DD230884A1 - Verfahren zur herstellung monoklonaler antikoerper fuer humanes igg - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikoerper fuer IgG. Es ist das Ziel, ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikoerper anzugeben, das in leicht beherrschbarer Weise die kostenguenstige Produktion groesserer Mengen spezifischer Antikoerper fuer humanes IgG gestattet. Die Aufgabe wird darin gesehen, zunaechst ein Hybridom zu selektionieren, das den entsprechenden monoklonalen Antikoerper produzieren kann. Unter Verwendung dieses Hybridoms soll der entsprechende Antikoerper in technisch einfacher Weise herstellbar sein. Die Aufgabe wird geloest durch die Selektionierung, Klonierung, Reklonierung und Subklongewinnung des Hybridoms H-BL-IgG/1 und dessen Kultivierung in vitro oder in vivo.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper, die in der Lage sind, spezifisch mit humanem IgG zu reagieren.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

IgG ist das dominierende humorale Immunglobulin des Menschen. Die Konzentrationsbestimmung von IgG ist mittels konventionell hergestellter Antiseren bei Anwendunc/einfacher analytischer Methoden möglich. Die verwendeten konventioneilen Antiseren weisen jedoch eine Reihe von Nachteilen auf, die ihre Einsatzmöglichkeit einschränken. Zuerst ist die Unmöglichkeit festzustellen, Antiseren gleicher Qualität zu reproduzieren. Die Ursache dafür liegt in der heterogenen humoralen Immunantwort der Serumspendertiere begründet. Die Zusammensetzung der Antiseren, z. B. hinsichtlich der Frequenz unterschiedlich affiner Antikörpertypen, variiert von Versuchstier zu Versuchstier, ja selbst von einer Blutentnahme zur anderen bei demselben Serumspender. Die Unmöglichkeit einer exakten Reproduktion eines Antiserums bei einer endlichen gewinnbaren Antiserummenge limitiert eine Standardisierung solcher Antiseren. Monoklonale Antikörper, die von einer permanent wachsenden Zellinie sezerniert werden, überwinden die Mängel der konventionellen Antiseren. Monoklonale Antikörper herzustellen ist bereits bekannt. So haben Köhler und Milstein (Nature 256, [1975] 495) durch Fusion antikörperbildender Zellen mit einer permanent wachsenden Plasmozytomlinie eine Hybridzellinie erzeugt, die permanent wächst und stabil Antikörper sezerniert. Diese Prinziplösung hat dazu geführt, daß verschiedene Hybridomlinien, die Antikörper unterschiedlicher Spezifität produzieren, hergestellt worden sind. Es sind jedoch keine Hybridomlinien bekannt, die in hoher Ausbeute monoklonale Antikörper vom Typ BL-IgG sezemieren, d.h. Antikörper, die in der Lage sind zur Bestimmung von humoralem IgG zu dienen.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung hat das Ziel, ein Verfahren zum Herstellen eines monoklonalen Antikörpers des Typs BL-IgG anzugeben, das in leicht beherrschbarer Weise die kostengünstige Produktion größerer Mengen dieses spezifischen Antikörpers für humanes IgG gestattet. Dabei soll gleichbleibende Qualität gewährleistet sein, der Antikörper soll stabil und lagerfähig sein und sich zur Verwendung in einfachen und exakten Nachweistests für humorales IgG eignen, wobei Kreuzreaktionen mit anderen humanen Immunglobulinen nicht vorkommen sollen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper abzuwickeln, die für humanes IgG spezifisch sind. Das Verfahren soll in reproduzierbarer Weise Antikörper hoher Affinität und Spezifität liefern. Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daiS zunächst nach an sich bekannten Verfahren eine Immunglobulinfraktion aus dem Serum gesunder Spender isoliert wird, z. B. durch Aussalzen. Aus dieser Immunglobulinfraktion wird durch lonenaustauschchromatographie an DEAE-ZeIIulose in an sich bekannter Weise reines IgG isoliert, mit dem erfindungsgemäß Mäuse immunisiert werden. Vorzugsweise werden 6 bis 8 Wochen alte weibliche Α-Mäuse verwendet. Die Immunisierung erfolgt durch mehrmalige Applikation des Antigens. Aus den Milzen derart hyperimmuner Mäuse werden die Lymphozyten in an sich bekannter Weise separiert. Die B-Lymphozyten dieses Zellgemisches werden mit Maus-B-Myelomzellen fusioniert bzw. hybridisiert. Die notwendigen Maus-B-Myelomzellen P3 —X —63Ag 8653 (KEARNEY et. al., J. Immunol. 123, [1979], 1548) werden in RPMI-1640 mit 10% fetalem Kälberserum (FKS) gezüchtet. In einem Kulturmedium, welches Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin enthält (Littlefield, Science, 145, [1964], 709), werden die gebildeten Hybride von den nicht fusionierten Myelomzellen abgetrennt und erfindungsgemäß ein Zellklon selektioniert, der Antikörper, die spezifisch mit Human-IgG reagieren, sezerniert. Die Selektionierung des Hybridoms erfolgt in der Weise, daß die Zellen unmittelbar nach der Fusion in eine Vielzahl von separaten 200-pl-Kulturen aufgeteilt werden. Die Überstände der die aufwachsenden Hybridzellen enthaltenden Kulturen werden auf die Anwesenheit von Antikörpern geprüft, die mit humanem IgG reagieren. Die Testung erfolgt zweckmäßigerweise mittels indirekter Radiobindungstechnik oder monoklonaler PAP-Technik. Als Antigen wird humanes IgG verwendet, das aus Serum gesunder Blutspender präpariert wird. Weitergezüchtet werden nur die Hybridome, die mit humanem IgG, nicht aber mit humanen Immunglobulinen der Isotypen IgM, IgA, IgD und IgE reagieren. Die Bindung des Antikörpers erfolgt dabei an eine gamma-kettenspezifische Determinante des IgG. Auf die geschilderte Weise wird ein Hybridom selektioniert, das die wertvolle Eigenschaft hat, Antikörper zu produzieren, die spezifisch mit humanem IgG reagieren. Das Hybridom wird kloniert und rekloniert, wodurch ein Subklon erhalten wird, der stabil und mit guter Ausbeute den entsprechenden monokionalen Antikörper sezerniert. Die so klonierten und stabilisierten Hybridome erhalten die Bezeichnung

H-BL-IgG, speziell H-BL-lgG/1. ,.

Das Hybridom H-BL-IgGA kann nach an sich bekannten Verfahren eingefroren werden und auf flüssigem Stickstoff gelagert werden. Zur Herstellung des Antikörpers BL-IgGA wird das Hybridom H-BL-IgGZ₁ in einem Kulturmedium mit Serumzusatz in Massenkultur aufgezogen. Nach entsprechender Kultivierung in CCVhaltiger Atmosphäre wird das nunmehr antikörperenthaltende Kulturmedium mit 50% gesättigtem (NH₄J₂SO₄ versetzt und eine Gammagiobulinfraktion erhalten.

Weitere Reinigung des Antikörpers ist nach an sich bekannten Verfahren wie Gelfiltration, lonenaustauschchromatographie

o. dgl. möglich. Der derart erzeugte monoklonale Antikörper BL-IgGZ₁ gehört der IgG-Klasse an und kann lyophilisiert werden.

Es ist zweckmäßig, als Kulturmedium MEM Eagle, Dulbeccos MEM, RPMI ο. dgl. anzuwenden. Besonders günstig ist die Verwendung von RPMI-1640, das in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung mit 1OmM HEPES, 5 · 10~⁵M Mercaptoethanol, lOOmgZI Centamycin versetzt ist.

Als Serumzusatz dient fetales Kälberserum oder Pferdenormalserum mit einem Anteil am Kulturmedium von 5 bis 20%.

Vorteilhaft ist es, mit einem Serumanteil von 10% zu arbeiten. Die Temperatur des Kulturmediums liegt zwischen 35⁰C und 38°C.

Vorteilhaft ist es, bei 37⁰C zu arbeiten.

Der CCVGehalt der Atmosphäre über dem Kulturmedium beträgt günstig 2 bis 10%, insbesondere 5%. Vorteilhaft ist eine hohe Luftfeuchtigkeit, die bis zur Sättigung der Atmosphäre reichen sollte.

Die Kultivierung des Hybridoms erfolgt über einen üblichen Zeitraum von mehreren Tagen. Zweckmäßig ist eine Kultivierung von 3 bis 4 Tagen. Anschließend ist ein teilweiser Kulturmedium-wechsel notwendig. Dabei ist erneut die optimale Zelldichte einzustellen.

In einer zweiten Ausführungsform der Erfindung wird das Hybridom H-BL-IgGZ₁ in histokompatible A χ Balb/C-FrMäuse i.p. injiziert. Es ist vorteilhaft, wenn die eingesetzten Mäuse mit einem Tumorstimulator wie Paraffinum subliquidum, Pristan o.dgl. vorbehandelt worden sind. — Nach der Aszitesbildung, die durch Anschwellen sichtbar wird, wird die den monoklonalen Antikörper BL-IgGZ₁ enthaltende Aszitesflüssigkeit entnommen, z. B. durch Punktion. Aus der Aszitesflüssigkeit werden die zellulären Bestandteile abgetrennt, z. B. durch Zentrifugieren. Der zelluläre Anteil besteht zum überwiegenden Teil aus Zellen des Hybridoms H-BL-IgGZ₁. Es wird zweckmäßigerweise mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und kann erneut injiziert werden. Der klare Überstand, der den monoklonalen Antikörper BL-IgGZ₁ enthält, wird entweder direkt bzw. in geeigneter Verdünnung eingesetzt oder weiterer Reinigung unterzogen. Zur weiteren Reinigung kommen Verfahren wie DEAE-lonenaustauschromatographie, Protein-A-Adsorption, Affinitätschromatographie o.dgl. in Frage, die den Isotyp des BL-IgGZi (IgG) spezifisch anreichern, oder Verfahren der Immunadsorption, die den Antikörper BL-IgGZ₁ antigenspezifisch isolieren. Die Aszitesflüssigkeit enthält bei erfindungsgemäßer Verfahrensdurchführung 5 bis 10mg BL-IgGZi pro ml Flüssigkeit. Anreicherung führt zu einem Produkt mit einem Antikörpergehalt von ca. 20 mg/ml.

Zum Herstellen einer stabilen Aufbewahrungsform, die auch als Handelspräparat geeignet ist, wird die Immunglobulinfraktion der zellfreien Assitesflüssigkeit präzipitiert, z.B. mit 50% gesättigter (NH₄)₂SO4-Lösung und in gepufferter physiologischer Kochsalzlösung aufgenommen. Dialysieren gegen NH₄HCC>3-Lösung führt zu einem lyophilisierbaren Produkt, das lyophilisiert bei +4X haltbar ist. Der so hergestellte monoklonale Antikörper weist das in Tabelle 1 dokumentierte Bindungsmuster mit humanen Immunglobulinen auf

Die Erfindung soll nachstehend an 2 Ausführungsbeispielen näher erläutert werden.

1. Ausführungsbeispiel

Auf flüssigem Stickstoff gelagerte Hybridomzellen H-BL-IgGZ₁ werden aufgetaut und zweimal mit Kulturmedium gewaschen. Die Zelldichte wird auf 1-5 χ 10⁵ Zellen pro ml Kulturmedium eingestellt und in geeigneten Gewebekulturflaschen kultiviert. Das Kulturmedium besteht aus RPMI-1640, welches mit Natriumhydrogenkarbonat (2gZI), Mercaptoethanol (5 χ 10"⁵M), Gentamycin (lOOmgZI) und N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-ethansuifonsäure (1OmM) ergänzt wird. Dieses Medium wird mit

a) fetalem Kälberserum oder

b) Pferdenormalserum

supplementiert. Die möglichen Anteile sind 5 bis 20%. Als geeignet hat sich 10% Serumanteil erwiesen.

Die günstigsten Kulturbedingungen werden erreicht, wenn die Zellen bei +37⁰C in einer wassergesättigten 5%igen CO₂-Atmosphäre bebrütet werden.

Nach 3 bis 4 Tagen werden die Zellkulturüberstände steril entnommen. Die z.T. an der Gefäßwand anhaftenden Zellen können erneut mit frischem Medium versorgt und bebrütet werden. Dabei ist jedoch auf die optimale Zelldichte zu achten. Die im Kulturüberstand enthaltenen Hybridzellen werden durch Zentrifugation abgetrennt. Sie können zu Aussaat in neue Kulturgefäße verwendet werden.

Die zellfreien Kulturbestände enthalten die monoklonalen'Antikörper BL-IgGZ₁. Die Konzentration des Antikörpers BL-IgGZi ist ausreichend für diagnostische Nachweisverfahren von Human-IgG (wie z. B. enzymimmunologische Nachweise, Radiobindungstechniken).

Gegebenenfalls kann der Titer mit einer geeigneten Technik (z.B. indirekte Radiobindungstechnik) bestimmt werden. Hochtitrige Kulturiiberstände gestatten eine Verdünnung bis zur gewünschten Arbeitskonzentration.

Werden höhere Konzentrationen des Antikörpers benötigt, so werden die Kulturüberstände mit 50% gesättigtem Ammoniumsulfat gefällt. Die so erhaltene Gammaglobuiinfraktion kann durch weitere bekannte Trenntechniken (lonenaustauschchromatographie, Gelfiltration usw.) weitergereinigt werden.

Werden hochgereinigte monoklonale Antikörper benötigt, so können diese durch Immunadsorption an trägerfixierte Anti-Mausimmungiobulinantikörper von den aus Kälberserum bzw. Pferdeserum stammenden Begleitproteinen abgetrennt werden und durch schonend wirkende Desorbentien (3M KSCN oder GlycinZHCL-Puffer pH 2.8) von diesem Immunadsorbens wieder isoliert werden.

2. Ausführungsbeispiel

Eingesetzt werden Zellen des Hybridoms H-BL-IgGZi, die gegebenenfalls in vitro vorkultiviert werden. Nach Waschen in serumfreier physiologischer Kochsalzlösung werden 10⁵ bis 5 · 10⁷ lebende Zellen histokompatiblen Mäusen intraperiteneal injiziert. Als histokompatible Mäuse werden F_rHybride der Stämme A und BaIbZc eingesetzt, die mit einem Tumorstimulator, hier mit 0,5 ml Paraffinum subliquidum i. p. 2 Wochen vor der Hybridominjektion behandelt worden sind.

Nach dem Einsetzen der Aszitesbildung werden die Mäuse punktiert. Die abgenommenen Aszitesflüssigkeiten, die den monoklonalen Antikörper BL-IgGZ₁ enthalten, werden durch Zentrifugieren in zelluläre Bestandteile und in Aszitesflüssigkeit getrennt.

Der zellul&re Anteil besteht zum überwiegenden Anteil aus Zellen des Hybridoms H-BL-IgGZv Diese Hybridomzellen werden mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und wie oben beschrieben eingesetzt, indem sie histokompatiblen Mäusen i.p.

injiziert werden. Solche Passagen sind wiederholt möglich.

Die Immunglobulinfraktion der zellfreien Aszitesflüssigkeit wird mit 50% gesättigtem (NH₄J₂SO₄ präzipitiert und in gepufferter physiologischer Kochsalzlösung aufgenommen. Diese Lösung wird gegen 0,5%ige NH₄HCO₃-Lösung dialysiert. Anschließend erfolgt die Lyophilisierung. Der Antikörper BL-IgGZ₁ ist lyophilisiert bei +4⁰C ohne Verlust der Bindungseigenschaften haltbar.

Der Antikörpertiter wird durch Herstellen einer Verdünnungsreihe und Austestung mittels indirekter Radiobindungstechnik bestimmt.

Tabelle 1

Reaktion des monoklonalen Antikörpers BL-IgGZ₁ mit humanem Immunglobulin bzw. deren Polypeptidketten mittels indirekter Radiobindungstechnik.

Zahlenwerte

Antigen

IgG²' IgGW

igG2_Bu lgG2wai

lgM(K)_Loh lgM(\)_Pra

IgD(K)₁ IgD(X)₁, lgE(K)_y4 IgE(X)ND K-Kette⁴¹ ' X-Kette⁴¹

1) Zur Testung des monoklonalen Antikörpers auf seine Reaktion mit den entsprechenden Antigenen wurden die Antikörper in Mikrotiterplatten aus PVC, die mit den entsprechenden Antigenen beschichtet worden waren, inkubiert. Die gebundenen monoklonalen Antikörper wurden dann durch ¹²⁵J-markierte Anti-Mausimmunglobulin-Antikörper nachgewiesen. Der Bindungsindex I entspricht dem Verhältnis der Zählrate des gebundenen Antikörpers BL-IgGA zu der des monoklonalen Antikörpers BL-DNP/II, der als Kontrolle für die unspezifische Bindung dient, nach Entwicklung mit ¹²⁵J-markierten Anti-Mausimmunglobulin-Antikörpern.

l> 10: +++, 10 > l>4: ++,4 > I > 2:+, K 2:-.

2) Humangammaglobulin der Firma SERVA, Heidelberg.

3) Die Indizes geben die Herkunft der Myelomproteine von entsprechenden Patienten an.

4) Standard κ- bzw. λ-Präparationen der Behringwerke AG, Marburg. Mischungen von mehreren Bance-Jones-Proteinen.

Claims (26)

1. Erfindungsanspruch:

   1. Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörperfür humanes IgG, dadurch gekennzeichnet, daß Mäuse mit hummanem IgG immunisiert werden, die Milzlymphozyten der hyperimmunen Mäuse mit Myelomzellen hybridisiert werden, Hybridomzellen H-BL-IgGA selektioniert werden, die selektiönierten Hybridomzellen kultiviert oder in Mäuse injiziert, die Aszitesflüssigkeit gewonnen und der Antikörper BL-IgGZ₁ isoliert wird.
2. 2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß zur Immunisierung 6 bis 8 Wochen alte weibliche Α-Mäuse verwendet werden.
3. 3. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Myelomzellen solche der Linie P3 — X — 63Ag 8653 eingesetzt wurden.
4. 4. Verfahren nach Punkt 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Immunisierung der Mäuse durch eine Reihe von Injektionen mit dem humanen IgG erfolgt.
5. 5. Verfahren nach Punkt 1,2,4, dadurch gekennzeichnet, daß die letzte Immunisierung 4 Tage vor der Isolierung der für die Hybridisierung bestimmten B-Lymphozyten vorgenommen wird.
6. 6. Verfahren nach Punkt 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Verhältnis von Myelomzellen und B-Lymphoblasten,diezur Fusion bestimmt sind, etwa 1:1 beträgt.
7. 7. Verfahren nach Punkt 1,3,6, dadurch gekennzeichnet, daß im Verfahrensschritt der Abtrennung der nicht hybridisierten Myelomzellen von den Hybridzellen das verwendete Kulturmedium Milzzellen von nicht immunisierten A χ BaIbZc-F₁-Hybridmäusen enthält.
8. 8. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Prüfung der Überstände der die aufwachsenden Hybridzellen enthaltenden Kulturen auf die Anwesenheit von Antikörpern, die mit der γ-Kette reagieren, und damit die Auswahl geeigneter Hybridome H-BL-IgG bestimmt, durch indirekte Radiobindungstechnik oder monoklonale PAP-Technik bei Verwendung von IgG, welches aus dem Serum normaler Spender präpariert wird, erfolgt und der Nachweis des Nichtreagierens mit einer Serie von humanen Immunglobulinen der Isotypen IgM, IgA, IgD und IgE geführt wird.
9. 9. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Hybridom H-BL-IgGA selektioniert, kloniert, rekloniert wird und, daß ein Subklon selektioniert wird, der stabil Antikörper BL-IgGZ₁ produziert.
10. 10. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß antikörperproduzierende Hybridomzellen des Hybridoms H-BL-IgGA in einem Kulturmedium in Massenkultur aufgezogen werden, wobei dem Kulturmedium ein Serum zugesetzt wird, nach entsprechender Kultivierung in CO₂-haltiger Atmosphäre das nunmehr antikörperhaltiges Kulturmedium mit 50% gesättigter (NH₄J₂SO₄ versetzt und eine Gammaglobulinfraktion erhalten wird, aus der nach weiterer Aufarbeitung in an sich bekannter Weise der monoklonale Antikörper isoliert wird.
11. 11. Verfahren nach Punkt 1 und 10, dadurch gekennzeichnet, daß als Kulturmedium MEM Eagle, Dulbeccos MEM, RPMIo. dgl. eingesetzt wird.
12. 12. Verfahren nach Punkt 1 und 10 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß als Kulturmedium RPMI-1640 verwendet wird.
13. 13. Verfahren nach Punkt 1 und 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß dem Kulturmedium 1OmM HEPES, 5 · 10"⁵M Mercaptoethanol, 100mg/l Gentamycin zugesetzt werden.
14. 14. Verfahren nach Punkt 1 und 10 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß als Serum fetales Kälberserum oder Pferdenormalserum eingesetzt werden.
15. 15. Verfahren nach Punkt 14, dadurch gekennzeichnet, daß der Anteil des fetalen Kälberserums am Kulturmedium ca. 10%, der des Pferdenormalserums ebenfalls ca. 10% beträgt.
16. 16. Verfahren nach Punkt 1 und 10 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierungstemperatur 25 bis 40°C beträgt.
17. 17. Verfahren nach Punkt 1 und 10 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß bei 37⁰C kultiviert wird.
18. 18. Verfahren nach Punkt 1 und 10 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß der CO₂-Gehalt der Atmosphäre über dem Kulturmedium 2 bis 10% beträgt.
19. 19. Verfahren nach Punkt 1 und 10 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß der CO₂-Gehalt über dem Kulturmedium 5% beträgt.
20. 20. Verfahren nach Punkt 1 und 10 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß über dem Kulturmedium hohe Luftfeuchtigkeit herrscht, die bis zur Sättigung der Atmosphäre mit Wasserdampf reichen kann.
21. 21. Verfahren nach Punkt 1 und 10 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß 3 bis 4 Tage kultiviert wird.
22. 22. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Hybridom BL-IgGZ₁ in histokompatible A χ BALBZc-F₁ Mäuse i. p. injiziert wird, nach der Aszitesbildung die Aszitesflüssigkeit entnommen wird, die zellulären Bestandteile abgetrennt werden, der klare Überstand, der den monoklonalen Antikörper BL-IgGZ₁ enthält, entweder direkt weiterverwendet wird oder Reinigungs- und Anreicherungsoperationen unterzogen wird oder auch Ausfällen der Immunglobuiinfraktion der zellfreien Aszitesflüssigkeit z. B. mit 50% gesättigter (NH₄)₂SGvLösung, Aufnehmen des Präzipitats in gepufferter physiologischer Kochsalzlösung, dialysieren gegen verdünnte NH₄HCO₃-Lösung und anschließende Lyophilisierung in eine dauerhafte Aufbewahrungsform überführt wird.
23. 23. Verfahren nach Punkt 1 und 22, dadurch gekennzeichnet, daß die abgetrennten zellulären Bestandteile, die hauptsächlich aus Zellen des Hybridoms H-BL-IgGZ₁ bestehen, mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und erneut histokompatiblen Mäusen injiziert werden können.
24. 24. Verfahren nach Punkt 1 und 22 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß die verwendeten Mäuse mit einem Tumorstimulator wie Paraffinum subiiquidum, Pristan o. dgl. vorbehandelt werden.
25. 25. Verfahren nach Punkt 1 und 22 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß ein entsprechender Tumorstimulator 3 Tage bis 6 Wochen vor der Hybridominjektion gegeben wird.
26. 26. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß der lyophilisierte Antikörper BL-IgG bei +4⁰C aufbewahrt wird.