DD259138A1 - Verfahren zur herstellung eines monoklonalen antikoerpers gegen ein fruehes aktivierungsantigen humaner lymphozyten - Google Patents

Abstract

Das Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikoerper, die zum Nachweis von aktivierten Lymphozyten kurzfristig nach deren Stimulierung geeignet sind, hat das Ziel, in leicht beherrschbarer Weise die kostenguenstige Produktion groeszerer Mengen solcher Antikoerper zu ermoeglichen. Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein nachvollziehbares Verfahren anzugeben, in dessen Verlauf zunaechst Hybridome erzeugt werden, welche leicht und unaufwendig handhabbar sind und deren Kultivierung in technisch und oekonomisch vorteilhafter Weise moeglich ist. Unter Verwendung dieser Hybridome sollen in anschlieszenden Verfahrensschritten monoklonale Antikoerper erzeugt werden. Die Aufgabe wird durch die Herstellung des Hybridoms H-BL-Ac/p26 mittels Zellfusion, dessen Kultivierung in vitro und in vivo sowie der Separierung und Reindarstellung des monoklonalen Antikoerpers BL-Ac/p26 geloest. Der monoklonale Antikoerper BL-Ac/p26 reagiert mit einem bisher unbekannten Zelloberflaechenantigen p26, welches aus einer einzelnen Polypeptidkette mit einer relativen Molekularmasse von 26 000 Da besteht. Dieses Antigen wird kurz nach der Aktivierung von Lymphozyten durch Antigene, Mitogene oder Anti-Rezeptorreagenzien auf der Zelloberflaeche exprimiert und kann durch den Antikoerper BL-Ac/p26 durch direkte oder indirekte Nachweisverfahren bestimmt werden. Der Antikoerper eignet sich fuer diagnostische Tests zum Nachweis aktivierter humaner Lymphozyten.{monoklonale Antikoerper; aktivierte Lymphozyten; Herstellung eines Hybridoms; Zelloberflaechenantigen p26; Nachweis aktivierter Lymphozyten}

Description

Hierzu 2 Seiten Zeichnungen

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers, der mit einem Zeiloberflächenmolekül reagiert, welches vori Lymphozyten relativ schnell nach Aktivierung exprimiert wird. Dadurch ist dieser monoklonale Antikörper als Nachweisreagens für aktivierte humane Lymphozyten, die bei verschiedenen Krankheiten mit immunologischen Komponenten, bei Infektionskrankheiten, bei Neoplasien des lymphozytären Systems sowie bei Transplantationskrisen auftreten, geeignet. Auch eine Nutzung des monoklonalen Antikörpers zur Eliminierung der aktivierten Lymphozyten ist möglich.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Die Fortschritte der Differenzierung von Lymphozyten, die unterschiedliche Funktionen erfüllen, durch monoklonale Antikörper (Leukocyte Typing II. Vol. 1-3, Hrsg. E. L. Reinherz, B. F. Haynes, L. M.Nadler u. I.D.Bernstein: Springer-Verlag; New York, Berlin, Heidelberg, Tokyo 1986) haben die Diagnostik von Krankheiten mit immunologischer Komponente, von Neoplasien des Immunsystem und die Überwachung von Transplantationen deutlich verbessert. Es hat sich jedoch gezeigt, daß Veränderungen der Anteile von funktionellen Subpopulation im peripheren Blut nur bei sehr drastischen Störungen und Reaktionen des Immunsystems erfolgen, so daß immunologische Reaktionen, soweit sie in der normalen physiologischen Schwankungsbreite liegen, nicht sicher mit Ahti-Subpopulations-Antikörpem erfaßt werden können.

Lymphozyten, die.durch Antigene, Mitogene oder monoklonale Antikörper gegen bestimmte Zelloberflächenantigene aktiviert werden, verändern im Gefolge dieser Aktivierung qualitativ und quantitativ ihr Zelloberflächenantigenmuster. Der durch die Aktivierung ausgelöste Eintritt in den Zellzyklus erfordert die Einstellung der Zelle auf andere physiologische Leistungen. Es werden Rezeptoren für Interleukine, wie z. B. das IL-2, Hormone, Nährstoffe und modifizierende Komponenten entweder neu oder verstärkt exprimiert.

Diese Veränderungen sind Voraussetzung für DNA-Synthese, Mitose, Proliferation und funktioneile Enddifferenzierung.

Die Aufklärung der Veränderungen desZelloberflächenmoleküls steht erst am Anfang. Einige dieser Veränderungen konnten schon durch die Markierung der Antigene mit monoklonalen Antikörpern erfaßt werden. Außer dem IL-2-Rezeptor (Mol.-Gew.

ca. 55000Da), der durch den Anti-Tac-Antikörper nachgewiesen werden kann (WALDMANN: Science 232, [1986] 727-732), sind monoklonale Antikörper gegen denTransferrinrezeptor (Mol.-Gew. 190000Da; GODING u. BURNS: J. Immunol. 127 [1981] 1256-1258) bekanntgeworden.

Weiterhin sind monoklonale Antikörper beschrieben worden, die mit Zelloberflächenantigenen unbekannter Funktion reagieren, die jedoch nach Aktivierung erst verstärkt exprimiert werden. Dazu gehören die Antigene, die durch die monoklonalen Antikörper 4F4 (Mol.-Gew. 80000/40000Da; HAYNES et al.: J. Immunol. 126, [1981], 1409), der CDw26-Gruppe (Mol.-Gew. 120000, 200000 Da; Leukocyte Typing II. Vol. 1, Hrsg. E. L. REINHERZ, B. F. HAYNES, L. M. NADLER u. I. D. BERNSTEIN: Springer-Verlag; New York, Berlin, Heidelberg, Tokyo 1986) und derCD30-Gruppe (Mol.-Gew. 95000/130000Da; WORKSHOP-Report des III. Leukocyte Differentiation Antigen Workshops, 1986, Oxford) erkannt werden.

Aber auch die Ia-Antigene sind als Aktivierungsmarker von humanen T-Lymphozyten geeignet (DD-PS 230877).

Als früheste Veränderung des Antigenmusters von aktivierten Lymphozyten, besonders T-Lymphozyten, gilt das Auftreten des IL-2-Rezeptors, welcher ungefähr 6 h nach der Aktivierung vermehrt exprimiert wird (WALDMANN: Science 232, [1986] 727-732).

Für diagnostische Zwecke ist es jedoch auch von Bedeutung, die früheste Phase der Aktivierung unabhängig vom Erscheinen des IL-2-Rezeptors sicher durch monoklonale Antikörper zu erfassen. Dazu sind monoklonale Antikörper prinzipiell geeignet, jedoch sind keine bekannt, die als Nachweisreagenzien für die frühe Phase der Aktivierung von Lymphozyten geeignet sind und nicht auf der Bindung an den IL-2-Rezeptor beruhen.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung hat das Ziel, ein Verfahren zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers, der Zeiloberflächenveränderungen von Lymphozyten, besonders von T-Zellen, erfaßt, die relativ schnell nach deren Aktivierung durch Antigene, analog wirkende Antikörper oder Mitogene vonstattengehen, anzugeben, das in leicht beherrschbare Weise die kostengünstige Produktion größerer Mengen dieses Nachweisreagenzes gestattet.

Das Verfahren soll gleichbleibende Qualität des monoklonalen Antikörpers gewährleisten. Die monoklonalen Antikörper sollen stabil und damit lagerfähig sein und sich zur Verwendung in einem einfachen Nachweistest von aktivierten humanen Lymphozyten eignen.

Durch die Bereitstellung eines solchen Antikörpers soll die medizinische Diagnostik, besonders von Infektionskrankheiten, von Rejektionskrisen bei Transplantationen und von Neoplasien im Immunsystem, verbessert werden.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein nachvollziehbares Verfahren anzugeben, in dessen Verlauf zunächst ein Hybridom erzeugt wird, das leicht und unaufwendig handhabbar ist und dessen Kultivierung in technisch und ökonomisch vorteilhafter Weise möglich ist. Unter Verwendung dieses Hybridoms sollen in anschließenden Verfahrensschritten ein monoklonaler Antikörper erzeugt werden, der mit einem besonders geeigneten, bisher unbekannten Zelloberflächenantigen von Lymphozyten, die aktiviert worden sind, reagiert.

Die Aufgabe wird dadurch gelöst, daß 6-8 Wochen alte, weibliche BALB/c-Mäuse mit humanen aktivierten T-Lymphozyten immunisiert werden.

Die aktivierten T-Lymphozyten werden durch Behandlung humaner peripherer Blutlymphozyten mit dem monoklonalen Antikörper BL-TRec/1 (DD-PS 291741), der spezifisch mit dem antigenspezifischen Rezeptor/CD3-Komplex reagiert, erzeugt. Durch die Behandlung mit BL-TRec/1 werden die T-Lymphozyten in einer Art und Weise aktiviert, die der Aktivierung durch ein Antigen sehr ähnlich ist. Im Gegensatz zur klonalen Aktivierung durch ein Antigen, wird durch dieses Verfahren jedoch die Mehrheit der Gesamt-T-Lymphozytenpopulation aktiviert.

Die Immunisierung erfolgt durch mehrmalige Applikation solcher aktivierten T-Zellen. Aus den Milzen derart hyperimmunisierter Mäuse werden die Lymphozyten in an sich bekannter Weise separiert. Die B-Lymphozyten dieses Zellgemisches werden mit Mausmyelomzellen fusioniert. Die geeigneten Myelomzellen P3-X63-Ag8,653 (KEARNEY et al., J. Immunol. 123, [1979], 1548) werden in RPM1-1640 mit 10% fetalem Kälberserum gezüchtet. In einem Kulturmedium,welchesHypoxanthin,Aminopterinund Thymidin enthält (LITTLEFIELD, Science 145, [1964], 709), werden die gebildeten Hybridzellen von den nicht fusionierten Myelomzellen abgetrennt und Zellklone selektiert, die Antikörper der gewünschten Spezifität sezernieren. Die erfindungsgemäße Selektionierung der Hybridome erfolgt in der Weise, daß die Zellen unmittelbar nach der Fusion in eine Vielzahl von separaten 200pl-Kulturen aufgeteilt werden. Die Überstände der die aufwachsenden Hybridzellen enthaltenen Kulturen werden auf die'Anwesenheit von Antikörpern geprüft, die nur mit Oberflächenantigenen von aktivierten T-Lymphozyten reagieren. Hierzu werden alle Kulturüberstände im ersten Selektionsschritt auf die Anwesenheit von Antikörpern geprüft, die mit BL-TRec/1 -aktivierten T-Lymphozyten, nicht aber mit ruhenden peripheren Blutlymphozyten reagieren. Nur die Kulturen werden weiter verwendet, deren Antikörper nur an aktivierte T-Lymphozyten, nicht aber an ruhende Zellen binden. Im zweiten Seiektionsschritt werden diejenigen Kulturen selektiert, deren Antikörper mit andersartig aktivierten Lymphozyten reagieren. Dazu werden sowohl durch bestrahlte allogene Leukozyten erzeugte Blasten (MLC-Blasten) als auch mitogenstimulierten Lymphoblasten (Phythämagglutinin, Concanavalin A, Pokeweed Mitogen) eingesetzt. Nur entsprechend reagierende Antikörper produzierende Hybridzellen werden weiter kultiviert.

Im dritten Selektionsschritt wird geprüft, daß diese ausgewählten Hybridomkulturen keine Antikörper enthalten, die mit Erythrozyten, Thrombozyten, Monozyten und Granulozyten reagieren.

Im vierten Selektionsschritt werden erfindungsgemäß die Hybridzellkulturüberstände mit aktivierten Lymphozyten, zu unterschiedlichen Zeiten nach Stimulierung, geprüft. Dabei werden Hybridome selektiert, die mit Lymphozyten schon wenige Stunden nach deren Stimulierung reagieren. Die geeigneten Hybridzellkulturen werden rekloniert und produktive Subklone selektiert. Diese erfindungsgemäße Selektionsstrategie führt zu Hybridomen, die den in der Zielstellung aufgestellten Anforderungen gerecht werden. Besonders günstige Eigenschaften weist das Hybridom H-BL-Ac/p26 auf. Die Herstellung des monoklonalen Antikörpers BL-Ac/p26, der mit einem frühzeitig nach der Aktivierung von Lymphozytenexprimierten Antigen reagiert, basiert auf einem Verfahren, weichesauf die Verwendung des Hybridoms H-BJ.-Ac/p26 ausgerichtet ist. Das Hybridom H-BL-Ac/p26 wird an der Sektion Biowissenschaften der Karl-Marx-Universität Leipzig kultiviert. Es liegt kryokonserviertvor und ist zugänglich. Der monokionale Antikörper BL-Ac/p 26 bzw. das ihn sezernierende Hybridom hat die Registriernummer DDR - 0148 im Zentralen Institut für Molekularbiologie der AdW der DDR erhalten. Für die Kultivierung ist zweckmäßig als Medium MEM Eagle, Dulbeccos MEM, RPM11640 o. dgl. anzuwenden. Besonders günstig ist die Verwendung von RPM11640, das'in einer bevorzugten Ausführungsform mit 1OmM HEPES, 5 χ 10"⁵M Mercaptoethanol und 100ml/! Genamycin versetzt ist. Als Serumzusatz dient fetales Kälberserum oder ein anderes geeignetes Serum, z. B. Pferdeserum, mit einem Anteil von 5-20% am Kulturmedium. Vorteilhaft ist es, mit einem Anteil von 10% zu arbeiten. Vorteilhaft ist es weiterhin, bei37°Czu kultiveren. Der CO2-Gehalt der Atmosphäre über dem Medium beträgt im günstigsten Fall 5%. Von Vorteil ist eine hohe Luftfeuchtigkeit, die bis zur Sättigung der Atmosphäre reichen kann. Die Kultivierung der Hybridome erfolgt über einen üblichen Zeitraum von mehreren Tagen, wobei die Kuiturdauer von 3-4Tagen geeignet ist. Danach wird das Medium gewechselt und die Zellzahl erneut auf einen optimalen Ausgangswert eingestellt.

Dermonoklonale Antikörper BL-Ac/p26 ist bis zu einer Konzentration von 150Mg/ml im Kulturüberstand enthalten und kann aus ihm nach den üblichen Methoden isoliert werden. Der monokionale Antikörper BL-Ac/p 26 ist ein lgG3-lmmunglobulin. Zur Gewinnung größerer Antikörpermengen wird das Hybridom H-BL-Ac/p26 in BALB/c-Mäuse i.p. inokuliert. Es ist von Vorteil, wenn die eingesetzten Mäuse mit einem Tumorstimulator, wie Paraffinum subliquidum, Pristan od. dgl. vorbehandelt werden. Nach Aszitesbildung wird die den monoklonalen Antikörper BL-Ac/p26 enthaltende Aszitesflüssigkeit durch Punktion entnommen. Von der Aszitesflüssigkeit werden die zellulären Bestandteile durch Zentrifugation abgetrennt, die überwiegend aus Zellen des Hybridoms H-BL-Ac/p26 bestehen. Diese können zweckmäßigerweise in neue, vorbehandelte Mäuse injiziert

-3- Zt)H ΙύΟ

werden. Der zellfreie Überstand, der den monoklonalen Antikörper BL-Ac/p26 enthält, wird entweder direkt verwendet oder einer weiteren Reinigung unterzogen.

Dafür kommen Salzpräzipitationen, lonenaustauschchromatographie, HPLC, FPLC, Protein-A-Adsorption, Affinitätschromatographie o.dgl. in Frage.

Die Aszitesflüssigkeit enthält bei erfindungsgemäßer Verfahrensdurchführung 5—20mg der monoklonalen Antikörper.

Anreicherungen führen zu einem Produkt mit einem Antikörpergehalt von mehr als 20 mg/ml.

Zur Herstellung einer stabilen Aufbewahrungsform, die auch als Handelspräparat geeignet ist, wird die Immunglobulinfraktion der zellfreien Aszitesflüssigkeit oder des Zellkulturüberstandes präzipitiert, z. B. mit 40-50% gesättigem (NH₄J₂SO₄, und in gepufferter physiologischer Kochsalzlösung aufgenommen. Dialyse/gegen NH₄HCC>3-Lösung führt nach Lyophilisierung zu einem salzfreien Präparat, welches bei +4⁰C haltbar ist.

Der nach einer dieser Verfahrensvarianten hergestellte monoklonale Antikörper BL-Ac/p26 besitzt hohe Spezifität für aktivierte Lymphozyten (Tab. 1). Das von dem monoklonalen Antikörper BL-Ac/p26 erkannte Antigen erscheint erst nach der Aktivierung derT-Lymphozyten auf der Zellmembran. Es handelt sich dabei um einfrühes Aktivierungsantigen, welches vordem IL-2-Rezeptorexprimiertwird (Abb. 1). Es wird sowohl von antigenspezifischen humanen T-Zellklonen, die durch IL-2-enthaltendes Medium bei periodischerStimulierung mit Antigen oderdurch Mitogen gezüchtet werden, als auch auf permanentwachsenden T-Zellinien ausgeprägt (Tab. 2). Die Präsenz des durch BL-Ac/p26 erkannten Antigens auf allen aktivierten proliferierenden T-Zellen spricht für eine essentielle Funktion dieses Antigens bei dem Prozeß der Zellaktivierung.

Die biologische Funktion des von BL-Ac/p26 erkannten Antigens ist noch unbekannt. Das erkannte Antigen (p26) besitzt ein Molekulargewicht von ca. 26000 Da. Es bildet keine kovalenten durch Disulfidbrücken gebundene Horhooligomere, da es sowohl in unreduzierter als auch in reduzierter Form bei NDS-Polyacrylamidelektrophorese-Analyse nur als eine Bande mit dem angegebenen Molekulargewicht erscheint. Die Isolierung des Antigens erfolgt dabei durch die Bindung an den monoklonalen Antikörper BL-Ac/p 26.

Der monoklonale Antikörper BL-Ac/p26 eignet sich als Nachweisreagens von aktivierten humanen Lymphozyten, besonders vonT-Lymphozyten, durch indirekte Immunfluoreszenz sowohl bei Auswertung mit einem Durchflußfluorzytometer (Abb. 2) als auch bei fluoreszenzmikroskopischer Auswertung.

Der monoklonale Antikörper kann mit geeigneten Verfahren mit Markierungssubstanzen wie Fluoreszenzfarbstoffen (z. B. FITC, TRITC, Phycoerythrin), Enzymen (z. B. Peroxidase, alkalische Phosphatase), kolloidalem Gold oder Radioisotopen gekoppelt werden. Dabei kann der markierte BL-Ac/p 26 zum Nachweis von aktivierten Lymphozyten sowohl in der Zellsuspension als auch am histologischen Schnitt eingesetzt werden.

Der monoklonale Antikörper BL-Ac/p26 kann damit in vielfältiger Weise als immunologisches Nachweisreagenz für humane aktivierte Lymphozyten in der medizinischen Diagnostik eingesetzt werden.

Tab. 1: Bindungsmuster des monoklonalen Antikörpers BI-Ac/p26 mit verschiedenen humanen Blutzellen und Blasten

	PHA	Markierung mit dem mAk	Stärke
	ConA	BL-Ac/p 26	der
Zielzellen	PWM	Positive	Markierung
	MLC	Zellen [%]	'—
	BL-TRec/1		-
Erythrozyten	CD 3	0	-
Thrombozyten	0	—
Monozyten	0	+
Granulozyten	0
Lymphozyten (PBL)11	0-5	+ -> +++
Aktivierte		+ -> +++
Lymphozyten21;	40-70	+ ^++ +
	40-50	+ -» +++
	20-40	4-^·+ + +
	10-25	+ ^> + + +
	50-70
	40-60

¹¹ Periphere mononukleäre Zellen aus dem Blut gesunder Spender ^

²¹ Bezogen auf alle Lymphozyten unabhängig von der Größe. Die Auswertung erfolgte bei der gemischten allogenen Lymphozytenkultur (MLC) am 4.Tag, bei allen anderen am 2.Tag.

Tab. 2: Bindung des monoklonalen Antikörpers an Zielzellen Zielzellen Reaktivität mit BL-Ac/p 26

T-Zellklone

AK15(CD8⁺) KU10(CD8⁺) KT2(CD4⁺)

T-Zellinien

CEM ±

SKW-3 +

MOLT-3 +

MOLT-4 +

Jurkat +

Non-T, Non-B REH

B-Zellinien

Staudte

IM 9 • 1419 Myelo-monozytäre Linien

U 937 Erythroide Linie

Claims (1)

1. Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper zum Nachweis von aktivierten humanen Lymphozyten schon frühzeitig nach der erfolgten Stimulierung, durch Immunisierung von Mäusen mit aktivierten humanen Lymphozyten, Fusion von aus der Milz der Mäuse gewonnenen B-Lymphozyten mit murinen Myelomzellen, Selektierung von Hybridomen, die Antikörper sezernieren, welche nur mit aktivierten, nicht aber mit ruhenden Lymphozyten reagieren,

dadurch gekennzeichnet, daß die zur Immunisierung verwendeten T-Lymphozyten durch Behandlung mit dem monoklonalen Antikörper BL-TRec/1 aktiviert werden, ein Hybridom H-BL-Ac/p26, dessen monoklonaler Antikörper BL-Ac/p 26 spezifisch mit einem lymphozytären Zelloberflächenantigen reagiert, welches von einer einzelnen Polypeptidkette mit einem Molekulargewicht von ca. 26000 gebildet und frühzeitig nach Aktivierung auf der Oberfläche von humanen Lymphozyten exprimiert wird, dergestalt spezifisch selektiert wird, daß zuerst seine Bindung an aktivierte T-Lymphozyten, die durch einen monoklonalen Antikörper gegen den Antigenrezeptor-CD3-Antigen-Komplex stimuliert wurden, getestet wird,

anschließend mit andersartig, z. B. durch allogene Zellen oder Mitogen, aktivierten Lymphozyten überprüft und mit ruhenden Lymphozyten sowie anderen Blutzellen gegengetestet wird, unter den Hybridomen dasjenige ausgewählt wird, welches ein Zelloberflächenantigen bindet, das ein Molekulargewicht von ca. 26000 besitzt und frühzeitig nach Aktivierung ausgeprägt wird, dieses Hybridom in vitro oder in vivo kultiviert wird und die produzierten Antikörper gewonnen werden.