DE3687044T2

DE3687044T2 - Hybridomen-tumor-zellinien und deren monoklonale antikoerper gegen thaumatin.

Info

Publication number: DE3687044T2
Application number: DE8686907053T
Authority: DE
Inventors: Pradip Ghosh-Dastidar
Original assignee: International Genetic Engineering Inc
Current assignee: International Genetic Engineering Inc
Priority date: 1985-10-31
Filing date: 1986-10-28
Publication date: 1993-03-11
Anticipated expiration: 2006-10-29
Also published as: JP2550043B2; JPS63501192A; CA1297819C; US4770993A; EP0243485A4; AU6596486A; WO1987002776A1; EP0243485B1; DE3687044D1; ATE81909T1; EP0243485A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein Materialien und Methoden zur Anwendung in immunologischen Verfahren zur Isolierung und zum quantitativen Nachweis eines süßschmeckenden Polypeptids, das als Thaumatin bekannt ist, aus biologischen Flüssigkeiten. Genauer gesagt, betrifft die Erfindung monoklonale Anti-Thaumatin-Antikörper, produziert von neuartigen Hybridomzellinien (bspw. A.T.C.C. HB-8921 und A.T.C.C. HB-8922), und Anwendungen dieser Antikörper bei der Isolierung von Thaumatin durch Affinitätsreinigungstechniken, bei Tests zum Nachweis von Thaumatin und bei immunologischen Techniken zur Untersuchung von süßen thaumatinähnlichen Peptiden.
Thaumatin ist ein extrem süßschmeckendes Protein, das in den Samenhülsen der Frucht des afrikanischen Strauches Thaumatococcus daniellii Benth produziert wird. Die Frucht ist traditionell in West-Afrika als Süßmittel von Palmwein, Mais, Brot und sauren Früchten verwendet worden. Thaumatin, das, bezogen auf das Gewicht, etwa 5000mal süßer ist als Saccharose, wird in wenigstens fünf Formen produziert. Thaumatin I, II, a, b und c. Diese Proteine, benannt in der Reihenfolge ihrer Elution aus einer Ionenaustauschsäule [Higgenbotham, et al., in Sensory Properties of Foods (Birch, et al., Hrg.), London: Applied Sciences, S. 129-149 (1977)], haben Molekulargewichte von annähernd 22 Kilodalton.
Thaumatin I und II sind nicht-toxische Proteine, mit niedrigem Kaloriengehalt und nicht-kariogen, und rufen tiefe Geschmacksreaktionen hervor, was eine stabile Wechselwirkung zwischen diesen Proteinen und menschlichen Geschmacksknospen nahelegt. Thaumatin besitzt daher das Potential zur Verwendung als ein Zuckerersatzstoff, ein Nahrungsmittelzusatzstoff, eine Sonde für Süße-Rezeptoren und ein Werkzeug für die weitere Aufklärung der Geschmacksreaktion.
Um das Protein als einen möglichen Nahrungsmittelzusatzstoff und ein Forschungsinstrument zu benutzen, ist ein reichliches Angebot an reinem Thaumatin erforderlich. Da T. daniellii ein tropisches Klima und Insektenbestäubung für ein erfolgreiches Fruchtwachstum benötigt, gibt es beträchtliche Schwierigkeiten bei der Gewächshauskultivierung der Frucht. Aus diesen Gründen sind beträchtliche Anstrengungen auf die Einführung von Genen in rekombinante Mikroorganismen gerichtet worden, um diese in die Lage zu versetzen, Thaumatin zu synthetisieren. Eine Forschergruppe berichtete von einer Aminosäuresequenz für Thaumatin I. [Iyengar, et al., Eur.J.Biochem., 96, 193-204 (1979)]. Die Forschergruppe berichtete auch von der erfolgreichen Klonierung eines Gens für Thaumatin II aus von Boten-RNA abgeleiteter cDNA [Edens, et al., Gene, 18, 1-12 (1982)]. Die oben zitierte Literaturstelle von Edens, et al. erwähnt, daß ein Polypeptid mit der natürlichen Sequenz von Präprothaumatin II mikrobiell hergestellt worden ist. Genauer gesagt, offenbaren die Literaturstellen und die europäischen Patentanmeldungen 54 330 und 54 331 cDNA- Sequenzen, die für natürliches reifes Thaumatin II und Präprothaumatin II kodieren, und offenbaren auch Klonierungsvehikel, die die DNA-Sequenzen umfassen, zur Verwendung bei der Transformation in Mikrooragnismen.
In der EP-A-0139501 wurde die erfolgreiche Synthese von "künstlich hergestellten" Genen, die für Thaumatin I kodieren, das eine strukturelle Primärkonformation besitzt, die die von Iyengar, et al. gelieferte Sequenz dupliziert, zusammen mit ihrer Expression in Bakterien- und Hefewirten offenbart.
Von Interesse für den Hintergrund der Erfindung sind gegenwärtige Forschungen, die sich auf Hybridomtechniken zur Herstellung von Tumorzellinien konzentrieren, die hochspezifische monoklonale Antikörper gegen eine ausgewählte antigene Substanz herstellen. Techniken für die Herstellung von monoklonalen Antikörpern sind allgemein auf diesem Gebiet der Technik gut bekannt. Typische Beschreibungen dieser Verfahren kann man finden bei Wands, J.R., und Zurawski, V.R., Gastroenterology 80 : 225 (1981); Marshak-Rothstein, et al., J. Immunol. 122 : 2491 (1979); und Oi, V.T. und L.A. Herzenberg, "Immunoglobulin Producing Hybrid", Mishell, B.B. und S.M. Shiigi (Hrg.) Selected Methods in Cellular Iinmunology, San Francisco: W.H. Freeman Publishing, 1979. Kurz zusammengefaßt, werden Lymphocyten, die aus der Milz eines Tieres entnommen worden sind, dem zuvor das interessierende Antigen injiziert wurde, dazu gebracht, mit Myelomzellen in Gegenwart von Polyethylenglykol zu verschmelzen. Tausende von "hybriden" Myelomzellen werden aus der Fusion produziert. Der Überstand aus dem Wachstum jeder "Hybridom"-Zellkultur wird auf das Vorhandensein der gewünschten Antikörperaktivität getestet. Wenn eine solche Aktivität im Überstand einer Zellkultur festgestellt wird, wird sie durch Grenzverdünnungen kloniert, und die Klone werden einzeln auf Überstandsaktivität getestet.
Wegen der hochspezifischen Natur ihrer immunologischen Eigenschaften sind monoklonale Antikörper, die mit Hybridomtechniken entwickelt worden sind, zur Verwendung als diagnostische Reagenzien, therapeutische Mittel und Mittel für die Affinitätsreinigung von spezifisch kreuzreaktiven antigenen Proteinen aus Rohquellen vorgeschlagen worden. Siehe z. B. Trends in Biotechnology, Vol. 3, No. 7 (July, 1985) und U.S. Patent Nrn. 4,465, 624, 4,514,505 und 4,514,507.
Obgleich ein beträchtliches Bedürfnis nach spezifischen monoklonalen Antikörpern zur Verwendung beim Nachweis, bei der Isolierung, bei der Reinigung und bei der Erforschung von Thaumatin und thaumatinähnlichen Polypeptidmolekülen besteht, hat es keine Berichte über die erfolgreiche Verwendung von Hybridomtechniken gegeben, mit denen monoklonale Antikörper gegen Thaumatin erhalten wurden.

KURZE ZUSAMMENFASSUNG

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine von Mäusen abgeleitete Hybridomzellinie zur Verfügung gestellt, die in der Lage ist, im Medium ihres Wachstums einen monoklonalen Antikörper zu produzieren, der in der Lage ist, sich spezifisch mit Thaumatin zu verbinden, aber nicht in der Lage ist, sich spezifisch mit L-Aspartyl-L-phenylalaninmethylester zu verbinden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird außerdem eine von Mäusen abgeleitete Hybridomzellinie zur Verfügung gestellt, die in der Lage ist, im Medium ihres Wachstums einen monoklonalen Antikörper zu produzieren, der in der Lage ist, sich spezifisch mit Monellin zu verbinden, aber nicht in der Lage ist, sich spezifisch mit L-Aspartyl-L-phenylalaninmethylester zu verbinden.
Die vorliegende Erfindung stellt zum ersten Mal Hybridomzellinien zur Verfügung, die monoklonale Antikörper produzieren, die spezifisch immunreaktiv mit Thaumatin sind. Zur Veranschaulichung stellt die vorliegende Erfindung eine neue Mäuse-Mäuse-Hybridomzellinie, A.T.C.C. HB-8922, zur Verfügung, die als einen Bestandteil des Überstandes ihres Wachstums in Kultur einen monoklonalen Antikörper produziert, der spezifisch reaktiv mit der kugelförmigen Tertiärstruktur von Thaumatin und thaumatinähnlichem Polypeptid ist. Die Erfindung stellt auch eine neue Mäuse-Mäuse-Hybridomzellinie, A.T.C.C. HB-8921, zur Verfügung, die als einen Bestandteil des Überstandes ihres Wachstums in Kultur einen monoklonalen Antikörper produziert, der spezifisch immunreaktiv mit einer oder mehreren spezifischen Aminosäuresequenzen ist, die die Polypeptid-Primärstruktur von Thaumatin und gewissen thaumatinähnlichen Polypeptiden ausmachen. Die Tumorzellinien, A.T.C.C. HB-8922 und A.T.C.C. HB-8921, sind bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD. 20852, einer anerkannten öffentlichen Hinterlegungsstelle für Zellkulturen und Mikroorganismen, hinterlegt.
Als ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein monoklonaler Antikörper zur Verfügung gestellt, der spezifisch immunreaktiv mit der kugelförmigen Tertiärstruktur von Thaumatin sowie mit thaumatinähnlichen Polypeptiden, wie etwa dem Protein Monellin, ist. Zusätzlich wird ein monoklonaler Antikörper zur Verfügung gestellt, der spezifisch immunreaktiv mit einer oder mehreren spezifischen Aminosäuresequenzen ist, die die Primärstruktur von Thaumatin und thaumatinähnlichen Polypeptiden ausmachen. Entsprechend der praktischen Umsetzung der vorliegenden Erfindung wird eine Tumorzellinie unter Verwendung einer immunologischen Standardtechnik hergestellt, wie sie bei Oi und Herzenberg, "Immunoglobulin Producing Hybrid", aaO, beschrieben ist.
Milzzellen aus Mäusen, hyperimmunisiert mit isoliertem Pflanzenthaumatin, werden mit einer Mäuse-Myelomzellinie in Gegenwart von Polyethylenglykol verschmolzen. Der Überstand vom Wachstum jeder "Hybridom"-Zellkultur wird auf das Vorhandensein der gewünschten Antikörperaktivität getestet. Eine ausgewählte Hybridomzelle, die kloniert wird, um eine Zellinie fortzupflanzen, kann in ihrem Wachstumsüberstand einen Antikörper produzieren, der hochspezifisch Antithaumatin-Aktivität besitzt.
Monoklonale Antikörper der Erfindung und, insbesondere, jeder der zwei neuen monoklonalen Antikörper, die von den Hybridomen A.T.C.C. HB-8921 und A.T.C.C. HB-8922 produziert werden, kann in immunologischen Verfahren zur Affinitätsreinigung und Isolierung von Thaumatin oder thaumatinähnlichen Polypeptiden aus einem Fermentations- oder einem anderen Medium verwendet werden. Bei solch einem Verfahren würde ein ausgewählter Antikörper (z. B. auf einer Säule) immobilisiert werden, und das Fermentationsmedium würde mit dem immobilisierten Antikörper in Kontakt gebracht werden. Thaumatin würde sich an den Antikörper binden und würde danach vom immobilisierten Antikörper in einer hochgereinigten Form eluiert werden. Antikörper der Erfindung können auch in immunologischen Verfahren für den quantitativen Nachweis von Thaumatin und thaumatinähnlichen Polypeptiden, wie etwa Monellin, in Fermentations- oder anderen Medien verwendet werden. Verfahren, die die Verwendung der zwei unterschiedlichen Arten von monoklonalen Antikörpern kombinieren, können verwendet werden, um das Vorhandensein und die Anzahl von Thaumatin- und thaumatinähnlichen Molekülen sowohl in ihren natürlichen Konformationen als auch in denaturierten Zuständen nachzuweisen, wenn sie aus Fermentations- oder anderen Medien isoliert werden. Die vorliegende Erfindung stellt außerdem einen immunologischen Test zum quantitativen Nachweis von Thaumatin und thaumatinähnlichen Polypeptiden durch die Verwendung von enzymgebundenen immunsorbierenden Testtechniken (ELISA) zur Verfügung. Andere Aspekte der vorliegenden Erfindung werden bei Betrachtung der folgenden detaillierten Beschreibung deutlich werden.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG

Die folgenden Beispiele veranschaulichen die praktische Umsetzung der Erfindung bei der Herstellung einer Anzahl von Hybridomzellinien, einschließlich A.T.C.C. HB-8921 und A.T.C.C. HB-8922, die Isolierung von Antikörpern gegen Thaumatin und thaumatinähnliche Polypeptide und die Charakterisierung, Amplifikation und Eigenschaften der monoklonalen Antikörper, von denen jeder immunologische Anknüpfungspunkte für eine antigene Determinante von Thaumatin besitzt.
Genauer gesagt, sind die Beispiele 1 bis 3 auf die Stimulierung einer Maus zur Produktion von polyklonalen Mäuseserum-Antikörpern gegen Thaumatin, die Fusion von Mäuse- Milzzellen mit Mäuse-Myelomzellen und das Screenen, Klonieren und Wachstum von Hybridomzellen und die Isolierung von monoklonalen Antikörpern daraus gerichtet. Die Beispiele 4 bis 46 betreffen die Charakterisierung der so hergestellten monoklonalen Antikörper durch ELISA-Tests und kompetitive Hemmungstests. Beispiel 47 betrifft die Amplifikation von monoklonalen Antikörpererträgen durch die Ascites-Methode. Beispiel 48 betrifft die Isolierung und Reinigung von Thaumatin und thaumatinähnlichen Peptiden durch die Verwendung der monoklonalen Antikörper der Erfindung. Beispiel 49 betrifft den quantitativen Nachweis von Thaumatin und thaumatinähnlichen Polypeptiden durch die Verwendung von Testtechniken, die mehr als einen Antikörper verwenden.

BEISPIEL 1

HERSTELLUNG VON POLYKLONALEM SERUM

Bei dem Verfahren zur Herstellung von Hybridomzellinien, einschließlich A.T.C.C. HB-8921 und A.T.C.C. HB-8922, wurden einer BALB/C-Maus zweimal über einen Zeitraum von zwei Monaten intramuskuläre Injektionen mit Freundschem Komplettadjuvans und 25 ug Pflanzen-Thaumatin I, erhalten von Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo. und gereinigt auf einer Ionenaustauschsäule nach van der Wel und Loeve, European J. Biochem. 31, 221-225 (1972), gegeben. Im dritten Monat nach der ersten Injektion wurden der Maus erneut 20 ug Thaumatin I injiziert. Um Seren zu sammeln, wurde der Maus vor der Immunisierung, vor der dritten Injektion mit Thaumatin und noch einmal vier Tage nach der dritten Injektion Blut aus ihrem Schwanz entnommen.
Beide Serenproben wurden auf Anti-Thaumatin-Antikörper unter Verwendung einer enzymgebundenen immunsorbierenden Testtechnik (ELISA) getestet. Bei dieser Technik wurde natürliches Pflanzen-Thaumatin auf ELISA-Platten so gebunden, daß nur Anti-Thaumatin-Antikörper sich an diese binden würden, verglichen mit einem Kontrollserum, das den Mäusen vor der ersten Injektion mit Thaumatin entnommen wurde. Beide Serenproben erwiesen sich im Test positiv auf Anti-Thaumatin-Antikörper, aber Seren, die aus der zweiten Blutentnahme stammten, hatten einen zweifachen oder noch größeren Antikörpertiter als Seren aus der früheren Blutentnahme.

BEISPIEL 2

ZELLFUSION

Bei dem Hybridomverfahren verschmelzen die Zellmembranen von Milz- und Myelomzellen und umhüllen anfangs ein gemeinsames Cytoplasma mit zwei oder mehr Zellkernen. Einige Tage nach der Fusion der Zellmembranen verschmelzen die Zellkerne und werden zu synchroner Mitose befähigt. Wenn sich diese verschmolzenen Zellen teilen, geht eine variable Zahl von Chromosomen beider verschmolzenen Partner verloren, bis die Hybridzellinien sich stabilisieren. Ein Hypoxanthin- Aminopterin-Thymidin(HAT)-Medium verhindert, daß die SP2- 0:SP2-0-Hybride wachsen. Die Milz:Milz-Zellhybride sterben im allgemeinen nach zwei Wochen in Kultur ab. Somit werden nur die SP2-0:Milz-Hybridzellen in den Kulturen wachsen.
Im Anschluß an die Verifizierung, daß die beimpften Mäuse polyklonale Antikörper gegen Thaumatin im Serum produzierten, wurde die Maus durch Herzpunktion getötet und ihre Milz aseptisch entnommen. Myelomzellen [(SP2-0/Ag 14) (Schulman, et al., Nature, 276,269 (1978)] wurden in RPMI 1640 (Irvine Scientific, GIBCO), das 10 % Pferdeserum mit 50 ug/ml Gentamycin, 2 mM Glutamin, 25 mM Hepes und 10&supmin;&sup5; M β-Mercaptoethanol enthielt, gezüchtet. Die Milz wurde zweimal mit RPMI- Medien, die 50 ug/ml Gentamycin, 2 mM Glutamin und 25 mM Hepes enthielten, gewaschen und mit einer Kanüle Nr. 25 perfundiert. Zentrifugation wurde verwendet, um Zellen aus den perfundierten Medien zu ernten. Die Milzzellen (6 · 10&sup6;) wurden als nächstes bei 1000 UPM für 10 Minuten in einem konischen 50 ml-Röhrchen zusammen mit 2,4 · 10&sup6; Myelomzellen zentrifugiert. Der Überstand wurde abgesaugt und die Zellen wurden für 5 Minuten in ein 37ºC warmes Bad gegeben. Die Milzzellen wurden dann mit den Myelomzellen durch die tropfenweise Zugabe von 1 ml 34 % Polyethylenglykol über einen Zeitraum von 1 Minute verschmolzen. Über die nächsten 3 Minuten wurden 3 ml serumfreies RPMI zugegeben. Serumfreies RPMI wurde dann mit einer Geschwindigkeit von 2 ml/min für 5 Minuten zugegeben. Zusätzliches serumfreies RPMI wurde dann zugegeben, bis ein Gesamtvolumen von 40 ml erreicht war. Das Gemisch wurde dann bei 1500 UPM auf einer IEC-Centra-7- Zentrifuge für 7 Minuten geschleudert. Das Zentrifugenröhrchen wurde abgesaugt und die Zellen wurden in (HAT) -Medium resuspendiert. Nach der Fusion wurden die Zellen in RPMI- Medium überführt, das 0,088 mg/ml Aminopterin, 1,94 mg/ml Thymidin und 6,8 mg/ml Hypoxanthin enthielt, und zwei Tropfen wurden auf jede Vertiefung von 6 Kulturplatten mit jeweils 96 Vertiefungen aufgebracht.
Nach vier Tagen wurden zwei Tropfen des RPMI- und HAT-Mediums zu jeder Vertiefung zugegeben. Nach vier weiteren Tagen wurden zwei weitere Tropfen des HAT-Mediums zu jeder Vertiefung zugegeben. Nach einem Zeitraum von 10-30 Tagen begannen Klone aufzutreten. Thaumatinpositive Klone, bestimmt mit ELISA, wurden fortlaufend auf Platten mit 24 Vertiefungen in RPMI-Medium, das (3-Mercaptoethanol, Glutamin, Pferdeserum und Gentamycin enthielt, überführt. Wenn die Klone erst einmal Konfluenz erreicht hatten, wurden sie mit ELISA getestet, und die thaumatinpositiven Klone wurden fortlaufend auf Platten mit 48 Vertiefungen, 24 Vertiefungen und 6 Vertiefungen überführt. Diejenigen thaumatinpositiven Klone, die den Scale-up-Prozeß überlebten, wurden dann auf Platten mit 96 Vertiefungen mit so einer Verdünnung rekloniert, daß auf 3 Vertiefungen eine Zelle kam.
Die reklonierten Zellkulturen wurden hochgefahren, um in den größeren Vertiefungen gezüchtet zu werden, obgleich bei jedem aufeinander folgenden Schritt 40-50 % der Klone verloren gingen. Die Klone wurden in Platten mit 24 Vertiefungen gezüchtet, dann in Platten mit 6 Vertiefungen und schließlich in Kolben. Auf der Stufe der Platte mit 24 Vertiefungen überlebten 60 positive Klone, aber zu dem Zeitpunkt, als die Kulturen in Kolben überführt worden waren, hatten nur 11 positive Klone auf Thaumatin das Scale-up überlebt. Diese Klone wurden mit den folgenden Nummern bezeichnet: 3, 10, 24, 27, 29, 30, 36, 37, 37, 38 und 41. Proben von Klon Nr. 3 wurden schließlich als A.T.C.C. HB-8922 hinterlegt und Proben von Klon Nr. 29 wurden schließlich als A.T.C.C. HB-8921 hinterlegt, als repräsentativ für zwei Arten von monoklonalen Anti-Thaumatin-Antikörpern. Als die Kulturen auf die Kolben hochgefahren wurden, wurde das Medium von den Zellen durch Zentrifugation abgetrennt und Ammoniumsulfat wurde verwendet, um Proteine auszufällen. Die Präzipitate wurden in phosphatgepufferter Kochsalzlösung, die 1 mM PMSF (phenylmethylsulfonylfluorid) enthielt, gelöst und in aliquote Teile aufgeteilt und bei -80ºC nach Dialyse gegen denselben Puffer eingefroren. Die Zellen wurden dann in flüssigem Stickstoff eingefroren.

BEISPIEL 3

SCREENEN, KLONIEREN UND CNARAKTERISIEREN VON MONOKLONALEN ANTIKÖRPERN

Das folgende Verfahren wird verwendet, um enzymgebundene immunsorbierende Tests (ELISA) auf Thaumatin durchzuführen. Alle Reaktionen werden bei Raumtemperatur durchgeführt und die ELISA-Platte wird in allen Stufen mit einer plastikhülle der Marke Saran überzogen und in einer Feuchtekammer inkubiert. Die ELISA-Platten werden durch Aufbringen von 10 ng Thaumatin I, gereinigt nach dem Verfahren von Beispiel 1, in 50 ul 25 mM NaHCO&sub3; (pH 9,2) beschichtet. Dies wird bei Raumtemperatur für 2 Stunden inkubiert. Die Platten werden zweimal mit 400 ul PBS (50 mM Kaliumphosphat, 51 nM NaCl, pH 7,4) und Tween 20 (0,05 %)) (ein von Sigma Chemical Co. hergestelltes Detergens) gewaschen und dann zweimal mit 400 ul Wasser. Die Platten werden dann mit 200 ul 1 % Rinderserum- Albumin (BSA) in PBS-Tween 20 (0,025 % Lösung) für zwei Stunden bei Raumtemperatur überzogen. Die Platten werden wieder zweimal mit 400 ul der PBS-Tween-Lösung und zweimal mit Wasser gewaschen.
50 ul Medium aus der zu testenden Kultur wird dann zugesetzt. Medium mit normalen, nicht-verschmolzenen Myelomzellen (Sp2- 0/Ag-14) wird als Negativkontrolle verwendet. Mäuseserum bei einer Verdünnung von 1 : 500 oder mehr wird als Positivkontrolle verwendet. Das Medium wird dann für wenigstens 4 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten werden dann erneut zweimal mit 400 ul PBS-Tween20-Lösung und dann zweimal mit Wasser gewaschen. 50 ul einer 1 : 100-Verdünnung von Kaninchen-anti-Mäuse-Leicht-K- und - -Ketten-Immunglobulin werden zugegeben und dies wird für zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten werden erneut zweimal mit 400 ul 0,5 % PBS-Tween20-Lösung und zweimal mit Wasser gewaschen. 50 ul konjugierte Ziegen-anti-Kaninchen-IgG-Peroxidase bei einer 1 : 1000-Verdünnung wird dann zugegeben und für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten werden nochmal zweimal mit 400 ul PBS-Tween20-Lösung und zweimal mit Wasser gewaschen.
50 ul O-Phenylendiamindihydrochlorid(OPD)-Lösung, die 0,01 % H&sub2;O&sub2; enthält, wird zu jeder Vertiefung zugegeben (OPD-Lösung umfaßt 18 mg OPD pro 30 ml Färbepuffer, der selbst 4,8 ml 0,5 M Zitronensäure und 10,28 ml 0,5 N Na&sub2;HPO&sub4; umfaßt, mit Wasser auf 100 ml verdünnt). Das H&sub2;O&sub2; sollte zum OPD nur Sekunden vor Anwendung zugegeben werden. Dieses Gemisch wird dann für 5-15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, bis die Reaktion durch Zugabe von 50 ul 4N H&sub2;SO&sub4; gestoppt wird. Die optische Dichte der Vertiefungen wird dann bei 490 nm mit einem Bio- Tek-ELISA-Ablesegerät gemessen.

BEISPIELE 4-5

CHARAKTERISIERUNG VON MONOKLONALEN ANTIKÖRPERN

In diesen Beispielen wurden kompetitive ELISA-Tests auf monoklonalen Antikörpern durchgeführt, die gemäß der Vorgehensweise von Beispiel 3 von den Klonen Nr. 3 und Nr. 29 produziert wurden, um diese Antikörper in Gegenwart von Pflanzen- Thaumatin I, Pflanzen-Thaumatin II, rückgefaltetem rekombinanten, von Hefe produziertem Thaumatinanalogon und einem rekombinanten, von Hefe produzierten Thaumatinanalogon- Glutathion-Addukt zu charakterisieren. TABELLE 1 Bindungshemmung (%) Beispiel Nr. Antikörperquelle (Klon Nr.) Thaumatin I Rückgefaltetes Hefe-Thaumatin Hefe-Thaumatin-Glutathion-Addukt
Tabelle 1 zeigt Testergebnisse für die Bindungshemmung von Thaumatin I, Thaumatin II, einem rekombinanten, von Hefe produzierten Thaumatinanalogon und einem rekombinanten, von Hefe produzierten Thaumatinanalogon-Glutathion-Addukt, gebildet als Zwischenprodukt beim Rückfalten des rekombinanten Produktes. Es zeigte sich, daß jede dieser Thaumatinarten im kompetetiven ELISA-Test wirkungsvoll mit dem Antikörper aus Klon Nr. 3 konkurriert. Das rekombinante, von Hefe produzierte Thaumatinanalogon-Glutathion-Addukt jedoch konkurrierte im Test mit Antikörper aus Klon Nr. 3 nicht, was anzeigt, daß dieser Antikörper entweder auf die Tertiärstuktur des Polypeptids gerichtet ist oder daß er auf die Primär struktur (eine kontinuierliche Sequenz von Aminosäuren im Polypeptid) des Polypeptids gerichtet ist, aber das die spezifischen Epitope, mit denen der Antikörper reaktiv ist durch die Bildung des Adduktes blockiert sind. Antikörper aus Klon Nr. 29 erkennt andererseits Thaumatin I und II in ihren natürlichen Konformationen ebenso wie rückgefaltetes, rekombinant produziertes Thaumatin. Er erkennt auch das rekombinante, von Hefe produzierte Thaumatinalaogon-Glutathion- Addukt. Das scheint anzuzeigen, daß der Antikörper aus Klon Nr. 29 nicht auf die kugelförmige Tertiärstruktur des Moleküls gerichtet ist (die im Falle des Glutathion-Adduktes aufgebrochen ist), sondern stattdessen auf die Primärstruktur des Polypeptids gerichtet ist, d. h. auf seine Aminosäuresequenz.

BEISPIELE 6-14

CHARAKTERISIERUNG VON MONOKLONALEN ANTIKÖRPERN

In diesen Beispielen wurden kompetitive ELISA-Tests auf monoklonalen Antikörpern durchgeführt, die von Klonen mit den Nummern 10, 24, 27, 30, 36, 37, 371, 38 und 41 produziert worden sind. Die Tests wurden gemäß der Vorgehensweise von Beispiel 3 auf nativem Thaumatin I in seiner natürlichen Konformation und mit Perameisensäure oxidiertem und denaturiertem Thaumatin I durchgeführt. Das denaturierte Thaumatin 1 wurde durch Inkubation von 1 mg Thaumatin I in 0,5 ml einer gekühlten (4ºC) Perameisensäurelösung, hergestellt durch Mischung einer 98 %igen Ameisensäurelösung mit einer 30 %igen Wasserstoffperoxidlösung in einem Verhältnis von 9 : 1, hergestellt. TABELLE 2 Bildungshemmung (%) Experiment Nr. Antikörperquelle (Klon-Nr.) Thaumatin Mit Perameisensäure oxidiertes Thaumatin
Tabelle 2 zeigt, daß monoklonale Antikörper, die von Klonen mit den Nummern 10, 24, 27, 36, 37, 37¹, 38 und 41 produziert worden sind, nur Thaumatin in seiner natürlichen Konformation erkennen und nicht Thaumatin, das mit Perameisensäure denaturiert worden ist. Dies legt nahe, daß diese Klone nur die Tertiärstruktur von Thaumatin erkennen. Antikörper aus Klon Nr. 30 erkennt andererseits sowohl Thaumatin in seiner nativen Konformation als auch mit Perameisensäure denaturiertes Thaumatin. Weil Antikörper aus Klon Nr. 30 sowohl natives als auch denaturiertes Thaumatin erkennt, scheint er auf die Primärstruktur des Polypeptids gerichtet zu sein (d. h. auf einen Teil der kontinuierlichen Aminosäuresequenz im Polypeptid).

BEISPIELE 15-28

CHARAKTERISIERUNG VON MONOKLONALEN ANTIKÖRPERN

In diesem Satz von Beispielen wurden monoklonale Antikörper, die von den Klonen mit den Nummern 10, 24, 27, 30, 36, 37, 37¹, 38 und 41 produziert worden waren, im Hinblick auf die Bindungsaffinität ihrer Antikörper an unterschiedliche Konzentrationen von Thaumatin I, dem verwandten Polypeptid Monellin und mit Perameisensäure oxidiertem Thaumatin I durch den kompetitiven ELISA-Test charakterisiert.
ELISA-Platten wurden mit 10 ng Thaumatin gemäß dem Verfahren von Beispiel 3 beschichtet. Zum selben Zeitpunkt wurde Medium, das monoklonale Antikörper aus den verschiedenen Klonen enthielt, mit Ammoniumsulfat behandelt und 100fach verdünnt. 50 ul der Ammoniumsulfatfraktion wurden dann zu verschiedenen Vertiefungen in Gegenwart unterschiedlicher Mengen an Thaumatin I, Monellin (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) und mit Perameisensäure oxidiertem Thaumatin I zugegeben. TABELLE 3 Beispiel Nr. Antikörperquelle (Klon Nr.) Optische Extinktion Kontrolle Thaumatin Monellin Mit Perameisensäure oxidiertes Thaumatin
Die Ergebnisse der kompetitiven ELISA-Tests, wie sie sich in Tabelle 3 darstellen, legen nahe, daß die monoklonalen Antikörper aus den Klonen mit den Nummern 24, 27, 36, 37¹ und 41 Thaumatin in seiner nativen Konformation ebenso wie Monellin erkennen. Sie erkennen jedoch nicht das mit Perameisensäure denaturierte Thaumatin. Dies ist ein zusätzlicher Hinweis, daß Antikörper aus diesen Klonen zu einem bestimmten Teil der Tertiärstruktur von Thaumatin spezifisch sind. Es scheint auch zu zeigen, daß Thaumatin und Monellin ein gemeinsames, von den monoklonalen Antikörpern erkanntes Epitop teilen, das auch für ihre Süße verantwortlich sein könnte. TABELLE 4 Optische Extinktion Beispiel Nr. Antikörperquelle (Klon Nr.) Kontrolle Thaumatin Monellin Mit Ameisensäure oxidiertes Thaumatin
Die Ergebnisse, wie sie sich in Tabelle 4 darstellen, zeigen, daß monoklonale Antikörper, die von den Klonen mit den Nummern 10, 37 und 38 produziert werden, Thaumatin I und Monellin erkennen, aber mit Perameisensäure denaturiertes Thaumatin nicht erkennen. Dies legt nahe, daß diese Antikörper spezifische Teile der Tertiärstruktur sowohl von Thaumatin als auch von Monellin erkennen. Der von Klon Nr. 30 produzierte Antikörer wird andererseits von Monellin, nativem Pflanzen-Thaumatin und denaturiertem Thaumatin gehemmt. Dies zeigt, daß der Antikörper aus Klon Nr. 30, ebenso wie der Antikörper aus Klon Nr. 29, mit einem Teil der Primärstruktur von Thaumatin sowie von Monellin spezifisch reaktiv ist.

BEISPIELE 29-36

CHARAKTERISIERUNG VON MONEKLONALEN ANTIKÖRPERN

In diesem Satz von Beispielen wurden monoklonale Antikörper aus den Klonen Nr. 3 (A.T.C.C. HB-8922) und Nr. 29 (A.T.C.C. HB-8921) als repräsentativ für zwei Antikörper-Hauptarten ausgewählt. Die ELISA-Platten wurden gemäß dem Verfahren von Beispiel 3 mit 50 ul (1) Rinderserumalbumin (BSA) (10 mg/ml), (2) mit Perameisensäure behandeltem Thaumatin I (21 ug/ml), (3) Thaumatin I (1 ug/ml) oder (4) Monellin (4ug/ml) beschichtet. Tabelle 5 zeigt die Ergebnisse eines ELISA-Verfahrens, die bestätigen, das der Antikörper aus Klon Nr. 3 nur Monellin und Thaumatin erkennt, daß in seiner nativen Konformation vorliegt. Andererseits erkennt der Antikörper aus Klon Nr. 29 Thaumatin, Monellin und denaturiertes Thaumatin. TABELLE 5 Optische Extinktion Beispiel Nr. Klon Nr. Thaumatin Monellin Mit Perameisensäure oxidiertes Thaumatin (Kontrolle)

BEISPIEL 37-40

CHARAKTERISIERUNG VON MONOKLONALEN ANTIKÖRPERN

In diesem Satz von Beispielen wurden monoklonale Antikörper aus den Klonen Nr. 3 und 29 als repräsentativ für zwei Antikörper-Hauptarten ausgewählt. Die ELISA-Platten wurden gemäß dem Verfahren von Beispiel 3 mit 50 ul Pflanzen-Thaumatin I (0,2 u/ml), mit Thaumatin-Glutathion-Addukt (5 ug/ml) oder mit Rinderserumalbumin (BSA) als Kontrolle beschichtet. Das Addukt ist ein Zwischenprodukt im Faltungsprozeß von rekombinantem, von Hefe produzierten Thaumatin I, entsprechend der Sequenz von Iyengar, et al., und ist nicht süß. TABELLE 6 Optische Extinktion Beispiel Nr. Klon Nr. Thaumatin Thaumatin-Glutathion-Addukt Kontrolle
Die Ergebnisse, die in Tabelle 6 dargestellt sind, beweisen, daß von Klon Nr. 3 produzierte Antikörper nur natives Pflanzen-Thaumatin I erkennen und nicht das nicht-gefaltete rekombinante Addukt erkennen. Monoklonale Antikörper aus Klon Nr. 29 erkennen jedoch sowohl das native Thaumatin als auch das nicht-gefaltete Addukt.

BEISPIEL 41

KOMPETITIVER TEST AUF MONOKLONALE ANTIKÖRPER

In diesem Beispiel wurde die Hemmungswirkung von rekombinantem, von Hefe produziertem Thaumatinanalogon-Glutathion- Addukt und von mit Perameisensäure oxidiertem Pflanzen-Thaumatin auf die Bindung von monoklonalen Antikörpern aus Klon Nr. 3 an natives Pflanzen-Thaumatin I bewertet. Die ELISA- Platten wurden mit 10 ng nativem Pflanzenthaumatin I pro Vertiefung beschichtet. Die Antikörper wurden mit Kontrollpuffer oder mit verschiedenen Mengen an Testmaterialien für zwei Stunden vorinkubiert und wurden zu den Platten zugegeben. Die Platten wurden dann entsprechend dem ELISA-Verfahren von Beispiel 3 entwickelt. Die in Tabelle 7 dargestellten Ergebnisse zeigen, daß die Zugabe von 500 ng nativem Thaumatin den Test wirksam um 50 % hemmt. Vor Inkubation des Antikörpers aus Klon Nr. 3 mit dem Thaumatinanalogon-Glutathion-Addukt oder mit dem mit Perameisensäure oxidierten Thaumatin führt zu geringer oder keiner Hemmung im Test. Tabelle 7 Bindungshemmung Zugabe Thaumatin Thaumatin-Glutathion-Addukt Mit Perameisensäure oxidiertes Thaumatin

BEISPIEL 42

KOMPETETIVER TEST AUF MONOKLONALE ANTIKÖRPER

In diesem Beispiel wurde die Hemmungswirkung von rekombinantem, von Hefe produziertem Thaumatinanalogon-Glutathion- Addukt und von mit Perameisensäure oxidiertem Thaumatin auf die Bindung von monoklonalen Antikörpern aus Klon Nr. 29 an natives Pflanzen-Thaumatin I bewertet. Die ELISA-Platten wurden mit 10 ng nativem Pflanzen-Thaumatin I pro Vertiefung beschichtet. Die Antikörper wurden mit Kontrollpuffer oder mit verschiedenen Mengen an Testmaterialien für zwei Stunden vorinkubiert und wurden zu den Platten zugegeben. Die Platten wurden dann gemäß dem ELISA-Verfahren von Beispiel 3 entwickelt. Die in Tabelle 8 dargestellten Ergebnisse zeigen, daß sowohl das Thaumatin-Glutathion-Addukt als auch das mit Perameisenaäure oxidierte Thaumatin wirkungsvoll mit nativen pflanzen-Thaumatin um Antikörper aus Klon Nr. 29 im kompetetiven ELISA-Test konkurrieren. TABELLE 8 Bindungshemmung Zugabe Thaumatin Thaumatin-Glutathion-Addukt Mit Perameisensäure oxidiertes Thaumatin

BEISPIELE 43-45

CHARAKTERISIERUNG VON MONOKLONALEN ANTIKÖRPERN

In diesem Satz von Beispielen wurden monoklonale Antikörper, die von den Klonen Nr. 3 und 29 produziert worden waren, auf Reaktivität gegen die Süßstoffe Monellin, Saccharose und Aspartame getestet. Medium aus Kulturen der zwei Klone (jeweils 100 ml) wurden mit einer 50 % Übersättigung an Ammoniumsulfat ausgefällt. Das Präzipitat wurde dann in 5 ml PBS (pH 7,4) gelöst. Die Proteinkonzentrationen für beide betrugen 20 mg/ml. Das ammoniumsulfatkonzentrierte Medium bei Verdünnungen von 1 : 20 und 1 : 60 wurde dann auf Reaktivität gegenüber den Süßstoffen überprüft.
Die ELISA-Platten wurden mit nativem Pflanzen-Thaumatin I beschichtet (10 ng in 50 ul 20 mM NaHCO&sub3;). Antikörper aus den Klonen Nr. 3 und 29 bei den zwei Verdünnungen wurden mit 0,5 nM Monellin, 50 nM Saccharose und 170 nM Aspartame für 3 Minuten bei 24ºC vorinkubiert. Die Platten wurden gemäß dem kompetetiven ELISA-Verfahren von Beispiel 3 entwickelt. Die in Tabelle 9 dargestellten Ergebnisse zeigen, daß keiner der monoklonalen Antikörper mit Saccharose oder mit Aspartame reagiert. Der Test zeigt auch, daß Monellin bei der vorgelegten Konzentration nicht die Bindung des von Klon Nr. 3 produzierten Antikörpers mit Thaumatin hemmt. TABELLE 9 Optische Extinktion Beispiel Nr. Klon Nr. Verdünnung Kontrolle Monellin Saccharose Aspartame

BEISPIEL 46

KOMPETETIVER TEST

In diesem Beispiel wurde ein kompetetiver Test zwischen nativem Pflanzen-Thaumatin I und Monellin durchgeführt, wie in Beispiel 41 beschrieben. Die in den Tabellen 10 und 11 dargestellten Ergebnisse zeigen, das Monellin die Bindung bei, grob gesagt, einer zehnfach höheren Konzentration als Thaumatin hemmt. Daher besitzt der monoklonale Antikörper aus Klon Nr. 29 eine zehnfach niedrigere Affinität für Monellin als für Thaumatin. TABELLE 10 Protein Menge an Protein Hemmung Thaumatin nicht nachweisbar TABELLE 11 Protein Menge an Protein Hemmung Monellin nicht nachweisbar

BEISPIEL 47

AMPLIFIKATION VON ANTIKÖRPERERTRÄGEN DURCH DIE ASCITES-METHODE

Um einen stärker konzentrierten Antikörper zu erhalten als denjenigen, der in Gewebekultur produziert wird, werden die monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung mit der Ascites-Methode amplifiziert, die allgemein bei Kenneth et al. (Hrg.), Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analysis, S. 403, New York: Plenum Press (1981) beschrieben ist. Gemäß diesem Verfahren werden Mäuse mit 0,6 ml Pristan (2,6,19,14-Tetramethylpentadecan, erhalten von Aldrich Chemical Co.) vorbereitet, das in ihre Bauchfellhöhlen mit Hilfe von Kanülen mit den Nummern 25 oder 27 injiziert wurde. Pristan-Behandlung ermöglicht das Wachstum von Tumorzellen in einer ascitischen Form in der Bauchfellhöhle. Nach drei Wochen wurden 10&sup6; Hybridomzellen in die Bauchfellhöhlen der Mäuse zusammen mit 0,5 ml serumfreien Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) (Irvine Scientific Co.) injiziert. Zwei Injektionssätze wurden bei zwei Mäusen für jeden der Klon Nr. 3 und Nr. 29 durchgeführt.
Sieben Tage nach der Injektion der Hybridomzellen wurde den Mäusen Wasser und Nahrung (Hafermehl) verabreicht. 12 bis 14 Tage nach der Injektion der Hybridomzellen wurde Ascitesflüssigkeit aus den intraperitonealen Höhlen der Mäuse entnommen, indem kleine Einschnitte in die Haut gemacht wurden und die Flüssigkeit herauspipettiert wurde. Die Flüssigkeit wurde zentrifugiert und die Zellen wurden in Einfriermedium suspendiert und dann in flüssigem Stickstoff eingefroren. Die Ascitesflüssigkeit wurde dann bei Verdünnungen von 1 : 3, 1 : 9, 1 : 27 und 1 : 81 gegen natives Thaumatin, Monellin und eine Kontrolle (BSA) getestet. Dieses Verfahren produzierte ein geringeres Volumen an monoklonalem Antikörper, der einen höheren Titer besaß, als der in einer Gewebekultur produzierte Antikörper. Antikörper aus Ascitesflüssigkeit können aus Ascitesflüssigkeitsalbumin durch Ausfällung mit 40 % Ammoniumsulfat und Ionenaustauschchromatographie weiter gereinigt werden.

BEISPIEL 48

ISOLIERUNG UND REINIGUNG VON THAUMATINÄHNLICHEN POLYPEPTIDEN

Durch ihre Bereitstellung hochspezifischer und hochreaktiver monoklonaler Anti-Thaumatin-Antikörper macht die vorliegende Erfindung erstmals die Isolierung von Thaumatin und thaumatinähnlichen Peptiden aus Fermentationskulturen sowie aus natürlichen Pflanzenquellen gemäß auf diesem Gebiet der Technik bekannten Affinitätsreinigungsverfahren möglich. Kurz gesagt, würden die bevorzugten Isolierungsverfahren das Immobilisieren eines Antikörpers der Erfindung auf einem festen Träger (z. B. auf einer Chromatographiesäule), das In- Kontakt-Bringen der thaumatinhaltigen Flüssigkeit mit dem immobilisierten Antikörper und das anschließende Eluieren gereinigten Thaumatins aus der Immunkomplexassoziation mit dem Antikörper umfassen. Durch Einstellen des besonderen verwendeten Antikörpers könnte die Reinigungstechnik so eingestellt werden, daß natives Thaumatin in seiner richtig gefalteten Konformation von unrichtig gefaltetem denaturiertem Thaumatin isoliert wird. Thaumatinähnliche Peptide könnten isoliert und untersucht werden, ebenso wie spezifische antigene Epitope von thaumatinähnlichen Molekülen.

BEISPIEL 49

QUANTITATIVER NACHWEIS VON THAUMATINÄHNLICHEN POLYPEPTIDEN

Durch ihre Bereitstellung von hochspezifischen monoklonalen Anti-Thaumatin-Antikörpern macht die vorliegende Erfindung auch neuartige Tests zum quantitativen Nachweis von Thaumatin in einer Flüssigprobe möglich, die mehr als einen Antikörper verwenden. Solche Tests würden die folgenden Schritte einschließen:
(1) In-Kontakt-Bringen der Flüssigkeit mit einem ersten immobilisierten Antikörper, der mit einer ersten antigenen Determinante von Thaumatin in der Flüssigkeit reagiert, um einen immunologischen Komplex von Thaumatin und dem ersten Antikörper zu bilden;
(2) In-Kontakt-Bringen des in Schritt (1) gebildeten Komplexes mit einem zweiten Antikörper, der mit einer anderen antigenen Determinante von Thaumatin als der ersten antigenen Determinante reagiert, um einen immunologischen Komplex von Thaumatin und dem zweiten Antikörper zu bilden; und
(3) Quantifizieren der Menge des zweiten Antikörpers, die an den in Schritt (2) gebildeten immunologischen Komplex gebunden ist.
Solche Testverfahren würden vorzugsweise zwei der oben beschriebenen monoklonalen Antikörper einschließen, können aber auch unter Verwendung einer der monoklonalen Antikörper und eines aus polyvalentem Serum abgeleiteten Antikörpers gegen Thaumatin entwickelt werden.

Claims

1. Von Mäusen abgeleitete Hybridomzellinie, die in der Lage ist, im Medium ihres Wachstums einen monoklonalen Antikörper zu produzieren, der in der Lage ist, sich spezifisch mit Thaumatin zu verbinden, aber nicht in der Lage ist, sich spezifisch mit L-Aspartyl-L-phenylalaninmethylester zu verbinden.

2. Hybridomzellinie nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie in der Lage ist, im Medium ihres Wachstums einen monoklonalen Antikörper zu produzieren, der in der Lage ist, sich spezifisch mit einem Epitop zu verbinden, das einen Teil der Tertiärstruktur von Thaumatin umfalt.

3. Hybridomzellinie nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie in der Lage ist, im Medium ihres Wachstums einen monoklonalen Antikörper zu produzieren, der in der Lage ist, sich spezifisch mit einem Epitop zu verbinden, das einen Teil der Primärstruktur von Thaumatin umfalt.

4. Hybridomzellinie nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie A.T.C.C. Nr. HB-8922 ist.

5. Hybridomzellinie nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie A.T.C.C. Nr. HB-8921 ist.

6. Monoklonaler Antikörper, produziert von einer Hybridomzellinie nach einem der Ansprüche 1 bis 5.

7. In einem immunologischen Verfahren zur Isolierung von biologisch aktivem Thaumatin oder thaumatinähnlichen Polypeptiden aus einer biologischen Flüssigkeit auf der Grundlage einer selektiven immunologischen Reaktion mit einem für Thaumatin spezifischen Antikörper, die folgende Verbesserung: Verwendung eines monoklonalen Antikörpers nach Anspruch 6 als besagter spezifischer Antikörper.

8. Immunologischer Test zum quantitativen Nachweis von Thaumatin oder thaumatinähnlichen Polypeptiden in einer biologischen Flüssigkeit, der die folgenden Schritte umfaßt:

(1) In-Kontakt-Bringen der Flüssigkeit mit einem ersten immobilisierten Antikörper, der mit einer ersten antigenen Determinante von Thaumatin in der Flüssigkeit reagiert, um einen immunologischen Komplex von Thaumatin und dem ersten Antikörper zu bilden;

(2) In-Kontakt-Bringen des in Schritt (1) gebildeten Komplexes mit einem zweiten Antikörper, der mit einer anderen antigenen Determinante von Thaumatin als der ersten antigenen Determinante reagiert, um einen immunologischen Komplex von Thaumatin und dem zweiten Antikörper zu bilden; und

(3) Quantifizieren der Menge des zweiten Antikörpers, der an den in Schritt (2) gebildeten immunologischen Komplex gebunden ist, wobei der erste oder zweite Antikörper ein monoklonaler Antikörper nach Anspruch 6 ist.

9. Von Mäusen abgeleitete Hybridomzellinie, die in der Lage ist, im Medium ihres Wachstums einen monoklonalen Antikörper zu produzieren, der in der Lage ist, sich spezifisch mit Monellin zu verbinden, aber nicht in der Lage ist, sich spezifisch mit L-Aspartyl-L-phenylalaninmethylester zu verbinden.

10. Hybridomzellinie nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß sie A.T.C.C. Nr. HB-8922 ist.

11. Hybridomzellinie nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß sie A.T.C.C. Nr. HB-8921 ist.

12. Monoklonaler Antikörper, produziert von einer Hybridomzellinie nach Anspruch 9, 10 oder 11.

13. In einem immunologischen Verfahren zur Isolierung von biologisch aktivem Monellin aus einer biologischen Flüssigkeit auf der Grundlage einer selektiven immunologischen Reaktion mit einem für Monellin spezifischen Antikörper, die folgende Verbesserung: Verwendung des monoklonalen Antikörpers nach Anspruch 12 als besagter spezifischer Antikörper.

14. Immunologischer Test zum quantitativen Nachweis von Monellin in einer biologischen Flüssigkeit, der die folgenden Schritte umfaßt:

(1) In-Kontakt-Bringen der Flüssigkeit mit einem ersten, immobilisierten Antikörper, der mit einer ersten antigenen Determinante von Monellin in der Flüssigkeit reagiert, um einen immunologischen Komplex aus Monellin und dem ersten Antikörper zu bilden;

(2) In-Kontakt-Bringen des in Schritt (1) gebildeten Komplexes mit einem zweiten Antikörper, der mit einer anderen antigenen Determinante von Monellin als der ersten antigenen Determinante reagiert, um einen immunologischen Komplex aus Monellin und dem zweiten Antikörper zu bilden; und

(3) Quantifizieren der Menge des zweiten Antikörpers, der an den in Schritt (2) gebildeten immunologischen Komplex gebunden ist, wobei der erste oder zweite Antikörper ein monoklonaler Antikörper nach Anspruch 12 ist.