten. Alle Klone waren DHSαF'-Zellen (Bethesda Research Laboratory).
  • Zur Erleichterung von Kartierung und Sequenzierung wurden die genomischen γ-Klone in Bluescript SK II+ subkloniert. Zur Lokalisierung der Membranbereiche wurde unter Verwendung des Erase a-base Kits ein Satz Deletions-Einsätze erzeugt. Das γ-Plasmid wurde mit Sac I und NcoI geschnitten. SacI ergibt 5'-zurückgesetzte Enden, die gegen Exo III-Verdau geschützt sind.
  • Einige µg wurden mit Exo III verdaut, und in Intervallen von 30 Sekunden wurden gleiche Teile (aliquots) abgezogen. Diese Aliquots wurden in ein S1 Verdau-Gemisch, das die Exo III Reaktion stoppt, eingebracht. Nach 30 Minuten wurde die S1-Reaktion durch Erhitzen auf 70ºC gestoppt. Nach einer kurzen Behandlung mit Klenow-Fragment wurde jeder Aliquot mit T4 DNA-Ligase wieder zirkularisiert. Plasmide mit Deletionen verschiedener Länge wurden sequenziert und mit Mausγ-Ketten-Membranbereichen verglichen. Nach dem Identifizieren von Klonen, die einen Teil der Membranbereiche enthalten, wurden Oligonecleotid-Primer konstruiert, um das Sequenzieren von die Membran-Exons deckenden Segmenten zu vervollständigen.
  • Zur Sequenzierung von cDNA wurden aus cDNA, die ausgehend von RNA, welche aus IM9-Zellen oder einkernigen Zellen peripheren Bluts von normalen Donoren, isoliert wurde, synthetisiert wurde, unter Verwendung eines Primers in dem 3, nicht translatierten Bereich 5'GTTGAGGGCGGTGAGACG3' (komplementäre Sequenz von genomischer DNA) und AMV reverser Transcriptase die cDNA-Klone hergestellt. Die Isolierung von RNA und die Herstellung von cDNA wurden gemäß Molecular Cloning (Sambrook, Fritch and Maniatis, Cold Spring Harbor, 1989) durchgeführt. Die Synthese des zweiten Stranges und die Vervielfachung wünschenswerter Gensegmente wurde unter Verwendung der PCR mit einem 3'-Primer, 5'GGCAACTGCGAGGCCAGAG3' von dem 3' nicht translatierten Bereich und einem Primer mit der Sequenz der CH3-Domäne (5'AGAAGAGCCTCTCCCTGTC3') ausgeführt. Die PCR-Bedingungen waren wie folgt: Denaturierung, 94ºC, eine Minute; Annealing, 60ºC, 2 Minuten, Polymerase-Reaktion, 72ºC, 3,5 Minuten; 35 Zyklen.
  • Aus der IM9 RNA-Quelle wurde 2 Bänder von 350 und 500 Nudeotiden isoliert. Diese wurden in Bluescript SK II+ kloniert. Bei der Sequenzierung wurden Klone mit 350 bp (Basenpaar)-Inserten mit γ-1- Sequenzen identifiziert. Diese cDNA wurde mit ³²P markiert und zum Absuchen einer Anzahl von cDNA-Klonen, die von dem PCR-Produkt von RNA aus normalen Lymphozyten abgeleitet waren, mittels Kolonie- Hybridisierung verwendet. Die Inserte der positiven Klone wurden hergestellt und die Nucleotid-Sequenzen bestimmt.

Claims (30)

1. DNA-Sequenz, die das extrazelluläre Epitop der B Zellen-Membrangebundenen Form von IgM oder IgG codiert, welches Epitop an der ausgeschiedenen Form des Immunglobulins nicht vorhanden ist, wobei die DNA-Sequenz eine der in Fig. 2A durch Großbuchstaben dargestellten Sequenzen oder
AG.GGG.GAG.GTG.AGC.GCC.GAC.GAG.GAG.GGC.TTT. GAG.AAC.
aufweist.
2. Peptid, das das extrazelluläre Epitop der B Zellen-Membrangebundenen Form von IgM odr IgG enthält, welches Epitop an der ausgeschiedenen Form des Inununglobulins nicht vorhanden ist, und das eine der folgenden Aminosäure-Sequenzen
EGEVS.ADEEG.FEN; oder
ELQLE.ESCAE.AQDGE.LDG
aufweist.
3. Peptid nach Anspruch 2, das an eine Substanz konjugiert ist, welche die Immunisierungsfähigkeit des Peptids erhöht.
4. Peptid nach Anspruch 3, bei dem die Substanz Hepatitis B- Oberflächenantigen, -Rumpfantigen oder Schlüsselloch Napfschnecken-Hämocyanin ist.
5. Antikörper, der spezifisch an das extrazelluläre Epitop der B Zellen- Membran-gebundenen Form von IgM oder IgG bindet, welches Epitop an der ausgeschiedenen Form des Immunglobulins nicht vorhanden ist.
6. Antikörper nach Anspruch 5, der beim Binden die mit dem Membran-gebundenen Immunglobulin verknüpften B Zellen zur Zerstörung bezeichnet.
7. Antikörper nach Anspruch 5 oder 6, bei dem der Antikörper an ein Epitop auf einem der folgenden Peptid-Segmente
EGEVS.ADEEG.FEN;
ELQLE.ESCAE.AQDGE.LDG.
bindet.
8. Antikörper nach einem der Ansprüche 5 bis 7, bei dem der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.
9. Antikörper nach Anspruch 8, bei dem der monoklonale Antikörper ein menschlicher monoklonaler Antikörper oder ein Fragment davon ist.
10. Fragment des Antikörpers nach einem der Ansprüche 5 bis 9 oder Peptid, das den Antigen-Bindungsteil des Fragments enthält, wobei das Fragment oder Peptid die Bindungsspezifität des Antikörpers besitzt.
11. Antikörper nach Anspruch 9, bei dem das menschliche Antikörperfragment ausgewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus VH, VL, FV, Fd, Fab, Fab', F(ab')&sub2; und Protein- oder Peptid- Analogen davon.
12. Antikörper nach Anspruch 8, bei dem der monoklonale Antikörper ein chimärer Antikörper mit tierischen variablen Bereichen und menschlichen konstanten Bereichen ist.
13. Antikörper nach Anspruch 12, bei dem der chimäre Antikörper bei Mäusen vorkommende variable Bereiche und menschliche konstante Bereiche hat.
14. Antikörper nach Anspruch 12 oder 13, bei dem der chimäre Antikörper den Antigen-Bindungsteil seines variablen Bereichs von einem Tier abgeleitet hat und andere Teile seines variablen Bereichs und seinen gesamten konstanten Bereich von einem Menschen abgeleitet hat.
15. Antikörper nach einem der Ansprüche 8 bis 9 oder 11 bis 14, bei dem der monoklonale Antikörper einer der folgenden Isotypen und Unterklassen ist: Mäuse-IgG2a, menschliches IgG1 und menschliches IgG3.
16. Beständige, stabile Zellinie, die den monoklonalen Antikörper nach einem der Ansprüche 8 bis 9 oder 11 bis 14 oder das Fragment nach Anspruch 10 erzeugt.
17. Zellinie nach Anspruch 16, die ein Hybridom ist.
18. Zellinie nach Anspruch 17, die ein Transfektom ist.
19. Monoklonaler anti-idiotyper Antikörper, der spezifisch ist für das Paratop des Antikörpers nach einem der Ansprüche 5 bis 15.
20. Monoklonaler anti-idiotyper Antikörper nach Anspruch 19, der ein chimärer Antikörper ist mit einem Antigen-Bindungsbereich tierischen Ursprungs und einem menschlichen konstanten Bereich oder einem Fragment davon.
21. Monoklonaler anti-idiotyper Antikörper nach Anspruch 20, bei dem das Antikörper-Fragment ausgewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus VH, VL, FV, Fd, Fab, Fab', F(ab')&sub2; und Protein- oder Peptid- Analogen davon.
22. Beständige stabile Zellinie, die den monoklonalen Antikörper nach einem der Ansprüche 19 bis 21 ausscheidet.
23. Pharmazeutische Zusammensetzung aufweisend einen Antikörper nach einem der Ansprüche 5 bis 15 oder 19 bis 21 oder das Peptid nach einem der Ansprüche 2 bis 4.
24. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 23 zur Behandlung einer Autoimmun-Krankheit, die im Zusammenhang steht mit einem speziellen Immunglobulin-Isotyp.
25. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 24, bei der das Immunglobulin IgG- oder IgM-Isotyp ist.
-26. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 24 oder 25, bei der die Autoimmun-Krankheit rheumatische Arthritis, multiple Sklerose, Myasthenia gravis oder allgemeiner Lupus erythematodes ist.
27. Verwendung des Antikörpers nach einem der Ansprüche 5 bis 15 oder 19 bis 21 oder des Peptids nach einem der Ansprüche 2 bis 4 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung einer Autoimmun-Krankheit.
28. Verwendung nach Anspruch 27, bei der die Autoimmun-Krankheit rheumatische Arthritis, multiple Sklerose, Myasthenia gravis oder allgemeiner Lupus erythematodes ist.
29. Verwendung des Antikörpers nach einem der Ansprüche 5 bis 15 oder 19 bis 21 zur Bestimmung von Anzahlen und relativen Anteilen von spezielle Isotypen tragenden B Lymphozyten in gemischen Leukozyten-Populationen in einem Standardtest.
30. Verfahren zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers oder eines Fragments davon, welches Züchten der Zellinie nach den Ansprüchen 16 bis 18 oder 22 und Isolieren des erzeugten monoklonalen Antikörpers oder Fragments aufweist.
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