DD230878B1 - Verfahren zur herstellung monoklonaler antikoerper fuer humanes ige - Google Patents

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper, die zur Reaktion mit humanem IgE befähigt sind.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Es ist bereits bekannt, monoklonale Antikörper herzustellen. Zu diesem Zweck werden zunächst durch Fusion antikörperbildender Zellen mit einer permanent wachsenden Plasmozytomlinie Hybridzellen erzeugt, die permanent wachsen und stabil Antikörper sezemieren (Köhler, Milstein, Nature 256, [1975], 495). Diese Prinziplösung hat dazu geführt, daß verschiedene Hybridomlinien hergestellt worden sind, die Antikörper unterschiedlicher Spezifität produzieren. Die Bildung der Antikörper kann dabei in vitro, aber auch in vivo erfolgen. Zum Beispiel sind Antikörper hergestellt worden, die mit verschiedenen humanen Immunglobulinen reagieren. Monoklonale Antikörper gegen humanes IgE sind von der Firma SEROTEC (Großbritannien) im Katalog ausgewiesen. Außer diesem sind jedoch keine Antikörper bekannt, die in der erforderlichen und gewünschten Weise mit humanem IgE reagieren.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung hat das Ziel, ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper, die spezifisch mit Determinanten der schweren Kette des humanen IgE reagieren, anzugeben. Das Verfahren soll in leicht beherrschbarer Weise die kostengünstige Produktion größerer Mengen dieses spezifischen Antikörpers gestatten. Dabei soll gleichbleibende Qualität gewährleistet sein, der Antikörper soll stabil und lagerfähig sein und sich zur Verwendung in einem einfachen und exakten Nachweises für humanes IgE eignen, wobei Kreuzreaktionen mit anderen humanen Immunglobulinisotypen nicht vorkommen sollen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ei η nachvollziehbares Verfahren zur Verfügung zu stellen, in dessen Verlauf zunächst ein Hybridom erzeugt wird, das leicht und unaufwendig handhabbar ist und dessen Kultivierung in technisch und ökonomisch vorteilhafter Weise möglich ist. Unter Verwendung dieses Hybridoms soll ein Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern, die zur spezifischen Reaktion mit humanem IgE befähigt sind, verwirklicht werden.

Die Aufgabe wird dadurch gelöst, daß zunächst nach an sich bekannten Verfahren eine Immunglobulinfraktion aus Seren von Patienten (z. B. den Patienten mit den Abkürzungen Yu und ND), die IgE-Myelomprotein in hoher Konzentration enthalten, isoliert wird. Das kann z. B. durch Aussalzen und lonenaustauschchromatographie geschehen. Aus diesen Immunglobulinfraktionen werden nach dem von Nezlin (Nezlin et al. Immunochem. 10, [1973], 681) beschriebenen Verfahren die Myelomproteine lgE_Yu und IgE(Mo isoliert, mit denen erfindungsgemäß Mäuse immunisiert werden. Vorzugsweise werden 6 bis 8 Wochen alte weibliche Α-Mäuse verwendet. Die Immunisierung erfolgt durch mehrmalige Applikation des Myelomproteins lgE_Yu (jeweils lOCVg/Maus), wobei die erste Antigengabe mit komplettem Freundschem Adjuvans erfolgt. Vier Tage vorder Entnahme der Milzen für die Fusion wird mit dem Myelomprotein lgE_ND eine Boosterung durchgeführt. Aus den Milzen derart hyperimmuner Mäuse werden die Lymphozyten in an sich bekannter Weise separiert. Die B-Lymphozyten dieses Zellgemisches wurden mit Maus-B-Myelomzellen fusioniert bzw. hybridisiert. Die notwendigen Maus-B-Myelomzellen P3-X-63 Ag 8.653 (KEARNEY et al., J. Immunol. 123, [1979], 1548) werden in RPMI-1640 mit 10% fetalem Kälberserum (FKS) gezüchtet. In einem Kulturmedium, welches Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin enthält (Littlefield, Sciences, 165, [1964], 709) werden die gebildeten Hybride von den nicht fusionierten Myelomzellen abgetrennt und erfindungsgemäß ein Zellklon selektioniert, der Antikörper der gewünschten Art sezemiert. Die Selektionierung des Hybridoms erfolgt in der Weise, daß die Zellen unmittelbar nach der Fusion in eine Vielzahl von separaten 200-/xl-Kulturen aufgeteilt werden. Die Überstände der die aufwachsenden Hybridzellen enthaltenden Kulturen werden auf die Anwesenheit von Antikörpern geprüft, die mit dem Myelomprotein IgEy₁, reagieren. Die Testung erfolgt zweckmäßigerweise mittels indirekter Radiobindungstechnik oder monoklonaler PAP-Technik. Dazu wird das Protein adsorptiv an Polyvinylchloridmikrotiterplatten gebunden, unspezifische Restbindungsstellen mit 2% fetalem Kälberserum geblockt und mit den Hybridzellkulturüberständen inkubiert.

Spezifisch an das IgEy₁, gebundene Hybridomantikörperwerden durch ¹²⁵J-markierte Anti-Mausimmunglobulin-Antikörperoder durch einen monoklonalen PAP-Komplex nachgewiesen. Die antikörperenthaltenden Kulturen werden dann in gleicher Weise mitlmmunglobulinpräparationen der Klassen IgGJgM, IgD und IgA getestet. Hybridomkulturen, die mit allen anderen humanen Immunglobulinklassen nicht reagieren, jedoch deutlich das Myelomprotein lgEy_u binden, werden auf ihre Bindungsfähigkeit an das Myelomprotein lgE_ND getestet. Hybridomkulturen, die Antikörper enthalten, die außer lgE_Yu und ІдЕмо binden, werden mit einem Hemmtest weiter charakterisiert. Hierzu wird versucht, die Bindung der Hybridomantikörper an PVC-adsorbiertes lgE_Yu durch verschiedene Konzentrationen von lgEy_u, IgE^o« Human-lgE-haltige Standardseren der Firmen Pharmacia (Schweden) und BehringwerkeAG (BRD) sowie eine Palette von Humanimmunglobulinen der Klassen IgG, IgM, IgD und IgA zu hemmen. Auf die geschilderte Weise wird eine Serie von Hybridomen (H-BL-lgE/1—4) erhalten, die die wertvolle Eigenschaft haben, Antikörper zu sezernieren, die nicht nur mit den Immunogenen lgE_Yu und lgE_N0' sondern überraschenderweise auch spezifisch mit normalem Human-lgE reagieren. Die Hybridome der Serie H-BL-lgE/1—4 sind sehr produktiv. Des weiteren sind sie gut zu handhaben und können über längere Zeit aufbewahrt werden. — Die durch die vorstehend beschriebene Selektion erhaltenen Hybridome werden rekloniert und Subklone werden erhalten, die stabil die gewünschten Antikörper produzieren.

Zur Herstellung der Antikörper der Serie BL-lgE/1-4, im folgenden kurz als BL-IgE bezeichnet, wird das entsprechende Hybridom in histokompatible A χ BALB/c-F, Mäuse i.p. injiziert. Es ist vorteilhaft, wenn die eingesetzten Mäuse mit einem Tumorstimulator wie Paraffinum subliquidum, Pristan o. dgl. vorbehandelt worden sind. — Nach der Aszitesbildung, die durch Anschwellen sichtbar wird, wird die den monoklonalen Antikörper BL-IgE enthaltende Aszitesflüssigkeit entnommene. B. durch Punktion. Aus der Aszitesflüssigkeit werden die zellulären Bestandteile abgetrennt, z. B. durch Zentrifugieren. Der zelluläre Anteil besteht zum überwiegenden Teil aus Zellen des Hybridoms H-BL-IgE. Er wird zweckmäßigerweise mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und kann erneut injiziert werden. Der klare Überstand, der den monoklonalen Antikörper BL-IgE enthält, wird entweder direkt bzw. in geeigneter Verdünnung eingesetzt oder weiterer Reinigung unterzogen. Zur weiteren Reinigung kommen Verfahren wie DEAE-Ionenaustauschchromatographie, Protein-A-Adsorption, Affinitätschromatographie o.dgl. in Frage, die den Isotyp das BL-IgE spezifisch anreichern, oder Verfahren der Immunadsorption, die den Antikörper BL-IgE antigenspezifisch isolieren. Die Aszitesflüssigkeit enthält bei erfindungsgemäßer Verfahrensdurchführung 5 bis 10mg BL-IgE pro ml Flüssigkeit. Anreicherung führt zu einem Produkt mit einem Antikörpergeh a It von ca. 20 mg/ml.

Zum Herstellen einer stabilen Aufbewahrungsform, die auch als Handelspräparat geeignet ist, wird die Immunglobulinfraktion der zellfreien Aszitesflüssigkeit präzipitiert, z. B. mit 50% gesättigter (NH₄)₂SO₄-Lösung und in gepufferter physiologischer Kochsalzlösung aufgenommen. Dialysieren gegen NH₄HCO₃-Lösung führt zu einem lyophilisierbaren Produkt, das lyophilisiert bei +4°C haltbar ist.

In einer zweiten Ausführungsform der Erfindung werden die jeweiligen Hybridome aus der Serie H-BL-lgE/1-4 in einem Kulturmedium mit Serumzusatz in Massenkultur aufgezogen. Nach entsprechender Kultivierung in CO₂-haltiger Atmosphäre wird das nunmehr antikörperenthaltende Kulturmedium mit 50% gesättigtem (NH₄J₂SO₄ versetzt und eine Gammaglobulinfraktion erhalten. Weitere Reinigung des Antikörpers ist nach an sich bekannten Verfahren wie Gelfiltration, lonenaustauschchromatographie o.dgl. möglich. Es ist zweckmäßig, als Kulturmedium MEM Eagle, Dulbeccos MEM, RPMI o.dgl. anzuwenden. Besonders günstig ist die Verwendung von RPMI-1640, das in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung mit 1OmM HEPES, 5 · 1O^-5M Mercaptoethanol, 100mg/l Gentamycin versetzt ist. Als Serumzusatz dient fetales Kälberserum oder Pferdenormalserum mit einem Anteil am Kulturmedium von 5 bis 20%. Vorteilhaft ist es, mit einem Serumanteil von 10% zu arbeiten. Die Temperatur des Kulturmediums liegt zwischen 25°C und 40⁰C, insbesondere zwischen 35°C und 38°C. Vorteilhaft ist es, bei 37°C zu arbeiten. Der CO₂-Gehalt der Atmosphäre über dem Kulturmedium beträgt günstig 2 bis 10%, insbesondere 5%. Vorteilhaft ist eine hohe Luftfeuchtigkeit, die bis zur Sättigung der Atmosphäre reichen kann. Die Kultivierung des Hybridoms erfolgt über einen üblichen Zeitraum von mehreren Tagen.

1. Ausführungsbeispiel

Auf flüssigem Stickstoff gelagerte Hybridomzellen (H-BL-lgE/1-4) werden aufgetaut und zweimal mit Kulturmedium gewaschen. Die Zelldichte wird auf 1-5 χ 10⁵ Zellen pro ml Kulturmedium eingestellt und in geeigneten Gewebekulturflaschen kultiviert. Das Kulturmedium besteht aus RPM11640, welches mit Natriumhydrogenkarbonat (2g/l), Mercaptoethanol (5 · 10"⁵M), Gentamycin (ЮОтд/І) und N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-ethansulfonsäure (lOmM)ergänzt wird.

Dieses Medium wird mit

a) fetalem Kälberserum oder

b) Pferdenormalserum

supplementiert. Die möglichen Anteile sind 5 bis 20%. Als geeignet hat sich 10% Serumanteil erwiesen.

Die günstigsten Kulturbedingungen werden erreicht, wenn die Zellen bei +37⁰C in einer wassergesättigten 5%igen CO₂-Atmosphäre bebrütet werden.

Nach 3-4Tagen werden die Zellkulturüberstände steril entnommen. Die z.T. an der Gefäßwand anhaftenden Zellen können erneut mit frischem Medium versorgt und bebrütet werden. Dabei ist jedoch auf die optimale Zelldichte zu achten. Die im Kulturüberstand enthaltenen Hybridzellen werden durch Zentrifugation abgetrennt. Sie können zur Aussaat in neue Kulturgefäße verwendet werden.

Die zellfreien Kulturüberstände enthalten den monoklonalen Antikörper BL-IgE. Die Konzentration des Antikörpers BL-IgE ist ausreichend für die üblichen diagnostischen Nachweisverfahren von Human-lgE (wie z. B. enzymimmunologische Nachweise, Radiobindungstechniken).

Gegebenenfalls kann der Titer mit einer geeigneten Technik bestimmt werden. Hochtitrige Kulturüberstände gestatten eine Verdünnung bis zur gewünschten Arbeitskonzentration.

Werden höhere Konzentrationen des Antikörpers benötigt, so werden die Kulturüberstände mit 50% gesättigtem Ammoniumsulfat gefällt. Die so erhaltene Gammaglobulinfraktion kann durch weitere bekannte Trenntechniken (lonenaustauschchromatographie, Gelfiltration usw.) weitergereinigt werden.

Werden hochgereinigte monoklonale Antikörper benötigt, so können diese durch Immunadsorption an trägerfixierte Anti-Maus-Immunglobulinantikörper von den aus Kälberserum bzw. Pferdeserum stammenden Begleitproteinen abgetrennt werden und durch schonend wirkende Desorbentien (3M KSCN oderGlycin/HCL-PufferpH2,8) von diesem Immunadsorbens wieder isoliert werden.

2. Ausführungsbeispiel

Eingesetzt werden Zellen eines Hybridoms der Serie H-BL-lgE/1—4, die gegebenenfalls in vitro vorkultiviert werden. Nach Waschen in serumfreier physiologischer Kochsalzlösung werden 10⁵ bis 5 · 10⁷ lebende Zellen histokompatiblen Mäusen intraperitoneal injiziert. Als histokompatible Mäuse werden F_rHybride der Stämme A und BALB/c eingesetzt, die mit einem Tumorstimulator, hier mit 0,5ml Paraffinum subliquidum i. p. 2 Wochen vor der Hybridominjektion behandelt worden sind.

Nach dem Einsetzen der Aszitesbildung werden die Mäuse punktiert. Die abgenommenen Aszitesflüssigkeiten, die den monoklonalen Antikörper BL-IgE enthalten, werden durch Zentrifugation in zelluläre Bestandteile und in Aszitesflüssigkeit getrennt. Der zelluläre Anteil besteht zum überwiegenden Anteil aus Zellen des Hybridoms H-BL-IgE. Diese Hybridomzellen werden mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und wie oben beschrieben eingesetzt, indem sie histokompatiblen Mäusen i. p. injiziert werden. Solche Passagen sind wiederholt möglich. Die Immunglobulinfraktion der zellfreien Aszitesflüssigkeit wird mit 50% gesättigtem (NH₄I₂SO₄ präzipitiert und in gepufferter physiologischer Kochsalzlösung aufgenommen. Diese Lösung wird gegen 0,5%ige NH₄HCO₃-Lösung dialysiert. Anschließend erfolgt die Lyophilisierung. Der Antikörper BL-IgE ist lyophilisiert bei +4⁰C ohne Verlust der Bindungseigenschaften haltbar. Der Antikörpertiter wird durch Herstellen einer Verdünnungsreihe und Austestung mittels indirekter Radiobindungstechnik unter Verwendung von PVC-Mikrotiterplatten, die mit einem IgE-Myelomprotein beschichtet sind, ermittelt. Als Titer wird diejenige größte Verdünnung des monoklonalen Antikörpers angegeben, bei der 50% der radiomarkierten Anti-Mausimmunglobulin-Antikörper, die bei maximaler Bindung angelagert sind, gebunden werden.

Die monoklonalen Antikörper der Serie BL-lgE/1 —4 haben die überraschende Eigenschaft, epsilonkettenspezifische Determinanten von normalem humanem IgE zu erkennen. Daraus ergeben- sich günstige diagnostische und therapeutische Möglichkeiten. Die Antikörper selbst sind unkompliziert zu handhaben, gut lagerfähig und in größeren Mengen herstellbar.

Durch das angegebene Verfahren zu ihrer Herstellung wird einem seit langem bestehenden gesellschaftlichen Bedürfnis entsprochen.

Die Hybridome H-BL-lgE/1-4 sind an der Sektion Biowissenschaften der Karl-Marx-Universität Leipzig zugänglich. Die produzierten monoklonalen Antikörper BL-lgE/1-4 haben folgende Registriernummern im Zentralen Institut für Molekularbiologie erhalten:

BL-lgE/1 = DDR 0052 (IgG 1, hochaffin)

BL-lgE/2 = DDR 0053 (IgG 2 a)

BL-lgE/3 = DDR 0094 (IgG 2 b)

BL-lgE/4 = DDR 0095 (IgG 1, niederaffin).

Der monoklonale Antikörper BL-lgE/1 eignet sich besonders für den Nachweis von allergenspezifischem IgE aus Patientenserum.

Claims (10)

1. Patentansprüche:

   1. Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper für humanes IgE, dadurch gekennzeichnet, daß 6-8 Wochen alte weibliche Α-Mäuse mit humanen IgE-Myelomproteinen immunisiert werden, die Milzlymphozyten der hyperimmunen Mäuse mit Myelomzellen hybridisiert werden, Hybridomzellen der Art H-BL-lgE/1^selektioniert werden, dieselektionierten Hybridomzeüen in vivo oder in vitro kultiviert werden und die jeweiligen Antikörper isoliert werden.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Myelomzellen solche der Linie P3-X-63 Ag8.653 eingesetzt werden.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Immunisierung der Mäuse durch eine Reihe von Injektionen mit dem humanen Myelomprotein lgE_Yu erfolgt.
4. 4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die letzte Immunisierung 4 Tage vor der Isolierung der für die Hybridisierung bestimmten B-Lymphozyten mit einem anderen humanen IgE-Myelom protein, wie z.B. lgE_N0- vorgenommen wird.
5. 5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Verhältnis von Myelomzellen und B-Lymphoblasten, die zur Fusion bestimmt sind, etwa 1:1 beträgt.
6. 6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß im Verfahrensschritt der Abtrennung der nicht hybridisierten Myelomzellen von den Hybridzellen das verwendete Kulturmedium Milzzellen von nicht immunisierten A χ BALB/c-F,-Hybridmäusen enthält.
7. 7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Prüfung der Überstände der die aufwachsenden Hybridzellen enthaltenden Kulturen auf ihre Reaktion mit humanem IgE mitderindirekten Radiobindungstechnikoderder monoklonalen PAP-Technik bei Verwendung von IgE-Myelomproteinen und normalem IgE erfolgt und der Nachweis des Nichtreagierens mit einer Serie von humanen Immunglobulinen der Isotypen IgG, IgM, IgA und IgD geführt wird.
8. 8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß antikörperproduzierende Hybridomzellen der Hybridomserie H-BL-lgE/1—4 in einem Kulturmedium in Massenkultur aufgezogen werden, wobei dem Kulturmedium ein Serum zugesetzt wird, nach entsprechender Kultivierung in СОг-haltiger Atmopshäredas nunmehr antikörperhaltige Kulturmedium mit 50% gesättigtem (NH₄J₂SO₄ versetzt und eine Gammaglobulinfraktion erhalten wird, aus der nach weiterer Aufarbeitung in an sich bekannter Weise der monoklonale Antikörper isoliert wird.
9. 9. Verfahren nach Anspruch 1 und 8, dadurch gekennzeichnet, daß als Serum fetales Kälberserum oder Pferdenormalserum eingesetzt werden.
10. 10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Anteil des fetalen Kälberserums am Kulturmedium ca. 10%, der des Pferdenormalserums ebenfalls ca. 10% beträgt.