DD236113A1

DD236113A1 - Verfahren zur herstellung von 5-bormsalizyl-4'-chloranilid-o-glykosiden

Info

Publication number: DD236113A1
Authority: DD
Publication date: 1986-05-28

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikoerper fuer die Humane Sekretorische Komponente. Es ist das Ziel, ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikoerper anzugeben, das in leicht beherrschbarer Weise die kostenguenstige Produktion groesserer Mengen spezifischer Antikoerper fuer die HSC gestattet. Die Aufgabe wird darin gesehen, zunaechst eine Serie von Hybridomen zu selektieren, die die entsprechenden Antikoerper produzieren koennen. Unter Verwendung dieser Hybridome sollen die entsprechenden Antikoerper in technisch einfacher Weise herstellbar sein. Die Aufgabe wird geloest durch die Selektierung, Klonierung, Reklonierung und Subklongewinnung der Hybridome H-BL-HSC/1-3 und deren Kultivierung in vitro oder in vivo.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper, die die Humane Sekretorische Komponente (HSC) sowohl als frei vorliegendes Molekül als auch im gebundenen Zustand zu binden vermögen.

-2- 749 88 Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Die Sekretorische Komponente ist ein Protein, welches in den Schleimhautsekreten und in verschiedenen sezernierten Körperflüssigkeiten vorkommt. Insbesondere als Bestandteil des sekretorischen IgA kommt ihr große biologische Bedeutung zu, indem sie den transepithelialen Transport ermöglicht. Zur Ermittlung der Konzentration der HSC sowie zum qualitativen Nachweis dieses Proteins (z. B. in Gewebeschnitten) sind spezifische Antiseren gegen die HSC erforderlich. Solche Antiseren, die auf konventionellen Wegen erzeugt wurden, sind bekannt. Ihre hauptsächlichen Nachteille bestehen darin, daß solche Seren nicht unerschöpflich sind und sich einer Standardisierbarkeit entziehen, da ein identisches Antiserum zu produzieren in verschiedenen Tieren aufgrund der Heterogenität der Immunantworten nicht möglich ist. Dieser Mangel beeinträchtigt auch quantitative Bestimmungsverfahren, bei denen Antiseren zum Einsatz kommen. Durch monoklonale Antikörper, die Produkt eines Hybridoms sind, können diese Mängel überwunden werden.

Die Herstellung monoklonaler Antikörper ist bereits bekannt. KÖHLER und MILSTEIN (Nature 256, (1975), 295) gelang es, Antikörper produzierende Zellen mit permanent wachsenden Myelomzellen zu fusionieren. Die resultierenden Hybridzellinien wachsen permanent und sezernieren monoklonale Antikörper.

In Anwendung dieser Prinziplösung wurden zahlreiche verschiedene Hybridomlinien hergestellt, welche Antikörper unterschiedlicher Spezifität stabil produzieren. Jedoch sind keine Hybridomlinien bekannt, die in hoher Ausbeute monoklonale Antikörper für die Humane Sekretorische Komponente (HSC) in freier und gebundener Form sezernieren.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung hat das Ziel, ein Verfahren zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers des Typs BL-HSC anzugeben, welches ermöglicht, mit relativ einfachen Mitteln und kostengünstig größeren Mengen eines spezifischen Antikörpers für die HSC zu produzieren. Dabei sollen gleichbleibende Qualität, Stabilität und Lagerfähigkeit des Antikörpers gewährleistet sein. Der monoklonale Antikörper soll sich zur Verwendung in einem exakten und einfachen Nachweistest für die HSC und sekretorisches IgA eignen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zu entwickeln, mit welchem monoklonale Antikörper hergestellt werden können, die spezifisch für die Sekretorische Komponente sind. Das'Verfahren soll reproduzierbar sein und Antikörper hoher Affinität und Spezifität liefern.

Die Aufgabe wird dadurch gelöst, daß die HSC aus menschlicher Kolostralmilch nach an sich bekannten Verfahren präpariert wird, z. B. durch Entfetten des Kolostrums, Fällen der Lipoproteide und des Ig-Anteils, gefolgt von Gelfiltration. Das gewonnene Protein wird erfindungsgemäß dazu genutzt, Mäuse zu immunisieren. Dazu eignen sich vorzugsweise weibliche A/J-Mäuse im Alter von 6 bis 8 Wochen. Immunisiert wird durch mehrmaliges Applizieren des Antigens. Die Milzen der immunisierten Tiere werden gewonnen und nach an sich bekannter Methode zu einer Zellsuspension verarbeitet. Die in der Suspension enthaltenen B-Lymphozyten werden mit Maus-B-Myelomzellen fusioniert bzw. hybridisiert. Letztere gehören der Linie P3-X-63 Ag 8.653 an (KEARNSY et al., J. Immunol. 123, (1979), 1548) und werden in RPMI 1640 mit 10% fetalem Kälberserum (FKS) gezogen. Die fusionierten Zellen werden in einem Selektionsmedium, welches Hypoxanthin,Aminopterin und Thymidin enthält (LITTLEFIELD, Science 145, (1964), 709), von den nicht fusionierten Myelomzellen getrennt. Unter den verbleibenden Hybridzellklonen werden erfindurigsgemäß solche selektiert, die Antikörper sezernieren, welche spezifisch mit der HSC bzw. mit dem die HSC enthaltenden sekretorischen IgA (slgA) reagieren. Die Selektion der Hybridome erfolgt derart, daß die Zellsuspension unmittelbar nach der Fusion in eine Vielzahl von 200μΙ-ΚυΚυΓβη aufgeteilt wird. Die Überstände derjenigen Mikrokulturen, die Hybridome enthalten, werden auf spezifische Antikörperbildung untersucht. Diese Tests werden vorzugsweise als indirekter Radiobindungstest oder mit der monoklonalen PAP-Technik als Enzymimmunassay durchgeführt. Als Antigen wird das zur Immunisierung verwendete Protein oder aus Humankolostrum präpariertes slgA verwendet. Nur solche Hybridzellklone werden weiterkultiviert, die sowohl mit der HSC als auch mit slgA reagieren, hingegen nicht mit den Immunglobulinen der Isotypen IgG, IgM, IgD oder isolierten K- und λ-Ketten. Auf diese Weise werden Hybridome selektiert, die die wertvolle Eigenschaft besitzen, monoklonale Antikörper, die spezifisch an die HSC binden, zu produzieren. Die Hybridome werden kloniert und rekloniert, wodurch Subklone entstehen, die stabil und mit guter Ausbeute den entsprechenden monoklonalen Antikörper sezernieren. Die so Monierten und selektierten Hybridzellklone erhalten die Bezeichnungen H-BL-HSC/1 bis 3. Die Hybridome können nach an sich bekannter Methode eingefroren und auf flüssigem Stickstoff gelagert werden.

Zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers der Serie BL-HSC/1-3 werden die entsprechenden Hybridomzellen in Massenkultur gezogen, wobei ein Kulturmedium mit Serumzusatz zum Einsatz kommt. Nach entsprechender Kultivierung in 5%iger CO₂-Atmosphäre werden die monoklonalen Antikörper, die sich im Kulturmedium befinden, mittels 50% gesättigter (NH₄)₂SO4-Lösung gefällt. Eine weitere Reinigung der erhaltenen Gammaglobulinfraktion ist möglich durch an sich bekannte Verfahren wie Gelfiltration, lonenaustauschchromatografie o.a. Die so erhaltenen monoklonalen Antikörper BL-HSC/1-3 können lyophilisiert werden.

Es empfiehlt sich, als Kulturmedien MEM Eagle, Dulbeccos MEM, RPMI 1640 o. dgl. zu verwenden. Am günstigsten ist der Einsatz von RPMI 1640, das in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung mit 10 mM HEPES, 5 x 10~⁵ Mercaptoethanol, 100 mg/ I Gentamycin versetzt ist. Als Serumzusatz dienen 5 bis 20ml FKS/100ml Medium.

Vorteilhaft ist die Konzentration von 10 ml FKS/100 ml Medium. Die Inkubationstemperatur liegt zwischen 35 und 38°C, am günstigsten erweist sich das Arbeiten bei37°C. Der CO₂-Gehalt der Atmosphäre über dem Kulturmedium beträgt 2-10%, insbesondere 5%. Von Vorteil ist weiter eine hohe relative Luftfeuchtigkeit, die bis zu 100% reichen sollte. Die Kultivierung der Hybridome erstreckt sich über einen üblichen Zeitraum von mehreren Tagen. Eine Kultivierungsdauer von 3-4 Tagen hat sich als günstig erwiesen, nach deren Ablauf ein partieller Kulturmedienwechsel notwendig ist. Dabei ist erneut eine optimale Zelldichte einzustellen.

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Die zweite Ausführungsform der Erfindung beinhaltet das Injizieren der Hybridomzellen H-BL-HSC/1-3 in histokompatible A/J χ BALB/c -F₁-MaUSe. Die Applikation erfolgt intraperitoneal. Für die Aszitesbildung ist es von Vorteil, wenn die Tiere mit einem Tumorstimulator wie Pristan, Paraffinum subliquidum o.a. vorbehandelt werden. Beim Anschwellen des Leibes der Tiere wird denselben die Aszitesflüssigkeit durch Punktion entnommen. Durch Zentrifugation werden die zellulären Bestandteile von der reinen Aszitesflüssigkeit abgetrennt. Der zelluläre Anteil besteht vorwiegend aus Hybridzellen des entsprechenden Klones H-BL-HSC/1 bis 3. Die Zellen können nach Waschen mit PBS erneut injiziert werden. Der Überstand wird von evtl. vorhandenen Öltröpfchen befreit und kann so evtl. direkt bzw. in entsprechender Verdünnung eingesetzt werden oder er wird weiter gereinigt.

Dazu kommen Verfahren wie DEAE-Ionenaustauschchromatografie, Protein-A-Adsorption, Affinitätschromatografie, die den Isotyp des jeweiligen BL-HSC/1 bis 3 spezifisch anreichern, in Betracht. Möglich ist auch die Immunadsorption mit dem Antigen, um den monoklonalen Antikörper BL-HSC/1-3 zu isolieren. Die Aszitesflüssigkeit enthält bei erfindungsgemäßer Verfahrensdurchführung 5-10 mg des jeweiligen monoklonalen Antikörpers BL-HSC/1-3 pro ml Flüssigkeit. Nach Anreicherung erhält man ein Produkt mit einem AK-Gehalt von ca. 20mg/ml.

Zum Herstellen einer stabilen Aufbewahrungsform, die auch als Handelspräparat geeignet ist, fällt man die Gammaglobulinfraktion der zellfreien Aszitesflüssigkeit z. B. mit 50%iger Ammonsulfatlösung aus und nimmt den Niederschlag inPBS/0,02%NaN₃auf.

Nach Dialyse gegen 0,5%ige NH₄HCO₃-Lösung läßt sich die Proteinlösung lyophilisieren und bei +4⁰C aufbewahren. Die monoklonalen Antikörper der Serie BL-HSC/1-3 weisen das in Tabelle 1 dokumentierte Bindungsmuster mit humanen Immunglobulinen und anderen Antigenen auf.

Die Erfindung soll nachstehend an 2 Ausführungsbeispielen erläutert werden:

1. Ausführungsbeispiel

Auf flüssigem Stickstoff gelagerte Hybridomzellen der Serie H-BL-HSC/1-3 werden aufgetaut und zweimal mit Kulturmedium gewaschen. Die Zelldichte wird auf 1-5 x 10⁵ Zellen pro ml Kulturmedium eingestellt und es wird in Gewebekulturflaschen kultiviert.

Das Kulturmedium besteht aus RPMI-1640, welches mit Natriumhydrogenkarbonat (2g/l) und N-2'Hydroxyethylpiperazin-N'-ethansulfonsäure (1OmM), Mercaptoethanol (5 χ 10~^sM) und Gentamycin (100mg/l) ergänzt wird.

Dieses Medium wird mit

a) fetalem Kälberserum oder

b) Pferdenormalserum

supplementiert. Die möglichen Anteil sind 5 bis 20%. Als geeignet hat sich 10% Serumanteil erwiesen. Die günstigsten Kulturbedingungen werden erreicht, wenn die Zellen bei 37°Cin einer wasserdampfgesättigten 5%igen CO₂-Atmosphäre bebrütet werden.

Nach 3-4 Tagen werden die Zellkulturüberstände steril entnommen. Die z.T. an der Gefäßwand anhaftenden Zellen können erneut mit frischem Medium versorgt und bebrütet werden. Dabei ist jedoch auf die optimale Zelldichte zu achten. Die im Kulturüberstand enthaltenen Hybridzellen werden durch Zentrifugation abgetrennt. Sie können zur Aussaat in neue Kulturgefäße verwendet werden.

Die zellfreien Kulturüberstände enthalten den jeweiligen monoklonalen Antikörper der Serie BL-HSC/1-3. Die Konzentration des jeweiligen Antikörpers BL-HSC/1-3 ist ausreichend für diagnostische Nachweisverfahren von HSC bzw. slgA (wie z. B.

enzymimmunologische Nachweise, Radiobindungstechniken).

Gegebenenfalls ist der Titer mit einer geeigneten Technik (z.B. indirekte Radiobindungstechnik) zu bestimmen. Hochtitrige Kulturüberstände gestatten eine Verdünnung bis zur gewünschten Arbeitskonzentration.

Werden höhere Konzentrationen des Antikörpers benötigt, so werden die Kulturüberstände mit 50% gesättigtem Ammoniumsulfat gefällt. Die so erhaltene Gammaglobulinfraktion kann durch weitere bekannte Trenntechniken (lonenaustauschchromatografie. Gelfiltration usw.) weitergereinigt werden.

Werden hochgereinigte monoklonale Antikörper benötigt, so können diese durch Immunadsorption an trägerfixierte Anti-Mausimmunglobulinantikörpervon den aus Kälber- bzw. Pferdeserum stammenden Begleitproteinen abgetrennt werden und durch schonend wirkende Desorbentien (3 M KSCN oder Glycin/HCI-Puffer pH 2,8) von diesem Immunadsorbens wieder isoliert werden.

2. Ausführungsbeispiel

Eingesetzt werden Zellen der Hybridome H-BI-HSC/1-3 die gegebenenfalls in vitro vorkultiviert werden.

Nach Waschen in serumfreier physiologischer Kochsalzlösung werden 10⁵ bis 5 x 10⁷ lebende Zellen histokompatiblen Mäusen injiziert. Die Applikation erfolgt intraperitoneal. Als histokompatible Mäuse werden F_rHybride der Stämme A/J und BALB/c eingesetzt, die mit einem Tumorstimulator, hier mit 0,5ml Paraffinum subliquidum, i.p. 1-2 Wochen vorder Hybridominjektion behandelt worden sind.

Nach dem Einsetzen der Aszitesbildung werden die Mäuse punktiert. Die abgenommenen Aszitesflüssigkeiten, die den jeweiligen monoklonalen Antikörper BL-HSC/1-3 enthalten, werden durch Zentrifugieren in zelluläre Bestandteile und in Aszitesflüssigkeit getrennt.

Der zelluläre Anteil besteht zum überwiegenden Anteil aus Zellen des jeweiligen Hybridoms der Serie H-BL-HSC/1-3. Diese Hybridomzellen werden mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und wie oben beschrieben eingesetzt, indem sie histokompatiblen Mäusen i. p. injiziert werden. Solche Passagen sind wiederholt möglich.

Die Immunglobulinfraktion der zellfreien Aszitesflüssigkeit wird mit 50% gesättigter (NH₄)₂SO₄-Lösung präzipitiert und in gepufferter physiologischer Kochsalzlösung aufgenommen. Diese Lösung wird gegen 0,5%ige NH₄HCO₃-Lösung dialysiert.

Anschließend erfolgt die Lyophilisierung. Die Antikörper der Serie BL-HSC/1-3 sind lyophilisiert bei +4⁰C ohne Verlust der Bindungseigenschaften haltbar.

Der Antikörpertiter wird durch Herstellen einer Verdünnungsreihe und Austestung mittels indirekter Radiobindungstechnik bestimmt.

-4- /43 Bö

Tabelle 1

Reaktion der monoklonalen Antikörper BL-HSC/1-3 mit humanen Immunglobulinen bzw. deren Polypeptidketten sowie mit einigen anderen Proteinen, nachgewiesen mittels indirekter Radiobindungstechnik

Antigen BL-HSC/1

HSC₁ ²¹ HSC₂ HSC₃ HSC₄ slgA₀,_/7 ³⁾

slgA_Koi/2

slgA_Koi/₃ slgA_Koi/4 ¹

I¹¹	BL-HSC/3
BL-HSC/2	+ + + +
+ +	++++
+	++ + +
+	+ +++
+ + + +	+ + + +
+ + +	+ + + +
+ +	+++ +
+ + + +

igA_Ar igA_Hep IgAI Lai IgAI WH IgMz₀ igM_Loh IgM₀

μ-Ketten HGG⁵⁾

\-Ketten_Kir _ _ _

K-Ketten_Krau .

IgEND - - - '

Laktoferrin - + -

HSA⁶¹ - - -

HVS⁷¹ -

RGG⁸¹ - - -

PVC, die mit den entsprechenden Antigenen beschichtet worden waren, inkubiert. Die gebundenen monoklonalen Antikörper wurden dann durch ¹²⁵l-markierte Anti-Mausimmunglobulin-Antikörper nachgewiesen. Der Bindungsindex I entspricht dem Verhältnis der Zählrate des jeweiligen gebundenen Antikörpers der Serie BL-HSC/1—3 zu der mittleren Zählrate der Kontrollen, bei denen der monoklonale Antikörper durch serumhaltiges Medium ersetzt worden war, nach Entwicklung mit ¹²⁵l-markierten Anti-Mausimmunglobulin-Antikörpern.

3-4 : +

2-3 : ±

2 Es handelt sich um 4 verschiedene HSC-Präparate.

3 Es handelt sich um4verschiedeneslgA-Präparateaus Humankolostrum.

4 Die Indizes geben die Herkunft der Myelomproteine von entsprechenden Patienten an.

5 HGG-Präparation der Firma SERVA, Heidelberg.

6 HSA-Präparation des Institutes für Impfstoffe Dessau.

7 Humanvollserum in 5%iger Verdünnung.

8 Rindergammaglobulin, Präparation der Firma SERVA, Heidelberg.

Claims

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Erfindungsanspruch:

1. Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper für die Humane Sekretorische Komponente, dadurch gekennzeichnet, daß Mäuse mit HSC und/oder sekretorischen IgA(slgA) immunisiert werden, Milzlymphozyten der hyperimmunen Mäuse mit Myelomzellen hybridisiert werden, Hybridomzellen der Art H-BL-HSC/1-2 selektiert werden, die selektierten Hybridomzellen kultiviert oder in Mäuse injiziert, die Aszitesflüssigkeit gewonnen und die jeweiligen Antikörper isoliert werden.
2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß zur Immunisierung 6 bis 8 Wochen alte weibliche A/J-Mäuse verwendet werden.
3. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Myelomzellen solche der Linie P3-X-63 Ag 8.653 eingesetzt werden.
4. Verfahren nach Punkt 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Immunisierung der Mäuse durch eine Reihe von Injektionen mit HSC und/oder slgA erfolgt.
5. Verfahren nach Punkt 1,2,4, dadurch gekennzeichnet, daß die letzte Immunisierung 4 Tage vor der Isolierung der für die Hybridisierung bestimmten B-Lymphozyten vorgenommen wird.
6. Verfahren nach Punkt 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Verhältnis von Myelomzellen und B-Lymphoblasten, die zur Fusion bestimmt sind, etwa 1:1 beträgt.
7. Verfahren nach Punkt 1,3, 6, dadurch gekennzeichnet, daß im Verfahrensschritt der Abtrennung der nicht hybridisierten Myelomzellen von den Hybridzellen das verwendete Kulturmedium Milzzellen von nicht immunisierten A/J χ BALB/c- F₁ — Hybridmäusen enthält.
8. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Prüfung der Überstände der die aufwachsenden Hybridzellen enthaltenden Kulturen auf die Anwesenheit von Antikörpern, die mit der HSC reagieren, und die damit die Auswahl geeigneter Hybridome H-BL-HSC bestimmt, durch indirekte Radiobindungstechnik oder monoklonale PAP-Technik bei Verwendung von HSC und slgA, welches aus Kolostrum präpariert wird, erfolgt und der Nachweis des Nichtreagierens mit einer Serie von humanen Immunglobulinen der Isotypen IgG, IgM, IgE und Serum-lgA geführt wird.
9. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß antikörperproduzierende Hybridomzellen der Hybridomserie H-BL-HSC/1-3 in einem Kulturmedium in Massenkultur aufgezogen werden, wobei dem Kulturmedium ein Serum zugesetzt wird nach entsprechender Kultivierung in CO₂ haltiger Atmosphäre das nunmehr antikörperhaltige Kulturmedium mit 50% gesättigter Ammoniumsulfatlösung versetzt und eine Gammaglobulinfraktion erhalten wird, aus der nach weiterer Aufarbeitung in an sich bekannter Weise der monoklonale Antikörper isoliert wird.
10. Verfahren nach Punkt 1 und 9, dadurch gekennzeichnet, daß als Kulturmedium MEM Eagle, Dubleccos MEM, RPMI o. dgl. eingesetzt wird.
11. Verfahren nach Punkt 1 und 9 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß als Kulturmedium RPMI-1640 verwendet wird.
12. Verfahren nach Punkt 1 und 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß dem Kulturmedium 1OmM HEPES, 5 x 10~⁵M Mercaptoethanol, 100 mg/l Gentamycin zugesetzt werden.
13. Verfahren nach Punkt 1 und 9 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß als Serum fetales Kälberserum oder Pferdenormalserum eingesetzt werden.
14. Verfahren nach Punkt 13, dadurch gekennzeichnet, daß der Anteil des fetalen Kälberserums am Kulturmedium ca. 10%, der des Pferdenormalserums ebenfalls ca. 10% beträgt.
15. Verfahren nach Punkt 1 und 9 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierungstemperatur +35 bis +38°C beträgt.
16. Verfahren nach Punkt 1 und 9 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß bei +37⁰C kultiviert wird.
17. Verfahren nach Punkt 1 und 9 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß der CO₂-Gehalt über dem Kulturmedium 5% beträgt.
18. Verfahren nach Punkt 1 und 9 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß über dem Kulturmedium hohe Luftfeuchtigkeit herrscht, die bis zur Sättigung der Atmosphäre mit Wasserdampf reichen kann.
19. Verfahren nach Punkt 1 und 9 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß 3 bis4Tage kultiviert wird.
20. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Hybridome H-BL-HSC/1-3 jeweils einzeln in histokompatible A/J χ BALB/c-F^Mäuse injiziert werden, nach der Aszitesbildung die Aszitesflüssigkeit entnommen wird, die zellulären Bestandteile abgetrennt werden, der klare Überstand, der den entsprechenden monoklonalen Antikörper der Serie BL-HSC/ 1-3 enthält, entweder direkt verwendet wird oder Reinigungs- und Anreicherungsoperationen unterzogen wird oder durch Ausfällen der Immunglobulinfraktion der zellfreien Aszitesflüssigkeit z. B. mit 50% gesättigter (NH^SGvLösung, Aufnehmen des Präzipitats in gepufferter physiologischer Kochsalzlösung, Dialysieren gegen verdünnte NH₄HCO₃-Lösung und anschließende Lyophilisierung in eine dauerhafte Aufbewahrungsform überführt wird.
21. Verfahren nach Punkt 1 und 20, dadurch gekennzeichnet, daß die abgetrennten zellulären Bestandteile, die hauptsächlich aus Zellen des eingesetzten Hybridoms der Serie H-BL-HSC/1-3 bestehen, mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und erneut histokompatiblen Mäusen injiziert werden.
22. Verfahren nach Punkt 1 und 20, dadurch gekennzeichnet, daß die verwendeten Mäuse mit einem Tumorstimulator wie Paraffinum subliquidum, Pristan o. dgl. vorbehandelt werden.
23. Verfahren nach Punkt 1 und 22, dadurch gekennzeichnet, daß ein entsprechenderTumorstimulator3 Tage bis 6 Wochen vor der Hybridominjektion gegeben wird.
24. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß der lyophilisierte Antikörper BL-HSC bei +4°C aufbewahrt wird.