DD230878A1 - PROCESS FOR THE PRODUCTION OF MONOCLONAL ANTIBODY FOR HUMANESE IGE - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikoerper fuer IgE. Es ist das Ziel, ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikoerper anzugeben, das in leicht beherrschbarer Weise die kostenguenstige Produktion groesserer Mengen dieses spezifischen Antikoerpers fuer humanes IgE gestattet. Die Aufgabe wird darin gesehen, zunaechst ein Hybridom zu selektionieren, das leicht und unaufwendig handhabbar ist und dessen Kultivierung technisch einfach ist. Unter Verwendung dieses Hybridoms soll ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikoerper verwirklicht werden, die zur Reaktion mit humanem IgE befaehigt sind. Die Aufgabe wird geloest, indem zunaechst die Hybridome H-BL-IgE/1-10 selektioniert, kloniert und rekloniert werden und damit in vivo oder in vitro die entsprechenden Antikoerper hergestellt werden.The invention relates to a process for the preparation of monoclonal antibodies for IgE. The object is to provide a process for the production of monoclonal antibodies which, in an easily controllable manner, permits the cost-effective production of larger quantities of this specific antibody for human IgE. The object is seen, first to select a hybridoma, which is easy and inexpensive to handle and whose cultivation is technically simple. Using this hybridoma, a process for producing monoclonal antibodies capable of reacting with human IgE is to be realized. The object is achieved by first selecting, cloning and recloning the hybridomas H-BL-IgE / 1-10 and thus producing the corresponding antibodies in vivo or in vitro.
Description
Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper für humanes IgEProcess for the preparation of monoclonal antibodies to human IgE
Anwendungsgebiet der Erfindung Field of application of the invention
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper, die zur.Reaktion mit humanem IgE befähigt sind.The invention relates to a method for producing monoclonal antibodies capable of reacting with human IgE.
Es ist bereits bekannt, monoklonale Antikörper herzustellen. Zu diesem Zweck werden zunächst durch Fusion antikörperbildender Zellen mit einer permanent wachsenden Plasmozytomlinie Hybridzellinien erzeugt, die permanent wachsen und stabil Antikörper sezernieren (Köhler, Milstein, Nature 256, (1975), 495). Diese Prinziplösung hat dazu geführt, daß verschiedene Hybridomlinien hergestellt worden'sind, die Antikörper unterschiedlicher Spezifität produzieren. Die Bildung der Antikörper kann dabei in vitro, aber auch in vivo erfolgen. Zum Beispiel sind Antikörper hergestellt worden, die mit verschiedenen humanen Immunglobulinen reagieren. Monoklonale Antikörper gegen humanes IgE sind von der Firma SEROTEC (Großbritannien) im Katalog ausgewiesen. Außer diesem sind jedoch keine Antikörper bekannt, die in der erforderlichen und gewünschten Weise mit humanem IgE reagieren.It is already known to produce monoclonal antibodies. For this purpose, hybrid cell lines are first generated by fusion of antibody-forming cells with a permanently growing Plasmozytomlinie that grow permanently and stably antibodies secrete (Köhler, Milstein, Nature 256 , (1975), 495). This principle solution has led to the production of various hybridoma lines which produce antibodies of different specificity. The formation of the antibodies can take place in vitro, but also in vivo. For example, antibodies have been produced which react with various human immunoglobulins. Monoclonal antibodies to human IgE are listed in the catalog by SEROTEC (UK). Apart from this, however, no antibodies are known which react in the required and desired manner with human IgE.
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Die Erfindung hat daa Ziel, ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper, die- spezifisch mit Determinanten der schweren Kette des humanen IgE reagieren, anzugeben. Das Verfahren soll in leicht beherrschbarer Weise die kostengünstige Produktion größerer Mengen dieses spezifischen Antikörpers gestatten. Dabei soll gleichbleibende Qualität gewährleistet sein, der Antikörper soll stabil und lagerfähig sein und sich zur Verwendung in einem einfachen und exakten Nachreistest für humanes IgE eignen, wobei Kreuzreaktionen mit anderen humanen Immunglobulinisotypen nicht vorkommen sollen.The object of the invention is to provide a method for producing monoclonal antibodies which react specifically with determinants of the human IgE heavy chain. The process should allow, in a readily controllable manner, the cost effective production of larger quantities of this specific antibody. It should be ensured consistent quality, the antibody should be stable and storable and are suitable for use in a simple and accurate Nachreistest for human IgE, cross-reactions with other human immunoglobulin isotypes should not occur.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein nachvollziehbares Verfahren zur Verfügung zu stellen, in dessen Verlauf zunächst ein Hybridom erzeugt wird, das leicht und unaufwendig handhabbar ist und dessen Kultivierung in technisch und ökonomisch vorteilhafter Weise möglich ist. Unter Verwendung dieses Hybridoms soll ein Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern, die zur spezifischen Reaktion mit humanem IgE befähigt sind, verwirklicht werden. Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß zunächst nach an sich bekannten Verfahren eine Immunglobulinfraktion aus den Seren von Patienten (z.B. den Patienten mit den Abkürzungen Yu und HD), die IgS-Myelomprotein in hoher Konzentration enthalten, isoliert wird. Das kann z.B. durch Aussalzen und Ionenaustauschchromatographie geschehen. Aus diesen Iiimiunglobulinfraktionen werden nach dem von Nealin · ( Nezlin et al. Immunochem. _1Ο_, 1973, 681 beschriebenen Verfahren die Hyelomproteine IgEv und IgSjm isoliert, mit denen erfindungsgemäß Mäuse immunisiert werden. Vorzugsweise werden 6 bis 8 Wochen alte weibliche A-Mäuse verwendet. Die Immunisierung erfolgt durch mehrmalige Applikation, des Myelomproteins IgSy (jeweils 100/Ug/Maus), wobei die erste Antigengabe mit komplettem Preundschen AdjuvansThe invention has for its object to provide a traceable process available, in the course of which a hybridoma is first generated, which is easy and inexpensive to handle and its cultivation is possible in a technically and economically advantageous manner. Using this hybridoma, a method for producing monoclonal antibodies capable of specifically reacting with human IgE is to be realized. The object is achieved according to the invention by first isolating an immunoglobulin fraction from the sera of patients (eg the patients with the abbreviations Yu and HD) containing IgS myeloma protein in high concentration by methods known per se. This can be done, for example, by salting out and ion exchange chromatography. From these immunoglobulin fractions, according to the method described by Nealin® (Nezlin et al., Immunochem., 1973, 681), the hyelom proteins IgE v and IgSjm are isolated, which mice are immunized according to the invention Preferably, 6 to 8 week old female A mice are used The immunization is carried out by repeated application of the myeloma protein IgSy (100 / ug / mouse each), the first antigen giving complete Preund's adjuvant
erfolgt. Vier Tage vor der Entnahme, der Milzen für die Fusion wird, mit dem Myelomprotein IgE™ eine Boosterung durchgeführt. Aus den Milzen derart hyperiinmuner Mäuse wurden die Lymphozyten in an sich bekannter Weise separiert. Die B-Lymphozyten dieses Zellgemisches werden mit Maus-B—Kfcyelomzellen fusioniert bzw. hybridisiert. Die notwendigen Maus-B-Myelomzellen P 3 - X - 63 Ag 8.653 (KEARNEY et al., J.Immunol. V23, (1979), 1548) werden in RPMI-164O mit 10 % fetalem Kälberserum (MS) gezüchtet. In einem Kulturmedium, welches Hypoxanthin, Aminop-.terin und Thymidin enthält (Littlefield, Science, 165, (ί9β4), 709), werden die gebildeten Hybride von den nicht fusionierten Myelomzellen abgetrennt und erfindungsgemäß ein Zeilklon selektioniert, der Antikörper der gewünschten Art sezerniert. Die Selektionierung des Eybridoms erfolgt in der Weise, daß ' die Zellen unmittelbar nach der Fusion in eine Vielzahl von separaten 200-/ul-KuItüren aufgeteilt werden. Die Überstände der die aufwachsenden Hybridzellen enthaltenden Kulturen werden auf die Anwesenheit von Antikörpern geprüft, die mit dem Myelomprotein IgEy reagieren. Die Testung erfolgt zweckmäßigerweise mittels indirekter Radiobindungstechnik oder monoklonaler PAP-Technik. Dazu wird das Protein adsorptiv an Polyviuylchloridmikrotiterplatten gebunden, unspezifische Restbindungsstellen mit 2 % fetalem Kälberserum geblockt und mit den Hybridzellkulturuberständen inkubiert.,Spezifisch an das IgEy11 gebundene Hybridomantikörper werden durch 9J-markierte Anti-Mausimmunglobulin-Antikörper oder durch einen monoklonalen PAP-Komplex nachgewiesen.he follows. Four days prior to collection, the spleens for fusion are boosted with the myeloma protein IgE ™. From the spleens of such hyperinmunic mice, the lymphocytes were separated in a manner known per se. The B-lymphocytes of this cell mixture are fused or hybridized with mouse B-Kfcyeloma cells. The necessary mouse B myeloma cells P 3 - X - 63 Ag 8.653 (KEARNEY et al., J. Immunol., V23, (1979), 1548) are grown in RPMI-164O with 10 % fetal calf serum (MS). In a culture medium containing hypoxanthine, aminopteratin and thymidine (Littlefield, Science, 165 , (ί9β4), 709), the hybrids formed are separated from the unfused myeloma cells and, according to the invention, a cell clone is selected which secretes antibodies of the desired type , Selection of the eyebright is done by dividing the cells into a plurality of separate 200 / μl cells immediately after fusion. The supernatants of the cultures containing the growing hybrid cells are checked for the presence of antibodies which react with the myeloma protein IgEy. The testing is expediently carried out by means of indirect radio-binding technique or monoclonal PAP technique. For this purpose, the protein is bound adsorptively to Polyviuylchloridmikrotiterplatten, non-specific residual binding sites blocked with 2 % fetal calf serum and incubated with the hybrid cell culture supernatants. Specific to the IgEy 11 bound hybridoma antibodies are detected by 9 J-labeled anti-mouse immunoglobulin antibody or by a monoclonal PAP complex ,
Die antikörperenthaltenden Kulturen werden dann in gleicher Weise mit Immunglobulinpräparationen der Klassen IgG, IgM, IgD, und IgA getestet. Hybridomkultüren, die mit, allen anderen humanen Immunglobulinklassen nicht reagieren, jedoch deutlich das Myelomprotein IgEyu binden, werden auf ihre Bindungsfähigkeit an das Myelomprotein IgS,^ getestet. Hybridomkulturen, die Antikörper enthalten, die außer IgEy auch IgE1^0 binden, werden mit einem Hemmtest weiter charakterisiert. Hierzu wird versucht, die Bindung der Hybridomantikörper an PVC-adsorbiertes IgSy durch verschiedene Konzentrationen vonThe antibody-containing cultures are then assayed in the same way with immunoglobulin preparations of classes IgG, IgM, IgD, and IgA. Hybridoma cultures that do not react with all other human immunoglobulin classes but clearly bind the myeloma protein IgEy u are tested for their ability to bind to the myeloma protein IgS. Hybridoma cultures containing antibodies that bind IgE 1 as well as IgE 1 0 are further characterized by an inhibition assay. For this purpose, the binding of the hybridoma antibodies to PVC-adsorbed IgSy by various concentrations of
, IgEjjp, Human-IgE-haltige Standardseren der Firmen Pharmacia (Schweden) und Behringwerke AG (BRD) sowie eine Palette von Humanimmunglobulineη der Klassen IgG, IgM, IgD und IgA zu hemmen., IgEjjp, human IgE-containing standard sera from Pharmacia (Sweden) and Behringwerke AG (Germany) as well as a range of human immunoglobulins η of classes IgG, IgM, IgD and IgA.
Auf die geschilderte Weise wird eine Serie von Hybridomen (H-Bl-IgE/1-10) erhalten, die wertvolle Eigenschaft haben, Antikörper zu sezernieren, die nicht nur mit den Immunogenen lgEyu und .TgEjTQt sondern überraschenderweise auch spezifisch mit normalem Human-IgE reagieren. Die Hybridoma der Serie H-BL-IgE/1-1O sind sehr produktiv. Des weiteren sind sie gut zu handhaben und können über längere Zeit aufbewahrt werden. - Die durch die vorstehend beschriebene Selektion erhaltenen Hybridome werden rekloniert und Subklone werden erhalten, die stabil die gewünschten Antikörper produzieren.In the manner a series of hybridomas (H-Bl-IgE / 1-10) is obtained, which have valuable property to secrete antibodies that not only with the immunogens lgEy u and .TgEjTQt but surprisingly also specifically with normal human IgE react. The hybridomas of the H-BL-IgE / 1-1O series are very productive. Furthermore, they are easy to handle and can be stored for a long time. The hybridomas obtained by the selection described above are recloned and subclones are obtained which stably produce the desired antibodies.
Zur Herstellung der Antikörper der Serie BL-IgE/1-10, im folgenden kurz als BL-IgE bezeichnet, wird das entsprechende Hybridom in histokompatible A χ Balb/c-F.. Mäuse i,p. injiziert. Eg ist vorteilhaft, wenn die eingesetzten Mäuse mit einem Tumorstimulator wie Paraffinum subliquidum, Pristan o. dgl. vorbehandelt worden sind. -Nach der Aszitesbildung, die durch Anschwellen sichtbar wird, wird die den monoklonalen Antikörper BL-IgE enthaltende Aszitesflüssigkeit entnommen, z.B. durch Punktion. Aus der Aszitesflüssigkeit werden die zellulären Bestandteile abgetrennt, z.B. durch Zentrifugieren. Der zelluläre Anteil besteht zum überwiegenden Teil aus Zellen des Hybridoma H-BL-IgE. Er wird zweckmäßigerweise mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen Und kann erneut injiziert werden. Der klare Überstand, der den monoklonalen Antikörper BL-IgE enthält, wird entweder direkt bzw. in geeigneter Verdünnung eingesetzt oder weiterer Reinigung unterzogen. Zur weiteren Reinigung kommen Verfahren wie DEAE-Ionenaust'auschchromatographie, Protein-A-Adsorption, Affinitätschromatographie o. dgl. in Frage, die den Isotyp das BL-IgE spezifisch anreichern, oder Verfahren der Immunadsorption, die den Antikörper BL-IgE antigenspezifisch isolieren. Die Aszitesflüssigkeit enthält bei erfindungsgemäßerFor the production of antibodies of the series BL-IgE / 1-10, hereinafter referred to as BL-IgE, the corresponding hybridoma is transformed into histocompatible A χ Balb / cF .. mice i, p. injected. Eg is advantageous if the mice used have been pretreated with a tumor stimulator such as Paraffinum subliquidum, Pristan or the like. After ascites formation, which becomes visible through swelling, the ascitic fluid containing the monoclonal antibody BL-IgE is removed, eg by puncture. From the ascitic fluid, the cellular components are separated, for example by centrifugation. The cellular part consists for the most part of cells of the hybridoma H-BL-IgE. It is conveniently washed with physiological saline and can be re-injected. The clear supernatant containing the monoclonal antibody BL-IgE is either used directly or in a suitable dilution or subjected to further purification. For further purification, methods such as DEAE Ionenaust'auschchromatographie, protein A adsorption, affinity chromatography o. The like. In question, which specifically enrich the isotype of the BL-IgE, or methods of immunoadsorption, which isolate the antibody BL-IgE antigen-specific. The ascites contains in inventive
Verfahre ns durchführung 5 bis 10 rag BL-IgJc. pro ml Flüssigkeit. -Anreicherung führt zu einem Produkt mit einem Antikörpergehalt von ca. 20 mg/ml. Move 5 to 10 days BL-IgJc. per ml of liquid. Enrichment leads to a product with an antibody content of approx. 20 mg / ml.
Zum Herstellen einer stabilen Aufbewahrungsform, die auch .als HaηdeIspräparat geeignet ist, wird die Immunglobulinfraktion der zellfreien Aszitesflüssigkeit präzipitiert, . z.B. mit 50 % gesättigter (ML)2SO4-Lösung und in gepufferter physiologischer Kochsalzlösung aufgenommen, Dialysieren gegen NH1HCO--Lösung führt zu einem lyophilisierbaren Pro-In order to produce a stable storage form, which is also suitable as a hair-care preparation, the immunoglobulin fraction of the cell-free ascitic fluid is precipitated,. eg with 50 % saturated (ML) 2 SO 4 solution and taken up in buffered physiological saline, dialyzing against NH 1 HCO solution leads to a lyophilisable product.
ο dukt, das lyophilisiert bei +4 C haltbar ist.ο Dukt which is lyophilized at +4 C durable.
In einer zweiten Ausführungsform der Erfindung werden die jeweiligen Hybridome aus der Serie H-BL-IgE/1-10 in einem Kulturmedium mit Serumzusatz in Massenkultur aufgezogen, lach entsprechender Kultivierung in CO?-haltiger Atmosphäre wird das nunmehr antikörperenthaltende Kulturmedium mit 50 % gesättigtem (HEL)2SO. versetzt und eine Gammaglobulinfraktion erhalten. Weitere Reinigung des Antikörpers ist nach an sich bekannten Verfahren wie Gelfiltration, Ionenaustauschchromatographie o. dgl. möglich. Es ist zweckmäßig, als Kulturmedium SiIEM Eagle, Dulbeccos MEM, RPMI o, dgl. anzuwenden* Besonders günstig ist die Verwendung von RPMI-164O, das in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung mit 10 mM HEPES, 5 *" 10"^ H--. Mercaptoethanol, 100 mg/1 Gentamycin versetzt ist. Als Serumzusatz dient fetales Kälberserum oder Pferdenormalserum mit einem Anteil am Kulturmedium,von 5 bis 20 %, Vorteilhaft ist es, mit einem Serumanteil von 10 % zu arbeiten. Die Temperatur des Kulturmediums liegt zwischen 250C und 400C, insbesondere zwischen 35°C und 380C. Vorteilhaft ist es, bei 37.C zu arbeiten. Der C0p-Geha2t der Atmosphäre über dem Kulturmedium beträgt günstig 2 bis 10 %, insbesondere 5 %, Vorteilhaft ist 'eine hohe Luftfeuchtigkeit, die bis zur Sättigung der Atmosphäre reichen kann.In a second embodiment of the invention, the respective hybridomas from the series H-BL-IgE / 1-10 are cultivated in a culture medium with serum addition in mass culture, after appropriate cultivation in CO ? -containing atmosphere is the now antibody-containing culture medium with 50 % saturated (HEL) 2 SO. staggered and received a gamma globulin fraction. Further purification of the antibody is possible by processes known per se, such as gel filtration, ion exchange chromatography or the like. It is expedient to use SiIEM Eagle, Dulbecco's MEM, RPMI, etc. as the culture medium. The use of RPMI-164O, which in a preferred embodiment of the invention comprises 10 mM HEPES, 5 * "10" H - is particularly favorable. , Mercaptoethanol, 100 mg / 1 gentamycin is added. As a serum supplement is fetal calf serum or horse normal serum with a share of the culture medium, from 5 to 20 %, It is advantageous to work with a serum content of 10 % . The temperature of the culture medium is between 25 0 C and 40 0 C, in particular between 35 ° C and 38 0 C. It is advantageous to work at 37.C. The C0p-Geha2t the atmosphere over the culture medium is favorably 2 to 10%, in particular 5 %, 'is a' high humidity, which can reach saturation of the atmosphere.
Die Kultivierung des Hybridoms erfolgt über einen üblichen Zeitraum von mehreren Tagen. Zweckmäßig ist eine Kultivierung von 3 bis 4 Tagen,The cultivation of the hybridoma takes place over a customary period of several days. It is expedient to cultivate for 3 to 4 days,
1. Ausführungsbeispiel 1st embodiment
Auf flüssigem Stickstoff gelagerte .Hybridomzellen (H-BL-IgE/1-10) werden aufgetaut und zweimal mit Kulturmedium gewaschen. Die Zelldichte wird auf 1-5x1O5 Zellen pro ml . Kulturmedium eingestellt und in geeigneten Gewebekulturflaschen kultiviert.Hybridoma cells (H-BL-IgE / 1-10) stored on liquid nitrogen are thawed and washed twice with culture medium. The cell density is increased to 1-5x10 5 cells per ml. Culture medium adjusted and cultured in suitable tissue culture bottles.
Das Kulturmedium besteht aus RPMI I640, welches mit Natriumhydrogenkarbonat (2 g/l), Mercaptoethanol (5x10 ""^M) , Gentamycin (IOO mg/1) und N-2-Hydroxyethylpiperazin-Nf-, ethansulfonsäure (10 mM) ergänzt wird.The culture medium consists of RPMI I640, which with sodium bicarbonate (2 g / l), mercaptoethanol (5x10 "" ^ M), gentamycin (IOO mg / 1) and N-2-hydroxyethylpiperazine-N f -, ethanesulfonic acid (10 mM) added becomes.
Dieses Medium wird mitThis medium comes with
a) fetalem Kälberserum odera) fetal calf serum or
b) Pferdenorma!serumb) Horse norma! serum
supplementiert. Die möglichen Anteile sind 5 bis 20 %. Als geeignet hat sich 10 % Serumanteil erwiesen.supplemented. The possible shares are 5 to 20 %. 10 % serum content has proven to be suitable.
Die günstigsten Kulturbedingungen werden erreicht, wenn die Zellen bei +37 C in einer wassergesättigten 5%igen CO^-Atmosphäre bebrütet werden.The most favorable culture conditions are achieved when the cells are incubated at + 37 C in a water saturated 5% CO 2 atmosphere.
Nach 3 bis 4 Tagen werden die Zellkulturüberstände steril entnommen. Die z,T.' an der Gefäßwand anhaftenden Zellen können erneut mit frischem Medium versorgt und bebrütet werden« Dabei ist jedoch auf die optimale Zelldichte zu achten. Die im Kulturüberstand enthaltenen Hybridzellen werden durch Zentrifugation abgetrennt. Sie können zur Aussaat in neue Kulturgefäße verwendet werden.After 3 to 4 days, the cell culture supernatants are removed under sterile conditions. The z, T. ' Cells adhering to the vessel wall can be re-supplied with fresh medium and incubated. "However, care must be taken to ensure optimal cell density. The hybrid cells contained in the culture supernatant are separated by centrifugation. They can be used for sowing in new culture vessels.
Die zellfreien Kulturüberstände enthalten den monoklonalen Antikörper BL-IgS". Die Konzentration des Antikörpers BL-IgE ist ausreichend für die üblichen diagnostischen Nachweisverfahren von Human—IgE (wie z.B. enzy.miimnunologische Nachweise, Radiobindungstechniken)..The cell-free culture supernatants contain the monoclonal antibody BL-IgS. "The concentration of the antibody BL-IgE is sufficient for the usual diagnostic detection methods of human IgE (such as enzyme immunological detection, radio linkage techniques).
Gegebenenfalls kann der Titer mit einer geeigneten Technik bestimmt werden. Hochtitrige Kulturüberstände gestatten eine Verdünnung bis zur. gewünschten Irbeitskonzentration..Optionally, the titer can be determined by a suitable technique. High titre culture supernatants allow dilution up to. desired working concentration ..
Werden höhere Konzentrationen des Antikörpers benötigt, so werden die Kulturüberstände mit 50 % gesättigtem Ammoniumsulfat gefällt. Die so erhaltene Gammaglobulinfraktion kann durch weitere bekannte Trenntechniken (Ionenaustauschchromatographie, Gelfiltration usw.) weitergereinigt werden.If higher concentrations of the antibody are required, the culture supernatants are precipitated with 50 % saturated ammonium sulfate. The gamma globulin fraction thus obtained can be further purified by further known separation techniques (ion exchange chromatography, gel filtration, etc.).
Werden hochgereinigte monoklonale Antikörper benötigt, so können diese durch Immunadsorption an trägerfixierte Anti-Maus-Immunglobulinantikörper von den aus Kälberserum bzw. Pferdeserum stammenden Begleitproteinen abgetrennt werden und durch schonend wirkende Desorbentien (3 MKSCN, oder Glycin/HCL-Puffer pH 2,8) von diesem Immunadsorbens wieder isoliert werden,If highly purified monoclonal antibodies are required, they can be separated from the calf serum or horse serum derived accompanying proteins by immunoadsorption on carrier-fixed anti-mouse immunoglobulin antibodies and by gently acting desorbents (3 MKSCN, or glycine / HCl buffer pH 2.8) of be isolated again in this immunoadsorbent,
2, Ausfuhrungsbeispiel2, exemplary embodiment
Eingesetzt werden Zellen eines Hybridoms der Serie H-BL-IgE/1-10, die gegebenenfalls in vitro vorkultiviert werden. Nach Waschen in serumfreier ühysiologischer Koch-Cells of a hybridoma series H-BL-IgE / 1-10 are used, which are optionally pre-cultured in vitro. After washing in serum-free physiological cooking
5 7 salzlösung werden 10^ bis 5 β 10 lebende Zellen histokompatiblen Mäusen intraperitoneal injiziert. Als histokompatible Mäuse werden F..-Hybride der Stämme Ä uha Balb/c eingesetzt, die mit einem Tumorstimulator, hier mit 0,5 nil Paraffinum subliquidum i.p. 2 Wochen vor der Hybridominjektion'behandelt worden sind. Nach dem Einsetzen der Aszitesbildung werden die Mäuse punktiert. Die abgenommenen AszitesflÜ3sigkeiten, die den monoklonaleη Antikörper BL-IgE enthalten, werden durch Zentrifugieren in zelluläre Bestandteile und in Aszitesflüssigkeit getrennt.In the same way, 10 ^ to 5 β 10 live cells are injected intraperitoneally into histocompatible mice. The histocompatible mice used are F. Hybrids of the strains Ä uha Balb / c, which have been treated with a tumor stimulator, here with 0.5 μl of Paraffinum subliquidum ip 2 weeks before the hybridinjection. After the onset of ascites formation, the mice are punctured. The collected ascites fluids containing the monoclonal antibody BL-IgE are separated by centrifugation into cellular components and ascites fluid.
Der zelluläre Anteil besteht zum überwiegenden Anteil aus Zellen des Eybridoms H-BL-IgE. Diese Hybridomzellen werden mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und wie oben beschrieben eingesetzt, indem sie histokompatiblen Musen i.p, injiziert werden. Solche Passagen sind wiederholt möglich.The cellular portion consists predominantly of cells of the eyebridge H-BL-IgE. These hybridoma cells are washed with saline and used as described above by injecting histocompatible mice i.p. Such passages are possible repeatedly.
Die Inmunglobulinfraktion der zellfreien Aszitesflüssigkeit wird mit 50 % gesättigtem (KH*)„SO. präzipitiert und in gepufferter physiologischer Kochsalzlösung aufgenommen. Diese Lösung wird gegen 0,5 %-ige KH.HCO--Lösung dialysiert. Anschließend erfolgt die Lyophilisierung. Der Antikörper BL-IgE ist lyophilisiert bei +40C ohne Verlust der Bindungseigenschaften haltbar. Der -Antikörpertiter wird durch Herstellen einer Verdünnungsreihe und .Austestung mittels indirekter Radiobindungstechnik unter Verwendung von PVC.-Mikrotiterplatten, die mit einem IgE-Eyelomprotein beschichtet sind,'ermittelt. «Als Titer wird diejenige größte Verdünnung des monoklonalen Antikörpers angegeben, bei der 50 % der radiomarkierten Anti-Mausimmunglobulin-Antikorper, die bei maximaler Bindung angelagert sind, gebunden werden.The inulin globule fraction of the cell-free ascitic fluid is treated with 50 % saturated (KH *) "SO. precipitated and taken up in buffered saline. This solution is dialyzed against 0.5% KH.HCO solution. Subsequently, the lyophilization takes place. The antibody BL-IgE is lyophilized at +4 0 C without loss of binding properties. Antibody titer is determined by preparing a dilution series and performing indirect radio-linkage technique using PVC microtiter plates coated with an IgE eyeloma protein. "The titre is the maximum dilution of the monoclonal antibody bound to 50% of the radiolabelled anti-mouse immunoglobulin antibodies attached at maximal binding.
Die monoklonalen Antikörper der Serie BL-IgE/1-10 haben die überraschende Eigenschaft, epsilonkettenspezifische Determinanten von normalem humanem IgE zu erkennen. Daraus ergeben sich günstige diagnostische und therapeutische Möglichkeiten. Die Antikörper selbst sind unkompliziert zu handhaben, gut lagerfähig und in größeren Mengen herstellbar. Durch das angegebene Verfahren zu ihrer Herstellung wird einem seit langem bestehenden gesellschaftlichen Bedürfnis entsprochen.The monoclonal antibodies of the BL-IgE / 1-10 series have the surprising property of recognizing epsilon chain-specific determinants of normal human IgE. This results in favorable diagnostic and therapeutic options. The antibodies themselves are uncomplicated to handle, easy to store and can be produced in larger quantities. The specified method for their production meets a long-standing social need.
Claims (26)
Kulturmedium 2 bis 10 % beträgt.23. The method according to item 1 and 15 to 22, characterized in that the CCU content of the atmosphere above the
Culture medium is 2 to 10 % .
5 % beträgt.24 «Procedure according to item 1 and 15 to 23 ,. characterized in that the COp content over the culture medium
5 % .
mit Wasserdampf reichen kann.25 »Procedure according to items 1 and 15 to 24» characterized • characterized in that above the culture medium high humidity prevails, which is up to the saturation of the atmosphere
can reach with steam.
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DD25464683A DD230878B1 (en) | 1983-09-08 | 1983-09-08 | PROCESS FOR THE PRODUCTION OF MONOCLONAL ANTIBODY FOR HUMANESE IGE |
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DD25464683A DD230878B1 (en) | 1983-09-08 | 1983-09-08 | PROCESS FOR THE PRODUCTION OF MONOCLONAL ANTIBODY FOR HUMANESE IGE |
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- 1983-09-08 DD DD25464683A patent/DD230878B1/en not_active IP Right Cessation
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
ENJ | Ceased due to non-payment of renewal fee |