DD287953A5 - Verfahren zur herstellung monoklonaler antikoerper gegen das kapselpolysaccharid des haemophilus influencae typ b - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikoerper gegen das Kapselpolysaccharid des Haemophilus influencae Typ b. Durch Immunisierung von Maeusen und Immortalisierung ihrer Milzlymphocyten mit einer murinen Myelomzellinie werden die Hybridomzellen HC-HIB-G1, -G2, -M1 und -M2 erhalten. Das Anwendungsgebiet der Erfindung ist die medizinische Diagnostik.{Antikoerper; monoklonale Antikoerper; Antigen; Haemophilus influencae Typ b; Kapselpolysaccharid; Immunisierung; Maeuse; Hybridzellen; Medizin; Diagnostik}

Description

durch ein geeignetes Verfahren (z. B. einem spezifischen Enzymimmunoassay (EIA]) sezernlerte Antikörper gegen Hämophilus Influencae Typ b-Kapselpolysacchariri nachgewiesen werden. Die Primärzellkulturen mit Anti-Hämophilus-Influencae Typ b-Kapselpolysaccharld-Antikörpor-Produktion werden klonlert und mehrmals rekloniert, bis monoklonale Subklone erhalten werden, die stabil und in hohen Konzentrationen spezifische Antikörper sezernieren.

Die Hybridome werden als H-CB-HIB bezeichnet. Besonders geeignet sind die Zellkulturen H-CB-HIB-G1, -G 2, -M1 und -M 2. Diese 4 Hybridome sind in der Hinterlegungsstelle des Zentralinstituts für Molekularbiologie der AdW der DDR, Berlin-Buch, unter folgenden Nummern registriert:

H-CB-HIB-G1 als ZIM-0485 . H-CB-HIB-G 2 aisZIM-0486 H-CB-HIB-M1 als ZIM-0487 H-CB-HIB-M 2 als ZIM-0488.

Die hinterlegten Hybridomzellkulturen eignen sich für eine Massenproduktion von monoklonalen Antikörpern in vitro und in Im ersten Fall werden die Zellen in 6-well-Platten bis zu einer maximalen Zelldichte von 4 x 10⁶ Zellen/ml kultiviert, wobei Antikörperkonzentrationen im Zellkulturüberstand bis zu 18MgAnIIg pro 5 χ 10^s Zellen erreicht werden. Im zweiten Fall werden die Zellen aus der Zellkultur auf eine Konzentration von 1-5 χ 10^e/ml gebracht und in Pristan-

vorbehandelte Mäuse intraperitoneal nach bekanntem Verfahren appliziert. Nach ca. 8-24 Tagen lassen sich durch Punktion biszu 12 ml Ascitesflüssigkeit gewinnen, die bis zu 18mg spezifischen Antikörpern/ml enthalten.

Auf diese Weise werden aus den genannten Hybridomen die monoklonalen Antikörper CB-HIB-G1, -G 2, -M1 und -M 2 gewonnen. Durch Anwendung verschiedener biochemischer und immunchemischer Verfahren lassen sich die genannten Antikörper bis zu

einem hohen Reinheitsgrad anreichern. Nach Antionen-Austauschchromatographie (FPLC-Reinigung) ließen sich aus 10ml

Ascites ca. 200 mg spezifischer Antikörper herstellen. Für die Entwicklung bestimmter Testverfahren lassen sich die Antikörper mit Enzymen oder partikulären Trägern koppeln

(Peroxidase-Marklerung bzw. Latox-Kopplung). Sie können außerdem biotiniliert werden bzw. für Reinigungsverfahren anverschiedene Trägermaterialien gekoppelt werden.

Anwendungsbeispiele Beispiel 1

Über einen Zeitraum von 8 Wochen werden 3 weibliche Balb/c-Mäuse 2x wöchentlich mit 100pg Phenol/Wasser-extrahlertem Hämophilus-influenc ae-Kapselpolysaccharid je Versuchstier intravenös immunisiert. 4 Tage nach der letzten Antigenapplikation werden die Milzen der Versuchstiere entnommen und mittels Glashomogenisator Einzelzellsuspensionen hergestellt. Je Versuchstier lassen sich 1-2 x 10⁸ Milzzellon Isolieren. Diese werden mit Myelomzellen der Linie P3X63 Ag 8/653 im Verhältnis von 1:3 bis 1:8 (Myelomzellen:Milzzellen) gemischt und mittels Polyethylenglykol 1500 fusioniert.

Nach entsprechenden Waschschritten werden die Zellen in 96-well-Zellkulturplatten mit 10⁵ Zellen/well in 100pg ausplattiert. Das dabei zur Kultivierung genutzte Standardzellkulturmedium besteht aus RPM11640 mit 10%igem FKS-Zusatz. Am folgenden Tag werden 100pg eines doppelt konzentrierten HAT-Selektlonsmedlums zugesetzt. Eine weitere Zugabe von 50pg des HAT-Mediums pro well der Zellkulturplatte erfolgt nach einer Woche. Nach 14tägiger Zellkultur werden die Primärzellkulturüberstände mit einem hochspezifischen EIA hinsichtlich ihres Gehaltes an spezifischen Antikörpern geprüft. Nach dem beschriebenen Verfahren können bis zu 16% der Primärkulturen spezifische Antikörpergegen Hämophilus influencae Typ b-Kapselpolyaaccharid bilden.

Die positiven Primärkulturen werden auf Perltonealmakrophagen der Balb/c-Maus (lOVwell) nach dem Grenzverdünnungsverfahren klonlert und bis Erreichen der Monoklonalität rekloniert. Auf diese Welse werden Zellinien mit spezifischer Anti-Hämophilus-influencae-Typb-Kapselpolysaccharid-Antikörperproduktion erhalten.

Beispiel 2

In 6-well-Zellkulturplatten werden die monoklonalen Hybridome bis zu Zellkonzentrationen von 0,5-1 χ 10^s Zellen/ml gezüchtet. Die Zellen werden 2 x in isotonischer Phosphatpufferlösung gewaschen und In einer Konzentration von 5 χ 10^β Zellen/ml in der gleichen Lösung aufgenommen. JeImI der wie beschrieben hergestellten Hybridomzellsuspension wird in Balb/c-Mäuse, die 8 Tage vorher mit 1 ml Pristani.p. behandelt wurden, intraperitoneal appliziert. Nach ca. 8-14 Tagen wird die Ascites-Produktion anhand der Bauchschwellung bei den Mäusen sichtbar. 4-12 ml Ascitesflüssigkeit mit einem spezifischen Antikörpergehalt bis zu 20mg/ml können pro Balb/c-Maus gewonnen werden. Die Reinigung der Antikörper erfolgt nach den bekannten Verfahren.

Beispiel 3 Je 10ml Balb/c-Maus-Ascitesflüssigkeit mit Gehalt an spezifischen Anti-Hämophilus-infiuencae-Typ b-Antikörpern werden per Anionenaustauschchromatographie mittels FPLC unter Anwendung eines 0-1 Mol/l Nacl-Gradienten an einer Mono-Q-Säule

eluiert.

Dabei lassen sich zwischen 100-180 mg spezifischer Antikörper aus der hergestellten Ascitesflüssigkeit reinigen. Die gereinigten Antikörper sind bei der Lagerung über einen längeren Zeitraum in isotonischer Phosphatpufferlösung bei -70°C stabil. Beispiel 4

Nach dem beschriebenen Schema sind Hybridomzellinien mit monoklonaler Antikörperproduktion gegen das Kapselpolysaccharid des Hämophilus influencae Typ b hergestellt worden, die mit H-CB-HIB-G1, -G 2, -M 1 und -M 2 bezeichnet wurden. Diese Zellinien wurden für die Optimierung des Verfahrens zur Herstellung der entsprechenden Antikörper charakterisiert (Tabelle 1). Die Spezifitätscharakterisierung der durch die genannten Zellinien produzierten Antikörper ist in Tabelle 2 dargestellt.

Tabelle 1: Charakterisierung der Hybridomzeiiinien mit monoklonaler Antikörperproduktion gegen Hämophilus infiuencae Typb

Klon	Verdoppe	Ig-Klasse	Ig-Produktlon
	lungszeit		(Mg/24 h/0,5 χ 10' Zellen)
H-CB-HIB-G1	26	G	19,3
H-CB-HIB-G 2	24	G	17,7
H-CB-HIB-M1	28	M	24,2
H-CB-HIB-M2	21	M	11,5

Tabelle 2: Charakterisierung der Antigenspezifitäten der monoklonalen CB-HIB im EIA gegenüber verschiedenen bakteriellen Antigenen (Festphasenbindung von Vollkeimsuspensionen (VK] bzw. irnmunchemisch charakterisierten Teilantigenen [PA], Entwicklung mit Anti-Species-Antikörpern POD-markiert, Testung ZKÜ nativ)

Antigen	CB-HIB-G1	CB-HIB-G 2	CB-HIB-M1	CB-HIB-M 2
	(Ext. 460 Mm)	(Ext. 460Mm)	(Ext. 460Mm)	(Ext. 460 Mm)
HIB Typ b-
Kapsel (PA)	1,513	1,384	2,000	1,856
HIB(VK)	1,970	1,518	1,995	1,789
H.influencae
ο. Kapsel (VK)	0,067	0,029	0,101	0,043
ScBIII(VK)	0,033	0,061	0,058	0,027
A-Meningo-
kokken(VK)	0,032	0,045	0,022	0,015
B-Meningo-
kokken(VK)	0,038	0,051	0,067	0,025
C-Meningo-
kokken(VK)	0,020	0,031	0,101	0,073
Pseudomonas
aeruginosa	0,030	0,045	0,042	0,024
(VK)
E.C0ÜK1-
Kapsel(PA)	0,014	0,030	0,084	0,032

Claims (4)

1. Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper, die verschiedene Strukturen des Hämophilus influencae Kapselpolysaccharides (HIB) erkennen, durch Immunisierung von Balb/c-Mäusen mit HIB-Phenol/Wasserextrahierten Antigenen und Immortalisierung ihrer Milzlymphozyten mit einer murinen Myelomzellinie, dadurch gekennzeichnet, daß daraus die Hybridomzellen H-CB-HIB-G1 (ZIM-0485), H-CB-HIB-G 2 (ZIM-0486), H-CB-HIB_:M 1 (ZIM-0487) und H-CB-HIB-M 2 (ZIM-0488) selektiert zur Züchtung eingesetzt und aus dem Überstand die monoklonalen Antikörper CB-HIB-G1, CB-HIb-G 2, CB-HIB-M1 und CB-HIB-M 2 isoliert werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Isolierung der Milzlymphozyten erfolgt, nachdem das Antigen 8 bis 10 Wochen alten weiblichen Mäusen über einen Zeitraum von 8 Wochen zweimal wöchentlich intravenös appliziert wird und die letzte Gabe des Antigens 4 Tage vor der Milzentnahme erfolgt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Antikörper biotiniliert oder an Enzyme, z. B. zur Peroxidase-Markierung, an partikuläre Träger, z. B. Latex bzw. an Trägermaterialien gekoppelt werden.

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper gegen das Kapselpolysaccharid des Hämophilus influencae Typ b. Das Anwendur gsgebiet der Erfindung ist die medizinische Diagnostik.

Charakteristik des bekannten St- ndes der Technik

Die Herstellung monoklonaler Antikörper ist bereits beschrieben. KÖHLER und MILSTEIN (Nature 1975,256,495) haben erstmalig durch somatlsche Fusion von murinen antikörpersezernlerenden Zellen und Zellen einer permanent wachsenden Plasmozytomzellinie Hybridome erzeugt, die nach entsprechenden Klonierungsschritten monoklonal Antikörper murinen Ursprungs gegen eine gewünschte Antigenspezifität produzierten. Die Herstellung muriner monoklonaler Antikörper gegen Hämophilus influencae Typ b mittels der von KÖHLER und MILSTEIN entwickelten Prinziplösung wird bereits im Schrifttum referiert (GIGLIOTTI, F. und R.A.INSEL, J. Infect. Die. 1982,146,249-254; ROBERTSON, S.M., CF.FRISCH, P.A.GULIG, J.R.KETTMANN, K.H. JOHNSTON und E. HANSEN 1982,36,80; HUNTER, K.W., G.W.FISCHER, V.G. HEMMING, S.R. WILSON, R. J. HARTZMAN und J.N.WOODY 1982, Lancet 11,798). Es sind jedoch keine Hybridomlinien bekannt, die in hoher Ausbeute monoklonal Antikörper vom Typ CB-HIB-G1, -G 2 und -M 2 sezernieren.

Ziel der Erfindung

Das Ziel der Erfindung besteht darin, für die medizinische Diagnostik monoklonal Antikörper zur Verfügung zu stellen, die zum Aufbau von Testsystemen zur Erkennung von Hämophilus influencae Typ b-Kapselpolysaccharid geeignet sind.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein effektives Verfahren zur Erzeugung von Hybridomzellinien aus deren Zellkulturüberständen in weiterführenden Verfahrensschritten monoklonalo Antikörper gegen das Kapsf'oolysaccharid des Hämophilus influencae gewonnen werden können, zu entwickein. Die nach beschriebenem Verfahren erzeugten Hybridomzellinien sollen mit ökonomisch günstigem Aufwand in vitro und in vivo kultivierbar sein und die I ir eine wirtschaftliche Reinigung erforderlichen Mengen an stabilen Antikörpern sezernieren. Die Aufgabenlösung erfolgte durch die Immunisierung von Mäusen des Balb/c Stammes mit einem hochgereinigten Phenol/Wasser-extrahierten Kapselpolysaccharid aus einem Hämophilus influencae Typ b-Patientenstamm nach einem bestimmten erfinderischen Schema. Als vorteilhaft erwies sich die Verwendung von 8-10 Wochen alten weiblichen Balb/c-Mäusen. Die Immunisierung erfolgte durch mehrmalige Antigenapplikation. Als ökonomisch sehr günstige Variante erwies sich die intravenöse Applikation von 100μς Phenol/Wasserextrahiertem Poly-Ribose-Ribitolphosphat 2mal wöchentlich je Versuchstier über einen Zeitraum von 8 Wochen. Aus den Milzen derart hyperimmunisierter Balb/c-Mäuse wurde

4 Tage nach der letzten Antigenapplikation in an sich bekannter Weise eine Einzellsuspension mittels Glashomogenisator hergestellt.

Als Fusionspartner für die derart präparierten Zellen wurden Mausmyelomzellen der Linie P3 X63 Ag8/653 (Kearney et al., J. Immunol., 1979,123,1548) verwendet. Die Kultivierung der Mausmyelomzellen erfolgte in Zellzuchtmedium RPM11640 mit einem 10%igem Anteil an fetalem Kälberserum (FKS). Nach dem Vermischen beider Fusionspartner in FKS-freiem Zellzuchtmodium und anschließender Sedimentation, wurde durch Polyethylenglykol die Zellfusion induziert. Anschließend wurden die Zellen in eine Vielzahl von separaten 200μΙ Kulturen aufgeteilt. In einem Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin enthaltendem Zellkulturmedium (HAI) nach LITTI.EFIELD (Science 1964,145,709) wrden die gebildeton Hybride von den nicht fusionierten Myelom- und Milzzellen abgetrennt und erfindungsgemäß Klone selektioniert, die Antikörper der gewünschten Spezifität produzieren. Die Detektion dieser Klone erfolgt dadurch, daß im zellfreien Überstand der angelegten Zellkulturen