DE60018761T2 - Therapeutischer antikörper gegen das muc-1-antigen und verfahren zu dessen verwendung - Google Patents

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Description

  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung betrifft therapeutische Zusammensetzungen zur Behandlung von Krebs. Im Einzelnen betrifft die Erfindung die therapeutische Behandlung von Karzinomen, die das MUC-1-Antigen exprimieren.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER VERWANDTEN TECHNIK
  • Das tumorassoziierte Antigen MUC1 ist ein hochmolekulares Glykoprotein, das an vielen Adenokarzinomen exprimiert wird. Gendler et al., J. Biol. Chem. 265: 15286, 1990, Gendler et al., P.N.A.S. U.S.A., 84: 6060, 1987, Siddiqui et al., P.N.A.S. U.S.A., 85: 2320, 1988, und Ligtenberg et al., J. Biol. Chem. 265: 5573, 1990, lehren, dass die extrazelluläre Domäne des integralen Glykoproteins hauptsächlich aus 30 bis 90 Tandemwiederholungen einer 20-Aminosäuren-Kernsequenz besteht, die reich an Serin, Threonin und Prolin ist, GSTAPPAHGVTSAPDTRPAP. Burchell et al., Cancer Surv. 18: 135, 1993, lehrt, dass die Zahl der durch ein Individuum exprimierten Wiederholungen genetisch determiniert ist, was zu Größenpolymorphismus führt.
  • Price et al., Breast 2: 3, 1993, lehrt, dass die minimale Sequenzerkennung der meisten MUC1-reaktiven monoklonalen Antikörper immer innerhalb von APDTRPAP liegt, wovon angenommen wird, dass es eine 1β-Schleife ist. Burchell et al., Cancer Surv. 18: 135, 1993, offenbart, dass die Sequenz SAPDTRP in der MUC1-Tandemwiederholung ein immundominantes B-Zellen-Epitop ist und dass ein T-Zellen-Epitop der Tandemwiederholung auf das Pentamer, PDTRP, abgebildet worden ist. Benachbarte Aminosäuren und Zuckerreste können bei der Bindung im nativen Molekül eine wichtige Rolle spielen. Im MUC1-Muzin kann eine große Zahl von Tandemwiederholungen vorhanden sein, die sich zwischen 30 und 90 pro Molekül bewegt.
  • Tumor-MUC-1 sind allgemein hypoglykosyliert, und die Glykosylierungsorte haben oft aberrante Zuckerkettenausdehnungen. Magnani et al., Cancer Res. 43: 5489, 1983 lehrt, dass diese aberrante Glykosylierung zur Exposition normalerweise kryptischer Peptidepitope und der Schaffung neuartiger Kohlenhydratepitope führt. Auf Grund ihrer hohen relativen Molekülmasse (2 × 105 – 5 × 107 Dalton) sowie übermäßiger Glykosylierung existieren Membranmuzine als flexible Stäbe und springen um eine verhältnismäßig große Strecke von der Zelloberfläche vor. Muzine bilden also einen wichtigen Bestandteil der Glykokalyx und sind wahrscheinlich der erste Punkt eines Zellkontakts mit Antikörpern und Zellen des Immunsystems.
  • Price, M. R. et al., (1998), Tumor Biology, Bd. 19 (Suppl. I), S. 1–20, beschreibt die Analyse von 56 monoklonalen Antikörpern gegen das MUC-1-Muzin. In DE 195 34 630 A1 werden monoklonale Antikörper gegen Epithelmuzin, deren Erzeugung und Verwendungen beschrieben. WO 94/11508 betrifft ein Polypeptid, das selektiv an ein an der Oberfläche oder im Zytoplasma von Tumorzellen gefundenes Antigen bindet. In WO 97/42973 wird ein Bindeagens beschrieben, das an ein lösliches tumorassoziiertes Antigen bindet. WO 93/20841 offenbart einen monoklonalen Antikörper, der an DF3-Antigen bindet, der wenigstens eine Kopie einer repetitiven 20-Aminosäurerest-Domäne einschließlich der Sequenz APDTRPAP enthält. Qi, W. et al., (Qi, W, et al. (1998). Proceedings of the American Association for Cancer Research Annual, Bd. 39, S. 367) erwähnen einen Anti-MUC-1-Muzin-Klon, der für seine Bindungsspezifizität an MUC-1-Tandemwiederholungskernpeptid charakterisiert wurde.
  • Rittenhouse et al., Lab. Med. 16: 556, 1985, Price et al., Breast 2: 3, 1993, Metzgar et al., P.N.A.S. U.S.A. 81: 5242, 1984, Magnani et al., Cancer Res. 43: 5489, 1983, Burchell et al., Int. J. Cancer 34: 763, 1984, Linsley et al., Cancer Res. 46: 5444, 1986 und Neutra et al., in Physiology of the Gastrointestinal Tract, Johnson, Hg., 2. Auflage, Raven Press, New York, S. 975–1009, 1987, lehren, dass normale Gewebemuzine üblicherweise nur an den Apikaloberflächen von Epithelzellen, insbesondere den Mukosaloberflächen, ausgegeben und abgesondert werden. Ho et al., Cancer Res. 53: 641, 1993, lehrt, dass das MUC1-Muzin stark an den Apikalmembranen von Bronchus, Mamma, Speicheldrüse, Bauchspeicheldrüse, Prostata und Uterus exprimiert wird und sparsam an Facies-Gastrica-Zellen, Gallenblase, Dünndarm- und Kolonepithel exprimiert wird. Zelloberflächen-MUC-1 können wichtigen Funktionen dienen, einschließlich des Schutzes gegen proteolytischen Abbau und des Bereitstellens einer Sperre gegen Mikrobentoxine. Jentoff, Trends Biol. Sci. 15: 291, 1990, Parry et al., Exp. Cell Res. 188: 302, 1990, Wong et al., J. Immunol. 144: 1455, 1990, Devine und Mackenzie, BioEssays 14: 619, 1993, lehren, dass sie ebenfalls als Gleitmittel für Epitheloberflächen, zur Darstellung von Kohlenhydratrezeptoren für Mikroorganismen, um deren Beseitigung zu unterstützen, zur Auswahl von symbiotischen Stämmen in Konkurrenz mit Pathogenen, zur Transmembran-Signalübertragung, für Zell-Zell-Wechselwirkungen, zur Regulierung des Zellwachstums sowie zum Aufrechterhalten der Polarität dienen können.
  • Es wird angenommen, dass Tumormuzine eine kritische Funktion für das Überleben eines Tumors im Körper ausüben. Sie können Tumorzellen vor dem niedrigen pH-Wert schützen, der durch hohe Stoffwechselaktivität innerhalb des Tumors verursacht wird. Es wird angenommen, dass MUC1 Tumorzellen darin hemmt, feste Aggregate mit dem Tumorgewebe zu bilden, wodurch das Metastasenpotential gesteigert wird. Regimbald et al., Cancer Res. 56: 4244, 1996, lehrt, dass MUC1 durch seine molekulare Wechselwirkung mit ICAMI, das an normalen Zellen vorhanden ist, bei der Zielsteuerung von umlaufenden Tumorzellen zu entfernten Orten beteiligt ist. Muzine können ebenfalls Tumorzellen vor einer Erkennung durch das Immunsystem schützen. Devine und Mackenzie, BioEssays 14: 619, 1993, lehrt, dass MUC-1, wenn sie in den Kreislauf abgegeben werden, eine Rolle bei der beobachteten tumorspezifischen Immunsuppression spielen können, möglicherweise durch Bereitstellen einer sterischen Hinderung für Zelloberflächenantigene gegenüber zellulären und humoralen Immuneffektoren. Codington et al., in Biomembranes, Mansoc, L. A., Hg., Plenum Pub. Corp. New York, S. 207–259, 1983, Miller et al., J. Cell Biol. 72: 511, 1977, Hull et al., Cancer Commun. 1: 261, 1989, lehren, dass Zellmembran-MUC-1 andere Zelloberflächenantigene maskieren und Krebszellen vor einem Immunangriff schützen kann.
  • Ansteigende Konzentrationen von tumorassoziiertem MUC-1 im Serum des Patienten sind ebenfalls mit steigenden Tumorbelastungen, die ein Fortschreiten der Krankheit anzeigen, in Beziehung gebracht worden. Price et al., Breast 2: 3, 1993, und Pihl et al., Pathol. 12: 439, 1980, lehren, dass hohe Serumspiegel von MUC-1 bei Krebspatienten mit einer schlechten Prognose in Beziehung stehen.
  • Daher besteht ein Bedarf an neuen therapeutischen Zusammensetzungen, die selektiv tumorassoziierte MUC-1 binden und deren Wirkungen bei Krebs verringern, umkehren oder verhindern können. Kufe, US-Patent Nr. 5,506,343, 1996, lehrt, dass Antikörperspezifizität für tumorassoziierte MUC-1 nur erreicht werden kann, wenn vollständig glykosyliertes Peptid durch den Antikörper erkannt wird. Unglücklicherweise ist jedoch nicht gezeigt worden, dass dieser Antikörper gegen einen Tumor, der ein tumorassoziiertes MUC-1 exprimiert, therapeutisch wirksam ist. Während tumorassoziiertes MUC-1 eine verringerte und veränderte Glykosylierung hat, enthalten sie doch für den Krebs spezifische Kohlenhydratstrukturen. Es gibt daher einen besonderen Bedarf an einer therapeutischen Zusammensetzung, die ein Bindeagens umfasst, das an ein Epitop eines MUC-1 binden kann, das sowohl Peptid als auch tumorspezifisches Kohlenhydrat enthält.
  • KURZE ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung stellt nichtradioaktivmarkierte therapeutische Zusammensetzungen bereit, umfassend Bindeagenzien, die spezifisch an tumorassoziierte MUC-1 binden und deren Wirkungen bei Krebs verringern, umkehren oder verhindern. Im Einzelnen stellt die Erfindung therapeutische Zusammensetzungen bereit, umfassend ein Bindeagens, das spezifisch an ein Epitop binden kann, das an solchem tumorassoziiertem MUC-1 sowohl Peptid als auch Kohlenhydrat umfasst. Die Erfindung stellt ferner Verfahren zur Verwendung solcher therapeutischer Zusammensetzungen bei der Behandlung von Krebs bereit. Die Erfinder des Vorliegenden haben überraschenderweise entdeckt, dass die relative Spezifizität für tumorassoziiertes MUC-1 im Fall von Bindeagenzien, die ein Epitop erkennen, das Kohlenhydrat enthält, nicht notwendigerweise geopfert wird. Die Zusammensetzung und die Verfahren gemäß der Erfindung stellen eine neue Aussicht für die therapeutische Behandlung von Tumoren bereit, die tumorassoziierte MUC-1-Antigene erzeugen.
  • In einem ersten Aspekt erzeugt die Erfindung nichtradioaktivmarkierte therapeutische Zusammensetzungen, umfassend Bindeagenzien, die spezifisch an tumorassoziiertes MUC-1 und sowohl an zirkulierendes als auch an tumorgebundenes tumorassoziiertes MUC-1 binden, wobei das Epitop eine immunologische Determinante umfasst, die Kohlenhydrat und Peptid enthält, und die wirksam sind zum Verringern der Tumorbelastung oder zum Verlängern des Überlebens eines Säugetiers mit einem Tumor, der ein tumorassoziiertes MUC-1 exprimiert. Bei bestimmten bevorzugten Ausführungsformen ist das MUC-1 menschliches MUC-1. Besonders bevorzugte Bindeagenzien schließen Peptide oder Peptidmimetika, einschließlich Antikörper und Antikörperderivate ein.
  • In einem zweiten Aspekt stellt die Erfindung die Verwendung eines Bindeagens' bereit, das spezifisch an ein Epitop von tumorassoziiertem MUC-1 und sowohl an zirkulierendes als auch an tumorgebundenes tumorassoziiertes MUC-1 bindet, wobei das Epitop eine immunologische Determinante umfasst, die Kohlenhydrat und Peptid einschließt, und wobei das Bindeagens wirksam ist zum therapeutischen Behandeln eines Säugetiers mit einem Tumor, der ein tumorassoziiertes MUC-1-Antigen umfasst, für die Herstellung einer Zusammensetzung für die Behandlung von Krebs. Die Verwendungen gemäß diesem Aspekt der Erfindung umfassen das Verabreichen einer wirksamen Menge eines Bindeagens' gemäß der Erfindung an das Säugetier. Vorzugsweise wird das Bindeagens bei niedrigen Dosierungen intravenös oder subkutan verabreicht.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 zeigt Ergebnisse einer Überlebensuntersuchung von Mäusen, denen Bindeagenzien gemäß der Erfindung verabreicht wurden, und Kontrollmäusen.
  • 2 zeigt Ergebnisse von Untersuchungen der Ab2-Produktion bei Mäusen, denen Bindeagenzien gemäß der Erfindung verabreicht wurden, und Kontrollmäusen.
  • 3 zeigt Ergebnisse von Untersuchungen, die zeigen, dass Tumorzellen als ACP wirken können, um bindeagensspezifische T-Zellenreaktionen zu erzeugen.
  • 4 zeigt Ergebnisse von Tumorreduktionsuntersuchungen von Mäusen, denen Bindeagenzien gemäß der Erfindung verabreicht wurden, und Kontrollmäusen.
  • 5 zeigt Ergebnisse von Tumorreduktionsuntersuchungen von hPBL-rekonstituierten SCID-Mäusen, denen Bindeagenzien gemäß der Erfindung verabreicht wurden.
  • 6 zeigt Ergebnisse von Tumorreduktionsuntersuchungen unter Verwendung eines Bindeagens' der Erfindung, gekoppelt mit einem photodynamischen Agens.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
  • Die Erfindung betrifft therapeutische Zusammensetzungen zur Behandlung von Krebs. Im Einzelnen betrifft die Erfindung die therapeutische Behandlung von Karzinomen, die das MUC-1-Antigen exprimieren. Die hierin zitierten Patente und Veröffentlichungen spiegeln das Wissen auf diesem Gebiet wider. Im Fall eines Konflikts zwischen den Lehren jeder beliebigen dieser Bezugsquellen und der vorliegenden Beschreibung soll die letztere gelten.
  • Die Erfindung stellt therapeutische Zusammensetzungen bereit, umfassend Bindeagenzien, die spezifisch an tumorassoziierte MUC-1 binden und deren Wirkungen bei Krebs verringern, umkehren oder verhindern. Im Einzelnen stellt die Erfindung therapeutische Zusammensetzungen bereit, umfassend ein Bindeagens, das spezifisch an ein Epitop binden kann, das an solchem tumorassoziiertem MUC-1 sowohl Peptid als auch Kohlenhydrat umfasst. Die Erfindung stellt ferner Verfahren zur Verwendung solcher therapeutischer Zusammensetzungen bei der Behandlung von Krebs bereit. Die Zusammensetzung und die Verfahren gemäß der Erfindung stellen eine neue Aussicht für die therapeutische Behandlung von Tumoren bereit, die tumorassoziierte MUC-1-Antigene erzeugen.
  • In einem ersten Aspekt stellt die Erfindung eine nichtradioaktivmarkierte therapeutische Zusammensetzung bereit, umfassend ein Bindeagens, das spezifisch an ein Epitop von tumorassoziiertem MUC-1 und sowohl an zirkulierendes als auch an tumorgebundenes tumorassoziiertes MUC-1 bindet, wobei das Epitop eine immunologische Determinante umfasst, die Kohlenhydrat und Peptid enthält, und wobei das Bindeagens therapeutisch wirksam ist beim Behandeln eines Säugetiers mit einem Tumor, der ein tumorassoziiertes MUC-1 exprimiert. Bei bestimmten bevorzugten Ausführungsformen ist das MUC-1 menschliches MUC-1. So, wie hierin verwendet, bedeutet der begriff "therapeutisch behandeln" oder "therapeutisches Behandeln", eine statistisch bedeutsame Verringerung des Tumorvolumens zu bewirken oder eine statistisch bedeutsame Verlängerung des Überlebens bei dem Sägetier, das den Tumor hat, zu bewirken. Ein "Bindeagens" ist ein Molekül oder Makromolekül, das unter physiologischen Bedingungen an MUC-1 bindet und dessen biologische Aktivität hemmt. "Spezifisch bindet" und "bindet" unter physiologischen Bedingungen" bedeutet, eine kovalente oder nichtkovalente Assoziation mit einer Affinität von wenigstens 106M–1, am bevorzugtesten wenigstens 109M–1, zu bilden, entweder im Körper oder unter Bedingungen, die sich in Bezug auf die Ionenstärke, z.B. 140 mM NaCl, 5 mM MgCl2, physiologischen Bedingungen annähern. Als praktische Frage kann aus einer Verringerung der Tumorbelastung oder einem verlängerten Überleben auf eine solche Bindung im Körper geschlossen werden. Im Einzelnen bindet das Bindeagens spezifisch an ein Epitop, das eine immunologische Determinante enthält, die Kohlenhydrat einschließt. Tumor-MUC-1 sind allgemein hypoglykosyliert, und die Glykosylierungsorte werden mit aberranten Zuckerkettenausdehnungen gefüllt und unterscheiden folglich normale von Tumor-MUC-1. Aberrante Glykosylierung führt zur Exposition normalerweise kryptischer Peptidepitope und der Schaffung neuartiger Kohlenhydratepitope. Bevorzugte Bindeagenzien gemäß der Erfindung können an diese neuartigen Epitope binden. Ein "Epitop" ist ein Abschnitt eines Antigens, der unter physiologischen Bedingungen durch ein Bindeagens gemäß der Erfindung gebunden wird. Eine "immunologische Determinante" ist eine dreidimensionale Form, die zur dreidimensionalen Gesamtform eines Epitops beiträgt. Bei bevorzugten Ausführungsformen bindet das Bindeagens ein Epitop, das immunologische Determinanten aus Aminosäureresten eines Peptids mit der Aminosäuresequenz DTRPAP umfasst. Ein "Aminosäurerest" ist eine Aminosäure, wie sie an ihrem Platz in einem bestimmten Peptid ist. "Hemmung der biologischen Aktivität", wie es hierin verwendet wird, bedeutet eine statistisch bedeutsame Verringerung der Tumorbelastung oder eine statistisch bedeutsame Verlängerung des Überlebens bei einem Tier oder einem Patienten mit einem Tumor. Solche statistisch bedeutsame Hemmung wird in den Beispielen hiervon illustriert. Bestimmte bevorzugte Ausführungsformen von Bindeagenzien gemäß der Erfindung sind nichtradioaktivmarkiert. Bindeagenzien gemäß der Erfindung binden sowohl an zirkulierendes als auch an tumorgebundenes, tumorassoziiertes MUC-1, wobei sich "tumorassoziiert" auf die durch Tumorzellen vorgenommene veränderte Glykosylierung des MUC-1 statt auf dessen Nähe zu einem Tumor bezieht. Ein besonders bevorzugtes Bindeagens ist Alt-1 (ATIC-Patentdepotbezeichnung PTA-975).
  • Bevorzugte Tumoren für die Behandlung schließen, ohne Begrenzung, Mammakarzinom, Kolonkarzinom, Ösophagus-Plattenepithelkarzinom, Pankreaskarzinom, Prostatakarzinom und multiples Myelom ein.
  • Vorzugsweise ist das Bindeagens gemäß der Erfindung ein Peptid oder ein Peptidmimetikum. Für die Zwecke der Erfindung ist ein "Peptid" ein Molekül, das aus einer linearen Anordnung von Aminosäureresten besteht, die durch Peptidbindungen in der linearen Anordnung miteinander verbunden sind. Solche Peptide gemäß der Erfindung können von etwa drei bis etwa 500 Aminosäuren einschließen und können ferner Sekundär-, Tertiär- oder Quartärstrukturen sowie Intermolekularassoziationen mit anderen Peptiden oder anderen Nichtpeptidmolekülen einschließen. Solche Intermolekularassoziationen können, ohne Begrenzung, durch kovalente Bindung (z.B. durch Disulfidbindungen) oder durch Chelatbildung, elektrostatische Wechselwirkungen, hydrophobe Wechselwirkungen, Wasserstoffbindung, Ion-Dipol-Wechselwirkungen, Dipol-Dipol-Wechselwirkungen oder eine beliebige Kombination derselben erfolgen.
  • Bei bestimmten bevorzugten Ausführungsformen umfasst ein solches Bindeagens einen komplementären determinierenden Bereich eines Antikörpers, der unter physiologischen Bedingungen an ein MUC-1-Epitop, das Kohlenhydrat enthält, bindet, oder ein Peptidmimetikum eines solchen komplementär-determinierenden Bereichs. Für Zwecke der Erfindung ist ein "komplementärer determinierender Bereich" (CDR) eines Antikörpers derjenige Abschnitt eines Antikörpers, der unter physiologischen Bedingungen an ein Epitop bindet, einschließlich beliebiger Gerüstbereiche, die für eine solche Bindung notwendig sind, und der vorzugsweise aus einer Teilmenge von Aminosäureresten besteht, die durch die menschlichen Schwerkettenbereiche V, D und J, die menschlichen Leichtkettenbereiche V und J und/oder Kombinationen derselben kodiert werden. Bestimmte bevorzugte Antikörper sind xenogene Antikörper, d.h., sie stammen von einer Art, die sich von der Art unterscheidet, welcher der Antikörper verabreicht wird. Solche Antikörper werden bewirken, dass menschliche anti-xenogene Antikörper (HAXA) hervorgerufen werden. Bevorzugte Antikörper schließen Maus-Antikörper, die eine Mensch-Maus-Antikörper-(HAMA-)Reaktion hervorrufen.
  • Fachleute werden anerkennen, dass angesichts des hierin offenbarten Antikörpers Fachleute in die Lage versetzt werden, eine Vielfalt von Antikörperderivaten herzustellen. Zum Beispiel offenbart Jones et a., Nature 321: 522–525 (1986) das Ersetzen der CDR eines menschlichen Antikörpers durch die von einem Maus-Antikörper. Marx, Science 229: 455–456 (1985) erörtert chimäre Antikörper mit variablen Mausregionen und konstanten menschlichen Regionen. Rodwell, Nature 342: 99–100 (1989) erörtert niedermolekulare Erkennungselemente, abgeleitet von Antikörper-CDR-Informationen. Clackson, Br. J. Rheumatol. 3052: 36–39 (1991) erörtert gentechnisch veränderte monoklonale Antikörper, die Fv-Fragment-Derivate, Einzelketten-Antikörper, Fusionsproteine, chimäre Antikörper und humanisierte Nager-Antikörper einschließen. Reichman et al., Nature 332: 323–327 (1988) offenbart einen menschlichen Antikörper, auf den hypervariable Rattenregionen aufgepfropft worden sind. Verhoyen et al., Science 239: 1534–1536 (1988) lehrt das Aufpfropfen eines Maus-Antigenbindeorts auf einen menschlichen Antikörper.
  • Außerdem werden angesichts des hierin offenbarten Antikörpers Fachleute in die Lage versetzt, Peptidmimetika zu entwerfen und zu erzeugen, die Bindungscharakteristiken haben, ähnlich oder überlegen einem solchen komplementären determinierenden Bereich (siehe z.B. Horwell et al., Bioorg. Med. Chem. 4: 1573 (1996), Liskamp et al., Recl. Trav. Chim. Pays-Bas 1: 113 (1994), Gante et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 1699 (1994), Seebach et al., Helv. Chim. Acta 79: 913 (1996)). Dementsprechend werden alle solche Antikörperderivate und Peptidmimetika als innerhalb des Rahmens der vorliegenden Erfindung liegend betrachtet. Zusammensetzungen gemäß der Erfindung können ferner physiologisch annehmbare Verdünner, Stabilisierungsmittel, Lokalisiermittel oder Puffer einschließen.
  • Bei einigen bevorzugten Ausführungsformen werden die Bindeagenzien gemäß der Erfindung aktiviert, vorzugsweise durch chemische oder photodynamische Herangehensweisen. Bevorzugte chemische Herangehensweisen schließen organische Reduktionsmittel, wie beispielsweise Formamidinsulfonsäure, anorganische Reduktionsmittel, wie beispielsweise Quecksilberion, Zinnion, Cyanidion, Natriumcyanoboronat, Thiolaustauschreagenzien, wie beispielsweise Dithiothreitol, Mercaptoethanol und Mercaptoethanolamin, und Proteinreduktionsmittel, wie beispielsweise Thioredoxin. Die Verwendung dieser Reagenzien führt zur Reduktion einiger Disulfide innerhalb des Bindeagens', um ein Bindeagens zu erzeugen, das einige Sulfhydrylgruppen hat. Das Vorhandensein solcher Gruppen kann die Tertiärstruktur des Bindeagens' verändern. Eine solche Strukturveränderung kann die Immunreaktivität des Bindeagens' modulieren. Eine solche Modulation kann bei einem Individuum, dem das Bindeagens verabreicht wird, zu einer verbesserten anti-idiotypischen Reaktion und/oder zellulären Reaktion führen.
  • Bei einigen Ausführungsformen benutzt die Aktivierung eine photodynamische Herangehensweise. Siehe z.B. die internationale Anmeldung PCT/US93/06388. Das Bindeagens wird vorzugsweise mit ultravioletter Strahlung, vorzugsweise im Spektralbereich von etwa 10 bis etwa 820 nm, bestrahlt. Insbesondere liegen wenigstens 90% und am bevorzugtesten wenigstens 99% der Strahlung im Spektralbereich von 250 bis 320 nm. Eine solche UV-Strahlung wird zweckmäßigerweise von einer Quelle, wie beispielsweise einer Wasserstoff- oder Deuterium-Entladungslampe, einer Xenon-Bogenlampe oder einer Quecksilberdampflampe geliefert. Es können herkömmliche Filter eingesetzt werden, um optimale Spektralwellenlängen zu erhalten. (Siehe z.B. Photochemistry, S. 686–798 (John Wiley & Sons, N.Y., 1966).
  • Bei einigen bevorzugten Ausführungsformen kann das Bindeagens gemäß der Erfindung wahlweise an photodynamische Agenzien gekoppelt werden. Vorzugsweise erfolgt eine solche Kopplung durch kovalente Bindung oder durch Liposomassoziation. Eine Liposomassoziation wird vorzugsweise durch Vermischen des photodynamischen Agens' mit einem Bindeagens in der Gegenwart eines liposombildenden Reagens' erreicht. Bei bestimmten bevorzugten Ausführungsformen wird das Bindeagens gemäß der Erfindung kovalent mit dem liposombildenden Reagens verbunden. Bevorzugte photodynamische Reagenzien schließen Hypocrelline ein.
  • Die Bindeagenzien gemäß der Erfindung schließen spezifisch die folgenden monoklonalen Antikörper aus: HMPV, VU-3-C6, MF06, VU-11-D1, MF30, BCP8, DF3, BC2, B27.29, VU-3-D1, 7540MR, MF11, Bc4E549, VU-11-E2, M38, E29, GP1, 214D4, BC4W154, HMFG-1, HMFG-2, C595, Mc5 und A76-A/C7. Jeder dieser Namen erscheint wie in der Literatur mit Bezug auf Anti-MUC-1-Antikörper verwendet. Ohne den Wunsch, durch eine Theorie gebunden zu werden, wird angenommen, dass bestimmte Bindeagenzien der vorliegenden Erfindung durch einen Mechanismus wirken, der allgemein ein Anti-Idiotyp-Netzwerk einschließt. Zusätzlich zur Induktion eines Anti-Idiotyp-Netzwerks führt die Verabreichung von Bindeagenzien gemäß der Erfindung zur Bildung von Komplexen mit MUC-1, wobei die These vertretan wird, dass dies eine wirksamere Präsentation deS Antigens für das Immunsystem hervorruft. Die Komplexbildung zwischen Antigen und Antikörper hat mehrere Wirkungen. Bindeagenzien gemäß der Erfindung können sowohl zirkulierendes als auch zelluläres, tumorassoziiertes MUC-1-Antigen binden. Folglich kann die mögliche immunsuppressive Wirkung des MUC-1-Antigens durch Entfernen des Komplexes aus dem Kreislauf inaktiviert werden. Der Komplex zwischen Antigen und Antikörper kann zu antigen-präsentierenden Zellen, die Fc-Rezeptoren oder Membran-Ig-Rezeptoren tragen (Makrophagen, Dendritzellen, B-Zellen) geleitet werden. Die gesteigerte Aufnahme von Antigen durch spezifische antigen-präsentierende Zellen wird zu einer erhöhten Präsentation von Antigenderivat-Peptiden gegenüber T-Zellen führen. Die Komplexbildung zwischen Antigen und Antikörper kann ebenfalls die Weise verändern, auf die das Antigen innerhalb der antigenpräsentierenden Zelle verarbeitet wird, was neuartige immunruhende oder kryptische Epitope exponiert und folglich die Toleranz für das tumorassoziierte Antigen überwindet. Da die Bindeagenzien gemäß der Erfindung ein Epitop binden, das wenigstens teilweise ein Kohlenhydrat ist, können sie ebenfalls wirken, um durch Verhindern einer Wechselwirkung des Kohlenhydrats von Lektinrezeptoren an T-Zellen eine Immunsuppression zu hemmen. Selbstverständlich können die Ausführungsformen von Bindeagenzien gemäß der Erfindung, die an photodynamische Agenzien gekoppelt werden, ebenfalls unmittelbare Zytotoxizität auf die Tumorzellen ausüben.
  • Folglich stellt die Erfindung in einem zweiten Aspekt die Verwendung eines Bindeagens' bereit, das spezifisch an ein Epitop von tumorassoziiertem MUC-1 und sowohl an zirkulierendes als auch an tumorgebundenes tumorassoziiertes MUC-1 bindet, wobei das Epitop eine immunologische Determinante umfasst, die Kohlenhydrat und Peptid einschließt, und wobei das Bindeagens wirksam ist zum therapeutischen Behandeln eines Säugetiers mit einem Tumor, der ein tumorassoziiertes MUC-1-Antigen exprimiert, für die Herstellung einer Zusammensetzung für die Behandlung von Krebs. Die Verwendungen gemäß diesem Aspekt der Erfindung umfassen das Verabreichen einer wirksamen Menge eines Bindeagens' gemäß der Erfindung an das Säugetier. Vorzugsweise ist das Bindeagens ein Peptid oder ein Peptidmimetikum, am bevorzugtesten ein Antikörper oder ein Antikörperderivat oder ein Peptidmimetikum derselben. Vorzugsweise ist das Säugetier ein Mensch. Das Medikament ist vorzugsweise zur parenteralen, insbesondere intravenösen oder subkutanen, Verabreichung vorgesehen. Bei bestimmten bevorzugten Ausführungsformen wird die intravenöse Injektion in der Abwesenheit jeglichen Adjuvans' durchgeführt. Bei bestimmten bevorzugten Ausführungsformen ist das Medikament dafür vorgesehen, subkutan in Gegenwart eines Adjuvans', wie beispielsweise RIBI, verabreicht zu werden. Bei bestimmten Ausführungsformen wird das Bindeagens kovalent an ein immunogenes Trägermolekül, wie beispielsweise KLH oder xenogenes Immunglobulin, gebunden. Bei bestimmten bevorzugten Ausführungsformen benutzt das Verfahren gemäß der Erfindung Bindeagenzien, die nicht radioaktiv markiert sind. Bestimmte bevorzugte Ausführungsformen des Verfahrens gemäß der Erfindung benutzen Bindeagenzien, die sowohl an zirkulierendes als auch an tumorgebundenes, tumorassoziiertes MUC-1 binden, wobei sich "tumorassoziiert" auf die durch Tumorzellen vorgenommene veränderte Glykosylierung von MUC-1 statt auf dessen Nähe zu einem Tumor bezieht.
  • Vorzugsweise werden die Bindeagenzien in einer Dosis von unter etwa 8 mg/30 kg Körpergewicht, vorzugsweise unter etwa 3 mg/30 kg Körpergewicht, insbesondere von etwa 0,5 bis etwa 2 mg/30 kg Körpergewicht, noch bevorzugterweise von etwa 0,5 bis etwa 1,5 mg/30 kg Körpergewicht und am bevorzugtesten von etwa 1 mg/30 kg Körpergewicht, verabreicht. Bei bestimmten Ausführungsformen wird die Dosierung die Höchstmenge an Bindeagens betragen, die keine antikörpervermittelte Toxizität auslöst. Bei bestimmten Ausführungsformen wird die Dosierung die Höchstmenge an Bindeagens betragen, die keine ADCC oder CDC auslöst. Bei diesen Ausführungsformen wird die ADCC eingeschätzt durch Inkubieren von 51Cr-markierten Tumorzellen mit einem Bindeagens gemäß der Erfindung und Hinzugeben frischer menschlicher PBMC, gefolgt von Inkubieren über 4 Stunden und Messung der spezifischen Lyse. Es wird angenommen, dass ADCC nicht vorhanden ist, falls die spezifische Lyse weniger als 15% beträgt. "Antikörpervermittelte Toxizität" bedeutet klinische Toxizität, wie beispielsweise abnorme Serumchemie, Nierenfunktionsstörung, Zeichen und Symptome von Serumkrankheit oder Anaphylaxie. Bei bestimmten Ausführungsformen wird eine einzige solche Dosis das Säugetier therapeutisch behandeln. Bei anderen Ausführungsformen wird die Behandlung fortlaufend sein, z.B. viermal im Jahr über drei oder mehr Jahre.
  • Der Begriff "wirksame Menge" bedeutet eine Menge, die ausreicht, um das Säugetier therapeutisch zu behandeln. Die Begriffe "therapeutisch behandeln", "therapeutisches Behandeln", "Bindeagens", "Peptid"; "Peptidmimetikum", "Antikörper" und "Antikörperderivat" werden alle verwendet, wie es für den ersten Aspekt der Erfindung beschrieben wird.
  • Die folgenden Beispiele sollen bestimmte bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung weiter darstellen und sind nicht als Einengung des Umfangs der Erfindung aufzufassen. Das in den folgenden Beispielen verwendete Bindeagens ist Alt-1, wenn nicht spezifisch anders erklärt.
  • BEISPIEL 1
  • ERZEUGUNG EINES HYBRIDOMS, UM EIN BINDEAGENS ZU PRODUZIEREN
  • Es wurde ein Bindeagens erzeugt für die Verwendung bei der Immuntherapie von Patienten mit Tumoren, die ein tumorassoziiertes Antigen (TAA) exprimieren, das als MUC1 bekannt ist (Taylor-Papdimitriou, Int. J. Cancer 49: 1, 1990). Das Bindeagens ist ein aktivierter monoklonaler Maus-Antikörper (MAb), ein Immunglobulin der IgGlk-Unterklasse. Das Bindeagens bindet mit hoher Affinität an MUC1, ein hochmolekulares Glykoprotein, das an vielen Tumoren exprimiert wird (Ho et al., Cancer Res. 53: 641, 1993). Das Bindeagens erkennt spezifisch die Sequenz DTRPAP innerhalb der Tandemwiederholungspeptidsequenz von MUC1. Dieses Bindeagens wird als Alt-1 bezeichnet. Die Mauszelllinie oder das Hybridom, welches das Bindeagens abgibt, wurde durch Immunisieren von Mäusen mit MUC1 und Ernten und Immortalisieren der antikörperabgebenden Splenozyten erzeugt. Die bei der Entwicklung des Hybridoms beteiligten Schritte schlossen (a) die Immunisierung von weiblichen BALB/cCrAltBM-Mäusen mit MUC1 aus mehreren Quellen, (b) Ernten der Splenozyten von den Mäusen und (c) Immortalisieren der Splenozyten durch Verschmelzen derselben mit der Myelom-Zelllinie SP2/0-Ag14, (d) Screening und Auswahl des gewünschten Klons durch Analysieren der abgegebenen Antikörper auf die Fähigkeit, MUC1 zu binden, (e) expansives Wachstum des ausgewählten Klons in den geeigneten Medien, (f) Isotyp-Umschaltung des Klons von einem IgM zu einem IgG und (g) fortgesetzte 0,2 μm-Filtration und Verdünnung unter Verwendung von Formulierungspuffer (10 mM Natriumpyrophosphat-HCl, pH 8,0). Die spezifische Bindung des Bindeagens' am MUC1-exprimierende Mammakarzinomzellen und MUC1-transformierte Mauszellen wurde durch FACS, Fluoreszenzmikroskopie und andere Bindungsanalysen demonstriert.
  • BEISPIEL 2
  • REINIGUNG, ZUBEREITUNG, AKTIVIERUNG UND FORMULIERUNG EINES BINDEAGENS'
  • Von dem Hybridom gemäß Beispiel 1 wurde Wachstumsmedium gesammelt. Das Bindeagens wurde gereinigt durch (a) Klärung des Wachstumsmediums durch Mikrofiltration unter Verwendung eines 0,22 μm-Filters, (b) Anionenaustausch-Chromatographie auf Q Sepharose® FF (Amersham Pharmacia Biotech) in 50 mM Tris, pH 8,0, mit einem NaCl-Gradienten von 40 mM bei Gleichgewicht zu 130 mM bei Elution. Darauf folgte 0,22 μm-Mikrofiltration, (c) Affinitätschromatographie auf Protein A Sepharose® FF (Amersham Pharmacia Biotech), wobei die Elution auftritt nach einem Wechsel beim Puffer von 1,0 M Glycin, 3,0 M NaCl, pH 8,8, zur Äquilibrierung zu einem Elutionspuffer, der 200 mM Glycin, 150 mM NaCl, pH 2,8, enthält, (d) Inkubation bei pH 3,5 für 40 Minuten, (e) Nanometerfiltration auf Viresolve-Filter (Millipore Corporation), gefolgt von 0,22 μm-Mikrofiltration, (e) Konzentration und Diafiltration durch Tangentialstrom-Ultrafiltration unter Verwendung einer 50 kD-Membran NMWCO Biomax (Millipore Corporation) gefolgt von 0,22 μm-Mikrofiltration.
  • Danach wurde das gereinigte Bindeagens auf die folgende Weise aktiviert. Das Hauptfluid des gereinigten Bindeagens' (5 mg/ml in Phosphat niedriger Molarität, pH 5–10) wurde, mit Bindemittel (Zinnchlorid) und Reduktionsmittel (Natriumpyrophosphat) vermischt, einer Bestrahlung von 200–400 nm, 90% bei 300 nm +/– 20 nm, von acht Lampen bei 3–9 Watt pro Lampe ausgesetzt, um aktiviertes Bindeagens zu ergeben. Das aktivierte Bindeagens wurde in Ampullen, die 2 mg des aktivierten Bindeagens' in gefrorener oder gefriergetrockneter Form zusammen mit dem gleichen Reduktionsmittel und Pufferkomplex enthalten geliefert. Die Zubereitung der endgültigen Formulierung wurde unter aseptischen Bedingungen nicht länger als 4 Stunden vor dem Verabreichen des Bindeagens' durchgeführt. Das Bindeagens wurde durch den folgenden Vorgang unter Verwendung aseptischer Verfahren zubereitet. Wir klappten die Metalllasche am Oberteil der Bindeagensampulle um und wischten die Gummischeidewand mit Alkohol ab. In einer geeigneten Spritze wurden 2,0 ml Natriumchlorid-Injektion USP aufgezogen und sie wurde der Ampulle hinzugegeben. Wir mischten den Ampulleninhalt durch sanftes Umschwenken der Ampulle, um die Bindeagenslösung herzustellen. Wir mischten nicht kräftig, weil dies zur Bildung von Schaum führen kann. Wir notierten die Uhrzeit unmittelbar nach diesem Schritt. Die Ampulle wurde überprüft, um zu sichern, dass die Lösung frei von Fremd- oder Feststoffen war.
  • BEISPIEL 3
  • REAKTION EINES BINDEAGENS' MIT NORMALEN UND TUMORGEWEBEN
  • Die Gewebereaktivität eines Bindeagens' gemäß Beispiel 2 wurde durch immunohistochemische Verfahren unter Verwendung der Avidin-Biotin-verstärkten Immunperoxidasetechnik der Färbung gefrorener Gewebe untersucht. In einer Vorstudie wurde das Bindeagens verwendet, um die Expression und Verteilung des MUC1-Antigens in einem ausgewählten Panel von normalen menschlichen Geweben und menschlichen Tumoren zu untersuchen und um die optimale Konzentration des Antikörpers oder des Endprodukts zum spezifischen Färben von MUC1-exprimerenden Geweben zu bestimmen. Spezifische Färbung wurde bei Tumorzellen von Mamma, Kolon und Lunge sowie bei Epithelzellen normaler Mamma, Niere, Dickdarm und Lunge beobachtet. In einer zweiten Studie wurde die Bindung und die Verteilung des Bindeagens gegenüber einem breiteren Panel von normalen menschlichen Geweben und menschlichen Tumoren durchgeführt, unter Verwendung eines isotyp-angepassten Antikörpers (MOPC-21) als Vergleichsprobe. Spezifische Färbung mit dem Bindeagens wurde bei Mammakarzinom, Kolonkarzinom, Ösophagus-Plattenepithelkarzinom, Pankreaskarzinom und Prostatakarzinom bemerkt. Etwas spezifische Färbung wurde ebenfalls bei Melanomen und Sarkomen beobachtet. Färbung mit dem Bindeagens wurde ebenfalls bei einigen normalen menschlichen Geweben beobachtet und wurde hauptsächlich an Epithelzellen lokalisiert. Diese Ergebnisse entsprechen Literaturberichten über die Expression von MUC1-Peptid und MUC1-mRNA in normalen menschlichen Geweben und menschlichen Tumoren und demonstrieren die Reaktivität eines Bindeagens' gemäß der Erfindung gegenüber diesen Geweben.
  • BEISPIEL 4
  • ERZEUGUNG EINER ANTI-IDIOTYPISCHEN REAKTION
  • Das Bindeagens von Beispiel 2 besitzt variable, für die Antigen-(MUC1-)Erkennung spezifische, Regionen, die als Idiotypen bekannt sind. Diese variablen Regionen sind selbst immunogen und können eine Reihe von anti-idiotypischen Antikörpern, die als Ab2 bekannt sind, erzeugen. Einige dieser Ab2 können wirksam die dreidimensionale Struktur oder die Peptidsequenz des ursprünglichen Antigens (MUC1) nachahmen und können verwendet werden, um spezifische Immunreaktionen zu erzeugen, die denen ähneln, die durch das ursprüngliche Antigen induziert werden. Dementsprechend ist zu erwarten, dass das Verabreichen des Bindeagens' Antigenmimetika oder Innenbild-Antikörper in der Form von Ab2 erzeugt, welche die spezifische Anti-MUC1-Immunreaktion erzeugen können. Um die Induktion von Ab2 durch das Bindeagens zu demonstrieren, wurden BALB/c-Mäuse mit an KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin) konjugiertem Bindeagens, in Kombination mit RAS-Adjuvans (RIBI Adjuvant System) immunisiert. KLH und das Adjuvans wurden in diese Versuche einbezogen, um die normalerweise schwache Immunreaktion in einer Maus auf einen Maus-Antikörper (als Antigen) zu steigern. Ein isotypangepasster Antikörper diente als Vergleichsprobe. Nach jeder von sechs Injektionen (abwechselnd zwischen intraperitonealer und subkutaner Verabreichung) wurden die Seren in einer Sandwich-Analyse unter Verwendung von F(ab1)2-Fragmenten des Bindeagens' an der festen Phase analysiert. Gebundene Maus-Antikörper wurden durch Ziegen-Antimaus-IgG-(Fc-spezifisch)-HRP als Indikatorsubstanz nachgewiesen. Die Injektion von an KLH konjugiertem Bindeagens führte zu einer Produktion von anti-idiotypischem Antikörper (Ab2), die größer war als ein isotyp-angepasster MAb. Ein Minimum von vier Injektionen in einer Dosis von 50 μg/Maus (0,83 mg/m2) war erforderlich, um eine messbare humorale Reaktion zu induzieren. Um zu demonstrieren, dass das Anti-Bindeagens (Ab2) im Serum vom Typ Ab2(β) war, wurde die Bindung an das Bindeagens in der Gegenwart von MUC1 getestet. Diese Bindung wurde durch das Vorhandensein von MUC1 gehemmt, wie es für einen Antikörper des Typs Ab2(β) zu erwarten wäre. Ab3-Antikörper wurden in den Serumproben unter Verwendung einer MUC1-ELISA gemessen. Anti-anti-idiotypische Antikörper (Ab3) konnten in den Seren von mit dem Bindeagens immunisierten Mäusen gegenüber den Kontrollseren nachgewiesen werden. Ähnlich den Ab2-Spiegeln erreichten die Ab3-Spiegel ihren Höhepunkt nach sechs Injektionen. Außerdem wurde ein gegen das Bindeagens erzeugter monoklonaler Maus-Ab2 wiederum verwendet, um anti-anti-idiotypische (Ab3) Antikörper in Ratten zu erzeugen. Zwei der drei so immunisierten Ratten demonstrierten eine positive Bindung an den monoklonalen Maus-Ab2. Das Erzeugen von Anti-MUC1-Antikörpern in einer anderen Art wurde, zusätzlich zu der Fähigkeit, die Bindung zwischen Ab1 und Ab2 durch das nominelle Antigen, d.h., MUC1, zu hemmen, als wichtiges Kriterium für die Klassifizierung eines Ab2β betrachtet.
  • BEISPIEL 5
  • INDUKTION EINER ZELLULÄREN REAKTION
  • T-Zellen-Proliferationsstudien zeigten eine spezifische Reaktion auf das injizierte Bindeagens gemäß Beispiel 2 und MUC1, was das Vorhandensein von idiotypspezifischen (T2) und anti-idiotypspezifischen T-Zellen (T3) anzeigt. Außerdem wurde ebenfalls der monoklonale Maus-Ab2 auf seine Fähigkeit bewertet, durch MUC1-spezifische T-Zellen erkannt zu werden. Die Proliferation solcher T-Zellen als Reaktion auf Ab2 wurde durch die 3H-Thymidin-Aufnahme überwacht und mit MUC1 verglichen. Die Analyse wurde als 3H-Thymidin-Aufnahme-Studie duchgeführt. Jeder Gruppe von immunisierten Mäusen wurde die Milz entnommen, und die Lymphozyten wurden auf Hisopaque 1077 (Sigma) von den roten Blutkörperchen getrennt. Die Zellen wurden in einer Konzentration von 2 × 105 Zellen/Mulde in 100 μl eines serumfreien Mediums (Gibeo) in eine 96-Mulden-U-Boden-Platte (Becton Dickinson) geimpft. Die Stimulanzien wurden in dreifacher Menge hinzugegeben und mit den Zellen über drei Tage inkubiert. Die Zellen wurden über 24 Stunden mit 1 μ Ci[3H-methyl]Thymidin pro Mulde pulsiert. Die Zellen wurden in einem Zellernter (Skatron) geerntet und die Radioaktivität in einem Betazähler (Beckman) analysiert. Die Stimulanzien schlossen MUC-1, MUC-1-Peptid, Anti-MUC-1-Antikörper, Kontroll-Antikörper und Phytohämagglutinin (PHA) ein. Ab2 und MUC1 zeigen eine ähnliche Reaktivität, was einen weiteren Beleg für die zelluläre Immunreaktion liefert.
  • BEISPIEL 6
  • BESTIMMUNG EINES DOSISREGIMES
  • Die Dosiswirkung des Bindeagens' gemäß Beispiel 2 für die Entwicklung von Ratten-Anti-Maus-Antikörpern (RtAMA) und Ratten-anti-idiotypischen Antikörpern (Ab2) wurde bei normalen Ratten erforscht. Männliche Sprague-Dawley-Ratten wurden mit dem Bindeagens immunisiert, in Dosen, die bei intravenöser Verabreichung von 26 μg bis 213 μg reichten, und einer Dosis von 106 μg durch subkutane Verabreichung. Die Immunisierungen wurden fünfmal in Abständen von 2 Wochen durchgeführt. Von jeder Ratte wurden Grundlinien- und Testserumproben (eine Woche nach der Injektion) gewonnen. Es wurden zwei ELISA-Analysen entwickelt, um RtAMA und Ab2 zu messen. Die RtAMA-ELISA misst die Menge des Antikörpers, die an die konstante Region eines Maus-IgG1-Antikörpers bindet. Die Ab2-ELISA misst die Menge des Antikörpers, die mit der Bindungsregion des Bindeagens' reagiert. Eine Dosis von 53 μg (1,3 mg/m2) schien optimal zu sein, um über intravenöse Injektion RtAMA zu induzieren. Eine subkutane Injektion des Antikörpers mit Adjuvans induzierte viel stärkere Reaktionen, dreimal höher als die gleiche Dosis bei intravenöser Injektion und zweimal höher als die wirksamste intravenöse Dosis (1,3 mg/m2). Eine Dosis von 1,3 mg/m2) induzierte eine anhaltende RtAMA-Reaktion. Höhere Dosen scheinen Anergie zu induzieren, da die Reaktion mit zunehmender Zahl von Injektionen bei 2,6 mg/m2 abnahm und mit der höchsten getesteten Dosis (5,2 mg/m2) keine Reaktion erreicht wurde. Das Bindeagens induzierte ebenfalls eine anti-idiotypische Reaktion, jedoch war die Reaktion nicht proportional zur injizierten Dosis. Es wurde beobachtet, dass die gleiche Dosis, die für RtAMA wirksam war, ebenfalls die optimale Dosis für die Induktion von anti-idiotypischen Antikörpern war. Bei dem intravenösen Dosierungsplan war eine Dosis von 1,3 mg/m2 die einzige zum Induzieren einer starken Ab2-Reaktion wirksame Dosis. Die Verwendung einer subkutanen Injektion des Antikörpers erzeugte eine bessere Reaktion, wobei eine subkutane Dosis von 2,6 mg/m2 die stärkste Ab2-Reaktion insgesamt induzierte. Insgesamt wurde eine Korrelation zwischen der RtAMA- und der Ab2-Reaktion beobachtet, die optimale Reaktionen für die gleichen intravenös verabreichten Dosen zeigten. Jedoch können die absoluten Mengen von Ab2 und RtAMA nicht unmittelbar verglichen werden. Es scheint, dass eine Dosis von 1,3 mg/m2 (entsprechend ungefähr 2 mg/60 kg Patient) optimal ist, um nach intravenöser Injektion des Bindeagens' eine humorale Reaktion zu induzieren. RtAMA konnte bereits in Woche 6 nach der ersten Immunisierung und Ab2 in Woche 4 (subkutane Immunisierung) oder Woche 10 (intravenöse Immunisierung) nachgewiesen werden. Der intravenöse Weg erforderte mehr Injektionen, um eine Immunreaktion zu induzieren, als der subkutane Weg. Diese schwächere Immunreaktion kann auf die verringerte Immunogenität von Mausproteinen bei dieser verwandten Art, den Ratten, zurückzuführen sein. Aus diesen Versuchen scheint es, dass die empfohlene Dosis für eine therapeutische Behandlung etwa 2 mg pro Patient beträgt, ohne eine Wirkung von zirkulierendem Antigen auf die Immunreaktion zu berücksichtigen.
  • BEISPIEL 7
  • BESTÄTIGUNG DES DOSISREGIMES
  • Ähnlich der bei Ratten durchgeführten Studie wurde eine Dosissteigerungsstudie durchgeführt, um die zum Induzieren einer Immunreaktion bei Kaninchen erforderliche Dosis zu erforschen. Kaninchen wurden verwendet, um sich der bei Menschen zu sehenden Reaktion (Erkennen als fremd) mehr anzunähern als entweder bei Ratten oder Mäusen. Kaninchen wurden mit verschiedenen Mengen des Antikörpers immunisiert, und Serumproben wurden auf Ab2 und Kaninchen-Anti-Maus-Antikörper (RAMA) analysiert. Weibliche New-Zealand-White-Kaninchen wurden durch intravenöse Verabreichung auf drei Dosisniveaus (125, 250 und 500 μg) und eine Dosis (125 μg) durch subkutane Verabreichung mit dem Bindeagens gemäß Beispiel 2 immunisiert. Von jedem Kaninchen wurden Grundlinien- und Testserumproben (ungefähr alle zwei Wochen gewonnen) gewonnen. Es wurden zwei ELISA-Analysen entwickelt, um RAMA und Ab2 zu messen. Die RAMA-ELISA misst die Menge des Antikörpers, die an die konstante Region eines Maus-IgG1-Antikörpers bindet. Die Ab2-ELISA misst die Menge des Antikörpers, die mit der Bindungsregion des Bindeagens' reagiert. Die RAMA-Reaktion repräsentiert die humorale Reaktion des Wirts auf die konstanten Regionen des injizierten Maus-Antikörpers. Eine Dosis von 0,575 mg/m2 wurde als positive Vergleichsprobe subkutan injiziert. Drei verschiedene Dosen wurden intravenös injiziert: 0,575, 1,15 und 2,3 mg/m2. Die RAMA-Reaktion war am stärksten bei Kaninchen, die intravenös mit 250 μg/Kaninchen an MAb-ALT-1 injiziert wurden, gefolgt von der subkutanen Injektion von 125 μg/Kaninchen, der intravenösen Injektion von 500 μg/Kaninchen und der intravenösen Injektion von 125 μg/Kaninchen. Das Bindeagens induzierte eine Immunreaktion bei Kaninchen, da sowohl Ab2 als auch RAMA in Proben von der ersten bis zur letzten Entnahme gefunden wurden. Eine Dosis von 250 μg/Kaninchen (1,15 mg/m2, entsprechend 2 mg/60 kg Patient) induzierte für beide Typen von Antikörpern, Ab2 und RAMA, die höchsten Reaktionen. Der induzierte Ab2 konnte durch MUC1, jedoch nicht durch MUC1-Peptid oder CA19.9 gehemmt werden. Das Bindeagens induzierte ebenfalls eine anti-idiotypische Reaktion bei Kaninchen, jedoch war die Ab2-Reaktion nicht proportional zur injizierten Dosis. Es wurde beobachtet, dass von den drei intravenös verabreichten Dosen eine Dosis von 250 μg/Kaninchen die höchste Ab2-Reaktion ergab. Eine subkutane Injektion des Antikörpers mit 125 μg/Kaninchen induzierte die stärkste Ab2-Reaktion insgesamt. Der induzierte Ab2 konnte sich bei den untersuchten Konzentrationen mit MUC1, aber nicht mit MUC1-Peptid messen. Es ist interessant zu bemerken, dass der Weg der Verabreichung den Typ der Immunreaktion beeinflusst. Die Ab2-Reaktion war bei subkutan immunisierten Kaninchen am stärksten, während die allgemeine RAMA-Reaktion bei intravenös injizierten Kaninchen am besten war. Insgesamt korrelierten die RAMA- und die Ab2-Reaktion, wobei sie für die gleichen intravenös verabreichten Dosen optimale Reaktionen zeigten. Diese Ergebnisse demonstrieren, dass eine Dosis von 1,15 mg/m2 (entsprechend 2 mg/60 kg Patient) optimal war, um nach der intravenösen Injektion von MAb-ALT-1 eine humorale Reaktion zu induzieren. RAMA und Ab2 konnten bereit in Woche 2 nach der ersten Immunisierung nachgewiesen werden. Daher war die Immunreaktion bei Kaninchen der Antikörperreaktion bei Ratten (Nachweis in Woche 8 bei intravenöser Verabreichung) überlegen. Daher beträgt aus diesen Versuchen die empfohlene Dosis für eine therapeutische Behandlung etwa 2 mg pro 60 kg Patient, ohne eine Wirkung von zirkulierendem Antigen auf die Immunreaktion zu berücksichtigen.
  • BEISPIEL 8
  • ERSTE TUMORBEHANDLUNGSSTUDIEN
  • Im Tiermodell verwendete Tumorzellen sollten sowohl Wirtsverträglichkeit als auch MUC1-Expression aufweisen. Nur eine MUC1-gentransfizierte Maus-Tumorzelllinie eignet sich als Modell bei Mäusen. Zwei MUC1-Transfektom-Zelllinien, MT und 413BCR, wurden bewertet. Beide dieser Zelllinien sind von der Maus-Mammakarzinom-Zelllinie 410.4 abgeleitet und wurden mit dem MUC1-Gen in voller Länge transfiziert, das mehr als 20 Tandemwiederholungsepitope enthält. Beide Zelllinien sind verträglich mit BALB/c- und CB6F1-Mäusen. Diese Zelllinien exprimieren das MUC1-Antigen stark, wie durch Bindung des Bindeagens' gemäß Beispiel 2 an diese Zellen durch FACS-Analyse analysiert wurde. MT-Zellen wurden intravenös in CB6F1-Mäuse injiziert und in die Lungen implantiert. Tumorherde erschienen 30–40 Tage nach Injektion in den Lungen, und die Mäuse starben ohne Behandlung nach 50–60 Tagen. Eine histopathologische Analyse bestätigte ebenfalls einen Tumor in der Lunge und eine MUC1-Expression am Tumorgewebe. Diese Zelllinie bildet subkutan keine Tumoren, selbst bei Injektion mit einer verhältnismäßig hohen Konzentration von 2 × 107 Zellen pro Maus. Mit 413BCR-Zellen wurden BALB/c-Mäuse in verschiedenen Zellkonzentrationen (2,5–5 × 106 Zellen pro Maus) subkutan in die Weiche oder das Mamma-Fettpolster injiziert. Tumoren entwickelten sich innerhalb von 10–15 Tagen, und es gab eine geringere Abstoßungsrate, wenn die Tumoren in das Mamma-Fettpolster transplantiert wurden. Für therapeutische Studien wurden die Tumoren auf das Tumorvolumen gemäß der Formel (a × b2)/2 gemessen, wobei a den längsten Durchmesser darstellt und b den kürzesten Durchmesser darstellt. Um die MUC1-Expression des Transfektoms in vivo zu untersuchen, wurden MT-tumortragende Mäuse getötet, und die Lungen wurden aseptisch entnommen. Das Tumorgewebe wurde aus den Lungen entnommen, in kleine Stücke geschnitten und über 10 Minuten mit Trypsin aufgeschlossen. Danach wurden die Tumorzellen über drei Tage kultiviert, und eine FACS-Analyse wurde durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten an, dass mehr als 80% der MT-Transfektomzellen nach einem Monat Wachstum in vivo das MUC1-Antigen exprimierten. Die Bindungsfähigkeit des Antikörper-KLH-Konjugats (KLH wurde verwendet, um die Immunogenität des Maus-Antikörpers bei Mäusen zu steigern) an das MUC1-Antigen wurde durch zwei Verfahren, ELISA und RIA, gemessen und demonstrierte die Fähigkeit der Immunogene, ihre Ziele in vivo zu erkennen. Bei diesen Studien wurden zwei unterschiedliche Typen von Adjuvanzien, RAS (RIBI Adjuvant System) und Quil A, verwendet. RAS ist eine stabile Öl-in-Wasser-Emulsion, die hochgereinigte Bakterienbestandteile von Mycobacterium tuberculosis, dem Organismus, welcher der Hauptbestandteil im Freundschen Adjuvans (PCA) ist, enthält. Quil A ist eine als Alternative verwendete grenzflächenaktive Substanz, kann aber nur subkutan injiziert werden. Die beiden Adjuvanzien wurden in gesonderten Versuchen verwendet. Während der Versuche gewonnene Serumproben wurden durch ELISA auf Ab2- und/oder Ab3-Gehalt analysiert. Durch Bestimmung der 3H-Thymidin-Aufnahme durch ein Standardprotokoll unter Verwendung von Lymphozyten, die aus der Milz immunisierter Mäuse isoliert wurden, wurde eine Lymphozyten-Proliferationsanalyse durchgeführt. Die Stimulanzien schlossen MUC-1, MUC-1-Peptid, Anti-MUC-1-Antikörper, Kontroll-Antikörper und Phytohämagglutinin (PHA) ein. Am Ende jedes Versuchs mit CB6F1-Mäusen wurden die Tiere getötet, und die Zahl von Tumorherden in den Lungen wurde durch eine unmittelbare Zähltechnik analysiert. Außerdem wurde bei einer ausgewählten Gruppe von Mäusen 4 Stunden vor dem Ende der Tiere den Mäusen 125I-Desoxy-Uridin injiziert. Die Lungen wurden in einem Gammazähler auf Radioaktivität analysiert, um die Tumorbelastung zu beziffern. Die Immunreaktionen und die Wirksamkeit des Bindeagens', des Bindeagens-KLH-, des Bindeagens-hIgG- und des Bindeagens-MUC1-Komplexes wurden sowohl bei tumortragenden BALB/c- als auch bei tumortragenden CB6F1-Mäusen analysiert.
  • Die erste Reihe von Versuchen bewertete die Wirkung eines Konjugats aus dem Bindeagens gemäß Beispiel 2 (KLH) oder eines Komplexes (Bindeagens-MUC1) auf die Induktion einer humoralen Reaktion (Anti-Maus-Antikörper, Ab2 und Ab3), einer zellulären Reaktion (T-Zellen-Proliferation) sowie die Wirkung dieser Verbindungen auf Tumorwachstum und/oder -größe. Mäusen wurden zwei Wochen nach dem Beginn der Immunisierungsreihen (entweder subkutan, intravenös oder eine Kombination beider Wege) 413BCR-Tumorzellen implantiert. Es zeigte sich, dass sowohl bei mit dem Konjugat- als auch bei mit dem Komplex-Bindeagens behandelten Mäusen eine humorale Reaktion induziert wird. Eine sogenannte T2-Zellen-Reaktion wurde bei diesen Mäusen induziert, aber die T3-Population (die auf MUC1 und MUC1-Peptid reagiert) war nicht offensichtlich (T2 sind Ab2-idiotypspezifische T-Zellen, und T3 sind Ab2-idiotypspezifische T-Zellen). Ein Trend zur Verringerung der Tumormasse und -größe bei mit Konjugat- oder Komplex-Bindeagens behandelten Mäusen wurde ebenfalls demonstriert, obwohl in diesen Studien keine statistische Bedeutsamkeit demonstriert wurde.
  • BEISPIEL 9
  • BESTÄTIGENDE TUMORBEHANDLUNGSSTUDIEN
  • Die Reihen 1 und 2 aus den BALB/c-Maus-Tumormodellversuchen wurden im CB6F1-Tumormodell wiederholt. Wieder wurden Ab2, Ab3 und T-Zellen-Proliferation gemessen, um die humorale und die zelluläre Reaktion zu bestimmen. Die Zahl der Tumorherde, die bei den Mäusen nach Injektion der verschiedenen Formulierungen auftreten, wurde in einer Reihe ebenfalls abgeschätzt, und durch Bewerten der Aufnahme von 125I-Uridin in vivo wurde eine Schätzung der Tumorgröße vorgenommen. Der letzte in dieser Reihe von Versuchen bewertete die Fähigkeit des Bindeagens' gemäß Beispiel 2, das Überleben von mit dem Lungentumormodell implantierten Mäusen zu beeinflussen, verglichen mit Kontroll-MAb und -PBS. Bei diesem Bestätigungssatz von Versuchen scheint es, dass bei diesen Mäusen eine humorale und eine zelluläre Reaktion induziert wurden, obwohl keine T-Zellen-Reaktion auf MUC1 beobachtet wurde. Es wurde keine bedeutsame Verringerung der Tumorbelastung beobachtet, jedoch scheint die Tumorgröße verringert zu werden. Es scheint ebenfalls einen Überlebensvorteil für mit dem Bindeagens injizierte Mäuse, verglichen mit Kontroll-MAb und -PBS zu geben. Wie in 1 gezeigt, gab es eine bedeutsame Verbesserung beim Überleben bei mit MAb-ALT-1 behandelten Mäusen gegenüber mit PBS behandelten Mäusen. Der p-Wert, bestimmt im Student-t-Test, war für die Behandlung mit MAb-ALT-1 gegenüber der PBS-Behandlung < 0,05. MAb-ALT-1, nativer, durch intravenöse Injektion verabreichter, Antikörper, demonstriert im MT-CB6F1-Maus-Tumormodell Anti-Tumor-Wirkungen. Ein Minimum von drei Injektionen vor der Impfung der Tumorzellen und vier anschließende Injektionen waren notwendig, um diese Wirkung zu demonstrieren, da vorherige Versuche mit weniger Injektionen des Antikörpers nicht so wirksam waren (Daten nicht gezeigt).
  • BEISPIEL 10
  • MIKROSPHÄRENEINGEKAPSELTES BINDEAGENS
  • Da Liposomformulierungen von Antikörpern idiotypische Reaktionen vergrößern können, wurde diese Studie durchgeführt, um die Immunreaktionen des mikrosphäreneingekapselten Bindeagens', das Mäusen mit menschlichem Mammakarzinom verabreicht wurde. Das Bindeagens wurde durch eine Doppelemulsionstechnik in PLGA-Mikrosphären eingeschlossen. Jede BALB/c-Maus erhielt am Studientag 0 subkutan eine Impfung von 5 × 106 413BCR-Tumorzellen. Eine Woche später wurden die Mäuse, in Gruppen von vier Tieren, in die folgenden Behandlungsgruppen geteilt: PBS, IgG-KLH, Bindeagens-KLH, Mikrosphären (MS), Bindeagens-Monophosphoryl-Lipid-A-Mikrosphären (MPLA-MS) und MUC-1.
  • Die Seren wurden auf 1/100 verdünnt und vor jeder Immunisierung wurden in ELISA die Ab2- und die Ab3-Reaktion gemessen. Jeden zweiten Tag wurden die Tumorvolumina in zwei Dimensionen mit Tastern gemessen. Das mikrosphären-eingekapselte Bindeagens induzierte eine überlegene idiotypische Immunreaktion gegenüber der von Bindeagens, konjugiert mit KLH oder im Komplex mit MUC-1. Das mikrosphären-eingekapselte Bindeagens zeigte etwas Suppression von Tumorwachstum, aber statistische Bedeutsamkeit wurde nicht erreicht. Dies kann auf die Tatsache zurückzuführen sein, dass die Mäuse bei diesem Versuch nicht mit dem Antikörper vorimmunisiert wurden.
  • BEISPIEL 11
  • SPEZIFIZITÄT FÜR TUMORASSOZIIERTES MUC-1
  • Die biologische Disposition des 99mTc-markierten Bindeagens' wurde ebenfalls bestimmt, durch seine Verabreichung an immundefiziente (nackte) Mäuse, denen kultivierte menschliche Mammakarzinom- (ZR-75-1-)Zellen implantiert wurden. Diese Zellen sind vorher getestet worden, und die Expression von MUC1-Antigen ist bestätigt worden. Das 99mTc-markierte Bindeagens wurde intravenös injiziert (20 μCi an 99mTc auf 20 μg an Bindeagens), und die Tiere wurden 3, 6 und 24 Stunden nach Injektion nach Standardprotokoll getötet. Die Organe und Gewebe von Interesse wurden entnommen und in einem Gammazähler auf Radioaktivität analysiert. Ähnlich wurde ein zweiter Nicht-MUC1-Antikörper der gleichen Unterklasse (99mTc-markierter MOPC-21) in einer anderen Gruppe von Tieren 6 und 24 Stunden nach Injektion getestet. Das Gesamtmuster der Bioverteilung zwischen den zwei Antikörpern war für die meisten Organe ähnlich, mit Ausnahme der höheren Leber- und Milzaufnahme für 99mTc-markierten MOPC-21. Dies ist am wahrscheinlichsten auf die höhere Menge von in der Zubereitung vorhandenen hochmolekularen 99mTc-Aggregaten und die bedeutsam höhere Aufnahme von 99mTc-markiertem Bindeagens in der Tumorstelle zurückzuführen. Der Unterschied in der mittleren Tumoraufnahme der zwei radioaktiv markierten MAb wurde unter Verwendung eines ungepaarten zweischwänzigen t-Test und erwies sich sowohl 6 als auch 24 Stunden nach Injektion als statistisch bedeutsam (p < 0,001). Daher scheint die nicht-spezifische Gewebelokalisierung von 99mTc-markiertem Bindeagens typisch für die anderer, ähnlich zubereiteter, monoklonaler IgG1-Maus-Antikörper zu sein. Diese Aufnahme ist repräsentativ für normale Gewebeanreicherungsprozesse, wie beispielsweise jene, die mit Indikatorsubstanzverteilung und Antikörperstoffwechsel verbunden sind, und wird in den höheren Leber-, Blut- bzw. Nierenwerten widergespiegelt. Die Tumoraufnahmewerte repräsentieren für das 99mTc-markierte Bindeagens im Verhältnis zur 99mTc-markierten MOPC-21-Zubereitung 24 Stunden nach Injektion eine beinahe 5-fache Steigerung bei der Zielgewebeanreicherung. Dieser sehr bedeutsame Unterschied deutet beinahe sicher auf eine bevorzugte Retention des 99mTc-markierten Bindeagens' auf Grund spezifischer Antigenbindung innerhalb von MUC1-exprimierendem Tumor-Xenotransplantatgewebe hin. Diese Aufnahme führte zu einem Anstieg von Tumor-Blut-Verhältnissen mit der Zeit und erreicht bei 24 Stunden ein Hoch von 2,1. Dies steht im Vergleich zu einem Wert von weniger als 1,0 für die meisten anderen Gewebe (außer der Niere, bei 1,5), was eine aktive spezifische Retention der Indikatorsubstanz andeutet.
  • BEISPIEL 12
  • BEVORZUGTE BINDUNG VON GLYKOSYLIERTEM MUC-1
  • ZR-75-1-Zellen, die an ihrer Oberfläche MUC-1-Glykoprotein exprimieren, wurden durch Behandlung mit 4 mM Phenyl-N-α-D-Glucosamid bei 37°C über 48 h deglykosyliert. Die Bindung des Bindeagens' gemäß Beispiel 2 wurde durch eine FACScan-Analyse unter Verwendung von Alt-1 oder einem Kontroll-Antikörper (SM3), von dem bekannt ist, dass er ein Allpeptidepitop von MUC-1 bindet, für das unbehandelte und das deglykosylierte MUC-1 verglichen. Wie in Tabelle 1 gezeigt, gab es eine geringfügige Präferenz beim Binden für das unbehandelte MUC-1. Diese Ergebnisse demonstrieren, dass das Bindeagens ein Epitop bindet, das wenigstens einige Kohlenhydrate einschließt.
  • Figure 00380001
  • BEISPIEL 13
  • TUMORIMMUNTHERAPIE UNTER VERWENDUNG VON XENOGENEM ANTIKÖRPER
  • MUC-1-transfektante Maus-413BCR-Tumorzellen wurden in BALB/c-Mäuse geimpft. Danach wurden die Mäuse fünfmal (s.c.) nur mit Alt-1 oder mit an KLH oder hIgG konjugiertem Alt-1 injiziert. Als Vergleichsproben wurde Maus-IgG, konjugiert an KLH oder hIgG, verwendet. Die Immunreaktionen wurden durch Messen von Anti-Idiotyp-Antikörpern (Ab2) bewertet. Für den Ab2-Nachweis wurden ELISA-Platten mit 100 μl Alt-1 F(ab)2 (2,5 μg/ml) beschichtet und mit verdünnten Proben inkubiert. Gebundener Ab2 wurde unter Verwendung von Anti-Maus-IgG (Fc-spezifisch), konjugiert an HRP und ABTS, nachgewiesen. Die Ergebnisse werden in 2 als die mittlere Absorbanz bei 405/492 nm + SD gezeigt. Diese Ergebnisse zeigen, dass Alt-1 in einem xenogenen Kontext oder gekoppelt mit KLH Ergebnisse bei der Produktion von Ab2 präsentierte, während weder Alt-1 noch die Vergleichsproben dies taten.
  • Die Fähigkeit von Tumorzellen, als antigen-präsentierende Zellen zu wirken, um für Alt-1 spezifische T-Zellen zu stimulieren, wurde wie folgt eingeschätzt. 413BCR-Zellen wurden bei 37°C über 24 Stunden mit PHA-Medium (positive Vergleichsprobe), Alt-1, hIgG, an hIgG konjugiertem Alt-1, Maus-Antihuman-Antikörpern (MAHA) oder an hIgG und Maus-Antihuman-Antikörper (MAHA) konjugiertem Alt-1 inkubiert. Die Tumorzellen wurden als APC verwendet, um gereinigte, von mit hIgG immunisierten Mäusen gewonnene T-Zellen zu stimulieren. Die T-Zellen-Proliferation wurde unter Verwendung der [3H]-Thymidin-Aufnahme gemessen. Die Ergebnisse werden in 3 gezeigt. Nur das an hIgG und Maus-Antihuman-Antikörper (MAHA) konjugierte Alt-1 behandelte Zellen. Diese Ergebnisse zeigen an, dass die behandelten Zellen als APC wirken können, um eine für Alt-1 spezifische T-Zellen-Reaktion zu erzeugen, wenn Alt-1 Tumorzellen in einem xenogenen Kontext unter Bedingungen Präsentiert wird, unter denen die Tumorzellen es internalisieren können.
  • Antikrebswirkungen wurden durch Wiegen von Tumormassen beurteilt. Mäuse mit 413BCR-Tumor wurden, wie zuvor beschrieben, fünfmal (s.c.) mit unterschiedlichen Antikörperformulierungen injiziert. Die Mäuse wurden am Tag 26 getötet, und die Tumoren wurden entnommen und gewogen. Die Ergebnisse werden in 4 als Mittel + SD von Tumoren von 5 Mäusen gezeigt. Eine statistische Analyse wurde durch einen t-Test ausgeführt. Diese Ergebnisse zeigen, dass in einem xenogenen Kontext präsentiertes Alt-1 eine statistisch bedeutsame Verringerung der Tumorbelastung gewährleistet.
  • Zusammen genommen, zeigen diese Ergebnisse, dass Bindeagenzien gemäß der Erfindung sowohl eine anti-idiotypische als auch eine zelluläre Reaktion erzeugen können, und dass diese Reaktion bei der Behandlung von Tumoren wirksam ist.
  • BEISPIEL 14
  • TUMORIMMUNTHERAPIE UNTER VERWENDUNG VON XENOGENEM ANTIKÖRPER
  • SCID/BG-Mäuse wurden mit 107 hPBL injiziert, die bei 80°C gelagert worden waren. Am Tag 12 wurde von den Mäusen Blut abgenommen und auf das Vorhandensein von hIgG getestet, um zu bestimmen, ob die Mäuse rekonstituiert waren. Fünf von sieben injizierten Mäusen waren rekonstituiert. Die rekonstituierten Mäuse wurden am Tag 0 i.p. mit PBS oder 100 μg Alt-1 oder einem Kontroll-IgG1 behandelt, mit wiederholten Behandlungen an den Tagen 7 und 14. Am Tag 17 wurden den Mäusen s.c. 5 × 106 Tumorzellen (NIH OVCAR-3) + 20% Matrigel implantiert. Den Mäusen wurden am Tag 21 Blut abgenommen und sie wurden an den Tagen 21 und 38 i.v. mit PBS oder 100 μg Alt-1 oder einem Kontroll-IgG1 behandelt. Die Mäuse wurden an den Tagen 28, 32, 35, 39 und 43 getötet, und ihre Tumorvolumina wurden gemessen. Die Ergebnisse werden in 5 gezeigt. Diese Ergebnisse demonstrieren, dass das xenogene Bindeagens Alt-1 in der Abwesenheit jeglichen Adjuvans' oder Trägerproteins eine statistisch bedeutsame Verringerung des Tumorvolumens gewährleistet.
  • BEISPIEL 15
  • ZUBEREITUNG EINES AN HYPOCRELLIN KONJUGIERTEN BINDEAGENS'
  • Die langen zirkulierenden, sterisch stabilisierten HBBA-R2-Liposom- (SL-) und Immunliposom- (SIL-)Zubereitungen sind zusammengesetzt aus DPPC/Maleimid-PEG2000-DSPE (Molverhältnis 94:6) bzw. DSPC/Cholesterin/Maleimid-PEG2000-DSPE (Molverhältnis 64:30:6). Kontroll-HBBA-R2-Liposome (CL) sind zusammengesetzt aus DPPC/DPPG (Molverhältnis 9:1). DSPC, DPPC, DPPG und Cholesterin wurden von der Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL, USA) erworben, und Maleimid-PEG2000-DSPE wurde von der Shearwater Polymers Inc. (Huntsville, AL. USA) erworben.
  • Die Synthese von Hypocrellinen benutzt auf dem Gebiet anerkannte Verfahren (siehe z.B. die internationale Anmeldung Nr. PCT/US98/00235). Zwei Verfahren wurden verwendet, um Hypocrelline in Liposome zu füllen. HBBA-R2 wurde entweder durch ein Lösungsmittelinjektionsverfahren in einem Molverhältnis von Lipid zu Wirkstoff von 15:1 in vorgeformte SL und SIL geladen oder durch ein Lösungsmittelverdünnungsverfahren in CL (Lipid:Wirkstoff 15:1) geladen.
  • Für das Lösungsmittelverdünnungsverfahren werden die Lipide und der Wirkstoff zuerst aus Vorratslösungen in organischem Lösungsmittel miteinander vermischt, danach getrocknet. Methanol wurde hinzugegeben, um eine abschließende Lipidkonzentration von 200 mM zu ergeben. Liposome wurden gebildet, wenn die Lipid-Wirkstoff-Lösung bei 65°C mit der Zugabe von 500 μl aliquoter Teile von erhitztem Puffer (20 mM HEPES 140 mM NaCl, pH 7,4) langsam auf 10 mM Lipid verdünnt wurde. Die sich ergebenden Liposome wurden durch Gelfiltration unter Verwendung von Sephadex G50 und Eluieren mit dem obigen Puffer gereinigt.
  • Für das Lösungsmittelinjektionsverfahren werden zuerst durch Hydratisieren eines getrockneten dünnen Films auf eine Endkonzentration von 10 mM Lipid 20 mM MOPSO 140 mM NaCl, pH 6,7, (HBBA-R2)-SL-Liposome zubereitet. HBBA-R2 (10 mM in PEG300) werden auf 65°C erhitzt und tropfenweise in eine 65°C-Lösung von Liposomen injiziert, über 15 Minuten inkubiert. Die sich ergebenden Hypocrellin-Liposome wurden unter Verwendung einer Extrudiervorrichtung von der Lipex Biomembranes (North Vancouver, BC) durch 80 nm-Polycarbonatmembranen extrudiert, um eine durchschnittliche Bläschengröße von 100 nm zu ergeben.
  • Immunliposome wurden wie folgt hergestellt: Zuerst wurde der Antikörper in 20 mM Pyrophosphatpuffer (pH 8,0) gelöst, danach über 1 Stunde bei 22°C mit 30 Molüberschuss an 2-Iminothiolan inkubiert. Der Thiolat-Antikörper wurde gereinigt und der pH-Wert durch Gelchromatographie unter Verwendung eines Puffers von 20 mM MOPSO 140 mM NaCl, pH 6,7, gesenkt. Der Thiolat-Antikörper wurde bei einer Konzentration von 25–50 μg MAb/μMol Lipid über Nacht bei 22°C mit einem Teil der oben beschriebenen Maleimid-Liposome inkubiert. Beide Sätze von Liposomen mit und ohne gebundenen Antikörper wurden durch Gelfiltration, unter Verwendung von Sepharose CL-4B, und Eluieren mit einem Puffer von 20 mM HEPES 140 mM NaCl, pH 7,4, gereinigt. Annähernd 90–95% des Antikörpers wurde an die Liposome gebunden.
  • Die Hypocrellin-Liposom-Lösungen wurden unter Verwendung eines Zentrifugaleindickers Centrisart I (300 000 MW Abschaltung) der Sartorius AG (Göttingen, Deutschland) konzentriert. Alle Liposomzubereitungen werden unter Verwendung steriler 0,22 μm-Filtereinheiten Millex-GV (Millipore, Bedford, MA, USA) filtersterilisiert, auf Lipid- und Wirkstoffkonzentrationen analysiert, danach unter Verwendung eines sterilen Puffers (20 mM HEPES 140 mM NaCl, pH 7,4) auf die gewünschte Konzentration verdünnt. Das endgültige Molverhältnis Lipid zu Wirkstoff von 20:1 wurde typischerweise für alle Formulierungen erreicht.
  • Die langen zirkulierenden, sterisch stabilisierten HBBA-R2- und HBEA-R1/2-Liposom- (SL-) und Immunliposom- (SIL-)Zubereitungen sind zusammengesetzt aus DPPC/Maleimid-PEG2000-DSPE (Molverhältnis 94:6) bzw. DSPC/Cholesterin/Maleimid-PEG2000-DSPE (Molverhältnis 64:30:6). Kontroll-HBBA-R2-Liposome (CL) sind zusammengesetzt aus DPPC/DPPG (Molverhältnis 9:1). DSPC, DPPC, DPPG und Cholesterin wurden von der Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL, USA) erworben, und Maleimid-PEG2000-DSPE wurde von der Shearwater Polymers Inc. (Huntsville, AL. USA) erworben.
  • Zwei Verfahren wurden verwendet, um Hypocrelline in Liposome zu füllen. HBBA-R2 wurde durch ein Lösungsmittelinjektionsverfahren in einem Molverhältnis von Lipid zu Wirkstoff von 15:1 in vorgeformte SL und SIL geladen. HBBA-R2 wurde durch ein Lösungsmittelverdünnungsverfahren in CL (Lipid:Wirkstoff 15:1) geladen und HBEA-R1/2 wurde durch ein Lösungsmittelverdünnungsverfahren in SL und SIL (Lipid:Wirkstoff 2:1) geladen.
  • Für das Lösungsmittelinjektionsverfahren werden zuerst durch Hydratisieren eines getrockneten dünnen Films aus verschiedenen Lipiden auf eine Endkonzentration von 10 mM Lipid entweder mit 20 mM HEPES 140 mM NaCl, pH 7,4, für SL-Zubereitungen oder mit 20 mM MOPSO 140 mM NaCl, pH 6,7, für SIL-Zubereitungen zubereitet. Der Wirkstoff, gelöst in Lösungsmittel (ann. 10–20 mM im Methanol oder ann. 5–10 mM in PEG300) wird auf 65°C erhitzt und tropfenweise in eine 65°C-Lösung von Liposomen injiziert.
  • Für das Lösungsmittelverdünnungsverfahren werden die Lipide und der Wirkstoff zuerst aus Vorratslösungen in organischem Lösungsmittel miteinander vermischt, danach getrocknet. Entweder Methanol oder PEG300 wurde hinzugegeben, um eine abschließende Lipidkonzentration von 200 mM bzw. 50 mM zu ergeben. Liposome wurden gebildet, wenn die Lipid-Wirkstoff-Lösung bei 65°C mit der Zugabe von kleinen aliquoten Teilen von erhitztem Puffer (20 mM HEPES 140 mM NaCl, pH 7,4, für CL- und SL-Zubereitungen oder 20 mM MOPSO 140 mM NaCl, pH 6,7, für SIL-Zubereitungen) langsam auf 10 mM Lipid verdünnt wurde.
  • Die sich ergebenden Hypocrellin-Liposome wurden unter Verwendung einer Extrudiervorrichtung von der Lipex Biomembranes (North Vancouver, BC) durch 80 nm-Polycarbonatmembranen extrudiert, um eine durchschnittliche Bläschengröße von 100 nm zu ergeben. Danach werden die Liposome durch Gelfiltration gereinigt und auf Lipid- und Wirkstoffkonzentrationen analysiert. Das endgültige Molverhältnis Lipid zu Wirkstoff von 20:1 wurde typischerweise für alle Formulierungen erreicht.
  • Immunliposome wurden wie folgt hergestellt: Zuerst wurde der Antikörper in 20 mM Pyrophosphatpuffer (pH 8,0) gelöst, danach über 1 Stunde bei 22°C mit 15–30 Molüberschuss an 2-Iminothiolan inkubiert. Der Thiolat-Antikörper wurde gereinigt und der pH-Wert durch Gelchromatographie unter Verwendung eines Puffers von 20 mM MOPSO 140 mM NaCl, pH 6,7, gesenkt. Der Thiolat- Antikörper wurde bei einer Konzentration von 25–50 μg MAb/μMol Lipid über Nacht bei 22°C mit Maleimid-Liposomen (oben beschrieben) inkubiert. Ungebundener Antikörper wurde durch Gelfiltration, Eluieren mit einem Puffer von 20 mM HEPES 140 mM NaCl, pH 7,4, entfernt. Annähernd 90–95% des Antikörpers wurde an die Liposome gebunden.
  • Falls notwendig, wurden die Hypocrellin-Liposom-Lösungen unter Verwendung von Zentrifugaleindickern Centricon der Amicon, Inc. (Beverly, MA, USA) oder Centrisart I der Sartorius AG (Göttingen, Deutschland) (100 000 bzw. 300 000 MW Abschaltung) konzentriert.
  • BEISPIEL 16
  • PHOTODYNAMISCHE THERAPIE IN EINEM TUMORTRAGENDEN MAUSMODELL
  • BALB/c-Mäusen wurden 2 × 106 413BCR-Zellen s.c. in die rechte Weiche injiziert. Tumoren erschienen nach 7–10 Tagen. Wenn die Tumoren einen Durchmesser von etwa 5 mm erreichten, wurde ein Konjugat gemäß Beispiel 15 oder ein Kontroll-Liposom mit Wirkstoff, aber einem anderen IgG1, i.v. mit 1 mg/kg injiziert. Zwei Stunden später wurden die Mäuse mit einem Diaprojektor bei > 590 nm (roter Kantenfilter), 40 J/cm2, 20 mW/cm2 bestrahlt. Die Kontrollmäuse wurden nicht bestrahlt. Die Ergebnisse werden in 6 gezeigt. Diese Ergebnisse zeigen, dass das Konjugat gemäß der Erfindung den Tumor bei Vorhandensein von Licht vollständig heilt.
  • BEISPIEL 17
  • MAUS-TUMORÜBERLEBENSSTUDIEN
  • CB6F1-Mäuse wurden vor der Tumorimplantation dreimal mit Alt-1-Bindeagens, mit PBS, mit Maus-IgG1 oder mit einem unverbundenen monoklonalen Maus-Antikörper (50 μg in 0,2 ml PBS, i.v.) immunisiert. Den Mäusen wurde die MT-Tumor-Zelllinie 410.4 implantiert, eine mit MUC-1-DNA voller Länge transfizierte Maus-Mammakarzinom-Zelllinie, implantiert. Die Tumorzellen wurden i.v. injiziert, 2 × 105 Zellen/Maus, und entwickelten Metastasen in den Lungen. Eine Woche nach Tumorimplantation wurden die Mäuse erneut mit Alt-1-Bindeagens, mit Maus-IgG1 oder mit einem unverbundenen monoklonalen Maus-Antikörper (50 μg in 0,2 ml PBS) immunisiert. Die Mäuse wurden jeden zweiten Tag auf Veränderungen des allgemeinen Zustands, einschließlich von Gewicht, Augen und Fell, beobachtet. Die Mäuse wurden getötet, falls sie Anzeichen zeigten, sehr krank zu sein, oder mehr als 25% des ursprünglichen Gewichts verloren.
  • Die Ergebnisse werden in der folgenden Tabelle gezeigt:
  • Figure 00470001
  • Diese Ergebnisse zeigen, dass Alt-1 allein einen statistisch bedeutsamen Schutz vor Tumorzellen, die MUC-1 exprimieren, gewährleistet (P = 0,038 gegenüber PBS, P = 0,159 gegenüber unverbundenem Antikörper).
  • BEISPIEL 18
  • BESTIMMEN DER HAMA-REAKTION BEI MENSCHLICHEN PATIENTEN
  • Siebzehn Patienten wurden mit Alt-1-Antikörper behandelt. Vierzehn waren weiblich, von denen elf Brustkrebs hatten. Weitere behandelte Karzinome waren Schilddrüsen- (1), Kolon- (2), Endometrium- (1), Uterus- (1) und Speicheldrüsenkarzinome (1). Alt-1 wurde in Woche 1, 3, 5, 9, 13 und 17 durch intravenöse Infusion über 20–30 Minuten verabreicht. Die Dosierung geschah in drei Kohorten, 1, 2 und 4 mg pro Patient. Für die 1 mg-Kohorte zeigten 2 von 5 Patienten eine gewisse Zunahme bei HAMA, einer zeigte eine Zunahme auf > 200 ng/ml, und einer zeigte eine Zunahme auf über 2000 ng/ml. Für die 2 mg-Kohorte zeigten alle 5 Patienten eine gewisse Zunahme bei HAMA, wobei zwei Patienten eine Zunahme > 200 ng/ml zeigten und 1 Patient eine Zunahme > 2000 ng/ml zeigte. Für die 4 mg-Kohorte zeigten 2 Patienten eine gewisse Zunahme bei HAMA, beide auf > 200 ng/ml. HAMA wird als Anzeige des Ausmaßes der gegen das Antigen erzeugten Gesamtimmunreaktion genommen. Dementsprechend legen diese Ergebnisse nahe, dass schon 1–2 mg an Alt-1 eine kraftvolle Immunreaktion induzieren können.
  • BEISPIEL 19
  • VERRINGERUNG DES TUMORSPEZIFISCHEN ANTIGENS
  • Die Patienten wurden behandelt, wie in Beispiel 18 beschrieben. Unter Verwendung einer im Handel erhältlichen MUC-1-Analyse wurden serielle Messungen des Tumor-Antigens CA15.3 gewonnen. Der Prozentsatz an Patienten, die eine Stabilisierung oder Verringerung der CA15.3-Spiegel zeigten, schloss keine Patienten bei 1 mg Alt-1, 80% bei 2 mg und 60% bei 4 mg ein. Eine maximale Verringerung wurde für zwei Patienten in der 2 mg-Dosis-Gruppe beobachtet, die Abfälle von 37% bzw. 25% erlebten.
  • BEISPIEL 20
  • BILDUNG VON Ab2
  • Die Patienten wurden behandelt, wie in Beispiel 18 beschrieben. Am Ende der Studie wurden die Ab2-Spiegel genommen. Zwei Patienten in der 2 mg-Dosis-Gruppe hatten Ab2-Spiegel > 1240 U/ml bzw. 1784 U/ml. Ein Patient in der 4 mg-Dosis-Gruppe hatte Ab2-Spiegel > 1102 U/ml. Der Normalbereich beträgt 0–200 U/ml.
  • BEISPIEL 21
  • BILDUNG VON ANTI-MUC-1-ANTIKÖRPERN
  • Die Patienten wurden behandelt, wie in Beispiel 18 beschrieben. Am Ende der Studie wurden die Spiegel der Anti-MUC-1-Antikörper genommen. Zwei Patienten in der 2 mg-Dosis-Gruppe überschritten den Grundlinienwert um > 3 ×, bei 667 U/ml bzw. 2464 U/ml. Zwei Patienten aus der 1 mg-Behandlungsgruppe und ein Patient aus der 4 mg-Behandlungsgruppe hatten Anti-MUC-1-Antikörper-Spiegel mit dem dreifachen Grundlinienspiegel. Der normale Spiegel beträgt 30–250 U/ml. Zusammen genommen zeigen diese Daten an, dass die 2 mg-Dosis wahrscheinlich optimal ist.

Claims (33)

  1. Nichtradioaktivmarkierte therapeutische Zusammensetzung umfassend ein Bindeagens, das spezifisch an ein Epitop von tumorassoziiertem MUC-1 und sowohl an zirkulierendes als auch an tumorgebundenes, tumorassoziiertes MUC-1 bindet, wobei das Epitop eine immunologische Determinante umfasst, die Kohlenhydrat und Peptid enthält, und wobei das Bindeagens therapeutisch wirksam ist zum Behandeln eines Säugetiers mit einem Tumor, der ein tumorassoziiertes MUC-1 exprimiert.
  2. Therapeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei das Bindeagens in dem Säugetier eine anti-idiotypische Antwort und eine zelluläre Immunreaktion auslöst.
  3. Bindeagens, das aus der Hybridom-Zelllinie mit der Depotzugangsnummer PTA-975 erhalten werden kann und das als Alt-1 bezeichnet wird.
  4. Therapeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, umfassend ein Bindeagens gemäß Anspruch 3.
  5. Therapeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei das Bindeagens photoaktiviert ist.
  6. Therapeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei das Bindeagens an ein photodynamisches Agens gekoppelt ist.
  7. Therapeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 6, wobei die photodynamischen Agenzien Hypocrelline und Hypocrellin-Derivate umfassen.
  8. Verwendung eines Bindeagens, das spezifisch an ein Epitop von tumorassoziiertem MUC-1 und sowohl an zirkulierendes als auch an tumorgebundenes, tumorassoziiertes MUC-1 bindet, wobei das Epitop eine immunologische Determinante umfasst, die Kohlenhydrat und Peptid enthält, und wobei das Bindeagens wirksam ist zum therapeutischen Behandeln eines Säugetiers mit einem Tumor, der ein tumorassoziiertes MUC-1 exprimiert, für die Herstellung einer therapeutischen Zusammensetzung für die Behandlung von Krebs.
  9. Verwendung gemäß Anspruch 8, wobei die Zusammensetzung in einer Dosis von unter etwa 8 mg/30 kg Körpergewicht verabreicht werden soll.
  10. Verwendung gemäß Anspruch 8, wobei die Zusammensetzung intravenös verabreicht werden soll.
  11. Verwendung gemäß Anspruch 8, wobei die Zusammensetzung subkutan verabreicht werden soll.
  12. Verwendung gemäß Anspruch 8, 10 oder 11, wobei das Bindeagens in einer Dosis von etwa 2 mg/Patient verabreicht werden soll.
  13. Verwendung gemäß Anspruch 9, wobei das Bindeagens in einer Dosis von etwa 0,5 bis 2 mg/30 kg Körpergewicht verabreicht werden soll.
  14. Verwendung gemäß Anspruch 9, wobei das Bindeagens in einer Dosis von etwa 0,5 bis 1,5 mg/30 kg Körpergewicht verabreicht werden soll.
  15. Verwendung gemäß Anspruch 9, wobei das Bindeagens in einer Dosis von etwa 1 mg/30 kg Körpergewicht verabreicht werden soll.
  16. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 9 bis 12, wobei das Bindeagens in einer Dosis verabreicht werden soll, welche der Höchstmenge an Bindeagens entspricht, die keine antikörpervermittelte Toxizität auslöst.
  17. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 8 bis 11, wobei das Bindeagens in einer Dosis verabreicht werden soll, welche der Höchstmenge an Bindeagens entspricht, die keine ADCC oder CDC auslöst.
  18. Verwendung gemäß Anspruch 17, wobei das Bindeagens in einer Dosis verabreicht werden soll, welche eine HAXA-Antwort von > 200 E/ml auslöst.
  19. Verwendung gemäß Anspruch 17, wobei das Bindeagens in einer Dosis verabreicht werden soll, welche eine HAXA-Antwort von > 2000 E/ml auslöst.
  20. Verwendung gemäß Anspruch 18 oder 19, wobei die HAXA-Antwort eine HAMA-Antwort ist.
  21. Verwendung gemäß Anspruch 8 bis 11, wobei das Bindeagens in einer Dosis verabreicht werden soll, die den Spiegel von Tumorantigen CA15.3 senkt.
  22. Verwendung gemäß Anspruch 8 bis 11, wobei das Bindeagens in Abwesenheit eines Adjuvans verabreicht werden soll.
  23. Verwendung gemäß Anspruch 8 bis 11, wobei das Bindeagens in Anwesenheit eines Adjuvans verabreicht werden soll.
  24. Verwendung eines Bindeagens gemäß Anspruch 8, wobei das Bindeagens an ein photodynamisches Agens gekoppelt ist.
  25. Verwendung gemäß Anspruch 24, wobei das photodynamische Agens Hypocrelline und Hypocrellin-Derivate umfasst.
  26. Verwendung eines Bindeagens gemäß Anspruch 8, das eine mindestens 3-fache Erhöhung des Spiegels von Anti-MUC-1-Antikörper gegenüber dem Basisspiegel bewirkt, wobei die therapeutische Zusammensetzung subkutan verabreicht wird.
  27. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 8 bis 26, wobei das Bindeagens ein Antikörper ist.
  28. Verwendung gemäß Anspruch 27, wobei der Antikörper photoaktiviert ist.
  29. Verwendung gemäß Anspruch 27, wobei der Antikörper in einer Dosis formuliert ist, die keine antikörpervermittelte Toxizität auslöst.
  30. Verwendung gemäß Anspruch 27, wobei der Antikörper in einer Dosis formuliert ist, die den Spiegel an Tumorantigen CA15.3 senkt.
  31. Therapeutische Zusammensetzug gemäß Anspruch 1, wobei das Bindeagens spezifisch an das gleiche Epitop von MUC-1 bindet, das von Alt-1 gebunden wird, wobei Alt-1 aus der Hybridom-Zelllinie mit der Depotzugangsnummer PTA-975 erhalten werden kann.
  32. Verwendung des Bindeagens gemäß Anspruch 8 für die Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von Krebs, wobei das Bindeagens spezifisch an das gleiche Epitop von MUC-1 bindet, das von Alt-1 gebunden wird, wobei Alt-1 aus der Hybridom-Zelllinie mit der Depotzugangsnummer PTA-975 erhalten werden kann.
  33. Verwendung des Antikörpers gemäß Anspruch 27, wobei der Antikörper spezifisch an das gleiche Epitop von MUC-1 bindet, das von Alt-1 gebunden wird, wobei Alt-1 aus der Hybridom-Zelllinie mit der Depotzugangsnummer PTA-975 erhalten werden kann.
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