DE3508307A1

DE3508307A1 - Monoklonale antikoerper gegen digoxin

Info

Publication number: DE3508307A1
Application number: DE19853508307
Authority: DE
Inventors: Rudi Dr. 5650 Solingen Grützmann; Frank Dr. 5600 Wuppertal Morich; Hans-Georg Dr. 5600 Wuppertal Opitz; Uta Dr. Opitz
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 1984-10-18
Filing date: 1985-03-08
Publication date: 1986-04-24

Description

Monoklonale Antikörper gegen Digoxin
Die Erfindung betrifft Hybridomzellinien, die hochspezifische monoklonale Antikörper (mAk) gegen Digoxin synthetisieren, monoklonale Antikörper gegen Digoxin, Verfahren zur Herstellung solcher Hybridomzellinien und Antikörper sowie die Verwendung der monoklonalen Antikörper zum Nachweis von Digoxin und zur Therapie von Digoxin-Intoxikationen.
Die Fusion von Maus-Myelomzellen mit Milzzellen von immunisierten Mäusen (Köhler und Milstein, Nature 256, 495-497 (1975)) war der erste Hinweis für die Möglichkeit, kontinuierliche Zellinien zu erhalten, die einheitliche (sog. "monoklonale") Antikörper produziren. Seitdem sind zahlreiche Versuche unternommen worden, verschiedene Hybrid-Zellen (sog. "Hybridome") herzustellen und die Antikörper, die von ihnen gebildet werden, für unterschiedliche wissenschaftliche Untersuchungen einzusetzen (z.B.: Current Topcis in Micorbiology and Immunology, Vol. 81 -"Lymphocyte Hybridomas", F. Melchers et al., Springer Verlag, 1978, sowie Referenzen darin; C. Barnstable et al., Cell 14 9-20 (1978); P. Parham, W.F. Bodmer, Nature 276, 397-399 (1978); Handbook of Experimental Immunology, 3. Aufl., Bd. 2, D.M. Wier, Hrsg.
Blackwell, 1978, Kapitel 25, Chem. Eng. News, 15-17 (1979)). Diese Arbeiten schildern die prizipielle Technik zur Produktion monoklonaler Antikörper durch Hybridome.
Monoklonale Antikörper gegen Histokompatbilitätsantigene, gegen Haptene, Proteine und Enzyme sind erzeugt worden. Es ist jedoch noch kein monoklonaler Antikörper bekannt, der hoch selektiv mit Diogxin reagiert.
Digoxin gehört zu den herzwiksamen Glykosiden. Substanzen dieser Gruppe wirken positiv inotrop, hemmen die Na + -K + -ATPase und sind chemisch durch die Cyklopentano-perhydrophenantren-Gerüst charakterisiert, das neben verschiedenen Substitutionen an den Ringen in 17-Stellung einen ungesättigten Laktonring aufweist.
Digoxin ist das therapeutisch am häufigsten verwendete Herzglykosid. Aufgrund seiner geringen therapeutischen Breite besteht die Gefahr einer Digoxin-Intoxikation.
Um dies zu verhindern oder aber eine bereits bestehende Digoxin-Intoxikation zu diagnostizieren, wurden Radioimmunoassays für die Bestimmung von Digoxin im Serum etabliert. Die Aussagefähigkeit solcher Testsysteme ist z.T. eingeschränkt, da gezeigt wurde, daß mit einer Reihe der auf dem Markt befindlichen Systemen zuweilen falsch positive Werte gemessen werden, (Graves S.W. et al, Ann. Intern. Med.
99:604 (1983)). Erklären lassen sich diese Befunde durch Kreuzreaktion der verwendeten Antiseren mit im Serum zuweilen auftretenden Bestandteilen.
Die Gefahr falsch positiver Digoxin-Bestimmungen läßt sich durch den Einsatz hochspezifischer (monoklonaler) anti-Digoxin-Antikörper ausschließen. Solche Antikörper wären darüber hinaus als Antidot bei Vorliegen einer Digoxin-Intoxikation geeignet.
Die Erfindung betrifft Hybridomzellinien, die hochspezifische monoklonale Antikörper gegen Digoxin synthetisieren und sezerieren, erhältlich durch Fusion von Myklomzellen mit Zellen aus Säugetieren, die Antikörper gegen Digoxin produzieren.
Bevorzugt betrifft die Erfindungen die Hybridomzellinien 255-J-B-9 und 114-A-E-9, die unter den Nummern 850222/01 und 850222/02 am 22.2.1985 bei der National Collection of Animal Cell Cultures, PHLS Centre for Applied Microbiology & Research, Porton Down, Salisbury SP4 OJG, UK hinterlegt wurden.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Herstellung von Hybridomzellinien, die hochspezifische monoklonale Antikörper gegen Digoxin synthetisieren und sezernieren.
Diese Hybridome werden nach der eingangs genannten Methode von Köhler und Milstein hergestellt. Nach der Immunisierung von Mäusen mit an Rinderserumalbumin (BSA) gebundenem Digoxin werden die Milzzellen dieser Mäuse mit Zellen einer Maus-Myzelomzellinie fusioniert.
Die daraus resultierenden Hybridome werden systematisch auf Antikörper untersucht, die selektiv mit Digoxin reagieren. Auf diese Weise wurden Hybridome isoliert, die Antikörper gegen Digoxin produzieren.
Die erfindungsgemäßen Antikörper können zur Bestimmung von Digoxin im Serum digitalisierter Patienten verwendet werden. Sie sind somit für aktuelle diagnostische Zwecke, z.B. zur Uberprüfung des Digoxin Serumspiegels einsetzbar.
Die Herstellung der erfindungsgemäßen Hybridome umfaßt im allgemeinen die folgenden Schritte: A. Immunisierung von Mäusen mit an Carrierprotein (z.B. Rinderserumalbumin) gebundenem Digoxin (Digoxin-BSA). Weibliche Balb/c-Mäuse erwiesen sich hierzu als brauchbar, jedoch können auch andere Mäusestämme verwendet werden. Das Immunisierungsschema und die Konzentration an Digoxin-BSA sollten so gewählt werden, daß eine hinreichende Anzahl Antigen stimulierter Lymphozyten gebildet wird. Drei Immunisierungen im Abstand von 14 Tagen mit 100 g/Digoxin-BSA/Maus/Injektion in phosphatgepufferter physiologischer Kochsalzlösung erwiesen sich als effektiv.
B. Gewinnung der Milzen der immunisierten Mäuse und Herstellung einer Milzsuspension in einem geeigneten Medium. Ungefähr 1 ml Medium pro Milz ist ausreichend. Die experimentellen Techniken dazu sind bekannt.
C. Fusion der suspendierten Milzzellen mit Maus-Myelomzellen einer geeigneten Zellinie (z.B.
P3X63Ag8), indem man einen geeigneten Fusionspromotor (z.B. Polyethylenglykol) verwendet.
Bevorzugte Fusionspromotoren sind Polyethylenglykole von mittlerem Molekulargewicht zwischen 1000 und 4000 (z.B. kommerziell erhältliches PEG 1000 etc.). Jedoch können auch andere bekannte Fusionspromotoren benutzt werden. Bevorzugt wird ein Verhältnis von etwa 10 Milzzellen pro Myelomzelle. Ein Gesamtvolumen von etwa 0,5 - 1,0 ml Fusionsmedium ist ausreichend für 108 Milzzellen. Es sind viele für Zellfusionen geeignete Myelomzellen aus Mäusen bekannt und erhältlich, z.B. von wissenschaftlichen Instituten oder von Zellhinterlegungsinstitutionen.
Die verwendete Zellinie soll vorzugsweise einen genetischen Defekt aufweisen, so daB nicht fusionierte Myelomzellen in einem Selektionsmedium absterben, während Hybride überleben.
Am häufigsten werden 8-Azaguanin-resistente Zellinien, welchen das Enzym Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyl-Transferase fehlt, und die deshalb in einem HAT-Medium (Hypoxanthin, Aminopterin, Thymidin) nicht wachstumsfähig sind, benutzt (Science 145:709, 1064).
Vorzugsweise soll die verwendete Myelomzellinie auch vom "non-secreting"-Typ sein, damit sie nicht selbst Antikörper oder H- bzw. L-Ketten von Immunglobulien bildet. In gewissen Fällen jedoch können sezernierende Myelomzellen von Vorteil sein.
D. Das Fusionsgemisch (Milz- und Myelomzellen) wird in Einzelgefäße in einem Selektivmedium verdünnt und kultiviert, so daß die nicht fusionierten Zellen sich nicht vermehren und in 1-2 Wochen absterben.
Die einzelnen fusionierten Zellen werden isoliert indem das Volumen des Verdünnungsmittels so eingestellt wird, daß eine bestimmte Zahl von Zellen (etwa 1-4) in das einzelne Gefäß (z.B. jede Vertiefung einer Mikrotiterplatte) kommt.
E. Nachweis von Antikörpern gegen Digoxin mit einem Solid Phase Radioimmunoassay (siehe unten).
F. Selektion (z.B. durch limitierte Verdünnung) und Klonierung der Hybridome, die den gewünschten Antikörper produzieren.
Ist einmal das gewünschte Hybridom selektioniert und kloniert worden, kann man den Antikörper auf zwei verschiedenen Wegen produzieren. Monoklonale Antikörper von sehr hoher Reinheit erhält man, wenn man die Hybridome in einem geeigneten Medium über eine gewisse Zeit im Vitro kultiviert und den Antikörper aus dem Uberstand gewinnt. Ein geeignetes Medium und die optimale Kulturdauer sind einfach zu bestimmen. Diese in vitro-Technik liefert monoklonale Antikörper, die nur mit geringen Mengen von Proteinen aus dem heterologen Serum (z.B. fötalem Kälberserum) verunreinigt sind.
Um eine wesentlich höhere Konzentration an monoklonalen Antikörpern mit nur wenig geringerer Reinheit herzustellen, kann man das ausgewählte Hybridom einer Maus - vorzugsweise einer syngenen oder semisyngenen - injizieren. Dies führt in der Maus nach einer Inkubationszeit zur Bildung eines Tumors, der hohe Antikörperkonzentrationen (5-20 mg/ml) im Blut und im peritonealen Exsudat (Ascites) des Wirtstieres freisetzt. Wenn auch diese Mäuse normale Antikörper in Blut und Ascites haben, so ist deren Konzentration im Vergleich zu den mAk sehr gering. Der so gewonnene monoklonale Antikörper hat einen hohen Titer (er ist aktiv in Verdünnungen von 10 3 oder darunter), und das Verhältnis zwischen spezifischem und nicht-spezifischem Immunglobulin beträgt etwa 20:1.
Beispiel 1 Herstellung der monoklonalen anti-Digoxin Antikörper a) Herstellung des zur Immunisierung verwendeten Antigens Als Antigen diente ein Digoxin-BSA-Konjugat, das nach der von T.B. Smith et al. beschriebenen Methode (Biochemistry 9:331 (1979)) hergestellt wurde.
b) Immunisierung von Balb/c-Mäusen Weibliche Balb/c-Mäuse wurden intraperitoneal mit 100 ßg Rinderserumalbumin-Digoxinkonjugat in 0,3 ml komplettem Freund'schen Adjuvans immunisiert. 14 Tage später erhielten die Tiere erneut 100 Fg des Antigens intraperitoneal in inkomplettem Freund'schen Adjuvans. 2 weitere Immunisierungen erfolgten intravenös in 14-tägigen Abständen mit jeweils 50 Ag Antigen in 100 ßl PBS/Tier. 3 Tage nach der letzten Antigengabe wurden die Milzen der Tiere entnommen.
c) Präparation einer Milzzellsuspension Aus den entnommenen Milzen wurden Einzelzellsuspensionen hergestellt, indem die Organe durch ein Sieb aus rostfreiem Stahl gepreßt wurden. Die Zellen wurden in Dulbecco's Minimal Essential Medium (DMEM), das mit 4,5 g/l Glukose, 100 Einheiten/ml Penicillin und 100 ßg/ml Streptomycin supplementiert war, überführt. Die Zellen wurden 3 mal mit DMEM gewaschen und dann in gewünschter Konzentration im selben Medium resuspendiert. Im allgemeinen wurden etwa 108 Zellen pro Milz gewonnen.
d) Präparation der Myelomzellen Die hier verwendete Myelomzellinie X63Ag8.653 ist ein Subklon der Mäusemyelomzellinie P3-X63-Ag 8, die keine schweren oder leichten Ketten von Immunglobulin exprimiert (J. Immunol. 123:1543-1550 (1980)). Die Zellen sind gegen 20 Ag/ml 8-Azaguanin sensitiv und können in Medium, das Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin (HAT) enthält, nicht mehr wachsen. Sie wurden in DMEM, das mit 4,5 g/l Glukose, 20 mM Glutamin, 1000 Einheiten/ml Penicillin, 100 ßg Streptomycin und 10 % fötalem Kälberserum supplementiert war (komplettes Medium) kultiviert.
Die Myelomzellen waren zum Zeitpunkt der Fusionierung in der logarithmischen Phase der Zellvermehrung.
e) Zellfusion Die Milzzellsuspensionen wurden zu den Myelomzellen in DMEM ohne Serum mit einem Verhältnis von 10:1 zugegeben und 10 Minuten bei 200 g in Bechern mit rundem Boden zentrifugiert. Nach Absetzen der Zelle wurde der Uberstand vorsichtig dekantiert.
Die Zelle wurde mit 2 ml einer Lösung von Polyethylenglykol vom Molekulargewicht 2000 (verdünnt auf 30 % w/w mit DMEM, pH 7,6) 1 Minute bei 370C inkubiert. Daraufhin wurden 20 ml DMEM zugegeben, worauf die Zellen über einige Minuten vorsichtig resuspendiert wurden. Sie wurden dann nochmals 5 Minuten lang bei 200 g zentrifugiert und das Zellpellet in HAT-Medium in einer Konzen- tration von 106 Zellen/ml resuspendiert worauf sie in 1-ml-Anteilen auf Costar-Platten verteilt wurden.
f) Selektionierung und Anzucht der Hybridome Nach der Zellfusion wurden die Zellen in HAT-Medium (Hypoxanthin, Aminopterin, Thymidin) bei 370C mit 5 % CO2 in einer feuchten Atmosphäre kultiviert.
Nach einigen Wochen wurden Uberstände von Hydridomzellkulturen auf das Vorhandensein von anti-Digoxin-Aktivität untersucht.
Diejenigen Hybridomzellinien, die positive Resultate im anti-Digoxin-Test zeigten, wurden zum Klonieren ausgewählt. Dabei wurden die Hybridome einer "Limiting-Dilution"-Technik unterworden, bei der in 96 Mikrotitervertiefungen im Mittel 0,5 Zellen/ Vertiefung ausgesät wurden, wobei 105 Mäusethymocyten als "Feeder-Zellen" zugegeben wurden.
Die nach diesem Klonierungsverfahren selektionierten Antikörper-produzierende Zellen wurden vermehrt, eingefroren und in flüssigem Stickstoff in komplettem Medium, das 25 % fötales Kälberserum sowie 7,5 % Dimethylsulfoxid enthielt, aufbewahrt.
g) Herstellung großer Mengen monoklonaler Antikörper Klonierte Hybridome wurden Mäusen, die mit 0,5 ml Pristan vorbehandelt waren, intraperitoneal injiziert, um antikörperenthaltende Ascitesflüssigkeit 10-15 Tage danach zu gewinnen. Die Antikörperaktivität wurde wie unten beschrieben, bestimmt. Wie in Tabelle 1 gezeigt, beträgt der Antikörpertiter der beiden monoklonalen anti-Digoxin-Antikörper ungefähr 106.
h) Bestimmung der anti-Digoxin-Aktivität in Kulturüberständen 100 1 Kulturüberstand wurden auf Mikrotitervertiefungen gegeben, an die Ovalbumin-Digoxin-Konjugat (5 Ag/ml) 3 Stunden lang bei Raumtemperatur adsorbiert worden war, und die daraufhin mit Wasser 5 mal gewaschen worden waren. 125Jod-(Ziegen)-anti-Maus-Immunglobulin (8-10 x 104 cpm) wurde darauf hinzugefügt; danach wurden die Platten 3 Stunden bei Zimmertemperatur inkubiert. Nach 5maligem Waschen mit destilliertem Wasser wurden die Vertiefungen der Mikrotiterplatten ausgeschnitten und in einem LKB-Gammazähler gezählt.
Tabelle 1 Isotyp und Titer der Aktivitäten monoklonaler Antikörper gegen Digoxin Antikörpertiterx (reziprok) Hybridom Isotyp Kulturüber- Ascitesstand flüssigkeit 114 A-E 9 Ig61 9,1 x 103 2 x 106 255 J-B 9 IgM 7,2 x 103 1 x 106 125 x Antikörpertiter wurde mit dem ( J) anti Maus Ig-Bindungstest bestimmt.
Tabelle 2 Kreuzreaktion der monoklonalen anti-Digoxin Antikörper mit verschiedenen Herzglykosiden.
Her zglykos ide anti-Digoxin Antikörper 114 A-E 9 255 J-B 9 Digoxin 1 1 Digoxingenin 15 18 Digitoxingenin 1700 1500 Ouabain - - Die Abb. 1 zeigt einen radioaktiven Bindungsinhibitionstest zum Nachweis von Digoxin.
In einem radiaktiven Bindungsinhibitionstest wurde versucht, die Bindung von 3H-markiertem-Digoxin an die mAk 114-A-E 9 und 255 J-B 9 mit verschiedenen Glykosiden (s. Tabelle 2) zu inhibieren. Die Menge von unmarkiertem Digoxin, die 50 % der Radioaktivität von der Bindung an die mAk verdrängte, wurde gleich 1 gesetzt. Die Zahlen geben an, wieviel mal mehr von der jeweiligen Substanz dem Testansatz zugegeben werden mußte, um eine dem homologen Inhibitor äquivalente Verdrängung zu erzielen. Das Symbol - bedeutet, daß die Substanzen keine Inhibition zeigten.
Auf der y-Achse ist die Bindung in % aufgetragen.
Die x-Achse zeigt die Digoxinmenge.
Legende zu Abb. 1 Mit den beiden mAk 114-A-E 9 und 255-J-B 9 wurde jeweils ein Bindungsinhibitionstest durchgeführt; bei steigenden Mengen von unmarkiertem Digoxin wurde die Bindung von 125-J-Digoxin an die entsprechenden Antikörper bestimmt.
Beispiel 2 Charakterisierung der monoklonalen anti-Digoxin-Antikörper a) Typisierung der monoklonalen anti-Digoxin-Antikörper Die Klassen und Unterklassen der von den Hybridklonen produzierten Antikörper wurden analysiert.
Der jeweilige Antikörper wurde aus dem Kulturtberstand durch Fällung mit Ammoniumsulfat (40 %ige Sättigung) angereichert und partiell gereinigt.
Unter Verwendung von klassenspezifischen anti-Maus-Immunglobul in-Antiseren wurden die jeweiligen Immunglobulinklassen im Ouchterlony Geldiffusionstest bestimmt. Wie in Tabelle 1 gezeigt, gehört der anti-Digoxin-Antikörper 114A-E9 der IgG1-Klasse, der anti-Digoxin-Antikörßer 255 J-B9 der IgM-Klasse an.
b) Kreuzreaktion der Antikörper mit verschiedenen Herzglykosiden Die Kreuzreaktivität der monoklonalen anti-Digoxin-Antikörper mit verschiedenen Herzglykosiden wurde mit Hilfe eines radioaktiven Bindungsinhibitionstests ermittelt. Der Test wird in Phosphat-gepufferter-Kochsalzlösung (PBS), 3 % BSA, 0,1 % NaN3 durchgeführt. Radioaktiv markiertes Digoxin wird zusammen mit Antikörpern in geeigneter Verdünnung für 2-16 h bei 40C inhibiert, das Gesamtvolumen beträgt 400 ßl. Beim Bindungsinhibitionstest enthält der Testansatz (bei gleichem Volumen) zusätzlich unmarkiertes Antigen (= Inhibitor) in unterschiedlicher Konzentration. Im zweiten Schritt des Tests wird dann das nicht an den Antikörper gebundene, radioaktive Digoxin nach Zugabe von 200 l einer Aktivkohle-Suspension (0,05 M Phosphatpuffer pH 7,4, lmg/ml Lyosozym, 0,02 % NaN3, 0,75 % Dextran, 7,5 % Norit-A-Aktivkohle) und Inkubation für 5 min. auf Eis an die Kohle adsorbiert. Anschließend wird die Aktivkohle durch Zentrifugation für 2 min. bei 5000 g sedimentiert und die Radioaktivität in 500 ßl Uberstand bestimmt. Die Menge an Radioaktivität im Uberstand ist abhängig von der Konzentration an unmarkiertem Inhibitor in der Probelösung. Gemessen wurde die Konzentration von verschiedenen Glykosiden, die erforderlich ist, um 50 % des 3H-markierten Digoxins vom Antikörper zu verdrängen.
Wie aus Tabelle 2 hervorgeht, reagieren beide Antikörper hochspezifisch mit Digoxin. Da beide monoklonalen Antikörper auch mit Digoxigenin (dem Aglykon des Digoxingenins) reagieren, scheinen die Kohlenhydratanteile des Digoxins für die Bindung an die monoklonalen Antikörper nicht essentiell zu sein. Mit dem strukturell sehr ähnlichen Digitoxin reagieren beiden Antikörper nur schwach, während sie mit Ouabain keinerlei Raktion zeigen.
Beispiel 3 Anwendungen der monoklonalen anti-Digoxin-Antikörper a) Nachweis von Digoxin im Serum mit monoklonalen anti-Digoxin-Antikörpern Antigene in hoher Verdünnung lassen sich quantitativ mit Radioimmunoassays bestimmen. Erforderlich für diesen Test sind hochspezifische Antikörper und ein radioaktiv markiertes Antigen. Die Bindung des radiaktiv markierten Antigens an den Antikörper läßt sich dosisabhängig durch nicht radioaktives Antigen inhibieren. Werden definierte verschiedene Konzentrationen nicht radioaktiven Antigens mit konstanten Konzentrationen an Antikörpern und radioaktiv markiertem Antigen inkubiert, so läßt sich auf diese Weise eine charakteristische Eichkurve erstellen (Abb. 1). Unbekannte Mengen an Antigen in Lösung können mit Hilfe dieser Eichkurve bestimmt werden. Ein Radioimmunoassay basierend auf den monoklonalen anti-Digoxin-Antikörpern 114-A-E 9 und 125Jod-Digoxin als Tracer ermöglicht den Nachweis von Digoxin im Serum bis zu einer Konzentration von 20 pg/ml.
b) Monoklonale anti-Digoxin-Antikörper als Antidot bei Digital is -Intoxikation Digoxin besitzt einen hohen therapeutischen Wert.
Die Anwendung ist jedoch dadurch erschwert, daß seine therapeutische Breite relativ eng ist und eine Digital is-Intoxikation relativ häufig beobachtet wird. Die monoklonalen anti-Digoxin-Antikörper 114-A-E 9 und 255 J-B 9 sind bei einer Digoxin-Intoxikation als Antidot wirksam. Hunde, die deutliche Zeichen einer Digoxin-Intoxikation aufwiesen (Rhythmus- und Uberleitungsstörung) werden durch Gabe von anti-Digoxin-Antikörpern rasch normalisiert.
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Claims

Patentansprüche 1. Hybridomzellinien, die hochspezifische monoklonale Antikörper gegen Digoxin synthetisieren und sezernieren, erhältlich durch Fusion von Myelomzellen mit Zellen aus Säugetieren, die Antikörper gegen Digoxin produzieren.
2. Hybridomzellinien, die hochspezifische monoklonale Antikörper gegen Digoxin synthetisieren und sezernieren, erhältlich durch Immunisierung von Mäusen mit Digoxin und anschließende Fusion der Milzzellen dieser Mäuse mit Zellen einer Maus-Myelomzellinie.
3. Hybridomzellinien, die hochspezifische monoklonale Antikörper gegen Digoxin synthetisieren und sezernieren, erhältlich durch Immunisierung von Mäusen mit Digoxin und anschließende Fusion der Milzzellen dieser Mäuse mit Zellen einer Maus-Myelomzellinie.
4. Monoklonale Antikörper, hergestellt unter Verwendung einer Hybridomzellinie gemäß den Ansprüchen 1 und 2.
5. Monoklonale Antikörper, hergestellt unter Verwendung der Hybridonzellinie, die hochspezifische monoklonale Antikörper gegen Digoxin synthetisieren und sezernieren, erhältlich durch Immunisierung von Mäusen mit Digoxin und anschließende Fusion die Milzzellen dieser Mäuse mit Zellen einer Maus-Myelomzellinie.
6. Verfahren zur Herstellung von Hybridomzellinien, die hochspezifische monoklonale Antikörper gegen Digoxin synthetisieren und sezernieren, dadurch gekennzeichnet, daß man Myelomzellen mit Zellen aus Säugetieren fusioniert, die Antikörper gegen Trigoxin produzieren.
7. Verfahren zur Herstellung von Hybridomzellinien gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man Mäuse mit an Carrierprotein gebundenem Digoxin immunisiert, aus den Milzen die immunisierten Mäuse im Milzzellensuspension herstellt, die Milzzellen mit Maus-Myelomzellen fusioniert und die der gewünschten Antikörper produzierenden Hybridomzellinien selektioniert.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man als Myelomzellen 8-Azaguaninresistente Zellinien, gegebenenfalls von non-secreting-Typ, verwendet.
9. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man das Fusionsgemisch aus Milz-, und Hybridomzellen in Einzelgefäßen mit einem Selektionsmedium verdünnt und in der Weise kultiviert, daß die nicht fusionierten Zellen sich nicht vermehren und absterben, die fusionierten Zellen isoliert, indem das Volumen des Verdünnungsmittels so eingestellt wird, daß eine bestimmte Zahl von Zellen in das einzelne Gefäß kommt, auf Anwesenheit von Antikörpern gegen Digoxin prüft und die Hybridomzellen, die den Antikörper produzieren, selektioniert und kloniert.
10. Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper mit Spezifität gegen Digoxin, dadurch gekennzeichnet, daß man Hybridomzelinien gemäß den Ansprechen 1 bis 3 in einem geeigneten Kulturmedium kultiviert und die Antikörper aus dem Uberstand gewinnt oder daß man das Hybridom einer, gegebenenfalls syngenen oder semisyngenen, Maus injiziert und die im Blut oder peritonealen Exsudat freigesetzten Antikörper isoliert.
11. Verwendung der monoklonalen Antikörper nach den Ansprüchen 4 und 5 zur Bestimmung von Digoxin in biologischen Flüssigkeiten.
12. Verwendung der monoklonalen Antikörper nach den Ansprüchen 4 und 5 zur Bestimmung von Digoxin in Blut, Serum, Urin, in der Systemflüssigkeit oder in der cerebrospinalen Flüssigkeit.
13. Verwendung der monoklonalen Antikörper nach den Ansprüchen 4 und 5 zur Therapie bei Digoxin-Intoxikationen.
14. Verwendung der monoklonalen Antikörper nach den Ansprüchen 4 und 5 zur Herstellung von XImmunoassays für den Nachweis und die Bestimmung von Digoxin.
15. Verwendung der monoklonalen Antikörper nach den Ansprüchen 4 und 5 zur Herstellung von Arzneimitteln, geeignet zur Bekämpfung von Digoxin-Intoxikationen.