DD230878B1

DD230878B1 - PROCESS FOR THE PRODUCTION OF MONOCLONAL ANTIBODY FOR HUMANESE IGE

Info

Publication number: DD230878B1
Application number: DD25464683A
Authority: DD
Inventors: Helmut Fiebig; Ingrid Behn; Herwart Ambrosius
Original assignee: Univ Leipzig
Priority date: 1983-09-08
Filing date: 1983-09-08
Publication date: 1987-07-22
Also published as: DD230878A1

Description

Field of application of the invention

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper, die zur Reaktion mit humanem IgE befähigt sind.The invention relates to a method for producing monoclonal antibodies capable of reacting with human IgE.

Characteristic of the known technical solutions

Es ist bereits bekannt, monoklonale Antikörper herzustellen. Zu diesem Zweck werden zunächst durch Fusion antikörperbildender Zellen mit einer permanent wachsenden Plasmozytomlinie Hybridzellen erzeugt, die permanent wachsen und stabil Antikörper sezemieren (Köhler, Milstein, Nature 256, [1975], 495). Diese Prinziplösung hat dazu geführt, daß verschiedene Hybridomlinien hergestellt worden sind, die Antikörper unterschiedlicher Spezifität produzieren. Die Bildung der Antikörper kann dabei in vitro, aber auch in vivo erfolgen. Zum Beispiel sind Antikörper hergestellt worden, die mit verschiedenen humanen Immunglobulinen reagieren. Monoklonale Antikörper gegen humanes IgE sind von der Firma SEROTEC (Großbritannien) im Katalog ausgewiesen. Außer diesem sind jedoch keine Antikörper bekannt, die in der erforderlichen und gewünschten Weise mit humanem IgE reagieren.It is already known to produce monoclonal antibodies. For this purpose, hybrid cells are initially produced by fusion of antibody-forming cells with a permanently growing plasmacytoma line, which grow permanently and stably secrete antibodies (Köhler, Milstein, Nature 256, [1975], 495). This principle solution has led to the production of various hybridoma lines which produce antibodies of different specificity. The formation of the antibodies can take place in vitro, but also in vivo. For example, antibodies have been produced which react with various human immunoglobulins. Monoclonal antibodies to human IgE are listed in the catalog by SEROTEC (UK). Apart from this, however, no antibodies are known which react in the required and desired manner with human IgE.

Object of the invention

Die Erfindung hat das Ziel, ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper, die spezifisch mit Determinanten der schweren Kette des humanen IgE reagieren, anzugeben. Das Verfahren soll in leicht beherrschbarer Weise die kostengünstige Produktion größerer Mengen dieses spezifischen Antikörpers gestatten. Dabei soll gleichbleibende Qualität gewährleistet sein, der Antikörper soll stabil und lagerfähig sein und sich zur Verwendung in einem einfachen und exakten Nachweises für humanes IgE eignen, wobei Kreuzreaktionen mit anderen humanen Immunglobulinisotypen nicht vorkommen sollen.The invention aims to provide a method for producing monoclonal antibodies that react specifically with human IgE heavy chain determinants. The process should allow, in a readily controllable manner, the cost effective production of larger quantities of this specific antibody. The aim is to ensure consistent quality, the antibody should be stable and storable and suitable for use in a simple and accurate detection of human IgE, cross-reactivity with other human immunoglobulin isotypes should not occur.

Explanation of the essence of the invention

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ei η nachvollziehbares Verfahren zur Verfügung zu stellen, in dessen Verlauf zunächst ein Hybridom erzeugt wird, das leicht und unaufwendig handhabbar ist und dessen Kultivierung in technisch und ökonomisch vorteilhafter Weise möglich ist. Unter Verwendung dieses Hybridoms soll ein Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern, die zur spezifischen Reaktion mit humanem IgE befähigt sind, verwirklicht werden.The invention has for its object to provide ei η traceable process available, in the course of which a hybridoma is first generated, which is easy and inexpensive to handle and its cultivation is possible in a technically and economically advantageous manner. Using this hybridoma, a method for producing monoclonal antibodies capable of specifically reacting with human IgE is to be realized.

Die Aufgabe wird dadurch gelöst, daß zunächst nach an sich bekannten Verfahren eine Immunglobulinfraktion aus Seren von Patienten (z. B. den Patienten mit den Abkürzungen Yu und ND), die IgE-Myelomprotein in hoher Konzentration enthalten, isoliert wird. Das kann z. B. durch Aussalzen und lonenaustauschchromatographie geschehen. Aus diesen Immunglobulinfraktionen werden nach dem von Nezlin (Nezlin et al. Immunochem. 10, [1973], 681) beschriebenen Verfahren die Myelomproteine lgE_Yu und IgE(Mo isoliert, mit denen erfindungsgemäß Mäuse immunisiert werden. Vorzugsweise werden 6 bis 8 Wochen alte weibliche Α-Mäuse verwendet. Die Immunisierung erfolgt durch mehrmalige Applikation des Myelomproteins lgE_Yu (jeweils lOCVg/Maus), wobei die erste Antigengabe mit komplettem Freundschem Adjuvans erfolgt. Vier Tage vorder Entnahme der Milzen für die Fusion wird mit dem Myelomprotein lgE_ND eine Boosterung durchgeführt. Aus den Milzen derart hyperimmuner Mäuse werden die Lymphozyten in an sich bekannter Weise separiert. Die B-Lymphozyten dieses Zellgemisches wurden mit Maus-B-Myelomzellen fusioniert bzw. hybridisiert. Die notwendigen Maus-B-Myelomzellen P3-X-63 Ag 8.653 (KEARNEY et al., J. Immunol. 123, [1979], 1548) werden in RPMI-1640 mit 10% fetalem Kälberserum (FKS) gezüchtet. In einem Kulturmedium, welches Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin enthält (Littlefield, Sciences, 165, [1964], 709) werden die gebildeten Hybride von den nicht fusionierten Myelomzellen abgetrennt und erfindungsgemäß ein Zellklon selektioniert, der Antikörper der gewünschten Art sezemiert. Die Selektionierung des Hybridoms erfolgt in der Weise, daß die Zellen unmittelbar nach der Fusion in eine Vielzahl von separaten 200-/xl-Kulturen aufgeteilt werden. Die Überstände der die aufwachsenden Hybridzellen enthaltenden Kulturen werden auf die Anwesenheit von Antikörpern geprüft, die mit dem Myelomprotein IgEy₁, reagieren. Die Testung erfolgt zweckmäßigerweise mittels indirekter Radiobindungstechnik oder monoklonaler PAP-Technik. Dazu wird das Protein adsorptiv an Polyvinylchloridmikrotiterplatten gebunden, unspezifische Restbindungsstellen mit 2% fetalem Kälberserum geblockt und mit den Hybridzellkulturüberständen inkubiert.The object is achieved by first isolating, according to known methods, an immunoglobulin fraction from sera of patients (eg the patients with the abbreviations Yu and ND), which contain IgE myeloma protein in high concentration. This can z. B. done by salting out and ion exchange chromatography. The myeloma protein IgE _Yu and IgE From these immunoglobulin fractions after of Nezlin (Nezlin et al. Immunochem. 10, [1973], 681) method described isolated (Mo, are those according to the invention Mice immunized. Preferably, 6 to 8 week old female Immunization is carried out by repeated application of the myeloma protein IgE _Yu (in each case lOCVg / mouse), the first antigen being administered with complete Freund's adjuvant Four days before removal of the spleens for fusion, a boosting is performed with the myeloma protein IgE _ND The lymphocytes are separated in a manner known per se from the spleens of such hyperimmune mice The B lymphocytes of this cell mixture were fused or hybridized with mouse B myeloma cells The necessary mouse B myeloma cells P3-X-63 Ag 8.653 (FIG. KEARNEY et al., J. Immunol., 123, [1979], 1548) are cultured in RPMI-1640 with 10% fetal calf serum (FCS) in a culture medium containing H ypoxanthin, aminopterin and thymidine (Littlefield, Sciences, 165, [1964], 709), the hybrids formed are separated from the unfused myeloma cells and according to the invention a cell clone is selected which secrete antibodies of the desired kind. The selection of the hybridoma is done by dividing the cells immediately after the fusion into a plurality of separate 200 / x1 cultures. The supernatants of the cultures containing the growing hybrid cells are tested for the presence of antibodies that react with the myeloma protein IgEy ₁ . The testing is expediently carried out by means of indirect radio-binding technique or monoclonal PAP technique. For this purpose, the protein is adsorptively bound to polyvinyl chloride microtiter plates, non-specific residual binding sites blocked with 2% fetal calf serum and incubated with the hybrid cell culture supernatants.

Spezifisch an das IgEy₁, gebundene Hybridomantikörperwerden durch ¹²⁵J-markierte Anti-Mausimmunglobulin-Antikörperoder durch einen monoklonalen PAP-Komplex nachgewiesen. Die antikörperenthaltenden Kulturen werden dann in gleicher Weise mitlmmunglobulinpräparationen der Klassen IgGJgM, IgD und IgA getestet. Hybridomkulturen, die mit allen anderen humanen Immunglobulinklassen nicht reagieren, jedoch deutlich das Myelomprotein lgEy_u binden, werden auf ihre Bindungsfähigkeit an das Myelomprotein lgE_ND getestet. Hybridomkulturen, die Antikörper enthalten, die außer lgE_Yu und ІдЕмо binden, werden mit einem Hemmtest weiter charakterisiert. Hierzu wird versucht, die Bindung der Hybridomantikörper an PVC-adsorbiertes lgE_Yu durch verschiedene Konzentrationen von lgEy_u, IgE^o« Human-lgE-haltige Standardseren der Firmen Pharmacia (Schweden) und BehringwerkeAG (BRD) sowie eine Palette von Humanimmunglobulinen der Klassen IgG, IgM, IgD und IgA zu hemmen. Auf die geschilderte Weise wird eine Serie von Hybridomen (H-BL-lgE/1—4) erhalten, die die wertvolle Eigenschaft haben, Antikörper zu sezernieren, die nicht nur mit den Immunogenen lgE_Yu und lgE_N0' sondern überraschenderweise auch spezifisch mit normalem Human-lgE reagieren. Die Hybridome der Serie H-BL-lgE/1—4 sind sehr produktiv. Des weiteren sind sie gut zu handhaben und können über längere Zeit aufbewahrt werden. — Die durch die vorstehend beschriebene Selektion erhaltenen Hybridome werden rekloniert und Subklone werden erhalten, die stabil die gewünschten Antikörper produzieren.Hybridoma antibodies bound specifically to the IgEy _{1 are} detected by ¹²⁵ I-labeled anti-mouse immunoglobulin antibodies or by a monoclonal PAP complex. The antibody-containing cultures are then assayed in the same way with immunoglobulin preparations of classes IgGJgM, IgD and IgA. Hybridoma, but do not react with any other human immunoglobulin classes, significantly myeloma protein lgEy bind _and are tested for their ability to bind to the myeloma protein IgE _ND. Hybridoma cultures containing antibodies that bind except IgE _Yu and ІдЕмо are further characterized with an inhibition assay. For this purpose, the binding of the hybridoma antibodies to PVC-adsorbed IgE _Yu by various concentrations of IgEy _u , IgE ^ o «human IgE-containing standard serums from Pharmacia (Sweden) and Behringwerke AG (Germany) and a range of human IgG immunoglobulins , IgM, IgD and IgA. In the manner a series of hybridomas is obtained (H-BL-IgE / 1-4), who have the valuable property to secrete antibodies that not only with the immunogens IgE _Yu and IgE _N0 'but surprisingly also specifically with normal Human IgE react. The hybridomas of the series H-BL-IgE / 1-4 are very productive. Furthermore, they are easy to handle and can be stored for a long time. The hybridomas obtained by the selection described above are recloned and subclones are obtained which stably produce the desired antibodies.

Zur Herstellung der Antikörper der Serie BL-lgE/1-4, im folgenden kurz als BL-IgE bezeichnet, wird das entsprechende Hybridom in histokompatible A χ BALB/c-F, Mäuse i.p. injiziert. Es ist vorteilhaft, wenn die eingesetzten Mäuse mit einem Tumorstimulator wie Paraffinum subliquidum, Pristan o. dgl. vorbehandelt worden sind. — Nach der Aszitesbildung, die durch Anschwellen sichtbar wird, wird die den monoklonalen Antikörper BL-IgE enthaltende Aszitesflüssigkeit entnommene. B. durch Punktion. Aus der Aszitesflüssigkeit werden die zellulären Bestandteile abgetrennt, z. B. durch Zentrifugieren. Der zelluläre Anteil besteht zum überwiegenden Teil aus Zellen des Hybridoms H-BL-IgE. Er wird zweckmäßigerweise mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und kann erneut injiziert werden. Der klare Überstand, der den monoklonalen Antikörper BL-IgE enthält, wird entweder direkt bzw. in geeigneter Verdünnung eingesetzt oder weiterer Reinigung unterzogen. Zur weiteren Reinigung kommen Verfahren wie DEAE-Ionenaustauschchromatographie, Protein-A-Adsorption, Affinitätschromatographie o.dgl. in Frage, die den Isotyp das BL-IgE spezifisch anreichern, oder Verfahren der Immunadsorption, die den Antikörper BL-IgE antigenspezifisch isolieren. Die Aszitesflüssigkeit enthält bei erfindungsgemäßer Verfahrensdurchführung 5 bis 10mg BL-IgE pro ml Flüssigkeit. Anreicherung führt zu einem Produkt mit einem Antikörpergeh a It von ca. 20 mg/ml.For the preparation of the antibodies of the series BL-IgE / 1-4, hereafter referred to as BL-IgE, the corresponding hybridoma in histocompatible A χ BALB / c-F, mice i.p. injected. It is advantageous if the mice used have been pretreated with a tumor stimulator such as Paraffinum subliquidum, Pristan or the like. After ascites formation, which becomes visible by swelling, the ascites fluid containing the monoclonal antibody BL-IgE is removed. B. by puncture. From the ascites fluid, the cellular components are separated, z. B. by centrifugation. The cellular part consists predominantly of cells of the hybridoma H-BL-IgE. It is conveniently washed with physiological saline and can be re-injected. The clear supernatant containing the monoclonal antibody BL-IgE is either used directly or in a suitable dilution or subjected to further purification. For further purification, methods such as DEAE ion exchange chromatography, protein A adsorption, affinity chromatography or the like. in question, which specifically accumulate the isotype of the BL-IgE, or immunoadsorption methods which specifically isolate the antibody BL-IgE antigen. The ascitic fluid contains 5 to 10 mg of BL-IgE per ml of liquid in the process according to the invention. Enrichment leads to a product with an antibody content of about 20 mg / ml.

Zum Herstellen einer stabilen Aufbewahrungsform, die auch als Handelspräparat geeignet ist, wird die Immunglobulinfraktion der zellfreien Aszitesflüssigkeit präzipitiert, z. B. mit 50% gesättigter (NH₄)₂SO₄-Lösung und in gepufferter physiologischer Kochsalzlösung aufgenommen. Dialysieren gegen NH₄HCO₃-Lösung führt zu einem lyophilisierbaren Produkt, das lyophilisiert bei +4°C haltbar ist.To produce a stable storage form which is also suitable as a commercial preparation, the immunoglobulin fraction of the cell-free ascites fluid is precipitated, for. B. with 50% saturated (NH ₄ ) ₂ SO ₄ solution and taken up in buffered saline. Dialyzing against NH ₄ HCO ₃ solution results in a lyophilizable product that is lyophilized at + 4 ° C.

In einer zweiten Ausführungsform der Erfindung werden die jeweiligen Hybridome aus der Serie H-BL-lgE/1-4 in einem Kulturmedium mit Serumzusatz in Massenkultur aufgezogen. Nach entsprechender Kultivierung in CO₂-haltiger Atmosphäre wird das nunmehr antikörperenthaltende Kulturmedium mit 50% gesättigtem (NH₄J₂SO₄ versetzt und eine Gammaglobulinfraktion erhalten. Weitere Reinigung des Antikörpers ist nach an sich bekannten Verfahren wie Gelfiltration, lonenaustauschchromatographie o.dgl. möglich. Es ist zweckmäßig, als Kulturmedium MEM Eagle, Dulbeccos MEM, RPMI o.dgl. anzuwenden. Besonders günstig ist die Verwendung von RPMI-1640, das in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung mit 1OmM HEPES, 5 · 1O^-5M Mercaptoethanol, 100mg/l Gentamycin versetzt ist. Als Serumzusatz dient fetales Kälberserum oder Pferdenormalserum mit einem Anteil am Kulturmedium von 5 bis 20%. Vorteilhaft ist es, mit einem Serumanteil von 10% zu arbeiten. Die Temperatur des Kulturmediums liegt zwischen 25°C und 40⁰C, insbesondere zwischen 35°C und 38°C. Vorteilhaft ist es, bei 37°C zu arbeiten. Der CO₂-Gehalt der Atmosphäre über dem Kulturmedium beträgt günstig 2 bis 10%, insbesondere 5%. Vorteilhaft ist eine hohe Luftfeuchtigkeit, die bis zur Sättigung der Atmosphäre reichen kann. Die Kultivierung des Hybridoms erfolgt über einen üblichen Zeitraum von mehreren Tagen.In a second embodiment of the invention, the respective hybridomas from the series H-BL-IgE / 1-4 are cultivated in a culture medium supplemented with serum in mass culture. After appropriate cultivation in a CO ₂ -containing atmosphere, the culture medium now containing the antibody is mixed with 50% saturated (NH ₄ J ₂ SO ₄₎ and a gamma globulin fraction is obtained Further purification of the antibody is possible by processes known per se, such as gel filtration, ion exchange chromatography or the like It is expedient to use MEM Eagle, Dulbecco's MEM, RPMI or the like as the culture medium, and it is particularly advantageous to use RPMI-1640 which, in a preferred embodiment of the invention, contains 10 mM HEPES, 5 × 10 ^-5 M mercaptoethanol, 100 mg / l gentamycin were added. fetal calf serum or horse normal serum is used as the addition of serum to a share of the culture medium of 5 to 20%. it possible to work with a serum content of 10% is advantageous. the temperature of the culture medium is between 25 ° C and 40 ⁰ C. , in particular between 35 ° C and 38 ° C. It is advantageous to work at 37 ° C. The CO ₂ content of the atmosphere over the culture medium bet ranks favorably 2 to 10%, especially 5%. The advantage is a high humidity, which can reach saturation of the atmosphere. The cultivation of the hybridoma takes place over a customary period of several days.

1. Ausführungsbeispiel1st embodiment

Auf flüssigem Stickstoff gelagerte Hybridomzellen (H-BL-lgE/1-4) werden aufgetaut und zweimal mit Kulturmedium gewaschen. Die Zelldichte wird auf 1-5 χ 10⁵ Zellen pro ml Kulturmedium eingestellt und in geeigneten Gewebekulturflaschen kultiviert. Das Kulturmedium besteht aus RPM11640, welches mit Natriumhydrogenkarbonat (2g/l), Mercaptoethanol (5 · 10"⁵M), Gentamycin (ЮОтд/І) und N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-ethansulfonsäure (lOmM)ergänzt wird.Hybridoma cells (H-BL-IgE / 1-4) stored on liquid nitrogen are thawed and washed twice with culture medium. The cell density is adjusted to 1-5 χ 10 ⁵ cells per ml of culture medium and cultured in appropriate tissue culture flasks. The culture medium consists of RPM11640 which with sodium bicarbonate (2g / l), mercaptoethanol (5 x 10 ^"5 M), gentamycin (ЮОтд / І) and N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-ethanesulfonic acid (lOmm) is added.

Dieses Medium wird mitThis medium comes with

a) fetalem Kälberserum odera) fetal calf serum or

b) Pferdenormalserumb) Horse Normal Serum

supplementiert. Die möglichen Anteile sind 5 bis 20%. Als geeignet hat sich 10% Serumanteil erwiesen.supplemented. The possible shares are 5 to 20%. 10% serum content has proven to be suitable.

Die günstigsten Kulturbedingungen werden erreicht, wenn die Zellen bei +37⁰C in einer wassergesättigten 5%igen CO₂-Atmosphäre bebrütet werden.The best culture conditions are achieved when the cells at +37 ⁰ C in a water-saturated 5% CO ₂ atmosphere are incubated strength.

Nach 3-4Tagen werden die Zellkulturüberstände steril entnommen. Die z.T. an der Gefäßwand anhaftenden Zellen können erneut mit frischem Medium versorgt und bebrütet werden. Dabei ist jedoch auf die optimale Zelldichte zu achten. Die im Kulturüberstand enthaltenen Hybridzellen werden durch Zentrifugation abgetrennt. Sie können zur Aussaat in neue Kulturgefäße verwendet werden.After 3-4 days, the cell culture supernatants are removed under sterile conditions. The z.T. Cells adhering to the vessel wall can be re-supplied with fresh medium and incubated. However, it is important to pay attention to the optimal cell density. The hybrid cells contained in the culture supernatant are separated by centrifugation. They can be used for sowing in new culture vessels.

Die zellfreien Kulturüberstände enthalten den monoklonalen Antikörper BL-IgE. Die Konzentration des Antikörpers BL-IgE ist ausreichend für die üblichen diagnostischen Nachweisverfahren von Human-lgE (wie z. B. enzymimmunologische Nachweise, Radiobindungstechniken).The cell-free culture supernatants contain the monoclonal antibody BL-IgE. The concentration of the antibody BL-IgE is sufficient for the usual diagnostic detection methods of human IgE (such as enzyme immunological detection, radio linkage techniques).

Gegebenenfalls kann der Titer mit einer geeigneten Technik bestimmt werden. Hochtitrige Kulturüberstände gestatten eine Verdünnung bis zur gewünschten Arbeitskonzentration.Optionally, the titer can be determined by a suitable technique. High titre culture supernatants allow dilution to the desired working concentration.

Werden höhere Konzentrationen des Antikörpers benötigt, so werden die Kulturüberstände mit 50% gesättigtem Ammoniumsulfat gefällt. Die so erhaltene Gammaglobulinfraktion kann durch weitere bekannte Trenntechniken (lonenaustauschchromatographie, Gelfiltration usw.) weitergereinigt werden.If higher concentrations of the antibody are required, the culture supernatants are precipitated with 50% saturated ammonium sulfate. The gamma globulin fraction thus obtained can be further purified by further known separation techniques (ion exchange chromatography, gel filtration, etc.).

Werden hochgereinigte monoklonale Antikörper benötigt, so können diese durch Immunadsorption an trägerfixierte Anti-Maus-Immunglobulinantikörper von den aus Kälberserum bzw. Pferdeserum stammenden Begleitproteinen abgetrennt werden und durch schonend wirkende Desorbentien (3M KSCN oderGlycin/HCL-PufferpH2,8) von diesem Immunadsorbens wieder isoliert werden.If highly purified monoclonal antibodies are required, they can be separated from the calf serum or horse serum-derived accompanying proteins by immunoadsorption on carrier-fixed anti-mouse immunoglobulin antibodies and isolated again from this immunoadsorbent by gently acting desorbents (3M KSCN or glycine / HCL buffer pH2.8) become.

2. Ausführungsbeispiel2nd embodiment

Eingesetzt werden Zellen eines Hybridoms der Serie H-BL-lgE/1—4, die gegebenenfalls in vitro vorkultiviert werden. Nach Waschen in serumfreier physiologischer Kochsalzlösung werden 10⁵ bis 5 · 10⁷ lebende Zellen histokompatiblen Mäusen intraperitoneal injiziert. Als histokompatible Mäuse werden F_rHybride der Stämme A und BALB/c eingesetzt, die mit einem Tumorstimulator, hier mit 0,5ml Paraffinum subliquidum i. p. 2 Wochen vor der Hybridominjektion behandelt worden sind.Cells of a hybridoma of the series H-BL-IgE / 1-4 are used, which are optionally pre-cultured in vitro. After washing in serum-free physiological saline, 10 ⁵ to 5 x 10 ⁷ live cells are injected intraperitoneally into histocompatible mice. As histocompatible mice F _r hybrids of strains A and BALB / c are used, which have been treated with a tumor stimulator, here with 0.5 ml Paraffinum subliquidum ip 2 weeks before hybridoma injection.

Nach dem Einsetzen der Aszitesbildung werden die Mäuse punktiert. Die abgenommenen Aszitesflüssigkeiten, die den monoklonalen Antikörper BL-IgE enthalten, werden durch Zentrifugation in zelluläre Bestandteile und in Aszitesflüssigkeit getrennt. Der zelluläre Anteil besteht zum überwiegenden Anteil aus Zellen des Hybridoms H-BL-IgE. Diese Hybridomzellen werden mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und wie oben beschrieben eingesetzt, indem sie histokompatiblen Mäusen i. p. injiziert werden. Solche Passagen sind wiederholt möglich. Die Immunglobulinfraktion der zellfreien Aszitesflüssigkeit wird mit 50% gesättigtem (NH₄I₂SO₄ präzipitiert und in gepufferter physiologischer Kochsalzlösung aufgenommen. Diese Lösung wird gegen 0,5%ige NH₄HCO₃-Lösung dialysiert. Anschließend erfolgt die Lyophilisierung. Der Antikörper BL-IgE ist lyophilisiert bei +4⁰C ohne Verlust der Bindungseigenschaften haltbar. Der Antikörpertiter wird durch Herstellen einer Verdünnungsreihe und Austestung mittels indirekter Radiobindungstechnik unter Verwendung von PVC-Mikrotiterplatten, die mit einem IgE-Myelomprotein beschichtet sind, ermittelt. Als Titer wird diejenige größte Verdünnung des monoklonalen Antikörpers angegeben, bei der 50% der radiomarkierten Anti-Mausimmunglobulin-Antikörper, die bei maximaler Bindung angelagert sind, gebunden werden.After the onset of ascites formation, the mice are punctured. The collected ascites fluids containing the monoclonal antibody BL-IgE are separated by centrifugation into cellular components and ascites fluid. The cellular portion consists predominantly of cells of the hybridoma H-BL-IgE. These hybridoma cells are washed with physiological saline and used as described above by ip injection into histocompatible mice. Such passages are possible repeatedly. The immunoglobulin fraction of the cell-free ascitic fluid is precipitated with 50% saturated (NH ₄ I ₂ SO ₄ and taken up in buffered saline solution.) This solution is dialyzed against 0.5% NH ₄ HCO ₃ solution, followed by lyophilization IgE lyophilized is stable at +4 ⁰ C without loss of binding properties The antibody titer is determined by preparing a serial dilution and testing by indirect radio-linkage technique using PVC microtiter plates coated with an IgE myeloma protein Specified dilution of the monoclonal antibody bound to 50% of the radiolabelled anti-mouse immunoglobulin antibodies attached at maximal binding.

Die monoklonalen Antikörper der Serie BL-lgE/1 —4 haben die überraschende Eigenschaft, epsilonkettenspezifische Determinanten von normalem humanem IgE zu erkennen. Daraus ergeben- sich günstige diagnostische und therapeutische Möglichkeiten. Die Antikörper selbst sind unkompliziert zu handhaben, gut lagerfähig und in größeren Mengen herstellbar.The monoclonal antibodies of the series BL-IgE / 1 -4 have the surprising property of recognizing epsilon-chain-specific determinants of normal human IgE. This results in favorable diagnostic and therapeutic possibilities. The antibodies themselves are uncomplicated to handle, easy to store and can be produced in larger quantities.

Durch das angegebene Verfahren zu ihrer Herstellung wird einem seit langem bestehenden gesellschaftlichen Bedürfnis entsprochen.The specified method for their production meets a long-standing social need.

Die Hybridome H-BL-lgE/1-4 sind an der Sektion Biowissenschaften der Karl-Marx-Universität Leipzig zugänglich. Die produzierten monoklonalen Antikörper BL-lgE/1-4 haben folgende Registriernummern im Zentralen Institut für Molekularbiologie erhalten:The hybridomas H-BL-IgE / 1-4 are available at the Life Sciences Section of Karl Marx University Leipzig. The produced monoclonal antibodies BL-IgE / 1-4 have received the following registration numbers in the Central Institute of Molecular Biology:

BL-lgE/1 = DDR 0052 (IgG 1, hochaffin)BL-IgE / 1 = DDR 0052 (IgG 1, high affinity)

BL-lgE/2 = DDR 0053 (IgG 2 a)BL-IgE / 2 = DDR 0053 (IgG 2 a)

BL-lgE/3 = DDR 0094 (IgG 2 b)BL-IgE / 3 = DDR 0094 (IgG 2 b)

BL-lgE/4 = DDR 0095 (IgG 1, niederaffin).BL-IgE / 4 = DDR 0095 (IgG 1, low affinity).

Der monoklonale Antikörper BL-lgE/1 eignet sich besonders für den Nachweis von allergenspezifischem IgE aus Patientenserum.The monoclonal antibody BL-IgE / 1 is particularly suitable for the detection of allergen-specific IgE from patient serum.

Claims

claims:

1. A process for the preparation of monoclonal antibodies to human IgE, characterized in that 6-8 weeks old female Α mice are immunized with human IgE myeloma proteins, the spleen lymphocytes of hyperimmune mice are hybridized with myeloma cells, hybridoma cells of the type H-BL-IgE / 1 ^ be selected, cultivated hybridoma cells are cultivated in vivo or in vitro and the respective antibodies are isolated.

2. The method according to claim 1, characterized in that are used as myeloma cells of the line P3-X-63 Ag8.653.

3. The method according to claim 1 and 2, characterized in that the immunization of the mice is carried out by a series of injections with the human myeloma protein IgE _Yu .

4. The method according to claim 1 to 3, characterized in that the last immunization 4 days before the isolation of the specific for the hybridization B lymphocytes with another human IgE myeloma protein, such as IgE _N0 - made.

5. The method according to claim 4, characterized in that the ratio of myeloma cells and B-lymphoblasts, which are intended for fusion, is about 1: 1.

6. The method according to claim 1 to 5, characterized in that in the step of separating the unhybridized myeloma cells from the hybrid cells, the culture medium used spleen cells of unimmunized A χ BALB / c-F, -hybrid mice.

7. The method according to claim 1, characterized in that the testing of the supernatants of the cultures containing the growing hybrid cells on their reaction with human IgE by indirect radio linkage technique or the monoclonal PAP technique using IgE myeloma proteins and normal IgE occurs and the detection of non-reacting with a Series of human immunoglobulins of the isotypes IgG, IgM, IgA and IgD is performed.

8. The method according to claim 1, characterized in that antibody-producing hybridoma cells of the hybridoma series H-BL-IgE / 1-4 are grown in a culture medium in mass culture, wherein the culture medium, a serum is added, after appropriate cultivation in СОг-containing Atmopshäredas now antibody-containing Culture medium with 50% saturated (NH ₄ J ₂ SO ₄ added and a gamma globulin fraction is obtained, from which after further workup in a conventional manner, the monoclonal antibody is isolated.

9. The method according to claim 1 and 8, characterized in that are used as serum fetal calf serum or normal horse serum.

10. The method according to claim 9, characterized in that the proportion of fetal calf serum in the culture medium is about 10%, that of the horse normal serum is also about 10%.