DD230881B1 - Verfahren zur herstellung monoklonaler antikoerper gegen die humane lambda-kette - Google Patents

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper, die in der Lage sind, mit der lambdakettenspezifischen Determinante der L-Kette humaner Immunglobuline spezifisch zu reagieren.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Es ist bereits bekannt, spezifische Antiseren für die humane lambda-Kette herzustellen und diese für die qualitative und quantitative Bestimmung von isolierten lambda-Ketten im Harn, Serum oder anderen biologischen Flüssigkeiten, von Immunglobulinen aller Isotypen, die L-Ketten vom lambda-Тур besitzen, sowie für den Nachweis und die Quantifizierung von humanen B-Lymphozyten, die Membranimmunglobulin vom lambda-Тур tragen, zu verwenden. Diese Antiseren sind nur durch eine aufwendige Absorption für die lambda-Kette spezfisch zu machen. Weiterhin haben konventionelle Methoden der Herstellung von Anti-Iambda-Seren die Nachteile, daß die Antikörperzusammensetzung, z. B. hinsichtlich der Affinität der einzelnen Antikörpertypen, von Tier zu Tier, ja von Blutentnahme zu Blutentnahme beim gleichen Serumspender variiert, so daß die Antiseren nicht reproduziert und standardisiert werden können. Für den Nachweis von Membranimmunglobulin vom lambda-Тур auf B-Lymphozyten, was für die Diagnose von lymphatischen Leukämien von Bedeutung ist, kommt noch die störende mögliche Bindung des Immunglobulins der Antiseren an Fc-Rezeptoren von Lymphozyten und Monozyten hinzu. Dieser Nachteil kann zwar durch die aufwendige und kostspielige Präparation von (Fab)₂-Fragmenten eliminiert werden, jedoch ist dieses Verfahren für eine Routineanwendung insgesamt zu teuer.

In der Literatur wird ein mAk mit lambda-Ketten-Spefizität (mAk C4) beschrieben (LOWE et al. Immunology 42,649-659 [1981]).

Dieser mAk reagiert sehr effektiv mit freien lambda-Ketten (Bence-Jones-Proteine), aber deutlich schwächer mit den H-Ketten gebundenen lambda-Ketten (siehe LOWE et al., Tab. 1). Seine Eignung zur quantitativen Bestimmung von löslichem IgG (λ) ist jedoch nachgewiesen (JEFFERIS et al. J. Immunol. Meth. 39,355-362 [1980]). Ob dieser mAk auch zur Bestimmung des Typs des lymphozytenmembrangebundenen Immunglobulins durch indirekte Immunfluoreszenz und Durchflußfluorozytometrie, der heutigen geübten Technik des Nachweises von Zelloberflächenantigenen von Lymphozyten, geeignet ist, geht aus der Publikation nicht hervor.

Bisher sind noch keine monoklonalen Antikörper verfügbar, die gegen die humane lambda-Kette gerichtet sind und sich zur Bestimmung des Typs des lymphozytenmembrangebundenen Immunglobulins eignen.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung hat das Ziel, ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper anzugeben, das in leicht beherrschbarer Weise die kostengünstige Produktion größerer Mengen Antikörper ermöglicht, die in der Lage sind, spezifisch mit humanen lambda-Ketten sowohl in isolierter als auch in H-Ketten-gebundener Form sowie als Bestandteil von zellmembrangebundenem Immunglobulin von B-Lymphozyten zu reagieren.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein nachvollziehbares Verfahren zur Verfügung zu stellen, das in wenigen Verfahrensschritten aus zugänglichen Ausgangskomponenten das gewünschte Endprodukt herzustellen erlaubt. Die angestrebten lambda-Ketten-spezifischen Antikörper sollen von gleichbleibender guter Qualität sein und gute Lagerfähigkeit aufweisen.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß aus dem Harn von Patienten mit Leichtkettenkrankheit, die Bence-Jones-Proteine vom lambda-Тур ausscheiden, lambda-Ketten durch die an sich bekannten Verfahren der Einengung, Aussalzung und Gelchromatographie isoliert werden. Mit solchen lambda-Kettenpräparationen werden Mäuse immunisiert. Vorzugsweise werden 6 bis 8 Wochen alte weibliche Α-Mäuse verwendet. Die Immunisierung erfolgt durch mehrmalige Applikation der humanen lambda-Ketten, wobei die erste Immunisierung als Emulsion des Antigens mit kompletten Freundschen Adjuvans vorgenommen wird. Aus den Milzen derart hyperimmuner Mäuse werden die Lymphozyten in an sich bekannter Weise separiert. Die B-Lymphozyten dieses Zellgemischs werden mit Maus-B-Myelomzellen fusioniert bzw. hydridisiert. Die dazu notwendigen Maus-B-Myelomzellen P 3-X-63 Ag 8.653 (KEARNEY et al., J.Immunol. 123, [1979], 1548) werden in RPMI-1640 mit 10% FKS gezüchtet. In einem Kulturmedium nach LITTLEFIELD (Science 145, [1964], 709) werden die gebildeten Hydride von den nicht fusionierten Myelomzellen abgetrennt und erfindungsgemäß ein Zeilklon selektioniert, der Antikörper der gewünschten Art sezerniert. Die Selektionierung des Hybridoms erfolgt in der Weise, daß die Zellen unmittelbar nach der Fusion in eine Vielzahl von separaten 200-pl-Kulturen aufgeteilt werden. Die Überstände der die aufwachsenden Hybridzellen enthaltenden Kulturen werden auf die Anwesenheit von Antikörpern geprüft, die mit lambda-Ketten reagieren. Die Testung erfolgt zweckmäßigerweise mittels indirekter Radiobindungstechnik oder monoklonaler PAP-Technik. Als Antigen werden lambda-Ketten eingesetzt, die aus dem Urin von Patienten mit Leichtkettenkrankheit (Bence-Jones-Plasmozytom) präpariert werden sowie Myelomproteine der Isotypen IgG, IgM, IgA, IgE und IgD, die lambda-Ketten besitzen. Bei positiver Reaktion werden die entsprechenden Zellklone auch mit humanen Immunglobulinen der Isotypen IgG, IgM, IgA, IgE und IgD, die kappa-Ketten tragen, sowie mit isolierten kappa-Ketten getestet. Nur Hybridome, deren Antikörper nicht mit isolierten oder H-Ketten-gebundenen kappa-Ketten reagieren, werden weitergezogen, wenn notwendig kloniert und besonders produktive Subklone ausgewählt. Die auf die vorstehend geschilderte Weise erhaltenen Hybridome H-BL-lg-\/1-4 sind durch die überraschende und vorteilhafte Eigenschaft charakterisiert. Antikörper zu sezemieren, die spezifisch die humane lambda-Kette erkennen. - Die Hybridome sind in flüssigem Stickstoff konservierbar.

Zur Herstellung der Antikörper wird ein Hybridom aus der Serie H-BL-lg-X/1-4 in einem Kulturmedium mit Serumzusatz in Massenkultur aufgezogen. Nach entsprechender Kultivierung in CO₂-haltiger Atmosphäre wird das nunmehr antikörperenthaltende Kulturmedium mit 50% gesättigtem (NH₄I₂SO₄ versetzt und eine Gammaglobulininfraktion erhalten. Weitere Anreicherung oder Reinigung der Antikörper ist nach an sich bekannten Verfahren, wie Gelfiltration oder lonenaustauschchromatographie, möglich. Die monoklonalen Antikörper zeichnen sich durch eine hohe Stabilität aus. Es ist zweckmäßig, als Kulturmedium MEM Eagle, Dulbeccos MEM, RPMI o. dgl. anzuwenden. Besonders günstig ist die Verwendung von RPMI-1640, das in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung mit 1OmM HEPES, 5 · 10"⁵M Mercaptoethanol, 100mg/1 Gentamycin versetzt ist.

Als Serumzusatz dient fetales Kälberserum oder Pferdenormalserum mit einem Anteil am Kulturmedium von 5 bis 20%. Vorteilhaft ist es, mit einem Serumanteil von 10% zu arbeiten. Die Temperatur des Kulturmediums liegt zwischen 35⁰C und 38°C. Vorteilhaft ist es, bei 37⁰C zu arbeiten.

Der CO₂-Gehalt der Atmosphäre über dem Kulturmedium beträgt günstig 2 bis 10%, insbesondere 5%. Vorteilhaft ist eine hohe Luftfeuchtigkeit, die bis zur Sättigung der Atmosphäre reichen kann.

Die Kultivierung des Hybridoms erfolgt über einen üblichen Zeitraum von mehreren Tagen. Zweckmäßig ist eine Kultivierung von 3 bis 4 Tagen. Danach ist ein teilweiser Mediumwechsel und eine erneute Einstellung der optimalen Zelldichte notwendig. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung werden die Hybridome H-BL-A/1-4 in histokompatible A χ BALB/c-F^Mäuse i. p. injiziert. Es ist vorteilhaft, wenn die eingesetzten Mäuse mit einem Tumorstimulator, wie Paraffinum subliquidum, Pristan o. dgl., vorbehandelt worden sind. - Nach der Aszitesbildung, die durch Anschwellen sichtbar wird, wird die den jeweiligen monoklonalen Antikörper BL-lg-\/1-4 enthaltende Aszitesflüssigkeit entnommen, z. B. durch Punktion. Aus der Aszitesflüssigkeit werden die zellulären Bestandteile abgetrennt, z. B. durch Zentrifugieren. Der zelluläre Anteil besteht zum überwiegenden Teil aus Zellen des jeweiligen Hybridoms H-BL-lg-X/1-4. Es wird zweckmäßigerweise mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und kann erneut injiziert werden. Der klare Überstand, der den jeweiligen monoklonalen Antikörper BL-lg-A/1-4 enthält, wird entweder direkt bzw. in geeigneter Verdünnung eingesetzt oder weiterer Reinigung unterzogen. Zur weiteren Reinigung kommen Verfahren wie DEAE-Ionenaustauschchromatographie, Protein-A-Adsorption, Affinitätschromatographie o. dgl. in Frage, die den Isotyp der monoklonalen Antikörper spezifisch anreichern, oder Verfahren der Immunadsorption, die die Antikörper BL-lg-\/1-4 antigenspezifisch isolieren. Die Aszitesflüssigkeit enthält bei erfindungsgemäßer Verfahrensdurchführung 5 bis 10mg Antikörper pro ml Flüssigkeit. Anreicherung führt zu einem Produkt mit einem Antikörpergehalt von etwa 20mg/ml.

Zum Herstellen einer stabilen Aufbewahrungsform, die auch als Handelspräparat geeignet ist, wird die Immunglobulinfraktion der zellfreien Aszitesflüssigkeit präzipitiert, z. B. mit 50% gesättigter (NH₄)₂SO₄-Lösung und in gepufferter physiologischer Kochsalzlösung aufgenommen. Dialysieren gegen NH^HCOyLosung führt zu einem lyophilisierbaren Produkt, das lyophilisiert bei +4⁰C haltbar ist. Die monoklonalen Antikörper der Serie BL-lg-X/1-4 weisen mit humanen isolierten L-Ketten und Immunglobulinen das in Tabelle 1 sowie mit Blutzellen das in Tabelle 2 dokumentierte Reaktionsmuster auf. Die Bindung wurde mittels indirekter Immunfluoreszenz (ilF) bestimmt. Diese Bindungscharakteristik dokumentiert die hohe Spezifität der monoklonalen Antikörper BL-lg-X/1-4 sowie deren vorzügliche Eignung besonders von λ/З und λ/4 zum Nachweis von membrangebundenem Immunglobulin, was für die Diagnostik von Leukämien von großer Bedeutung ist. Die Erfindung soll nachstehend an einem Ausführungsbeispiel näher erläutert werden.

1. Ausführungsbeispiel

Auf flüssigem Stickstoff gelagerte Hybridomzellen H-BL-lg-A/1-4 werden aufgetaut und zweimal mit Kulturmedium gewaschen. Die Zelldichte wird auf 1-5 χ 10⁵ Zellen pro ml Kulturmedium eingestellt und in geeigneten Gewebekulturflaschen kultiviert.

Das Kulturmedium besteht aus RPMI-1640, welches mit Natriumhydrogenkarbonat (2g/l), Mercaptoethanol (5 · 1O^-5M), Gentamycin (lOOmg/l) und N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-ethansulfonsäure (1OmM) ergänzt wird.

Dieses Medium wird mit

a) fetalem Kälberserum oder

b) Pferdenormalserum

supplemented. Die möglichen Anteile sind 5 bis 20%. Als geeignet hat sich 10% Serumanteil erwiesen.

Die günstigsten Kulturbedingungen werden erreicht, wenn die Zellen bei +37⁰C in einer wassergesättigten 5%igen CCb-Atmosphäre bebrütet werden.

Nach 3 bis 4 Tagen werden die Zellkulturüberstände steril entnommen. Die z.T. an der Gefäßwand anhaftenden Zellen können erneut mit frischem Medium versorgt und bebrütet werden. Dabei ist jedoch auf die optimale Zelldichte zu achten. Die im Kulturüberstand enthaltenen Hybridzellen werden durch Zentrifugation abgetrennt. Sie können zur Aussaat in neue Kulturgefäße verwendet werden.

Die zellfreien Kulturüberstände enthalten den jeweiligen monoklonalen Antikörper BL-lg-\/1-4. Die Konzentration des Antikörpers ist ausreichend für die üblichen diagnostischen Nachweisverfahren von lambda-kettentragenden B-Lymphozyten (wie z. B. indirekte Immunfluoreszenz, enzymimmunologische Nachweise, Radiobindungstechniken). Gegebenenfalls kann der Titer mit einer geeigneten Technik (z. B. indirekte Radiobestimmungstechnik und Immunfluoreszenz) bestimmt werden.

Hochtitrige Kulturüberstände gestatten eine Verdünnung bis zur gewünschten Arbeitskonzentration.

Werden höhere Konzentrationen des Antikörpers benötigt, so werden die Kulturüberstände mit 50% gesättigtem Ammoniumsulfat gefällt. Die so erhaltene Gammaglobulinfraktion kann durch weitere bekannte Trenntechniken (lonenaustauschchromatographie, Gelfiltration usw.) weitergereinigt werden.

Werden hochgereinigte monoklonale Antikörper benötigt, so können diese durch Immunadsorption an trägerfixierte Anti-Mausimmungiobulinantikörper von den aus Kälberserum bzw. Pferdeserum stammenden Begleitproteinen abgetrennt werden und durch schonend wirkende Desorbentien (3M KSCN oder Glycin/HCI-Puffer pH 2,8) von diesem Immunadsorbens wieder isoliert werden.

2. Ausführungsbeispiel

Zellen eines der Hybridome H-BL-lg-λ/1-4 werden wie im Beispiel 1 kultiviert und vermehrt. Nach dem Erreichen einer ausreichend großen Zellzahl werden die Hybridomzellen geerntet und mehrmals mit serumfreiem Zellzuchtmedium gewaschen.

Anschließend werden die Hybridomzellen in einer Dichte von 2-5 χ 10^е Zellen pro 1 ml in einem serumfreien Zellzuchtmedium, wie zum Beispiel RPMI-1640, welches mit Natriumhydrogenkarbonat (2g/l), Mercaptoethanol (5 1O^-5), Gentamycin (100 mg/l) und N^-Hydroxyethylpiperazin-N'-ethansulfonsäure (1OmM) ergänzt wird, kultiviert.

Die günstigsten Kulturbedingungen werden erreicht, wenn die Zellen bei +37⁰C in einer 5%igen CO₂-Atmosphäre bebrütet werden.

Die Inkubation dauert 12-24 Stunden.

Der zellfreie Kulturüberstand enthält den monoklonalen Antikörper des jeweiligen Hybridoms H—BL-lg-\/1—4 ohne Verunreinigungen von Serumproteinen, die sonst als Mediumzusatz verwendet werden.

Die monoklonalen Antikörper können durch DEAE-Ionenaustauschchromatographie oder Protein-A-Adsorption und dgl. mehr konzentriert werden, wenn dies erforderlich ist.

3. Ausführungsbeispiel

Eingesetzt werden Zellen eines Hybridoms der Serie H-BL-Ig-Ay 1-4, die gegebenenfalls in vitro vorkultiviert werden. Nach Waschen in serumfreier physiologischer Kochsalzlösung werden 10^s bis 5 · 10⁷ lebende Zellen histokompatiblen Mäusen intraperitoneal injiziert. Als histokompatible Mäuse werden Fi-Hybride der Stämme A und BALB/c eingesetzt, die mit einem Tumorstimulator, hier mit 0,5ml Paraffinum subliquidum, i. p. 2 Wochen vor der Hybridominjektion behandelt worden sind. Nach dem Einsetzen der Aszitesbildung werden die Mäuse punktiert. Die abgenommenen Aszitesflüssigkeiten, die den - jeweiligen monoklonalen Antikörper der Serie BL-lg-X/1-4 enthalten, werden durch Zentrifugieren in zelluläre Bestandteile und in Aszitesflüssigkeit getrennt.

Der zelluläre Anteil besteht zum überwiegenden Anteil aus Zeilen des jeweiligen Hybridoms H-BL-lg-\/1-4. Diese Hybridomzellen werden mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und wie oben beschrieben eingesetzt, indem sie histokompatiblen Mäusen i.p. injiziert werden. Solche Passagen sind wiederholt möglich.

Die Immunglobulinfraktion der zellfreien Aszitesflüssigkeit wird mit 50% gesättigtem (NH₄I₂SO₄ präzipitiert und in gepufferter physiologischer Kochsalzlösung aufgenommen. Diese Lösung wird gegen 0,5%ige NH₄HCO₃-Lösung dialysiert. Anschließend erfolgt die Lyophilisierung. Die Antikörper der Serie BL-Ig-λ/1-4 sind lyophilisiert bei +4⁰C ohne Verlust der Bindungseigenschaften haltbar.

Der Antikörpertiter wird durch Herstellen einer Verdünnungsreihe und Austestung mittels indirekter Radiobindungstechnik unter Verwendung von lambda-Ketten, die an Plastoberflächen adsorbiert sind, bestimmt. Die Quantifizierung der daran gebundenen monoklonalen Antikörper BL-lg-A/1-4 erfolgt durch Zugabe eines mit ¹²⁵J-markierten Anti-Mausimmunglobulinantikörpers. Als Titer wird diejenige Verdünnung der BL-lg-λ/Ι—4 angegeben, bei der die Hälfte der maximalen Sättigungsmenge angelagert ist. Für den Einsatz der Antikörper zur Membranimmunglobulinbestimmung wird der Titer mittels indirekter Immunfluoreszenz unter Verwendung frischer humaner Blutlymphozyten und einem geeigneten FITC-marktierten Anti-Mausimmunglobulinserum bestimmt. Als Titer wird diejenige größte Verdünnung angegeben, bei der noch deutlich alle λ-Ketten tragenden B-Lymphozyten markiert werden.

Tabelle 1

Reaktion der monoklonalen Antikörper BL-Ig-λ/1-4 mit humanen L-Ketten und Immunglobulinen

Antigen

λ/1 λ/2 λ/3 λ/4

λ-Standard³¹

ККгв

K-Standard³¹

IgAUh. IgDU)H

lgG(K)_Bud lgM(K)_Uh

IgD(K)₁ igE(K)_Yu

1) Die Bindung der monoklonalen Antikörper BL-lg-λ/Ι bis 4 an die antigenbeladenen Plastoberflächen wurde mittels indirekter Radiobindungstechnik unter Verwendung eines ¹²⁵-J-markierten Anti-Mausimmunglobulin-Antikörpers quantifiziert. Der Bindungsindex I entspricht dem Verhältnis derZählraten bei Inkubation der adsorbierten Antigene mit den monoklonalen Antikörpern BL-lg-\/1-4 oder dem als Kontrolle für die unspezifische Bindung dienenden monoklonalen Antikörper BL-DNP/II und nachfolgender Entwicklung mit ¹²⁵J-markierten Anti-Mausimmunoglobulin-Antikörpern.

2) Die Indizes geben die Herkunft der Proteine von entsprechenden Patienten an.

3) Standard-λ- bzw. -κ-Präparationen der Behringwerke AG. Mischungen mehrerer Bence-Jones-Proteine.

Tabelle 2

Bindung der monoklonalen Antikörper BL-lg-λ/Ι bis 4 an humane lymphoide Blutzellen, nachgewiesen durch indirekte Immunfluoreszenz

Testzellen	λ/1	Markierte Zellen (%)	λ/3	λ/4
	2±3	λ/2	4 + 2	4±3
PBL11	27 ±5	3±2	34 + 8	35 ±9
B-Lymphozyten21	<1	29 ±8	<1	<1
T-Lymphozyten31	0	<1	0	0
Thymozyten	<5	0	<5	<5
B-CLL-PBL41		<5
(K-Typ)	>70		>80	>80
B-CLL-PBL51		>70
(λ-Typ)

^Periphere Blutlymphozyten.

2) Ε-Rosetten negative Lymphozyten.

3) Ε-Rosetten bildende Lymphozyten.

4} PBL von CLL-Patienten mit Membranimmunglobulin vom к-Тур. 5) PBL von CLL-Patienten mit Membranimmunglobulin vom λ-Typ.

Claims (4)

1. Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper gegen die humane lambda-Kette, dadurch gekennzeichnet, daß Mäuse mit humanen lambda-Ketten immunisiert werden, Hybridomzellen der Art H-BL-lg-lambda/1^4 (ZIM 0048-0051) selektiert und daraus die entsprechenden monoklonalen Antikörper in an sich bekannter Weise gewonnen werden.

2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß zur Immunisierung 6 bis 8 Wochen alte weibliche Α-Mäuse verwendet werden.

3. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Myelomzellen solche der Linie P 3-X-63 Ag 8.653 eingesetzt werden.

4. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Prüfung der Überstände der die aufwachsenden Hybridzellen enthaltenden Kulturen auf die Anwesenheit von Antikörpern, die mit der lambda-Kette reagieren und damit die Auswahl geeigneter Hybridome H-BL-lg-λ bestimmt, durch indirekte Radiobindungstechnik oder monoklonale PAP-Technik bei Verwendung von lambda-Ketten, die aus dem Urin von Patienten präpariert werden, sowie von Mycelomproteinen der Isotypen IgG, IgM, IgA, IgE und IgD, die lambda-Ketten besitzen, erfolgt und der Nachweis des Nichtreagierens mit einer Serie von humanen Immunglobulinien der Isotypen IgG, IgM, IgA, IgE und IgD, die kappa-Ketten tragen, sowie isolierter kappa-Ketten geführt wird.