DD230880B1 - PROCESS FOR THE PRODUCTION OF MONOCLONAL ANTIBODIES FOR THE HUMAN KAPPA CHAIN - Google Patents
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper, die in der Lage sind, mit der kappakettenspezifischen Determinante der L-Kette humaner Immunglobuline spezifisch zu reagieren.The invention relates to a method of producing monoclonal antibodies capable of specifically reacting with the kappa chain-specific determinant of human immunoglobulin L chain.
Es ist bereits bekannt, spezifische Antiseren für die humane kappa-Kette herzustellen und diese für die qualitative und quantitative Bestimmung von isolierten kappa-Ketten im Harn, Serum oder anderen biologischen Flüssigkeiten, von Immunglobulinen aller Isotypen, die L-Ketten vom kappa-Тур besitzen, sowie für den Nachweis und die Quantifizierung von humanen B-Lymphozyten, die Membranimmunglobulin vom kappa-Тур tragen, zu verwenden. Diese Antiseren sind nur durch eine aufwendige Verfahrensweise für die kappa-Kette spezifisch zu machen. Andere konventionelle Methoden für die Herstellung von antikappa-Seren haben den Nachteil, daß die Antikörperzusammensetzung, z. B. hinsichtlich der Affinität der einzelnen Antikörpertypen von Tier zu Tier, ja von Blutentnahme zu Blutentnahme, variiert, so daß die Antiseren nicht zuverlässig reproduziert und nicht standardisiert werden können. Für den Nachweis von Membranimmunglobulin vom kappa-Тур auf B-Lymphozyten, der für die Diagnostik von lymphatischen Leukämien von Bedeutung ist, kommt noch die störende Bindung des Immunglobulins der Antiseren an Fc-Rezeptoren von Lymphozyten und Monozyten nachteilig hinzu. Zwar läßt sich diese Unzulänglichkeit durch die Präparation von (Fab)2-Fragmenten eliminieren, aber das ist aufwendig und teuer, so daß für eine Routineanwendung dieses Verfahren insgesamt zu teuer ist.It is already known to prepare specific antisera for the human kappa chain and to have these for the qualitative and quantitative determination of isolated kappa chains in urine, serum or other biological fluids, immunoglobulins of all isotypes having L-chains of kappa-tur , as well as for the detection and quantification of human B-lymphocytes carrying membrane immunoglobulin kappa-Tur. These antisera can only be made specific by a costly procedure for the kappa chain. Other conventional methods for the production of antikappa sera have the disadvantage that the antibody composition, for. B. with respect to the affinity of the individual antibody types from animal to animal, yes from blood collection to blood collection, varies, so that the antisera can not be reliably reproduced and can not be standardized. For the detection of membrane immunoglobulin kappa Тур on B lymphocytes, which is for the diagnosis of lymphatic leukemias important, nor the interfering binding of the immunoglobulin of the antisera to Fc receptors on lymphocytes and monocytes is added disadvantageous. Although this deficiency can be eliminated by the preparation of (Fab) 2 fragments, but this is complicated and expensive, so that for a routine application of this method is altogether too expensive.
Monokionale Antikörper sind zur Bestimmung der humanen kappa-Kette bisher nur in Einzelfällen eingesetzt worden. Offenbar ist ihre Herstellung bisher zu aufwendig und/oder zu kompliziert.Monokionale antibodies have been used for the determination of the human kappa chain so far only in isolated cases. Apparently, their production has been too expensive and / or too complicated.
In der Europapatentschrift EP 0044219 werden die hypothetischen Möglichkeiten der Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen die vorstellbaren Determinanten von humanem IgG aufgeführt. Darunter auch von mAk, die gegen Determinanten gerichtet sind, die für die kappa-Kette spezifisch sein sollen. Es werden jedoch weder solche mAk konkret vorgestellt, noch die Selektion der entsprechenden Hybridome charakterisiert oder diese gar hinterlegt, so daß die Wiederholbarkeit der patentgemäßen Lehre nicht gegeben ist.European Patent EP 0044219 lists the hypothetical possibilities of producing monoclonal antibodies against the conceivable determinants of human IgG. Including mAbs directed against determinants specific to the kappa chain. However, neither such mAb are concretely presented, nor the selection of the corresponding hybridomas characterized or even deposited, so that the repeatability of the patent teaching is not given.
Von LOWE et al. (Immunology 42,649-659 [1981]) werden 6 Hybridome beschrieben, die mit der kappa-Kette reagieren, von denen allerdings nurein Klon (Gel) hinsichtlich Spezifität und Eignung des Hybridoms den Anforderungen genügt, so daß es für quantitative Assays genutzt werden kann (JEFFERIS et al.: J. Immunol. Meth. 39,355-362 [1980]). LING et al. (Clin. exp. Immunol. 52, [1983]) gelang die Herstellung von 5 mAk, die mit Determinanten der freien Kappa-Kette reagieren, nicht jedoch mit der Η-Ketten gebundenen Form oder dem Membranimmunglobulin тід(к) der B-Lymphozyten. Von diesen Autoren wird auch ein genereller mAk gegen kappa-Ketten erwähnt (FC3), aber nicht näher charakterisiert. So fehlen Angaben über die Eignung zum Nachweis von тід(к) der B-Lymphozyten. Auch für die von LOWE et al. (Immunology 42,649-659 [1981]) beschriebenen mAk gibt es keine Angaben für die Eignung als Nachweisreagenzien in der indirekten Immunfluoreszenz und Durchflußzytometrie zur quantitativen Bestimmung von mlg(K)-positiven B-Lymphozyten.LOWE et al. (Immunology 42, 649-659 [1981]) describes 6 hybridomas which react with the kappa chain, of which, however, only one clone (gel) satisfies the requirements with regard to specificity and suitability of the hybridoma, so that it can be used for quantitative assays ( JEFFERIS et al .: J. Immunol., Meth., 39, 355-362 [1980]). LING et al. (Clin. Exp. Immunol., 52, [1983]) succeeded in producing 5 mAbs that react with kappa free chain determinants, but not with the Η chain-bound form or the membrane immunoglobulin тід (к) of B lymphocytes , These authors also mention a general mAb against kappa chains (FC3), but do not characterize it further. Thus, information on the suitability for the detection of тід (к) of B-lymphocytes is missing. Also for the LOWE et al. (Immunology 42, 649-659 [1981]), there are no data for the suitability as detection reagents in indirect immunofluorescence and flow cytometry for the quantitative determination of mlg (K) -positive B lymphocytes.
Die Erfindung hat das Ziel, ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper anzugeben, das in leicht beherrschbarer Weise die kostengünstige Produktion größerer Mengen Antikörper ermöglicht, die in der Lage sind, spezifisch mit humanen kappa-Ketten zu reagieren, wobei diese sowohl in isolierter als auch in H-Ketteπ gebundener Form sowie als Bestandteil von zellmembrangebundenem Immunglobulin von B-Lymphozyten vorliegen können.The object of the invention is to provide a process for the production of monoclonal antibodies which makes it possible, in an easily controllable manner, to inexpensively produce larger quantities of antibodies capable of specifically reacting with human kappa chains, both isolated and isolated H-chain bound form and may be present as a component of cell membrane-bound immunoglobulin of B lymphocytes.
-2- 230 880 Darlegung des Wesens der Erfindung-2- 230 880 Explanation of the essence of the invention
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein nachvollziehbares Verfahren zur Verfügung zu stellen, das in wenigen Verfahrensschritten aus zugänglichen Ausgangskomponenten das gewünschte Endprodukt herzustellen erlaubt. Die angestrebten kappa-kettenspezifischen Antikörper sollen von gleichbleibender guter Qualität sein und gute Lagerfähigkeit aufweisen.The invention has for its object to provide a traceable process available that allows to produce the desired end product in a few steps from accessible starting components. The targeted kappa-chain-specific antibodies should be of consistently good quality and have good shelf life.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß aus dem Harn von Patienten mit Leichtkettenkrankheit, die Bence-Jones-Proteine vom kappa-Тур ausscheiden, kappa-Ketten durch die an sich bekannten Verfahren der Einengung, Aussalzung und Gelchromatographie isoliert werden.' Mit einer solchen kappa-Kettenpräparation werden Mäuse immunisiert. Vorzugsweise werden 6 bis 8 Wochen alte weibliche Α-Mäuse verwendet. Die Immunisierung erfolgt durch mehrmalige Applikation der humanen kappa-Ketten, wobei die erste Immunisierung als Emulsion des Antigens mit komplettem Freundschen Adjuvans vorgenommen wird. Aus den Milzen derart hyperimmuner Mäuse werden die Lymphozyten in an sich bekannter Weise separiert. Die B-Lymphozyten dieses ZellgemischS werden mit Maus-B-Myelomzellen fusioniert bzw. hybridisiert. Die dazu notwendigen Maus-B-Myelomzellen P3-X-63 Ag 8.653 (Kearney et al., J. Immunol. 123, [1979], 1548) werden in RPMI-1640 mit 10% FKS gezüchtet. In einem Kulturmedium nach Littlefield (Science 145, [1964], 709) werden die gebildeten Hybride von den nicht fusionierten Myelomzellen abgetrennt und erfindungsgemäß ein Zellklon selektioniert, der Antikörper der gewünschten Art sezerniert. Die Selektionierung des Hybridoms erfolgt in der Weise, daß die Zellen unmittelbar nach der Fusion in eine Vielzahl von separaten 200pl-Kulturen aufgeteilt werden. Die Überstände der die aufwachsenden Hybridzellen enthaltenen Kulturen werden auf die Anwesenheit von Antikörpern geprüft, die mit kappa-Ketten reagieren. Die Testung erfolgt zweckmäßigerweise mittels indirekter Radiobindungstechnik oder monoklonaler PAP-Technik. Als Antigen werden kappa-Ketten eingesetzt, die aus dem Urin von Patienten mit Leichtkettenkrankheit (Bence-Jones-Plasmozytom) präpariert werden sowie Myelomproteine der Isotypen IgG, IgM, IgA, IgE und IgD, die kappa-Ketten besitzen. Bei positiver Reaktion werden die entsprechenden Zeilklone auch mit humanen Immunglobulinen der Isotypen IgG, IgM, IgA IgE und-IgD, die lambda-Ketten tragen sowie mit isolierten lambda-Ketten getestet. Nur Hybridome, deren Antikörper nicht mit isolierten oder Η-Ketten gebundenen lambda-Ketten reagieren, werden weitergezogen, wenn notwendig Moniert oder rekloniert und ein besonders produktiver Subklon ausgewählt, der Antikörper der IgG-Klasse sezerniert.The object is achieved according to the invention in that kappa chains are isolated from the urine of patients with light chain disease who excrete Bence-Jones proteins from kappa-tur by the per se known methods of concentration, salting out and gel chromatography. Mice are immunized with such a kappa chain preparation. Preferably 6 to 8 week old female Α mice are used. The immunization is carried out by repeated application of the human kappa chains, wherein the first immunization is carried out as an emulsion of the antigen with Freund's complete adjuvant. From the spleens of such hyperimmune mice, the lymphocytes are separated in a conventional manner. The B lymphocytes of this cell mixture are fused to mouse B myeloma cells. The mouse B myeloma cells P3-X-63 Ag 8.653 (Kearney et al., J. Immunol. 123, [1979], 1548) required for this purpose are cultured in RPMI-1640 with 10% FCS. In a culture medium according to Littlefield (Science 145, [1964], 709), the hybrids formed are separated from the unfused myeloma cells and, according to the invention, a cell clone which secretes antibodies of the desired type is selected. The selection of the hybridoma is done by dividing the cells immediately after the fusion into a plurality of separate 200 μl cultures. The supernatants of the cultures containing the growing hybrid cells are checked for the presence of antibodies that react with kappa chains. The testing is expediently carried out by means of indirect radio-binding technique or monoclonal PAP technique. As an antigen kappa chains are used, which are prepared from the urine of patients with light chain disease (Bence Jones plasmocytoma) and myeloma proteins of the isotypes IgG, IgM, IgA, IgE and IgD, which have kappa chains. In a positive reaction, the corresponding cell clones are also tested with human immunoglobulins of the isotypes IgG, IgM, IgA IgE and IgD, which carry lambda chains and with isolated lambda chains. Only hybridomas whose antibodies do not react with isolated or Η chain-linked lambda chains are pulled further, cloned or recloned if necessary, and a particularly productive subclone is selected that secretes IgG-class antibodies.
Das auf die vorstehend geschilderte Weise erhaltene Hybridom H-BL-lg-κ ist durch die überraschende und vorteilhafte Eigenschaft charakterisiert. Antikörper zu sezernieren, die spezifisch die humane kappa-Kette erkennen. - Das Hybridom selbst ist in flüssigem Stickstoff konservierbar.The hybridoma H-BL-Ig-κ obtained in the manner described above is characterized by the surprising and advantageous property. To secrete antibodies that specifically recognize the human kappa chain. - The hybridoma itself is conserved in liquid nitrogen.
Zur Herstellung der Antikörper wird das Hybridom H-BL-lg-κ in einem Kulturmedium mit Serumzusatz in Massenkultur aufgezogen. Nach entsprechender Kultivierung in CO2-haltiger Atmosphäre wird das nunmehr antikörperenthaltende Kulturmedium mit 50% gesättigtem (NH4I2SO4 versetzt und eine Gammagtobulinfraktion erhalten. Weitere Anreicherung oder Reinigung der Antikörper ist nach an sich bekannten Verfahren wie Gelfiltration oder lonenaustauschchromatographie möglich. Der Antikörper BL-lg-κ gehört der IgG Klasse an und zeichnet sich durch hohe Stabilität aus.For the preparation of the antibodies, the hybridoma H-BL-Ig-κ is grown in a culture medium supplemented with serum in mass culture. After appropriate cultivation in a CO 2 -containing atmosphere, the culture medium now containing the antibody is mixed with 50% saturated (NH 4 I 2 SO 4) and a gamma-pentobuline fraction Further enrichment or purification of the antibodies is possible by processes known per se, such as gel filtration or ion exchange chromatography Antibody BL-Ig-κ belongs to the IgG class and is characterized by high stability.
Es ist zweckmäßig, als Kulturmedium MEM Eagle, Dulbeccos MEM, RPMI o.dgl. anzuwenden. Besonders günstig ist die Verwendung von RPMI-1640, das in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung mit 1OmM HEPES, 5 · 10"5M Mercaptoethanol, 100mg/l Gentamycin versetzt ist.It is useful as a culture medium MEM Eagle, Dulbecco's MEM, RPMI or the like. apply. It is particularly favorable to use RPMI-1640, the "5 M mercaptoethanol, 100 mg / l gentamycin is displaced in a preferred embodiment of the invention, with 1OmM HEPES, 5 x 10 degrees.
Als Serumzusatz dient fetales Kälberserum oder Pferdenormalserum mit einem Anteil am Kulturmedium von 5 bis 20%. Vorteilhaft ist es, mit einem Serumanteil von 10%zu arbeiten. Die Temperatur des Kulturmediums liegt zwischen 35°C und 38°C. Vorteilhaft ist es, bei 370C zu arbeiten.As a serum supplement is fetal calf serum or normal horse serum with a proportion of the culture medium of 5 to 20%. It is advantageous to work with a serum content of 10%. The temperature of the culture medium is between 35 ° C and 38 ° C. It is advantageous to work at 37 0 C.
Der СОг-Gehalt der Atmosphäre über dem Kulturmedium beträgt günstig 2 bis 10%, insbesondere 5%. Vorteilhaft ist eine hohe Luftfeuchtigkeit, die bis zur Sättigung der Atmosphäre reichen kann.The СОг content of the atmosphere over the culture medium is favorably 2 to 10%, especially 5%. The advantage is a high humidity, which can reach saturation of the atmosphere.
Die Kultivierung des Hybridoms erfolgt über einen üblichen Zeitraum von mehreren Tagen. Zweckmäßig ist eine Kultivierung von 3 bis 4Tagen. Danach ist ein teilweiser Mediumwechsel und eine erneute Einstellung der optimalen Zelldichte notwendig. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird das Hybridom H-BL-lg-κ in histokompatible A χ Balb/c-FrMäuse i. p. injiziert. Es ist vorteilhaft, wenn die eingesetzten Mäuse mit einem Tumorstimulator wie Paraffinum subliquidum, Pristan o.dgl. vorbehandelt worden sind. - Nach der Aszitesbildung, die durch Anschwellen sichtbar wird, wird die den monoklonalen Antikörper BL-lg-κ enthaltende Aszitesflüssigkeit entnommen, z. B. durch Punktion. Aus der Aszitesflüssigkeit werden die zellulären Bestandteile abgetrennt, z. B. durch Zentrifugieren. Der zelluläre Anteil besteht zum überwiegenden Teil aus Zellen des Hybridoms H-BHg-K. Er wird zweckmäßigerweise mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und kann erneut injiziert werden. Der klare Überstand, der den monoklonalen Antikörper BL-lg-κ enthält, wird entweder direkt bzw. in geeigneter Verdünnung eingesetzt oder weiterer Reinigung unterzogen. Zur weiteren Reinigung kommen Verfahren wie DEAE-Ionenaustauschchromatographie, Protein-A-Adsorption, Affinitätschromatographie o. dgl. in Frage, die dem Isotyp des BL-lg-κ (IgG) spezifisch anreichern, oder Verfahren der immunadsorption, die den Antikörper BL-lg-κ antigenspezifisch isolieren. Die Aszitesflüssigkeit enthält bei erfindungsgemäßer Verfahrensdurchführung 5 bis 10mg BL-Ig- к pro ml Flüssigkeit.The cultivation of the hybridoma takes place over a customary period of several days. It is expedient to cultivate for 3 to 4 days. Thereafter, a partial medium change and a renewed adjustment of the optimal cell density is necessary. In another embodiment of the invention, the hybridoma H-BL-Ig-κ is transformed into histocompatible A χ Balb / c mice i. p. injected. It is advantageous if the mice used with a tumor stimulator such as Paraffinum subliquidum, Pristan or the like. have been pretreated. After ascites formation, which becomes visible by swelling, the ascitic fluid containing the monoclonal antibody BL-Ig-κ is removed, e.g. B. by puncture. From the ascites fluid, the cellular components are separated, z. B. by centrifugation. The cellular part consists predominantly of cells of the hybridoma H-BHg-K. It is conveniently washed with physiological saline and can be re-injected. The clear supernatant containing the monoclonal antibody BL-Ig-κ is either used directly or in a suitable dilution or subjected to further purification. For further purification, methods such as DEAE ion exchange chromatography, protein A adsorption, affinity chromatography or the like, which specifically enrich the isotype of BL-Ig-κ (IgG), or immunoadsorption methods comprising the antibody BL-Ig isolate -κ antigen-specifically. When carrying out the process according to the invention, the ascitic fluid contains 5 to 10 mg of BL-Ig-k per ml of fluid.
Anreicherung führt zu einem Produkt mit einem Antikörpergehalt von etwa 20 mg/ml.Enrichment leads to a product with an antibody content of about 20 mg / ml.
Zum Herstellen einer stabilen Aufbewahrungsform, die auch als Handelspräparat geeignet ist, wird die Immunglobulinfraktion der zellfreien Aszitesflüssigkeit präzipitiert, z. B. rr.it 50% gesättigter (NH^SCVLösung und in gepufferter physiologischer Kochsalzlösung aufgenommen. Dialysieren gegen NH4HC0rLösung führt zu einem lyophilisierbaren Produkt, das lyophilisiert bei +40C haltbar ist.To produce a stable storage form which is also suitable as a commercial preparation, the immunoglobulin fraction of the cell-free ascites fluid is precipitated, for. B. Rr.it 50% saturated (NH ^ SCV) solution and in buffered saline dialyzed against NH 4 HC0rLösung leads to a lyophilizable product which is lyophilized at +4 0 C preserved.
Der monoklonal Antikörper weist mit humanen isolierten L-Kette η und Immunglobulinen das in Tabelle 1 sowie mit Blutzellen das in Tabelle 2 dokumentierte Reaktionsmuster auf. Die Bindung wurde mittels indirekter Radiobindungstechnik (RBT) und indirekter Immunfluoreszenz (ilF) bestimmt. Die Bindungscharakteristik dokumentiert die hohe Spezifität des monoklonalen Antikörpers BL-lg-κ sowie seine vorzügliche Eignung zum Nachweis von membrangebundenem Immunglobulin. Diese vorteilhafte Eigenschaft ist für z. B. die Diagnostik von Leukämien von entscheidender Bedeutung. Die Erfindung soll nachstehend an Ausführungsbeispielen näher erläutert werden.The monoclonal antibody with human isolated L chain η and immunoglobulins has the in Table 1 and with blood cells the documented in Table 2 reaction pattern. Binding was determined by indirect radio-binding technique (RBT) and indirect immunofluorescence (ilF). The binding characteristic documents the high specificity of the monoclonal antibody BL-Ig-κ and its excellent suitability for the detection of membrane-bound immunoglobulin. This advantageous property is for z. For example, the diagnosis of leukemia is of crucial importance. The invention will be explained in more detail below by exemplary embodiments.
1. Ausführungsbeispiel1st embodiment
Auf flüssigem Stickstoff gelagerte Hybridomzelien H-BL-Ig- к werden aufgetaut und zweimal mit Kulturmedium gewaschen. Die Zelldichte wird auf 1-5 χ 10s Zellen pro ml Kulturmedium eingestellt und in geeigneten Gewebekulturflaschen kultiviert. Das Kulturmedium besteht aus RPM11640, welches mit Natriumhydrogenkarbonat (2 g/l), Mercaptoethanol (5 χ 10"5M), Gentamycin (100mg/1) und N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-ethansulfonsäure (1OmM) ergänzt wird. Dieses Medium wird mitHybridoma cells H-BL-Ig- k stored on liquid nitrogen are thawed and washed twice with culture medium. The cell density is adjusted to 1-5 χ 10 s cells per ml of culture medium and cultured in suitable tissue culture flasks. The culture medium consists of RPM11640 which with sodium bicarbonate (2 g / l), mercaptoethanol (5 χ 10 "5 M), gentamycin (100 mg / 1) and N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-ethanesulfonic acid (1OmM) is added. This Medium is with
a) fetalem Kälberserum odera) fetal calf serum or
b) Pferdenormalserumb) Horse Normal Serum
supplementiert. Die möglichen Anteile sind S bis 20%. Als geeignet hat sich 10% Serumanteil erwiesen.supplemented. The possible shares are S to 20%. 10% serum content has proven to be suitable.
Die günstigsten Kulturbedingungen werden erreicht, wenn die Zellen bei +37 °C in einer wassergesättigten 5%igen CO2-Atmosphäre bebrütet werden.The most favorable culture conditions are achieved when the cells are incubated at + 37 ° C in a water saturated 5% CO 2 atmosphere.
Nach 3 bis 4 Tagen werden die Zellkulturüberstände steril entnommen. Die z. Z. an der Gefäßwand anhaftenden Zellen können erneut mit frischem Medium versorgt und bebrütet werden. Dabei ist jedoch auf die optimale Zelldichte zu achten. Die im Kulturüberstand enthaltenen Hybridzellen werden durch Zentrifugation abgetrennt. Sie können zur Aussaat in neue Kulturgefäße verwendet werden.After 3 to 4 days, the cell culture supernatants are removed under sterile conditions. The z. Z. Cells adhering to the vessel wall can be re-supplied with fresh medium and incubated. However, it is important to pay attention to the optimal cell density. The hybrid cells contained in the culture supernatant are separated by centrifugation. They can be used for sowing in new culture vessels.
Die zellfreien Kulturüberstände enthalten den monoklonalen Antikörper BL-lg-κ. Die Konzentration des Antikörpers BL-lg-κ ist ausreichend für die üblichen diagnostischen Nachweisverfahren von kappa-Ketten tragenden B-Lymphozyten (wie z. B. indirekte Immunfluoreszenz, enzymimmunologische Nachweise, Radiobindungstechniken).The cell-free culture supernatants contain the monoclonal antibody BL-Ig-κ. The concentration of the antibody BL-Ig-κ is sufficient for the usual diagnostic detection methods of kappa chain-bearing B lymphocytes (such as indirect immunofluorescence, enzyme immunological detection, radio-linkage techniques).
Gegebenenfalls kann der Titer mit einer geeigneten Technik (z. B. indirekte Radiobindungstechnik oder Immunfluoreszenz) bestimmt werden. Hochtitrige Kulturüberstände gestatten eine Verdünnung bis zur gewünschten Arbeitskonzentration.Optionally, the titer can be determined by a suitable technique (eg, indirect radio-linkage technique or immunofluorescence). High titre culture supernatants allow dilution to the desired working concentration.
2. Ausführungsbeispiel:2nd embodiment:
Hybridomzelien H-BL-Ig-Kwerden wie in Beispiel 1 kultiviert und vermehrt. Nach dem Erreichen einer ausreichend großen Zellzahl werden die Zellen geerntet und mehrmals mit serumfreiem Zellzuchtmedium gewaschen. Anschließend werden die Hybridomzelien in einer Dichte von 2-5 χ 10е Zellen pro 1ml in einem serumfreien Zellzuchtmedium, wie z. B. RPM11640, welches mit Natriumhydrogenkarbonat (2g/l), Mercaptoethanol (5 x 1CT5M), Gentamycin (100mg/1) und N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-ethansulfonsaure (1OmM) ergänzt wird, kultiviert.Hybridomas H-BL-Ig-K are cultured and expanded as in Example 1. After reaching a sufficiently large cell number, the cells are harvested and washed several times with serum-free cell culture medium. Subsequently, the hybridoma cells at a density of 2-5 χ 10 е cells per 1ml in a serum-free cell culture medium, such as. RPM11640 which is supplemented with sodium bicarbonate (2 g / l), mercaptoethanol (5 x 1CT 5 M), gentamycin (100 mg / l) and N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-ethanesulfonic acid (10 mM).
Die günstigsten Kulturbedingungen werden erreicht, wenn die Zellen bei +37°C in einer wassergesättigten 5%igen CO2-Atmosphäre bebrütet werden. Die Inkubation dauert 12 bis 24 Stunden.The most favorable culture conditions are achieved when the cells are incubated at + 37 ° C in a water saturated 5% CO 2 atmosphere. The incubation takes 12 to 24 hours.
Der zellfreie Kulturüberstand enthält den monoklonalen Antikörper BL-lg-κ ohne Verunreinigungen durch die sonst üblichen Serumproteine, die als Mediumzusatz verwendet werden.The cell-free culture supernatant contains the monoclonal antibody BL-Ig-κ without contamination by the otherwise common serum proteins used as medium supplement.
Die monoklonalen Antikörper können durch DEAE-Ionenaustauschchromatographie der Protein-A-Adsorption u. dgl. mehr konzentriert werden, wenn dies erforderlich ist.The monoclonal antibodies can be detected by DEAE ion exchange chromatography of protein A adsorption and the like. Like. Be more concentrated if necessary.
3. Ausführungsbeispiel:3rd embodiment
Eingesetzt werden Zellen des Hybridoms H-BL-lg-κ, die gegebenenfalls in vitro vorkultiviert werden. Nach Waschen in serumfreier physiologischer Kochsalzlösung werden 10s bis 5 107 lebende Zellen histokompatiblen Mäusen intraperitoneal injiziert. Als histokompatible Mäuse werden FrHybride der Stämme A und Balb/c eingesetzt, die mit einem Tumorstimulator, hier mit 0,5ml Paraffinum subliquidum i. p. 2 Wochen vor der Hybridominjektion behandelt worden sind.Cells of the hybridoma H-BL-Ig-κ are used, which are optionally pre-cultured in vitro. After washing in serum-free physiological saline solution 10 s are injected intraperitoneally to 5 10 7 living cells histocompatible mice. As histocompatible mice F r hybrids of strains A and Balb / c are used, which have been treated with a tumor stimulator, here with 0.5 ml Paraffinum subliquidum ip 2 weeks before hybridoma injection.
Nach dem Einsetzen der Aszitesbildung werden die Mäuse punktiert. Die abgenommenen Aszitesflüssigkeit, die den monoklonalen Antikörper BL-lg-κ enthalten, werden durch Zentrifugieren in zelluläre Bestandteile und in Aszitesfiüssigkeit getrennt.After the onset of ascites formation, the mice are punctured. The collected ascitic fluid containing the monoclonal antibody BL-Ig-κ is separated by centrifugation into cellular components and into ascites fluid.
Der zelluläre Anteil besteht zum überwiegenden Anteil aus Zellen des Hybridoms H-BL-lg-κ. Diese Hybridomzelien werden mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und wie oben beschrieben eingesetzt, indem sie histokompatiblen Mäusen i. p.The cellular portion consists predominantly of cells of the hybridoma H-BL-Ig-κ. These hybridoma cells are washed with saline and used as described above by injecting histocompatible mice i. p.
injiziert werden. Solche Passagen sind wiederholt möglich.be injected. Such passages are possible repeatedly.
Die Immunglobulinfraktion der zellfreien Aszitesflüssigkeit wird mit 50% gesättigtem (NH4)2SO4 präzipitiert und in gepufferter physiologischer Kochsalzlösung aufgenommen. Diese Lösung wird gegen 0,5%ige NH4HCO3-Lösung dialysiert. Anschließend erfolgt die Lyophilisierung. Der Antikörper H-BL- lg-κ ist lyophilisiert bei +4°C ohne Verlust der Bindungseigenschaften haltbar.The immunoglobulin fraction of the cell-free ascitic fluid is precipitated with 50% saturated (NH 4 ) 2 SO 4 and taken up in buffered saline. This solution is dialyzed against 0.5% NH 4 HCO 3 solution. Subsequently, the lyophilization takes place. The antibody H-BL-Ig-κ is stable lyophilized at + 4 ° C without loss of binding properties.
Der Antikörpertiter wird durch Herstellen einer Verdünnungsreihe und Austestung mittels indirekter Radiobindungstechnik unter Verwendung von kappa-Ketten, die an Plastoberflächen adsorbiert sind. Die Quantifizierung der daran gebundenen monoklonalen Antikörper BL-Ig- erfolgt durch Zugabe eines mit 125J markierten Anti-Mausimmunglobulinantikörpers. Als Titer wird diejenige Verdünnung des BL-lg-κ angegeben, bei der noch die Hälfte der maximal gebundenen Menge angelagert ist. Für den Einsatz der Antikörper zur Membranimmunglobulinbestimmung wird der Titer mittels indirekter Immunfluoreszenz unter Verwendung frischer humaner Blutlymphozyten und einem geeigneten FITC-markierten Anti-Mausimmunglobulinserum bestimmt. Als Titer wird diejenige größte Verdünnung angegeben, bei der noch deutlich alle kappa-Ketten tragenden B-Lymphozyten markiert werden.The antibody titer is determined by preparing a dilution series and testing by indirect radio-linkage technique using kappa chains adsorbed on plastic surfaces. The quantification of the monoclonal antibody BL-Ig- bound thereto is carried out by adding a 125 I-labeled anti-mouse immunoglobulin antibody. The titre is the dilution of BL-Ig-κ at which half of the maximum amount bound is attached. For the use of the antibodies for membrane immunoglobulin determination, the titer is determined by indirect immunofluorescence using fresh human blood lymphocytes and a suitable FITC-labeled anti-mouse immunoglobulin serum. The titer is the highest dilution at which markedly all kappa-bearing B lymphocytes are still labeled.
Werden höhere Konzentrationen des Antikörpers benötigt, so werden die Kulturüberstände mit 50% gesättigtem Ammoniumsulfat gefällt. Die so erhaltene Gammaglobulinfraktion kann durch weitere bekannte Trenntechniken (lonenaustauschchromatographie. Gelfiltration usw.) weitergereinigt werden.If higher concentrations of the antibody are required, the culture supernatants are precipitated with 50% saturated ammonium sulfate. The gammaglobulin fraction thus obtained can be further purified by further known separation techniques (ion exchange chromatography, gel filtration, etc.).
Werden hochgereinigte monoklonale Antikörper benötigt, so können diese durch Immunadsorption an trägerfixierte Anti-Mausimmunglobulinantikörpervon den aus Kälterserum bzw. Pferdeserum stammenden Begleitproteinen abgetrennt werden und durch schonend wirkende Desorbentien (3M KSCN oder Glycin/HCL-Puffer pH 2,8) von diesem Immunadsorbens wieder isoliert werden.If highly purified monoclonal antibodies are required, they can be separated from colder serum or horse serum-derived accompanying proteins by immunoadsorption to carrier-fixed anti-mouse immunoglobulin antibodies and re-isolated from this immunoadsorbent by gently acting desorbents (3M KSCN or glycine / HCl buffer pH 2.8) become.
Reaktion des monoklonaien Antikörpers BL-Ig-к mit humanen L-Ketten und ImmunglobulinenReaction of monoclonal antibody BL-Ig-к with human L-chains and immunoglobulins
Antigenantigen
KKra KLaKKra KLa
Км K-Standard31 Км K standard 31
вава
λ-Standard31 λ standard 31
lgM(K)L0h ІдА(к)нвР IgD(K), lgE(K)Yu lgM (K) L0 h ІдА (к) нв Р IgD (K), lgE (K) Yu
ІдА(Х)твІдА (Х) тв
IgE(X)ND - IgE (X) ND -
T\ Die Bindung des monoklonaien Antikörpers BL-lg-κ an die antigenbeladenen Plastoberflächen wurde mittels indirekter Radiobindungstechnik unter Verwendung eines 125J-markierten Anti-Mausimmunglobulin-Antikörpers quantifiziert. Der Bindungsindex I entspricht dem Verhältnis der Zählraten bei Inkubation mit BL-lg-κ und dem monoklonaien Antikörper BL-DNP/II, der als Kontrolle für die unspezifische Bindung dient, bei nachfolgender Entwicklung mit 125J-markierten Anti-Mausimmunglobulin-Antikörpern.The binding of the monoclonal antibody BL-Ig-κ to the antigen-loaded plastic surfaces was quantitated by indirect radio-linkage technique using a 125 I-labeled anti-mouse immunoglobulin antibody. The binding index I corresponds to the ratio of the count rates when incubated with BL-Ig-κ and the monoclonal antibody BL-DNP / II, which serves as a control for the non-specific binding, with subsequent development with 125 J-labeled anti-mouse immunoglobulin antibodies.
2) Die Indizes geben die Herkunft der Proteine von entsprechenden Patienten an.2) The indices indicate the origin of the proteins of corresponding patients.
3) Standard к- bzw. λ-Präparationen der Behringwerke AG. Mischungen mehrerer Bence-Jones-Proteine.3) Standard к and λ preparations of Behringwerke AG. Mixtures of several Bence-Jones proteins.
Bindung des monoklonaien Antikörpers BL-lg-κ an humane lymphoide Blutzellen, nachgewiesen durch indirekte ImmunfluoreszenzBinding of the monoclonal antibody BL-Ig-κ to human lymphoid blood cells, detected by indirect immunofluorescence
Testzellen BL-Ig- positive Zellen (%)Test cells BL-Ig positive cells (%)
PBL1) 8 +PBL 1) 8 +
B-Lymphozyten21 60 ±12B lymphocytes 21 60 ± 12
T-Lymphozyten3' <T lymphocytes 3 '<
Thymozytenthymocytes
B-CLL-PBL41 >80B-CLL-PBL 41 > 80
(K-Typ)(K type)
B-CLL-PBL51 <5 (λ-Тур) B-CLL-PBL 51 <5 (λ-TUR)
1) Periphere Blutlymphozyten.1) Peripheral blood lymphocytes.
2) Ε-Rosetten negative Lymphozyten. Ε-Rosetten bildende Lymphozyten.2) Ε rosettes negative lymphocytes. Ε rosettes forming lymphocytes.
4) PBL von CLL-Patienten mit Membranimmunglobulin vom к-Тур.4) PBL of CLL patients with membrane immunoglobulin from к-Тур.
5) PBL von CLL-Patienten mit Membranimmunglobulin vom λ-Тур.5) PBL of CLL patients with membrane immunoglobulin λ-TUR.
Claims (4)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD25464883A DD230880B1 (en) | 1983-09-08 | 1983-09-08 | PROCESS FOR THE PRODUCTION OF MONOCLONAL ANTIBODIES FOR THE HUMAN KAPPA CHAIN |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD25464883A DD230880B1 (en) | 1983-09-08 | 1983-09-08 | PROCESS FOR THE PRODUCTION OF MONOCLONAL ANTIBODIES FOR THE HUMAN KAPPA CHAIN |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DD230880A1 DD230880A1 (en) | 1985-12-11 |
| DD230880B1 true DD230880B1 (en) | 1990-06-13 |
Family
ID=5550304
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DD25464883A DD230880B1 (en) | 1983-09-08 | 1983-09-08 | PROCESS FOR THE PRODUCTION OF MONOCLONAL ANTIBODIES FOR THE HUMAN KAPPA CHAIN |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DD (1) | DD230880B1 (en) |
-
1983
- 1983-09-08 DD DD25464883A patent/DD230880B1/en not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DD230880A1 (en) | 1985-12-11 |
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