DD296102A5

DD296102A5 - Verfahren zur Herstellung natürlicher humaner monoklonaler Antikörper mitAnti-Tumorzell-Aktivität

Info

Publication number: DD296102A5
Authority: DD
Publication date: 1991-11-21

Abstract

Die Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung natuerlicher humaner monoklonaler Antikoerper (hmAk), die anti-Tumor-Aktivitaet aufweisen. Damit wird ein neuer Weg zur Tumordiagnostik und -therapie auf der Basis natuerlicher IgM-Antikoerper (physiologisches Repertoire im gesunden Organismus) aufgezeigt. Aus Lymphozyten des adulten Milz- und fetalen Lebergewebes werden die Hybridomzellinien H-CB-P 1, H-CB-P 2 und H-CB-P 3, (ZIM-0517, ZIM-0518, und ZIM-0519) gewonnen, aus deren Zellkulturueberstaenden die hmAk isoliert werden. In Verbindung mit Komplement bewirken die hmAk eine Lyse von menschlichen Tumorzellen. Die Anwendungsgebiete der Erfindung sind die Medizin und die Biotechnologie.{monoklonale Antikoerper, mAk; humane monoklonale Antikoerper, hmAk; natuerliche hmAk; anti-Tumor-Aktivitaet; Tumordiagnostik; Tumortherapie; IgM-Antikoerper; Lymphozyten; adultes Milzgewebe; fetales Lebergewebe; Hybridoma; Komplement}

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung natürlicher humaner monoklonaler Antikörper (hmAk), die anti-Tumorzell-Aktivitäten aufweisen und damit einen neuen Weg zurTumordiagnostik und -therapie auf der Basis natürlicher IgM-Antikörper aufzeigen.

Die Anwendungsgebiete der Erfindung sind die Medizin und die Biotechnologie.

Charakterisierung des bekannten Standes der Technik

Die von KÖHLER und MILSTEIN (NATURE, 256,1975,495-497) entwickelte Technik der Herstellung muriner monoklonaler Antikörper (mAk) gestattet die Entwicklung spezifischer Immunglobuline, unter anderem auch gegen Tumormaterial des Menschen. So werden in den DE-OS 3413340 und 3413341 (YOSHIMURA, M. et al.) mAK mit spezifischer Wirkung auf Oberflächenantigene der Human-Hamblasen- sowie Prostata-Krebszelle beschrieben, wobei sich die mAk zur Identifizierung der Karzinome und als Mittel zur Behandlung eignen sollen. Gemäß DE-OS 3629640 (BOSSLET, K. et al.) wird die Verwendung von mAk zur Therapie von Tumoren vorgeschlagen: Danach sollen die mAk u.a. die Eigenschaft besitzen, Wachstumshormone Tumor Angiogenesis Factor oder Transforming Growth Factor von Pancreas-Tumorzellen - zu blockieren. Therapieversuche mit murinen monoklonalen Antikörpern beim Tumorpatienten jedoch sind wegen der Xenogenität der Abwehrstoffe der Maus als zumindest problematisch einzuschätzen (OLDHAM, R. et al., CANCER, 54,1984,2795-2806) und zeigten auch keinen überzeugenden Erfolg (SEARS, H. et. al., J. BIOL. RESP. MOD., 3; 1984,138-150, GODMAN, G., et al., J. CLIN. ONCOL., 3,1985,340-352). Bei den Versuchen, humane monoklonale Antikörper gegen Tumorantigene zu entwickeln, wurde bisher immer auf das in vivo sensibilisierte Lymphozytenmaterial von Tumorpatienten selbst zurückgegriffen (meist aus regionären Lymphknoten). Dabei wurden eine Reihe von humanen monoklonalen Antikörpern der IgG- und IgM-Klasse entwickelt (HELLSTROM, K.E. et al., DD-AP 266028). Diese Antikörper scheinen aber meist lediglich in dem Patienten zu wirken, dessen Lymphozyten für die Hybridomtechnik verwendet wurden (spezifische Abwehr). Eine Tumorabwehr mit humanen monoklonalen Antikörpern ist bis heute ein ungelöstes Problem.

Ziel der Erfindung

Das Ziel der Erfindung ist es, der Medizin, speziell der Tumordiagnostik und -therapie, natürliche hmAk mit anti-Tumorzell-Aktivität zur Verfügung zu stellen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zu entwickeln, mit dem zunächst Hybridomzellinien erzeugt werden, aus denen in anschließenden Verfahrensschritten hmAk gewonnen werden können, die anti-Tumorzell-Aktivitäten besitzen. Erfindungsgemäß wurde die Aufgabe dadurch gelöst, daß menschliche Lymphozyten von gesunden Spendern mit einer Maus-Myelomzellinie fusioniert und aus den derart gewonnenen Hybridomlinien-Zellklone mit anti-Tumor-Aktivität selektiert, zur Züchtung eingesetzt und aus dem Zellkulturüberstand hmAk isoliert werden. Dabei finden Lymphozyten aus dem Milzgewebe des adulten und aus dem Lebergewebe des fetalen Organismus Verwendung. Die aus adultem Gewebe durch Fusion mit der Maus-Myelomzellinie gewonnenen Hybridomalinien werden als H-CB-P1 und H-CB-P2, die aus fetalem Lebergewebe erhaltene Linie als H-CB-P3 bezeichnet. Die Linien sezernieren menschliches monoklonales IgM (lambda)- CB-P1, CB-P2 und (kappa) CB-P3, das überraschenderweise polyspezifische Aktivität gegenüber Autoantigenen und bakteriellen Antigenen besitzt und in verschiedenen In-vitro-Assays eine Hemmung des Wachstums menschlicher Tumorzellen anzeigt und nach Komplementaktivierung eine Zell-Lyse hervorruft.

Die Hybridomazellinien H-CB-P1, H-CB-P2 und H-CB-P3 sind in der Hinterlegungsstelle des Zentralinstituts für Molekularbiologie (ZIM) der AdW der DDR, Berlin-Buch, unter den Nummern ZIM-0517, ZIM-0518 und ZIM-0519 hinterlegt worden.

Der Erfindung liegt eigentlich der Gedanke zugrunde, daß neben dem zellulären auch ein humorales Basis-Abwehrsystem der Tumorabwehr im gesunden Organismus existiert.

Es wurden erfindungsgemäß Lymphozyten aus menschlichem adulten Milz- bzw. fetalen Lebermaterial gewonnen und mit der Maus-Myelomzellinie P3 X63 Ag8.653 (KEARNEY, J., et al., J. IMMUNOL. 123,1979,1548-1550) mittels Polyethylenglykol (PEG)-Fusion hybridisiert (JAHN, S. et al., HYBRIDOMA, 6,1987,679-688). Die Hybridomalinien wurden kloniert und rekloniert.

Es wurden Mensch-Maus-Heterohybridoma etabliert, die stabil große Mengen an menschlichem IgM (lambda bzw. kappa) in den Zellkulturüberstand sezernieren.

Die Zellkulturüberstände wurden im ELISA nach bekannten Verfahren auf ihre Reaktivität mit verschiedenen Antigenen hin untersucht (JAHN, S. et al., BIOMED. BIOCHIM. ACTA, 45,1986,467-^176; KIESSIG, S. et al. ALLERG. IMMUNOL., 33,1987,

Die anti-Tumor-Aktivität wurde an folgenden menschlichen Tumorlinien nachgewiesen: CoIo 205 (ATCC, CCL 222), Sw 620 (ATCC, CCL 227), NCI-H 69 (ATCC, HTB-119), Daudi (ATCC, CCL 213), Raji (ATCC, CCL 86).

Die Zellkulturüberstände der Hybridoma H-CB-P1, H-CB-P und H-CB-P3 enthalten humanes monokonales IgM, das mit Tumorlinien in folgenden Assays reagiert: 1. Bindung an die Zelloberfläche (indirekte Immunfluoreszenz, Durchflußzytometrie) (FALCK, P., et al. Z. KLIN. MED., 42,1987,2281-2284), 2. Beeinflussung des Wachstums der Tumorzellinien in vitro (Wachstumsverlangsamung, Synzytienbildung, Veränderung des Adhärenzverhaltens), 3. Inhibierung der Proliferation menschlicher Tumorzellinien in vitro (verringerter Einbau von ³H-Thymidin), 4. Komplementvermittelte Lyse von menschlichen Tumorzellinien, ^s1Cr-Freisetzungstest).

Ausführungsbeispiele

Beispiel 1: H-CB-PI und H-CB-P2 (ZIM-0517 und -0518)

Die Hybridoma H-CB-P1 und H-CB-P 2 wurden durch Fusion von Lymphozyten aus der Milz einer zwölfjährigen Patientin mit idiopathischerThrombozytopenie mit Maus-Myelomzellen P3 X63 Ag 8.653 gewonnen. Die Hybridoma produzieren über zwei Jahre in der In-vitro-Kultur (RPM11640 mit 10% fetalem Kälberserum ohne Antibiotika) (JAHN, S. et al., J. IMMUNOL. METH., 107,1988,59-66) konstant bis zu 100 Mg/ml humanes IgM (lambda). Der Anteil der Zellen mit Ig-Produktion betrug stets mehr als 90%. Die Zellen wurden mehrfach rekloniert. Sie sind mycoplasmenfrei.

Beispiel 2: H-CB-P3 (ZIM-0519)

Die Hybridomalinie H-CB-P3 wurde durch Fusion von Lymphozyten aus fetalem Lebergewebe (medizinisch indizierter Schwangerschaftsabbruch in der 24. Woche) mit Maus-Myelomzellen РЗХАд. 8.653 etabliert. Die Produktion von menschlichem IgM (kappa) war über mehrere Monate stabil (1 Oμg/ml). Die Linie wurde zweimal rekloniert. Sie ist mycoplasmenfrei.

Beispiel 3: Hemmung des Tumorwachstums

Alle Antikörper hemmten in Konzentrationsbereichen 10 bis 1 цд/ті das in-vitro-Wachstum menschlicher Tumorlinien (CoIo 205, Sw620, H69, Daudi, Raji).

Morphologische Untersuchungen zeigen verstärkte Synzytienbildung, erhöhte Adhärenzneigung, verlangsamtes Wachstum.

Die Tumorlinien wurden über 4 Tage in vitro in Anwesenheit der monoklonalen IgM-Antikörper im Kulturmedium (RPM11640 mit 10% FKS) inkubiert (jezwei Parallelkulturen in 24well Platten). Als Kontrolle fungierte der konditionierte Kulturüberstand der Fusionslinie P3 X63 Ag 8.653, der kein Immunglobulin enthält sowie die Zellkulturüberstände verschiedener Human-lgM-produzierender Hybridoma-Linien ohne anti-Tumorzell-Bindungsaktivität.

Beispiel 4: Komplementvermitfelte Zellyse

In Anwesenheit von Meerschweinchenkomplement wurden die Tumorzellen mit und ohne Antikörper CB-P1, CB-P2 und CB-P3 inkubiert. Das Meerschweinchenkomplement wurde wegen seiner Spontanzytotoxizität jeweils vorher austitriert, die Tumorzellen wurden mit ⁶¹Cr markiert. Die ^s1Cr-Freisetzung wurde nach vierstündiger Inkubation bei 37 ⁰C und 5% CO₂ bestimmt. Dabei zeigte sich eine komplementabhängige Zellyse abhängig von der Antikörperkonzentration (0,8-3,3 цд/ті), dokumentiert durch die Freisetzung von 25-92% des zur Markierung verwendeten ⁶¹Cr, wobei dieser Effekt sich auf die Tumor-Zellinien beschränkte, die auch in der Immunfluoreszenz eine Reaktion mit den Antikörpern CB-P1, CB-P2 und CB-P3 zeigten. Als Kontrolle fungierte der konditionierte Kulturüberstand der Fusionslinie P3 X63 Ag8.653, der kein Immunglobulin enthält sowie die Zellkulturüberstände verschiedener Human-lgM-produzierender Hybridoma-Linien ohne anti-Tumorzeil-Bindungsaktivität

Beispiel 5: Hemmung der Zeilproliferation

Die Tumorzellen wurden, wie im Beispiel 3 beschrieben, mit und ohne Antikörper CB-P1, CB-P2 und CB-P3 inkubiert. Über vier Tage wurde zu den entsprechenden Kulturen jeweils 1 [id ³H-Thymidin für 18 Stunden gegeben. Anschließend wurde der Einbau von ³H-Thymidin in die Tumorzell-DNS (Desoxyribonukleinsäure) am Scintillationszähler bestimmt. Die Antikörper H-CB-P1, H-CB-P2 und H-CB-P3 verursachten im Vergleich zu den Kontrollen (Inkubation mit nicht-reaktiven IgM-Antikörpern und konditioniertem Zellkulturüberstand der Fusionslinie P3X63 Ag8.653, der kein Immunglobulin enthält) eine Proliferationshemmung mit dem Faktor 60-100 (Beispiel: CoIo 205- Einbau in 18 Stunden 120OOOcpm (Kontrolle), in Gegenwart von H-CB-P1 (Konzentration 5цд/тІ) 6000cpm.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung natürlicher humaner monoklonaler Antikörper (hmAk) mit anti-Tumorzeil-Aktivität, dadurch gekennzeichnet, daß humane Lymphozyten mit der Maus-Heteromyelomlinie P3X Ag8.658 fusioniert, die Hybride abgetrennt und Klone mit anti-Tumorzell-Aktivität selektiert, kloniert und rekloniert werden, die Hybridome H-CB-P1, H-CB-P2 und H-CB-P3 (ZIM-0517, ZIM-0518 und ZIM-0519), die stabil menschliches IgM (lambda) sezernieren, etabliert, zur Kultivierung eingesetzt und aus dem Zellkulturüberstand die hmAk CB-P1, CB-P2 und CB-P3 isoliert werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß aus Lymphozyten des adulten Milzgewebes die Hybridome H-CB-P1 (ZIM-0517) und H-CB-P2 (ZIM-0518) gewonnen werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß aus Lymphozyten des fetalen Lebergewebes das Hybridom H-CB-P3 (ZIM-0519) gewonnen wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß zur Lyse von menschlichen Tumorzellen die hmAk CB-P1, CB-P2 und CB-P3 in Verbindung mit Komplement Verwendung finden.