DD259137A1 - Verfahren zur herstellung monoklonaler antikoerper fuer tsh (beta) - Google Patents

Abstract

Das Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikoerper gegen humanes Thyreoidea stimulierendes Hormon (TSH) hat das Ziel, in leicht beherrschbarer Weise die kostenguenstige Produktion groesserer Mengen Antikoerper, die mit Epitopen reagieren, die fuer die b-Kette des TSH spezifisch sind, zu ermoeglichen. Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein nachvollziehbares Verfahren anzugeben, in dessen Verlauf zunaechst Hybridome erzeugt werden, die leicht und unaufwendig handhabbar sind und deren Kultivierung in technisch und oekonomisch vorteilhafter Weise moeglich ist. Unter Verwendung dieser Hybridome sollen in anschliessenden Verfahrensschritten monoklonale Antikoerper erzeugt werden, die mit TSH (b) spezifisch reagieren. Die Hybridome H-BL-TSH (b) 63 und H-BL-TSH (b) 216 produzieren solche spezifischen Antikoerper bei Kultivierung in vitro und in vivo, so dass die monoklonalen Antikoerper BL-TSH (b) 63 und BL-TSH (b) 216 relativ unaufwendig gewonnen werden koennen. BL-TSH (b) 216 ist hoch affin und eignet sich besonders als Fang- und Detektionsantikoerper in Immunoassays. BL-TSH (b) 63 besitzt eine mittlere Affinitaet und eignet sich besonders zur affinitaetschromatografischen Isolierung und Reinigung von TSH.

Description

durch die Gestaltung einer Testhierarchie die Hybridome H-BL-TSH(ß) 63 und 216 ausgewählt werden, deren Antikörper spezifisch für TSH(ß) und als festphasengebundene Fangantikörper geeignet sind,

indem in einem ersten Schritt ein Assay verwendet wird, der monoklonale Antikörper mit

besonderer Eignung als festphasengebundene Fangantikörper erkennt, .

woran sich ein zweiter Schritt anschließt,

mit dessen Hilfe mit FSH, LH und HCG-kreuzreagierende Antikörper bestimmt und deren Hybridome verworfen werden,

während in einem dritten Schritt diejenigen Hybridome ausgewählt werden, deren Antikörper mit der isolierten ß-, aber nicht mit der isolierten α-Kette reagieren, und schließlich in einem vierten Schritt

die Antikörper hinsichtlich ihrer Affinität selektiert werden, wobei der monoklonale Antikörper BL-TSH(ß) 216 aufgrund seiner hohen Affinität für quantitative Bestimmungen und der monoklonale Antikörper BL-TSH(ß) 63 aufgrund seiner mittleren Affinität für die präparierte Isolierung von TSH als besonders vorteilhaft einsetzbar erkannt werden und durch Kultur der zugehörigen Hybridome in vitro oder in vivo hergestellt werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zur Immunisierung der BALB/c-Mäuse ein kovalentes TSH-Thyreoglobulin-Konjugat verwendet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Selektion der Hybridome mit einem Test ausgeführt wird, der den zu testenden Antikörper in festphasengebundener Form mit dem Testantigen reagieren läßt.

Anwendungsgebiet der Erfindung . _>

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern, die hochspezifisch mit der ß-Kette des humanen TSH (Thyreoidea stimulierendes Hormon) reagieren. Diese monoklonalen Antikörper eignen sich zur Isolierung von TSH von anderen Serumproteinen, besonders zur Abtrennung von den verwandten Proteohormonen FSH, LH und HCG. Damit sind diese Antikörper sowohl zur präparativen Reinigung als auch für hochempfindliche Immunoassays zur quantitativen Bestimmung von TSH geeignet.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Das TSH wird von den basophiien Zellen des Hypophysenvorderlappens gebildet Es ist ein Glykoprotein, welches aus je einer a- und ß-Kette, die nicht kovalent verbunden sind, besteht. Während die α-Kette auch Bestandteil anderer Proteohormone, wieder Gonadotropine, LH, FSH und HCG ist, ist die ß-Kette für die spezifische Hormonwirkung des TSH verantwortlich. Das Molekulargewicht der ß-Kette beträgt ca. 14500Da, das der α-Kette 14000 Da und das des kompletten humanen TSH 28000Da. Die Schwierigkeit hochspezifischer ß-Ketten-Antikörper zu gewinnen, besteht darin, daß die ß-Kette schwach immunogen ist und daß hauptsächlich Antikörper gebildet werden, die mit den Gonadotropinen, LH, FSH und HCG kreuzreagieren, was offenbar hauptsächlich auf Anti-a-Ketten-Antikörper zurückzuführen ist. Aber auch die ß-Ketten dieser Proteohormone sind homolog, so daß gleiche und ähnliche Epitope vorkommen. Konventionell hergestellte Antiseren müssen somit durch Immunadsorption mit den Gonadotropinen spezifisch gemacht werden. Dieser Prozeß ist aufgrund der begrenzten Verfügbarkeit und der hohen Kosten dieser Hormone nicht praktikabel. Dje Herstellung monoklonaler Antikörper, die in reproduzierbarer Weise von Hybridomen produziert werden, würde eine elegante und kostengünstige Lösung dieses Problems darstellen. Es ist bereits bekannt, monokonale Antikörper herzustellen. So haben KÖHLER und MILSTEIN (Nature 256, [1975], 495) durch Fusion antikörperbildende Zellen mit einer permanent wachsenden Plasmozytozellinie Hybridzellen erzeugt, die permanent wachsen und stabil Antikörper sezernieren. Diese Prinziplösung führte zur Herstellung verschiedener Hybridomlinien, die Antikörper definierter Spezifität produzieren. Monoklonale Antikörper gegen TSH sind hergestellt worden und in einem Enzymimmunoassay eingearbeitet (Workshop Report: Enzymun-Test® TSH, Boehringer Mannheim GmbH, 1983). Dieser Test arbeitet mit monoklonalen TSH-Antikörpern, die an Plastetuben adsorbiert sind und polyklonalen Antikörpern, die mit Enzym markiert sind. Dieser Test weist neben vielen Vorteilen einige Schwachpunkte auf:

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Das Probevolumen ist relativ groß, so werden 200μΙ Serum mit 1 ml Inkubationspuffer gemischt. Diese große Probemenge ist notwendig, da die Anti-ß-TSH-Antikörper offenbar nicht hoch affin sind. Dafür spricht auch die Kinetik der Adsorption, da nach 2 Stunden noch keine Sättigung erreicht ist. Die Spezifität der monoklonalen Anti-ß-TSH-Antikörper weist ebenfalls Mangel auf. Bei Zusatz von gereinigten HCG tritt zwar keine erhöhte Bindung auf, aber bei Addition von FSH oder LH treten bis zu 20% höhere Bindungswerte auf. Diese Erscheinung deutet auf bestehende Kreuzreaktivität der verwendeten monoklonalen Antikörper zu diesen Gonadotropinen hin. Der verwendete Anti-ß-TSH-Antikörper ist Bestandteil eines kommerziell vertriebenen Testsatzes und nicht einzeln erhältlich.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung hat das Ziel, ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper anzugeben, das in leicht beherrschbarer Weise die kostengünstige Produktion größerer Mengen spezifischer Antikörperfür Determinanten der ß-Kette des humanen TSH gestattet. Die Kreuzreaktivität dieser monoklonalen Antikörper mit den Gonadotropinen LH, FSH und HCG soll vernachläßigbar gering sein. Dabei sind monoklonale Antikörper sowohl von hoher als auch von niedriger Affinität wünschenswert, um Antikörper für unterschiedliche Verwendungszwecke zur Verfugung zu haben. Die Antikörper sollen stabil und damit lagerfähig sein. Durch die Bereitstellung solcher monoklonalen Antikörper soll sowohl die Diagnostik, d. h. die Bestimmung von TSH im Serum als auch Reinigung von TSH verbessert werden.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein nachvollziehbares Verfahren anzugeben, in dessen Verlauf zunächst Hybridome erzeugt werden, die leicht und unaufwendig handhabbarsind und deren Kultivierung in technisch und ökonomisch vorteilhafter Weise möglich ist. Unter Verwendung dieser Hybridome sollen in anschließenden Verfahrensschritten monoklonale Antikörper erzeugt werden, die mit Determinanten der ß-Kette des humanen TSH spezifisch reagieren. Die Aufgabe wird dadurch gelöst, daß gereinigtes humanes TSH kovalent an hochmolekulare Carriermoleküle, z. B. Thyreoglobulin, gekoppelt wird. Mit diesem immunogenen Konjugat werden vorzugsweise 6-8 Wochen alte weibliche BALB/c-Mäuse immunisiert. Die Immunisierung erfolgt durch zusätzliche Unterstützung mit Adjuvantien und mehrfache Applikation. Aus den Milzen derart hyperimmunisierter Mäuse werden die Lymphozyten in ah sich bekannter Weise separiert. Die B-Lymphozyten dieses Zellgemisches werden mit Maus-B-Myelomzellen fusioniert.

Die geeigneten Maus-B-Myelomzellen P3-X63-AG8.653 (KEARNEY et al., J. Immunol. 123, [1979], 1548), werden in RPMI-1640 mit 10% fetalem'Kälberserum (FKS) gezüchtet. In einem Kulturmedium, welches Hypoxanthin, Aminopterin undThymidin enthält (LITTLEFlELD, Science 145, [1964], 709), werden die gebildeten Hybridzellen von den nicht fusionierten Myelomzellen abgetrennt und erfindungsgemäß Zellklone selektiert, die Antikörper der gewünschten Spezifität sezernieren. Die Selektion erfolgt in der Weise, daß die Zellen unmittelbar nach der Fusion in eine Vielzahl von separaten 200p-Kulturen aufgeteilt werden.

Die Überstände der Kulturen, die Hybridzellen enthalten, werden auf die Anwesenheit von Antikörpern geprüft, die nur mit der ß-Kette des humanen TSH reagieren.

Hierzu wird erfi/idungsgemäß ein Test eingesetzt, der bevorzugt solche Anti-TSH-Antikörper erfaßt, die gute Eignung als Fangantikörper aufweisen. Anti-Mausimmunglobulin-Antikörper (z. B. von Ziegen) werden adsorptiv an Mikrotiterplatten z. B. aus Polystyrene oder Polyvinylchlorid, gebunden. Die zu testenden Hybridzellüberstände werden in Vertiefungen solcher beschichteten Mikrotiterplatten pipettiert. Enthaltene Antikörper werden gebunden. Anschließend werden diejenigen Kulturen ausgewählt, deren Zellen Antikörper sezernieren, die in ihrer festphasengebundenen Form zugesetztes radiomarkiertes humanes TSH mit hoher Effizienz binden. In einer zweiten Selektionsstufe werden unter den Kulturen, die TSH-bindende Antikörper produzieren, diejenigen ausgewählt und weitergezogen, die die zugesetzten radiomarkierten GonadotropineFSH, LH und HCG nicht binden.

In der dritten Selektionsstufe werden diese Antikörper getestet, ob sie mit radiomarkierten isolierten α- und ß-Ketten des humanen TSH reagieren.

Im vierten Selektionsschritt werden unter den vorselektierten Kulturen diejenigen weitergezogen, deren Antikörper die gewünschte Affinität aufweisen. Dazu werden die festphasengebundenen Antikörper mit unterschiedlichen Konzentrationen des radiomarkierten TSH inkubiert. Hochaffine Antikörper werden aufgefunden, durch eine nachweisbare Sättigung der vorhandenen Antikörperbindungsstellen bei niedrigen TSH-Konzentrationen. Niedrigaffine Antikörper zeigen eine Sättigung erst bei höherer TSH-Konzentration.

Nach dieser Selektionsstrategie als geeignet befundene antikörperbildende Hybridzellkulturen werden mehrfach nach der Grenzverdünnungsmethode rekloniert. Dabei werden Hybridomsubklone ausgewählt, die außer den beschriebenen Spezifitäts- und Affinitätskriterien stabil monoklonale Antikörper in hoher Menge sezernieren. Besonders geeignet für die Erfüllung der eingangs erwähnten Zielstellungen.haben sich die Hybridome H-BL-TSH(ß) 216 und H-BL-TSH (ß) 63 erwiesen. Die Herstellung der monoklonalen Antikörper, die spezifisch mit der ß-Kette des humanen TSH reagieren, basiert auf der Kultivierung dieser beiden Hybridome. Sie werden an der Sektion Biowissenschaften der Karl-Marx-Universität Leipzig kultiviert. Sie liegen kryokonserviert vor und sind zugänglich. Die monoklonalen Antikörper BL-TSH(ß) 63 und 216 haben die Registriernummern DDR - 0143 und DDR - 0144 in der Liste der monoklonalen Antikörper, die im Zentralen Institut für Molekularbiologie der AdW der DDR geführt wird, erhalten.

Für die Kultivierung ist zweckmäßig, als Medium MEM Eagle, Dulbeccos MEM, RPM11640 o. dgl. anzuwenden. Besonders günstig ist die Verwendung von RPM11640, das in einer bevorzugten Ausführungsform mit 1OmM HEPES, 5 χ 10"⁵M Mercaptoethanol und 100 mg/IGentamycin versetzt ist. Als Serumzusatz dient fetales Kälberserum oder ein anderes geeignetes Serum, z. B. Pferdeserum mit einem Anteil von 5-20% am Kulturmedium. Vorteilhaft ist es, mit einem Anteil von 10% zu arbeiten. Vorteilhaft ist es weiterhin, bei 37⁰C zu kultivieren. Der CO₂-Gehalt der Atmosphäre über dem Medium beträgt im günstigsten Fall 5%. Vorteilhaft ist eine hohe Luftfeuchtigkeit, die bis zur Sättigung der Atmosphäre reichen kann. Die Kultivierung der Hybridome erfolgt über einen üblichen Zeitraum von mehreren Tagen, wobei die Kulturdauer von 3-4 Tagen geeignet ist. Danach wird das Medium gewechselt und die Zellzahl erneut auf einen optimalen Ausgangswert eingestellt. Die monoklonalen Antikörper

BL-TSH(ß) 63 und BL-TSH(ß) 216 sind in Konzentrationen biszu'120 bzw. 150μ9/πηΙ im Kulturüberstand enthalten und können aus ihm nach den üblichen Methoden isoliert werden.

Zur Gewinnung größerer Antikörpermengen werden die Hybridome H-BL-TSH(ß) 63 oder H-BL-TSH(ß) 216 in BALB/c-Mäuse i. p. injiziert. Es ist von Vorteil, wenn die eingesetzten Mäuse mit einem Tumorstimulator, wie Paraffinum subliquidum, Pristan o. dgl. vorbehandelt werden. Nach Aszitesbildung wird die den monoklonalen Antikörper BL-TSH(ß) 63 oder BL-TSH(ß) 216 enthaltende Aszitesflüssigkeit durch Punktion entnommen. Von der Aszitesflüssigkeit werden die zellulären Bestandteile durch Zentrifugation abgetrennt, die überwiegend aus Zellen der Hybridome H-BL-TSH(ß) 63 oder H-BL-TSH(ß) 216 bestehen. Diese können zweckmäßigerweise in neue, vorbehandelte Mäuse injiziert werden. Der zellfreie Überstand, der den monoklonalen Antikörper BL-TSH(ß) 63 oder BL-TSH(ß) 216 enthält, wird entweder direkt verwendet oder einer weiteren Reinigung unterzogen. Dafür kommen Salzpräzipitationen, lonenaustauschchromatographie, HPLC, FPLC, Protein-A-Adsorption, Affinitätschromatographie, o.dgl. in Frage. Die Aszitesflüssigkeit enthält bei erfindungsgemäßer Verfahrensdurchführung 5-20mg der monoklonalen Antikörper. Anreicherungen führen zu einem Produkt mit einem Antikörpergehalt von mehr als 20mg/ml.

Zur Herstellung einer stabilen Aufbewahrungsform, die auch als Handelspräparat geeignet ist, wird die Immunglobulinfraktion der zellfreien Aszitesflüssigkeit oder des Zellkulturüberstandes präzipitiert, z. B. mit 40-50% gesättigtem (NH₄I₂SO₄, und in gepufferter physiologischer Kochsalzslösung aufgenommen. Dialyse gegen NH₄HCC>3-Lösung führt nach Lyophilisierung zu einem salzfreien Präparat, welches bei +4°C haltbar ist.

Die nach einer dieser Verfahrensvarianten hergestellten monoklonalen Antikörper BL-TSH(ß) 63 und BL-TSH(ß) 216 besitzen eine hohe Spezifität für humanes TSH, zeigen eine niedrige Kreuzreaktivität mit den Gonadotropinen FSH, LH und HCG (Tab. 1). Die Affinität der beiden monoklonalen Antikörper unterscheidet sich deutlich.

Während der monoklonale Antikörper BL-TSH(ß) 216 eine sehr hohe Affinität (K_A> 10¹⁰M'¹) zum TSH aufweist und dadurch als Fang- oder DetektionsantikörperfürTSH in Immunoassays zur quantitativen Bestimmung besonders gut geeignet ist, bietet sich der monoklonale Antikörper BL-TSH(ß) 63 aufgrund seiner mittleren Affinität (Ka = 3 x 10⁷M"¹) dazu an, ihn als immunspezifisches Reagens bei affinitätschromatographischer Isolierung und Hochreinigung von humanem TSH, welches aus natürlichem oder gentechnisch hergestelltem Material stammt, zu verwenden. Durch seine moderate Affinität kann das gebundene TSH unter schonenden Bedingungen bei Erhalt der biologischen Aktivität in hoher Ausbeute vom Adsorbens abgelöst werden. Beide monoklonalen Antikörper lassen sich kovalent an feste Träger mit etablierten Methoden, wie z. B. Zyanbromidaktivierung oder Carbodiimidkopplung, ankoppeln.

Tabelle 1: Spezifitätsmerkmale der monoklonalen Antikörper

	TSH-Sollwert	FSH 50mU/ml	150mU/ml	TSH-Ist-Wert (μυ/ml) bei	120mU/ml	HCG 200 U/ml
	μυ/ml	0,2 0,3	0,9 0,9	LH 60mU/ml	1,1 1,2	0,1 0,1
BL-TSH(ß)/63 BL-TSH(ß)/216	0 0			0,6 0,8

Claims (1)

1. Verfahren zur Hersteilung monoklonaler Antikörper für Epitope der ß-Kette des Thyreoidea stimulierenden Hormons (TSH) durch Immunisierung von Mäusen von humanem TSH, Fusion von aus der Milz der immunisierten Mäuse gewonnenen B-Lymphozyten mit murinen Myelomzellen, Separierung gebildeter Hybridzellen von nicht fusionierten Myelomzellen, Selektion von Hybridomen, die monoklonale Antikörper sezernieren, die spezifisch mit Epitopen der ß-Kette des humanen TSH reagieren, dadurch gekennzeichnet, daß

ein kovalent gekoppeltes, hochimmunogenes TSH-Carrierkonjugat als Immunogen verwendet