JPS63501192A - 抗タウマチンモノクローナル抗体およびそのモノクローナル抗体を用いたタウマチンの単離方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 「ハイブリドーマの腫瘍細胞系とタウマチンに対するそれらのモノクローナル抗 体」 （発明の背景） 本発明は、主として生体液からのタウマチンとして知られる。

甘味のポリペプチドの単離と定量のための免疫処理で用いる材料と方法に関する 。特に本発明は、新規なハイブリドーマ細胞系（寄託番号Ａ、Ｔ、Ｃ，Ｃ，ＨＢ −８９２１及び、　Ａ、Ｔ、Ｃ，Ｃ，８Ｂ−８９２２）によって産生ずるモノク ローナル抗タウマチンに抗体に関するもので、親和精製法によるタウマチンの単 離に、タウマチンを検出するための分析法に、また、甘味のあるタウマチン類似 のポリペプチドの研究のための免疫技術に、これらの抗体を用いることに関する 。

タウマチンは、アフリカの低木、学名がタウマドコンカス　ダニエリ　ベントの 果実の仮種皮から得られる非常に強い甘味のタンパク質である。この古来の果実 は、西アフリカでは、ココナツワイン、トウモロコシパン及び酸味の強い果実の 甘味増強材料として用いられてきた０重量ベースで、しよ糖の約５０００倍も甘 いタウマチンは、少なくとも、５種の形態が生産されている。すなわち、タウマ チンＩ、ＩＩ、ａ、ｂ、ｃの５種である。イオン交換カラムからの溶離の順番で 名付けられたこれらのタンパク質は、約２２キロダルトンの分子量を持っている 。〔文献器ｇｇｅｎｂｏｔｈａｓ等。

食物の感覚的特性（Ｓｅｎｓｏｒｙ　Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ｏｆ　Ｆｏｏｄｓ ）　（Ｂｉｒｃｈ等。

り　Ｌｏｎｄｏｎ：　Ａｐｐｌｉｅｄ　５ｃｉｅｎｃｅｓ、　ｐｐ、１２９〜１ ４９　（１９７７））無毒性タンパク質であるタウマチン！および■は、低カロ リーで、虫歯にならなく、これらのタンパク質と人間の味蕾の安定な相互作用を 示唆すａｔ滑在的な味覚反応を誘発する。したがってタウマチンは、砂糖代用品 の食品添加物、甘味受容体の探査、あるいは、味覚反応をさらに解明する手段と しての利用可能性を有する。

タウマチンを、許容できる食品添加物あるいは研究手段として利用するには、そ のタンパク質の純度の高いものを大量供給しなければならない、Ｔ、ダニエリは 、うまく果実を増殖するには、熱帯気候と、昆虫による授粉が必要であるから、 その果実のハウス栽培には、かなりの困難が伴う。これらの理由から、遺伝子を 組み換え体微生物に導入し、それらにタウマチンを合成させることに多大な努力 が払われてきた。一研究グループは、タウマチンＩのアミノ酸配列順序を報告し ている。〔文献１ｙｅｎｇａｒ等、　Ｅｕｒ、　Ｊ。

Ｂｔｏｃｈｅｍ、　、９６．１９３−２０４　（１９７９））その研究グループ は、また、メツセンジャーＲＮ＾−由来の相補的ＤＮＡ　（ｃＤＮＡ）からの、 タウマチン■の遺伝子のクローニングに成功したことを報告している。〔文献　 Ｅｄｅｎｓ等、遺伝子（Ｇｅｎｅ）　、　１８゜１−１２　（１９８２）　）　 、上に引用した参考文献において、　Ｅｄｅｎｓ等は。

プレプロタウマチンＨの自然の配列順序をもったポリペプチドが。

微生物学的に産生されたと記している。

さらに、特別なことに、その参考文献と、欧州特許出願第５４，３３０号及び第 ５４．３３１号は、自然の成熟タウマチン■とプレプロタウマチン■を作るため のｃＤＮＡのコード配列順序を開示し、また、微生物における組み換えに用いる ためのＤＮＡ配列からなるクローニングベクターについても、開示している。

１９８３年１０月１１日に出願された。共有され係属中の米国特許出願筒５４０ ．６３４号では＊　Ｉｙｅｎｇａｒ等によって与えられた配列を複製する１次構 造のタウマチン■のためのコードを存する“工業”遺伝子の合成に成功したが、 彼らは、細菌や酵母を宿主として、という表現で開示した。

発明の背景としては１選定された抗原物質に対して、高度に特異的なモノクロー ナル抗体を製造する腫瘍細胞系を産生をするためのハイブリドーマ技術に焦点を 合せた最近の研究が興味深い。

モノクローナル抗体の産生に関する技術は、技能的には一般によく知られている 。これらの処理の典型的な記述は、　Ｗａｎｄｓ＋　Ｊ、　Ｒ。

＆　Ｚｕｒａｗｓｋｉ＋　Ｖ、　Ｒ８，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ　８ ０　：　２２５　（１９８１）；Ｍａｒｓｈａｋ−Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ等、　Ｊ 、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１２２　：　２４９１　（１９７９）；そして。

Ｏｉ、　Ｖ、　Ｔ、　＆　Ｌ、Ａ、　Ｈｅｒｚｅｎｂｅｒｇ、　”免疫グロブリ ンを産生ずるハイブリッド（Ｉｎ＋ａ＋ｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ　Ｐｒｏｄｕｃ ｉｎｇ　Ｈｙｂｒｉｄ）’Ｍｉｓｈｅｌｌ、　Ｂ、　Ｂ。

＆　Ｓ、　Ｍ、　Ｓｈｉｉｇｉ　（＆Ｈ）、細胞　学における　法（Ｓｅｌｅｃ ｔｅｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｉｍｕｎｏｌｏｇ　Ｌ　Ｓａ ｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ　：　Ｗ、　Ｈ，’ＦｒｅｅｍａｎＰｕｂｌｘｓｈｔｎ ｇ＋　１９７９＋等がある。これらは要約すると、関係する抗原を前もって注射 した動物の肺臓から取出したリンパ球を、ポリエチレングリコールの存在のもと で、骨髄腫細胞内に誘導し、その細胞と融合させる。何千もの“ハイブリッド” 骨髄腫細胞が融合から産生される。それぞれの“ハイブリドーマ”細胞培養の増 殖から得られた上滑は目的の抗体活性の有無を試験される。そのような活性が、 一つの細胞培養の上清中で、見つかると、限界希釈によりクローン化され、クロ ーン化したものは、上清の活性について９個々に１分析される。

それらの免疫性の高度な特異性のため、ハイブリドーマ技術に従って、開発した モノクローナル抗体については１診断薬、治療薬、あるいは、特異に交互反応性 のある野生資源からの抗原タンパク質の親和精製薬としての利用が、提案されて きた。

例＋　Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ　Ｖｏｌ、　３＋Ｎｏ、７ 　（ＪｕｌＶ、　１９８５Ｌ米国特許第４．４６５．６２４号、第４．５１４， ５０５号あるいは第４．５１４．５０７号を参照されたい。

タウマチンやタウマチン６８２のポリペプチド分子の検知、単離。

精製、研究に利用するために、特異的なモノクローナル抗体に対する需要が実質 的にあるのだが、タウマチンに対するモノクローナル抗体を得るためのハイブリ ドーマ技術利用に成功したという報告は今までにない。

（要約） 本発明は先ず第１に、タウマチンに特異的な免疫反応性のあるモノクローナル抗 体を産生ずるハイブリドーマ細胞系を提供する。

本発明は、実施例として新しいマウス−マウスハイブリドーマ細胞系のＡ、Ｔ、 Ｃ，Ｃ，ＨＢ−８９２２を提供する。そしてこの細胞は、タウマチン及びタウマ チン類似のポリペプチドの３次元の球状構造に特異的な反応性をもったモノクロ ーナル抗体をその培養の増殖における上清の成分として産生ずる。本発明は、ま た、新しいマウス−マウスハイブリドーマ細胞系のＡ、Ｔ、Ｃ，Ｃ，ＨＢ−８９ ２１を提供する。

そしてこの細胞は、タウマチン及び、特定のタウマチン類似のポリペプチドの１ 次元のポリペプチド構造を組み立てている一つ。

又は、それ以上の特定のアミノ酸配列に特異的な免疫反応性のあるモノクロナー ル抗体を、その培養の増殖の上清成分として産生ずる。腫瘍細胞系のＡ、Ｔ、Ｃ ，Ｃ，ＨＢ−８９２２およびＡ、Ｔ、Ｃ，Ｃ，）ＩＢ−８９２１は。

Ａｍｅｒｉｃａｎ　ｔｙｐｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｒ＋、　１ ２３０１　Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ＋Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　Ｍｄ、　２ ０８５２＋　に寄託している。同所は細胞培養や微生物の公認の寄託機関である 。

本発明は、別の面として、タウマチンの、あるいは同様なタンパク質のモネリン のようにタウマチン８４１のポリペプチドの、３次元の球状構造と特異的な免疫 反応性をもったモノクローナル抗体を提供する。加うるに、タウマチン及び、タ ウマチン類似のポリペプチドの１次構造を組立てている１つ、又は、それ以上の 特定のアミノ酸配列に、特異的な免疫反応性をもったモノクローナル抗体を提供 する。

本発明の実施例では、腫瘍細胞系は、　Ｏｉ及び、　Ｈｅｒｚｅｎｂｅｒｇが１ 免疫グロブリンを産生ずるハイブリッド”（前掲）に記述した標準的な免疫技術 を用いて産生される。即ち、マウスからの肺臓細胞を、植物から単離したタウマ チンで、高度免疫化し、ポリエチレングリコールの存在で、マウスの骨髄腫細胞 系と融合させる。

各１ハイプリードーマ”細胞の培養で増殖してできた上滑は、希望する抗体活性 の有無を試験する。細胞系を増殖するようクローン化された選別されたハイブリ ードーマ細胞系は、高度に特異的な抗タウマチン活性をもった抗体をその増殖上 清中で産生できる。

本発明のモノクローナル抗体、特に、ハイブリドーマＡ、Ｔ、Ｃ，Ｃ。

）ＩＢ−８９２１とＡ、Ｔ、Ｃ，Ｃ，０８−８９２２によって産生ずる新しい二 つのモノクローナル抗体の各々は、醗酵、又は、他の培地からのタウマチンある いはタウマチン類似のポリペプチドの親和性による精製や分離のための免疫学的 手法に使われるよう４こなろう。このような処理では、選別された抗体は、（例 えばカラムで）固定化され。

醗酵培地は、固定化された抗体と接触することになる。

タウマチンは、抗体に結合して、その後で、高純度の形で、固定された抗体から 溶離する。本発明の抗体はまた。＠酵、その他の培地におけるタウマチンあるい は、モネリンのようなタウマチン類似のポリペプチドの定量のための免疫学的処 理で用いられることになろう。異種のモノクローナル抗体を組み合わせて用いる 処理は、タウマチン及びタウマチン類似の分子が、醗酵その他の培地から単離さ れたとき、それらの自然コンフォメーション及び変性状態のどちらにあるものを も検出・定量することに用いることができる。本発明は、更に酵素結合免疫吸収 定量法（ＥＬＩＳＡ）を用いる。タウマチン及びタウマチン類似のポリペプチド の定量のための免疫定量法を提供する。本発明の他の事項は９次の詳細な説明で 明らかになる。

（詳細な説明） 以下の実施例′は１本発明のＡ、Ｔ、Ｃ，Ｃ，ＨＢ−８９２１及びＡ、Ｔ、Ｃ， Ｃ，ＨＢ−８９２２を含む多くのハイブリドーマ細胞系の産生、タウマチン及び タウマチン類似のポリペプチドに対する抗体の単離及びタウマチンの抗原決定基 に対し、各々免疫的な誘引力をもったモノクローナル抗体の、特性分析、収量増 加に関する。

個別に述べると、実施例１から実施例３までは、マウス細胞に対する。抗タウマ チンポリクローナルマウス血清抗体を産生させるための刺戟、マウス牌細胞とマ ウス骨髄腫細胞の融合、そして。

ハイブリッド細胞の、スクリーニング、クローニング、増殖とそこからのモノク ローナル抗体の単離に方向づけられた。実施例４から実施例４６までは、そうし て産生じたモノクローナル抗体の特性分析であってＥＬＩＳＡ定量法及び競合的 阻害定量法によるものである。実施例４７は、腹水症法によるモノクローナル抗 体の収量の増加に関する。実施例４８は１本発明のモノクローナル抗体を用いた 。タウマチンとタウマチン類似のポリペプチドの単離及び精製に関する。実施例 ４９は、二以上の抗体を活用した定量技術によるタウマチン及びタウマチン類似 のポリペプチドの定量に関する。

実施例１ ポリクローナル血清の調製 Ａ、Ｔ、Ｃ，Ｃ，）ＩＢ−８９２１及びＡ、Ｔ、Ｃ，Ｃ，ＨＢ−８９２２を含む ハイブリッド細胞系の産生の処理において、　ＢＡＬＢ／Ｃマウスに、２ケ月以 上の期間に、完全なフロイント　アジュバント（細胞性免疫を増強する補助薬） と２５μｇの植物タウマチンＩ　（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、　 Ｓｔ。

Ｌｏｕｉｓ、　Ｍｏから入手した）を２度にわたって筋肉内に注射した。

そして文献νａｎ　ｄｅｒ　Ｗｅｌ　とＬｏｅｂ、　Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｊ、　 Ｂｉｏｃｈｅｍ、　３Ｌ２２１〜２２５　（１９７２）に従って、イオン交換カ ラムで精製した。最初の注射から３ケ月で、そのマウスに２０μｇのタウマチン Ｉを、再注射した。そのマウスについては、免疫になる前に血清を集めるため、 ３回目のタウマチンの注射の前と３回目の注射後４日目とに。

その尾から採血した。

血清の２回の試料は、抗タウマチン抗体に関して、酵素結合免疫吸収定量（ＥＬ ＩＳＡ）の技術で測定された。この技術では、天然植物タウマチンをＥＬＩＳＡ プレートに塗り固めた。すると、抗タウマチン抗体だけが、タウマチンの最初の 注射に先立って、マウスから得られた対照血清よりも、それらと結合するように なる。両方の血清試料は、抗タウマチン抗体に関しては陽性を示すが、後者の採 血から得た血清から、前者から得た血清の２倍またはそれ以上の抗体力価が得ら れた。

実施例２ 細胞融合 ハイブリドーマ法の手法において、牌細胞と骨髄腫細胞の細胞膜が溶けて、当初 は二つまたはそれ以上の核とともに通常の細胞質を取り囲む。細胞膜の融合後、 数日で核が溶け、同調的有糸分裂が可能になる。これらの融合した細胞が分裂す ると１両方の融合したパートナ−の多くの種類の染色体は、ハイブリッド細胞系 が安定するまでに、消失する。ヒポキサンチン　アミノプテリンチミジン（ＨＡ Ｔ）培地は、　５Ｐ２−０　：　５Ｐ２−０ハイブリツドの増殖を防止する。肺 臓：牌細胞ハイブリッドは、培養で１通常２週間後に死滅する。このように５Ｐ ２−０：肺臓ハイブリッド細胞だけが、培養中で増殖する。

次に、接種されたマウスで、血清中でのタウマチンに対するポリクローナル抗体 の産生が確かめられた後、採血され、心臓に孔がおいて死亡し、その肺臓を、摘 出した。

骨髄腫細胞（（ＳＦ３−０／Ａｇ　１４）（Ｓｃｈｕｌｍａｎ等、　Ｎａｔｕｒ ｅ、　２７６、２６９　（１９７Ｂ）　）を、５０μｇｌ訓ｌのゲンタマイシン 、２ｍＭのグルタミン。

２５　ｍＭのヘペス（Ｈｅｐｅｓ　：グツドの緩衝剤の１つ）と　１０−’　Ｍ β−メルカプトエタノールと１０％のウマ血清を含むＲＰＭＩ　１６４０（Ｉｒ ｖｉｎｅ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、　ＧＩＢＣＯ）中で増殖した。肺臓を、　５ ０μｓ／　ｍｌのゲンタマイシン、２ｍＭのグルタミンと２５ｍＭのヘペスを含 むＲＰ旧培地で２度洗浄し、２５ゲージ針で潅流した。遠心分離で細胞を潅流培 地から分ける。牌細胞（６Ｘ１０６）は１次に、　２．４　ＸＩＯ’の骨髄腫細 胞と共に５０ｍ　ｆの円錐チューブに入れ、１０分間、　１０００　ｒｐｍの回 転速度で遠心分離する。上清を吸引し、その細胞に、５分間。

３７℃の湯浴を施した。そして、牌細胞に、３４％のポリエチレングリコール１ １を、１分間以上かけ、て滴下し、骨髄腫細胞と融合した。次の３分間にわたり 、３　ｍｌの無血清ＲＰＭＩを添加した。そして、無血清ＲＰ旧を２ｔｎｌｌ１ 分の割合で５分間添加した。さらに無血清ＲＰＭＩを、総量が４０ｍ　Ａ’にな るまで添加した。そして、混合物をＩＥＣ−Ｃｅｎｔｒａ−７の遠心分離機によ り、　１５００　ｒｐｍの回転速度で７分間回転させた。その遠心分離チューブ を吸引し、その細胞を、　ＨＡＴ培地に再懸濁させた。融合の後、それらの細胞 を、　０．０８８　ｍｇ／　ｏ＋ｊ！のアミノプテリン、１．９４■／ｍｌのチ ミジンと、６．８■／ｍｌｌのヒポキサンチンを含むＲＰＭＴ培地に移し、９６ ケのウェルがある培養プレート６ケの各々゛のウェルに２滴づつ入れた。

４日後、各ウェルに、　ＲＰ［と）ＩＡＴ培地の各２滴を添加し、更に４日後、 もう２滴のＩＩＡＴ培地を各ウェルに添加した。クローンは。

１０〜３０日の後に現れ始める。ＥＬＩＳＡ測定によって、タウマチン陽性であ るクローンは、続いて２４ウエルプレートのβ−メルカプトメタノール、グルタ ミン、ウマ血清とゲンタマイシンを含むＲＰＭＩ培地に移した。

クローンが、塊りになるほど増えると、　ＥＬＩＳＡ法によって試験し、タウマ チン陽性クローンは、続いて４８ケのウェル、２４ケのウェル及び６ケのウェル プレートに、順次移した。処理のスケールアンプで生き残ったこれらのタウマチ ン陽性クローンを再びクローン化し、３ケのウェルに１つの細胞の割合になるよ うに希釈して、９６ウエルプレートに入れた。

再クローン化した細胞の培養を、より大きいウェルで増殖するようステップアッ プしたが、それぞれ後のステップになるごとにクローンの４０〜５０％が消失し た。クローンを、２４ウエルプレート。

それから、６ウエルプレート、そして最後に、フラスコ中で、増殖した。２４ウ エルプレートの段階で、６０ケの陽性クローンが生き残ったが、培養が、フラス コに移される時までに、わずかに、　１１ケのタウマチン陽性のクローンが、ス ケールアンプで生き残った。

これらのクローンの表記番号は、　３．１０．２４．２７．２９．３０．３６゜ ３７、３７’、　３Ｂ、ト４１であった。結局抗タウマチンモノクローナル抗体 の典型的な二つのタイプとして、クローンＮｏ、３の試料が＾、Ｔ、Ｃ。

Ｃ，８Ｂ−８９２２として、りＯ−７Ｎｏ、　２９ノ試料がＡ、Ｔ、Ｃ，Ｃ，Ｈ Ｂ−８９２１として寄託された。

培養がフラスコにまでスケールアップした時、その培地を、遠心分離によって細 胞から分離し、硫酸アンモンによりタンパク質を沈澱した。沈澱は、１ｓ＋Ｍの ＰＭＳＦ　（フェニル　メチル　スルフォニル　フルオライド）を含むリン酸緩 衝塩に溶解し１分取して。

同じ緩衝液に対して透析の後、−８０℃で凍結させた。そして、その細胞は、液 体窒素で凍結させた。

実施例３ モノクローナル抗体のスクリーニング、クローニング、及び、特性分析 以下の処理は、タウマチンに対する酵素結合免疫吸収定量法（ＥＬＩＳＡ）を通 用するために利用される。すべての反応は、室温で実施され、　ＥＬＩＳＡプレ ートは、全段階にわたって、商品名サランのプラスチックランプで覆われ、湿潤 室の中で培養する。ＥＬＩＳＡプレートを、実施例１の処理に従って、　２５　 ｍＭのＮａＨＣＯｓ　（ｐＨ９，２）を含む５０μｍ溶液中で精製した１０　ｎ ｇのタウマチン■で薄く覆う。

これを、室温で、２時間インキュベート、そのプレートは、４００ｐｉのＰＢＳ 　（５０ｍＭのリン酸カリ、　１５０　ｍＭのＮａＣ１，（ｐＨ７，４）とトウ ウィーン４面活性剤の種類”）　２０　（０，０５％）　）　（Ｓｉｇｍａ　Ｃ ｈｅｍｉ−ｃａｌ　Ｃｏ、により製造された洗浄剤）で２度洗浄し、それから、 ４００μｌの水で２度洗浄する。そして、そのプレートを、室温で２時間、１％ のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の（ＰＢＳ−トウウィーン２０（０，０２５％ 溶液）〕溶液２００μｌで＋ｆｆ＜覆う。そのプレートを。

再び、４００μｌのＰＢＳ−）ウウィーン溶液の２度洗浄し、また、水で２度洗 浄する。

そこで、テストされるべき培養から５０μｌの培地を添加する。

正常の融合していない骨髄腫細胞（ＳＦ３−０／Ａｇ−１４）培地を、陰性対照 として用いる。１：５００あるいは、それ以上で希釈したマウス血清を、陽性対 照として用いる。そこで、培地は室温で少なくとも４時間インキュベートされる 。そこで、再び、そのプレートを。

４００μｌのＰＢＳ−）ウウィーン２ｏ溶液で２度、また、水で２度洗浄する。

ウサギの抗マウスに型及び、λ型のし鎖を有する免疫グロブリンを１：１００に 希釈したもの５０μｌを、添加する。そして、これを室温で２時間インキュベー トする。このプレートを、再び、４００μＥの０．５％のＰＢＳ−）ウウィーン ２０溶液で２度、さらに水で２度洗浄する。そこで、ヤギ抗つサギ複合１ｇＧ／ パーオキシダーゼの１：　１ｏｏｏ希釈したもの５０μｌを添加し、室温で１時 間インキュベートする。このプレートは、もう一度、４００μｌのＰＢＳ−トウ ウィーン２０溶液で２度、さらに水で２度洗浄する。

０．０１％のＨｔＯｔを含むＯ−フェニレンジアミン　ジヒドロクロライド（Ｏ ＰＤ）溶液を、各ウェルに添加する（ＯＰＤ溶液は、１５ｍｇのＯＰＤを。

１０．２８ｍｊ！の０．５ＭのクエンＨ４，８６ｍｌ！　＋０．５　ＭのＮａｚ ＨＰＯａを水で希釈して１００ｍｆにしたものであって、染色された緩衝液３０ ｍ１華位に含むものである）　、　Ｈ，Ｏ□は、　ＯＰＤ溶液をウェルに加える ほんの数秒前に、　ＯＰＤに添加するべきである。

この混合物は１反応がストップするまで室温で５〜１５分間インキュベート、そ こで５０μｌの４Ｎ　１１２ｓｏ、のを添加した。その時、ウェルの吸光度を、 　Ｂｉｏ−Ｔｅｋ　ＥＩｊＳＡ　リーグで、　４９０　ｎｍで、測定する。

実施例４−５ モノクローナル抗体の特性分析 これらの実施例では、実施例３の方式に従って、クローンＮｏ、３及びＮｏ、２ ９によって産生されたモノクローナル抗体に対し、これらの抗体の特性を分析す るために、植物タウマチンＩ、植物タウマチン■、再生組み換え体酵母が産生ず るタウマチン類似物、及び５組み換え体酵母が産生ずるタウマチン類似のグルタ チオン付加物の存在のもとで、　ＥＬＩＳＡ競合分析を施した。

４　Ｎｏ、３　４２　４６　３１　０ ５　Ｎｏ、２９　４４　５５　３３　４４表１は、タウマチンＩ、タウマチン■ ９組み換え体酵母が産生ずるタウマチン類似物、及び１組み換え産物の再生にお ける中間物として形成する組み換え体酵母が産生ずるタウマチン類似のグルタチ オン付加物の結合の阻害に関する試験結果を示す。これらのタウマチンタイプの 各々は、　ＥＬＩＳＡ競合分析において、クローンＮ００３抗体と効果的に競合 することが分かった。

しかし１組み換え体酵母が産生じたタウマチン類似のグルタチオン付加物はクロ ーンＮｏ、　３抗体とは競合しない。それはすなわち、この抗体が、ポリペプチ ドの３次構造、あるいはポリペプチドの１次構造（ポリペプチドにおけるアミノ 酸の連続的な配列順序）には作用するが、付加物の形成によって、それらポリペ プチドにおけるその抗体と特異的に反応するエピトープが不活性化することを示 す。一方クローンＮｏ、　２９の抗体は、その天然コンフォメーションにあるタ ウマチン■及び■も、再生組み換え体が産生じたタウマチンをも同様に認識する 。それは、また１組み換え体酵母が産生ずるタウマチン類似のグルタチオン付加 物をも、認識する。これは、クローンＮｏ、　２９の抗体が、ポリペプチドの３ 次元の球状構造（グルタチオン付加物の場合には崩壊している）に作用しようと せず９代わりに、その分子の１次構造５例えば、そのアミノ酸の配列順序に作用 することを示す傾向にある。

実施例６−１４ モノクローナル抗体の特性分析 これらの実施例では、クローンＮｏ、　１０．２４．２７．３０．３６．３７゜ ３７’、　３８と４１により産生じたモノクローナル抗体に対してＥＬＩＳＡ競 合分析を行った。

試験は、実施例３０手法によって、自然のコンフォメーションを存する天然のタ ウマチン■と、過蟻酸により酸化し変性したタウマチンＩについて行われた。そ の変性タウマチンＩは、９８％の蟻酸溶液と３０％の過酸化水素溶液を９：１の 割合で混合し冷却（４℃）した過蟻酸溶液０．５ｍｊｉ中に、タウマチンＩを１ ■を入れたものをインキュベートして、調製した。

表２は、クローンＮｏ、　１０．２４．２７．３６．３７．３７’、３８と４１ によって産生じたモノクローナル抗体が、自然コンフォメーションにあるタウマ チンのみを認識し、過蟻酸で変性したタウマチンは認識しなかったことを示して いる。このことは、これらのクローンが。

タウマチンの３次構造だけを認識することを示している。一方。

クローンＮｏ、　３０の抗体は、その自然コンフォメーションのタウマチンと過 蟻酸で変性したタウマチンの両方を認識した。クローンＮｏ、　３０の抗体が、 天然と変性の両方のタウマチンを認識することから、それはポリペプチドの１次 構造（例えば、ポリペプチドのアミノ酸の連続する配列のある部分）に作用する ことが分る。

試験Ｎｏ、　６　７　８　９　１０　１１　１２　１３　１４抗体源クローンＮ ｌ　１０　２４　２７　３０　３６　３７　３７’　３８　４１実施例１５−２ ８ モノクローナル抗体の特性分析 これらの実施例では、クローンＮｏ、　１０．２４．２７．３０．３６．３７゜ ３７’、　３Ｂと４１によって産生じたモノクローナル抗体について、それらの 抗体の種々の濃度のタウマチンタイプ族の甘味のあるポリペプチドのモネリンあ るいは、過蟻酸で酸化したタウマチン■に対する結合親和性を、ＥＬＩＳＡ競合 分析により測定した。

ＥＬＩＳＡプレートは、実施例３０手法によって、　Ｌｏｎｇのタウマチンで薄 く覆った。同時に色々のクローンから得られたモノクローン抗体を含む培地を、 硫酸アンモンで処理し、１００倍に希釈した。

硫酸アンモンの分液の５０ｐ１．を、異なった量のタウマチン！、モネリン（Ｓ ｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、　Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ、）あるいは 、過蟻酸で酸化したタウマチンＩの存在のもとで１種々なウェルに添加した。

表３に表したように、　ＥＬＩＳＡ　ｆｉ合分析結果は、クローンＮｏ、　２４ ゜２７、３６．３７’、と４１からのモノクローナル抗体が、その自然コンフォ メーションにあるタウマチンとモネリンを、同様に認識することを示している。

しかし、それらは過蟻酸処理タウマチンを認識しない、このことは、さらに、こ れらのクローンからの抗体が。

タウマチンの３次構造のある部分に特異性があるということを示している。

表　４ 吸光度　（４９０ｎｍ） 試料Ｎｏ、　２５　２６　２７　２８ 抗体源（クローン１１ｋｌ＞　１０　３０　３７　３８対照　１．５　１．４　 １．３　１．５２対照　１．５　１．３５　１．４　１．５０．５μｇ　Ｏ，３ ５０，４０，４０，９２，０μｇ　Ｏ，３５０，３５０，３Ｂ　０．４５．０μ ｇ　Ｏ，３５０，３６０，３３０，４５，０μｇ　Ｏ，３５０，３５０，４９１ ，２１０，０，１ｊｇ　Ｏ，３５０，３５０，４３０，８７，０μｇ　１．５　 ０．３８１．４２１．５１０．０μｇ　１．５　０．３８１．５０１．５それは 、また、タウマチンやモネリンがモノクローナル抗体によって認識され、それら の甘味を説明するものでもあるエピトープを共通して有することを示すことにな る。

表４で表した結果は、クローンＮｏ、　１０．３７．　と３８によって産生じた モノクローナル抗体は、タウマチン■及びモネリンをＪするが、過蟻酸で処理し たタウマチンは認、識しないことを示している。このことは、これらの抗体が、 タウマチンおよび、モネリンの両方の３次構造の特定部分を認識することを示し ている。

一方、クローンＮｏ、３０によって産生じた抗体は、モネリン１天然植物のタウ マチンおよび、変性タウマチンにより、阻害される。

このことは、クローンＮｏ、　２９の抗体に似たクローンＮｏ、　３０の抗体は 、タウマチン及び同様にモネリンの一次構造の、成る部分に。

特異的に反応性のあることを示している。

表　５ 吸光度　（４９０ｎｍ） ２９３　１．５１．４７　０．２８６　−０．１４６３０３　１．５１．４　０ ．３０　−０．１５３１３　１．６４１．４　０．０５　−０．２４３２３　１ ．６２１．４　０．０６　−０．２１３３２９　０．３５０．３６　０．４７　 ０．０１２３４２９　０．３５０．２８　０．５５　０．０７０３５２９　０． ３９０．２２　０．４　０．１０３６２９　０．３６０．２３　０．４　０．１ ６実施例２９−３６ モノクローナル抗体の特性分析 これらの実施例では、クローンＮｏ、　３　（Ａ、Ｔ、Ｃ，Ｃ，ＨＢ−８９２２ ）及び。

Ｎｏ、　２９　（Ａ、Ｔ、Ｃ，Ｃ，ＨＢ−８９２１）を、二つの主要な抗体タイ プの典型として選定した。

ＥＬＩＳＡプレートは、実施例３の手法によって、　５０μｌの、（１）ウシ血 清アルブミン（ＢＳＡ）　（１０ｍｇ／ＬＤ、（２１過蟻酸処理のタウマチンＩ （２１μｓ／ｍＡ）、＋３１タウマチン（１μｓ／ｍ＃）または、（４）モネリ ン　（４μｇ／ｍＩｔ）の何れかで薄く覆った。

表５は、クローンＮｏ、３の抗体が、モネリンと自然のコンフォメーションにあ るタウマチンだけを認識することを確定するＥＬＩＳＡ処理の結果を示した。一 方、クローンＮｏ、　２９の抗体は、タウマチン、モネリン、変性タウマチンを 認識する。

実施例３７−４０ モノクローナル抗体の特性分析 これらの実施例では、クローンＮｏ、　３および２９から得たモノクローナル抗 体を、二つの主要抗体型の典型として選定した。ＥＬＩＳＡプレートは、実施例 ３の手法により＋５０ｐｌ！の植物タウマチン１　（０，２μｇ／　ｍε）、タ ウマチン−グルタチオン付加物（５μｇ７ｍｊりあるいは、対照としてのウシ血 清アルブミン（ＢＳＡ）で薄く覆う。

その付加物は、　Ｉｙｅｎｇａｒ等の手順による組み換え体Ｕ母が産生じたタウ マチンＩの再生プロセスの中間物であり、それは、甘味がない。

表　６ 吸光度　（４９０ｎｍ） ３７　３　１．４　０．１１　０．０８３Ｂ　３　１．５　０．１４　０．０９ ３９２９　０．５３　０．５５　０．１０４０２９　０．４７　０．４８　０． １０表６に表した結果は、クローンＮｏ、３によって産生じた抗体が。

天然植物タウマチン■のみを認識し、変性組み換え体付加物は認識しないことを 示す、しかし、クローンＮｏ、　２９からのモノクローナル抗体は、天然タウマ チンと変性付加物の双方とを同様に、認識する。

実施例４１ モノクローナル抗体に対する競合分析 この例では、クローンＮ００３のモノクローナル抗体゛と、天然の植物タウマチ ンＩの結合に対する９組み換え体酵母が産生じたタウマチン類似−グルタチオン 付加物及び、　３ｆｉ４ｉａａ化植物タウマチンの阻害効果を分析した。

ＥＬＩＳＡプレートは、ウェル１ケ毎に対し、　１０ｎｇの天然植物タウマチン を、薄く覆った。上記抗体は、対照の緩衝液、または種々の量の試験材料で、２ 時間ブレインキュベートして、プレートに添加した。そのプレートは、そこで、 実施例３のＥＬＩＳＡ手法によって処理を進めた。

タウマチン　０　１６　３０　５０　６０　８０表７に示した結果は、　５００ ｎｇの天然のタウマチンを添加したものが、その測定を５０％まで効果的に阻害 することを示している。

クローンＮｏ、３の抗体と、タウマチン類似グルタチオン付加物。

または、過蟻酸と酸化したタウマチンとをブレインキュベートしたものは、測定 上の阻害がほとんどないか全（なかった。

実施例４２ モノクローナル抗体に対する競合分析 この実施例では、クローンＮｏ、　２９のモノクローナル抗体と、天然植物タウ マチン■の結合に対する９組み換え体酵母が産生ずるタウマチン類似−グルタチ オン付加物および、過蟻酸で酸化したタウマチンの阻害効果を分析した。

ＥＬＩＳＡプレートは、各ウェルを、天然の植物タウマチン■の１０ｎｇで薄く 覆った。上記抗体は、対照緩衝液または種々の試験材料と共に２時間ブレインキ ュベートされ、そのプレートに添加された。そして、そのプレートは、実施例３ のＥＬＩＳＡの手法によって処理を進めた。

添加　０１１００ｎ　２００ｎｇ　５００ｎｇ　ＬＬｌｇ　２．ｃ＋ｇタウマチ ン　０　５　３０　５１　６５　８０表８に示した結果は、　ＥＬＩＳＡ競合分 析で、クローンＮｏ、２９の抗体に対してタウマチン−グルタチオン付加物ある いは過蟻酸で酸化したタウマチンが、天然の植物タウマチンと、効果的に競合す ることを示す。

実施例４３−４５ モノクローナル抗体の特性分析 これらの実施例では、クローンＮｏ、３および２９によって産生じたモノクロー ナルの甘味料のモネリン、ショ糖あるいは、アスパルテームに対する反応性、を 試験した。二つのクローン（各１００ｍ　ｊ！　）の培養からの培地を、硫酸ア ンモンの５０％過飽和液で沈澱させた。

そして、その沈澱を、　５ｍｌのＰＢＳ　（ＰＨ７，４）に溶解する。両者のタ ンパク質の濃度は、　２０　ｍｇ／　ｖａ４であった。硫酸アンモンで濃縮され た濃度１；２０またはｌ：６０の培地の、甘味料としての反応性を検査した。

ＥＬＴＳＡプレートは、天然の植物タウマチ７　Ｉ　（２０ｍＭ　ＮａＨＣＯｘ の５０ｐｌ中に１０　ｍｇ）で、薄く覆った。二通りに希釈したクローンＮｏ、 ３及び２９から得た抗体は、　０．５　ｒ＋Ｐのモネリン、　５００　ｎｌｌの ショ糖及び１７０　ｎＭのアスパルテームとともに、２４℃で３番間、ブレイン キュベートした。そのプレートは、実施例３のＥＬＩＳＡ競合法によって処理を 進めた。

表　９ 吸光度　（４９０ｎｍ） １１！　クローン陽　盪度対皿　モネリン　２１穂　アスパルテーム４３　’３ 　ｂ２０　１．６　１．６９　１．５９　１．５４４３　３　１：６０　１．４ 　１．３９　１．４１　１．４１４４　２９　１：２０　１．１５　０．０５９ 　１．４０　１．３３４４　２９　１：６０　０．３６５　０．’０１６　０． ３１０　０．２１０４５　２９　１：２０　１．１２　０．０３４　１．３９　 １．３２４５　２９　１：６０　０．３０５　０．０７　０．２３９　０．３４ ０表９に示された結果は、モノクローナル抗体がショ糖ともアスパルテームとも 反応しないことを示している。その分析は、また。

高濃度で存在するモネリンが、クローンＮｏ、３から産生じた抗体とタウマチン との結合を阻害しないことを示している。

実施例４６ 競合分析 この実施例では、競合分析を、実施例４１に記述したようにして。

天然植物タウマチンＩとモネリンの間で行った。

タウマチン　１０　ｎｇ　検知せず タウマチン　５０　ｎｇ　検知せず タウマチン　１００　ｎｇ　２５ タウマチン　ｌμｇ　６２．５ タウマチン　１０μｇ　９４ タウマチン　１００μｇ　９５ モネリン　１０　ｎｇ　検知せず モネリン　５０　ｎｇ　検知せず モネリン　１００　ｎｇ　検知せず モネリン　ｌμｇ　１５ モネリン　１０Ｊ１ｇ　６０ モネリン　１００μｇ　９８ 表１０及び表１１に示された結果は、モネリンが、タウマチンの約１０倍の濃度 で、結合を阻害することを示している。

したがって、クローンＮｏ、　２９モノクローナル抗体のモネリンに対する親和 力は、タウマチンに対してより１０倍低い。

腹水症法による抗体収量の増加 組織培養で産生ずる。より高濃度の抗体を得るために１本発明のモノクローナル 抗体を　Ｋｅｎｎｅｔｈ等編、モノクローナル抗体。

ハイブリドーマ；生物学的分析における新しい次元Ｐ、４０３．　ＮｅｗＹｏｒ ｋ：　Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ　（１９８１）で、一般的に詳述されている腹 水症法で、収量を増加した。この手法によれば、マウスに予めブリスティン（２ ，６，１９，１４−テトラメチル　ペンタデカン、　ＡｌｄｒｉｃｈＣｈｅｍｉ ｃａｌ　Ｃｏ、から得たもの）　０．６ｎｊ！を、２５から２７ゲージの針で。

その腹腔内に注射しておく。ブリスティンで処理すると、腹水症の症状で腹腔内 に腫瘍細胞が増殖する。３週間後、１０６ハイブリドーマ細胞を、　０．５　ｍ 　ｌの無血清のダルベツコ改良のイーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｉｒｖｉｎｅ　５ ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｃｏ、）と共に、マウスの腹腔内に注射した。

クローンＮｏ、　３　、およびＮｏ、　２９の２組の注射を２匹のマウスに行っ た。

ハイブリドーマ細胞注射の７日後、マウスに水と食物（オートミール）をペトリ 皿で与えた。ハイブリドーマ細胞の注射の１２日から１４日の後、腹水を２、皮 膚に小さい切口をっけマウスの腹腔からピペットで吸出して、得た。その液を、 遠心分離し、その細胞を凍結用培地の中に！！！濁させ、そこで液体窒素中で冷 凍した。

そこで、腹水は、天然、のタウマチン、モネリン、および、対照（ＢＳＡ）に対 して、　ｔｅ３．１：９．１：２７．及び１：８１の希釈液で測定した。

この処理で９組織培養で産生されるより少量で力価の高いモノクロナール抗体が 産生ずる。腹水の抗体は、４０％の硫酸アンモンで沈澱させ、イオン交換クロマ トグラフィにかけることにより、腹水のアルブミンから更に、精製することがで きる。

実施例４８ タウマチン類似のポリペプチドの単離と精製高度の特異性と高度の反応性をもっ た抗タウマチンモノクローナル抗体を提供することを通して１本発明は、初めて 、技能的によく知られた親和精製処理によって、天然植物からと同様に醗酵培養 から、タウマチン及びタウマチン類似ポリペプチドを単離することを可能にした 。要約すれば、好ましい単離処理は、固体の支持体（例えば、クロマトグラフの カラム）に本発明の抗体を固定し、固定された抗体と、液を含むタウマチンとの 接触、更に。

抗体との免疫複合体からの精製されたタウマチンの溶離を含む。

用いられる特定の抗体を調整することにより、その精製技術を。

誤って配列したり、変性したりしたタウマチンから、正しいコンフォメーション にある天然タウマチンを単離するために、調整することができる。タウマチン類 似ポリペプチドは、単離され、タウマチン類似分子に特異的な抗原エピトープと しての研究ができる。

実施例４９ タウマチン類似ポリペプチドの定量 高度に特異的な抗タウマチンモノクローナル抗体を調製することを通じて９本発 明は、二つ以上の抗体が含まれる液体試料中のタウマチンの定量のための、新規 な測定法を可能にした。このような定量法は、以下の３つの段階を含む。

＋１）　試料液と固定化第１抗体との接触。その抗体は、液中で。

タウマチンの第１抗原決定基と反応して、タウマチンの免疫複合体と第１抗体を 形成する。

（２）　ステップ（１）で形成した複合物と第２抗体との接触。その第２抗体は 、タウマチンの、第１抗原決定基以外の抗原決定基と反応して、タウマチンの免 疫複合体と第２抗体を形成する。

（３）ステップ（２）で形成した免疫複合体と結合している第２抗体の定量。

このような測定処理は、好ましくは、上述のモノクローナル抗体の二つが含まれ るようにする。しかし、モノクローナル抗体のうちの１つと多価血清由来のタウ マチン抗体を用いても１発展する。

前述の好ましい具体化に関する説明を考慮して、当業者が９発明の実施における 多くの修正や変形を思いつくことが予測される。

従って、そのような限定は、以下の請求の範囲に見られるように。

本発明に含まれるものである。

・ＰＣＴ／υ５８６１０２２６５ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ　Ｐａｒｔ　Ｉ　Ｃ１ａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　 ５ｕｂｊｅｃｔ　Ｍａセｔｅｒｔ’ｓ、　Ｃ１＋　４３５／７，６８，７０，１ ７２．２，２４０；　４３６１５０１，５４３，５４８

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ネズミ科動物由来のハイブリドーマ細胞系であって、その増殖の培地に、タ ウマチンと特異的に結合する能力があるモノクローナル抗体を産生する能力があ ることを特徴とするもの。 ２．ネズミ科動物由来のハイブリドーマ細胞系であって、その増殖の培地に、モ ネリンと特異的に結合する能力があるモノクローナル抗体を産生する能力がある ことを特徴とするもの。 ３．請求の範囲第１項記載のハイブリドーマ細胞系であって、その増殖の培地で 、タウマチンの３次構造の一部分を含むエピトープと特異的の結合する能力があ るモノクローナル抗体を産生する能力があることを特徴とするもの。 ４．請求の範囲第１項記載のハイブリドーマ細胞系であって、その増殖の培地で 、タウマチンの１次構造の一部分を含むエピトープと特異的の結合する能力があ るモノクローナル抗体を産生する能力があることを特徴とするもの。 ５．請求の範囲第３項記載のハイブリドーマ細胞系であって、ＡＴＣＣ　Ｎｏ． ＨＢ−８９２２であるもの。 ６．請求の範囲第４項記載のハイブリドーマ細胞系であって、ＡＴＣＣ　ＮＯ． ＨＢ−８９２１であるもの。 ７．モノクローナル抗体であって、請求の範囲第１項記載のハイブリドーマ細胞 系によって産生するもの。 ８．モノクローナル抗体であって、請求の範囲第２項記載のハイブリドーマ細胞 系によって産生するもの。 ９．モノクローナル抗体であって、請求の範囲第３項記載のハイブリドーマ細胞 系によって産生するもの。 １０．モノクローナル抗体であって、請求の範囲第４項記載のハィブリドーマ細 胞系によって産生するもの。 １１．モノクローナル抗体であって、請求の範囲第５項記載のハイブリドーマ細 胞系によって産生するもの。 １２．モノクローナル抗体であって、請求の範囲第６項記載のハイブリドーマ細 胞系によって産生するもの。 １３．生物学的活性を有するタウマチンまたはタウマチン類似ポリペプチドを、 生体液から単離するための免疫処理であって、タウマチン特異性抗体との選択的 免疫反応に基づくものの改良、において、前記特異性抗体として、ネズミ科動物 由来のハイブリドーマ細胞系が、その増殖の培地で産生し、かつ、タウマチンと 特異的に結合する能力があるモノクローナル抗体を用いることを含むもの。 １４．請求の範囲第１３項記載の免疫処理の改良であって、用いるモノクローナ ル抗体に、タウマチンの３次構造の一部分を含むエピトープと特異的に結合する 能力があるもの。 １５．請求の範囲第１３項記載の免疫処理の改良であって、用いるモノクローナ ル抗体に、タウマチンの１次構造の一部分を含むエピトープと特異的に結合する 能力があるもの。 １６．請求の範囲第１３項記載の免疫処理の改良であって、ネズミ科動物由来の ハイブリドーマ細胞系が、ＡＴＣＣ　ＮＯ．ＨＢ−８９２２であるもの。 １７．請求の範囲第１３項記載の免疫処理の改良であって、ネズミ科動物由来の ハイブリドーマ細胞系が、ＡＴＣＣ　ＮＯ．ＨＢ−８９２１であるもの。 １８．生物学的活性を有するモネリンを、生体液から単離するための免疫処理で あって、モネリン特異性抗体との選択的免疫反応に基づくものの改良において、 前記特異性抗体として、ネズミ科動物由来のハイブリドーマ細胞系が、その増殖 の培地で産生し、かつ、モネリンと特異的に結合する能力があるモノクローナル 抗体を用いることを含むもの。 １９．以下のステップを含む、生体液中のタウマチン又はタウマチン類似のポリ ペプチドの定量のための免疫定量法。 （１）試料液と固定化第１抗体との接触。その抗体は、液中でタウマチンの第１ 抗原決定基と反応して、タウマチンの免疫複合体と第１抗体を形成する。 （２）ステップ（１）で形成した複合物と第２抗体との接触。その第２抗体は、 タウマチンの、第１抗原決定基以外の抗原決定基と反応して、タウマチンの免疫 複合体と第２抗体を形成する。 （３）ステップ（２）で形成した免疫複合体と結合している第２抗体の定量。 ２０．以下のステップを含む、生体液中のモネリンの定量のための免疫定量法。 （１）試料液と固定化第１抗体との接触。その抗体は、液中でモネリンの第１抗 原決定基と反応して、モネリンの免疫複合体と第１抗体を形成する。 （２）ステップ（１）で形成した複合物と第２抗体との接触。その第２抗体は、 モネリンの、第１抗原決定基以外の抗原決定基と反応して、モネリンの免疫複合 体と第２抗体を形成する。 （３）ステップ（２）で形成した免疫複合体と結合している第２抗体の定量。