JPH0570437B2

JPH0570437B2 -

Info

Publication number: JPH0570437B2
Application number: JP61028565A
Authority: JP
Inventors: Koji Maeda; Hiroshi Sakai
Original assignee: Nisshin Seifun Group Inc
Current assignee: Nisshin Seifun Group Inc
Priority date: 1986-02-12
Filing date: 1986-02-12
Publication date: 1993-10-05
Also published as: JPS62186798A

Description

【発明の詳細な説明】

〔産業上の利用分野〕本発明は、小麦由来の小麦α−アミラーゼ阻害
蛋白質に対するモノクローナル抗体に関する。〔従来の技術〕小麦中に種々のアミラーゼ阻害蛋白質が存在し
ていることが数十年前から知られていたが、それ
らは全て動物ないし昆虫由来のアミラーゼを阻害
する蛋白質であつた。最近、Mundyらは、小麦
中に小麦α−アミラーゼを阻害する蛋白質が存在
することを発見し、これを単離した〔Mundy，
J.，Hejgaard，J.and Srendsen，I.：FEBS
Letters，167，210−214（1984）〕。この小麦α−
アミラーゼ阻害蛋白質は、小麦が発芽の際、ジベ
レリンによりα−アミラーゼを生合成し、この酵
素により種子中のデンプンを分解し、発芽に必要
なエネルギーを得ていることから、この発芽の際
生成したα−アミラーゼを阻害し、小麦の発芽を
制御しているものと考えられている。〔発明が解決しようとする問題点〕一方、小麦は収獲直前に雨等により水分を受け
ると、α−アミラーゼの生合成が誘起され、一部
デンプンの分解を始める。こうした状態の小麦
は、低アミロ小麦と呼ばれ、その物性が通常の小
麦と異なり、製パン等に適さない為商品価値が著
しく劣る。低アミロ小麦の問題は、世界的なもの
であり、今だに有効な解決方法が見つかつていな
い。考えられる一つの方法は、水分によつて生合成
が誘起されるα−アミラーゼを有効に阻害できる
阻害蛋白質を含む種子を遺伝子操作により作り出
すことである。そのためには発芽の機構を理解す
ることが重要であり、発芽におけるα−アミラー
ゼ阻害蛋白質の挙動を知る上で、同物質に特異的
に結合するモノクローナル抗体は極めて有効な道
具となる。また、該阻害蛋白の遺伝子操作におい
ても、モノクローナル抗体は、遺伝子が適切に操
作されているかどうかを知る上での必須の道具と
なる。更に現在、低アミロ化現象を起こしやすい
小麦、起こしにくい小麦が存在することが知られ
ているが、これら各種小麦と上述α−アミラーゼ
阻害蛋白質の含量との間には相関関係があること
が考えられ、該阻害蛋白質の簡便かつ正確な定量
にはモノクローナル抗体を使用することが適して
いる。しかしながら、未だ小麦α−アミラーゼ阻害蛋
白質に対するモノクローナル抗体は見い出されて
いなかつた。〔問題点を解決するための手段〕そこで本発明者らは、上記問題点を解決すべく
鋭意検討した結果、小麦由来の小麦α−アミラー
ゼ阻害蛋白質に対するモノクローナル抗体を見い
出し、本発明を完成した。本発明のモノクローナル抗体には、ハイブリド
ーマ細胞系HAENAI−１、HAENAI−２、
HAENAI−３またはHAENAI−４がそれぞれ産
生するAENAI−１、AENAI−２、AENAI−３
およびAENAI−４の４種類が含まれ、これらは
それぞれ免疫グロブリンクラスIgG_2a、IgG_2a、
IgG_2bおよびIgMに属するものである。本発明のモノクローナル抗体は、ハイブリドー
マ細胞系HAENAI−１、HAENAI−２、
HAENAI−３またはHAENAI−４の培養上清か
ら、あるいはこれらの細胞系を腹腔内に投与され
たマウスの腹腔液若しくは血清から採取すること
により製造される。本発明モノクローナル抗体を産生するハイブリ
ドーマ細胞系は、抗原として、小麦に含有される
分子量19641（アミノ酸配列より算出）の小麦α−
アミラーゼ阻害蛋白質〔以下「NAI」（ネイテイ
ブアミラーゼインヒビターの略）と称す〕を用い
て動物を免疫し、その動物から採取した脾細胞と
マウスミエローマ細胞とを融合させることにより
得られる。抗原であるNAIは前記Mundyらの方
法に従つて小麦より単離される。 NAIを抗原とする脾細胞を採取するには、マ
ウス等の動物をNAIで免疫し、その動物の脾臓
から採取することにより行なわれる。免疫は、抗
原とフロインド完全アジユバントとの混合物を皮
下注射し、免疫を増強するために３週間後に再度
皮下注射し、更に２週間後に抗原を静脈注射する
ことにより行なわれる。脾細胞の採取は、最終投
与の３日後に動物を屠殺し、摘出した脾臓より分
離することにより行なわれる。マウスミエローマ細胞としては、Ｐ−３−NS
−１／１−Ag4−１株又はこの株を継代培養した
ものが用いられる。継代培養は、例えば10％ウシ
胎児血清を含むRPMI 1640培地を用い、炭素ガ
ガスインキユベータにて37℃付近で行なわれる。細胞融合は、前記の脾細胞とミエローマ細胞と
を、例えばKoehler，G.及びMilstein，G.が確立
した方法〔Nature，256，495（1954）〕に準じて
融合させることにより行なわれる。すなわち、ミ
エローマ細胞と脾細胞とを１：10の割合でRPMI
1640培地に懸濁させ、これにポリエチレングリコ
ールを添加し、おだやかに撹拌することにより融
合せしめる。ポリエチレングリコール等を除去し
て融合細胞懸濁液を作製し、これを培養した後、
酵素免疫法（enzyme immunoassay）にて抗体
産生株を選択する。更に目的とする抗体産生細胞のみを単離するに
は、希釈法によるクローニングを繰り返して、１
つのクローンから発生した全てのシングルクロー
ン抗体産生である様にすることにより行なわる。斯くして得られたハイブリドーマ細胞系には前
記本発明のモノクローナル抗体AENAI−１、
AENAI−２、AENAI−３又はAENAI−４をそ
れぞれ産生する４種類の細胞が存在する。これら
のハイブリドーマ細胞の特性は以下の通りであ
る。４種類ともに、Ｐ−３−NS−1/1Ag4−１マ
ウスミエローマ細胞とマウス脾細胞を融合させ
た雑種細胞である。４種類ともにHAT培地で増殖可能である。４種類ともにRPMI−1640培地（10％ウシ胎
児血清補添）で増殖可能であり、この培地での
doubling time（細胞が２倍に増殖するのに要
する時間）は約24時間である。４種類ともにの培地に懸濁させた状態で−
80℃以下で凍結保存可能である。４種類ともにの培地に懸濁させ、37℃で長
期継代培養可能である（植え継ぎ周期は約４
日）。４種類ともにマウス（Balb／ｃ）の腹腔内
にて継代培養可能である（植え継ぎ周期は約３
週間）。４種類の細胞はNAIとクロスする免疫グロ
ブリンIgC_2a、IgG_2a、IgG_2bまたはIgMに属す
るモノクローナル抗体AENAI−１、AENAI
−２、AENAI−３またはAENAI−４をそれ
ぞれ永久的に産生する。以上の特性を有する４種類の細胞は、AENAI
−１を産生する細胞をHAENAI−１、AENAI
−２を産生する細胞をHAENAI−２、AENAI
−３を産生する細胞をHAENAI−３、AENAI
−４を産生する細胞をHAENAI−４と命名し、
通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所に寄
託すべく手続を行なつたが、受託を拒否された
（寄託受託拒否通知番号61微寄文第72号、同第73
号、同第74号、同第75号）。尚、これらの細胞は
出願人において醸渡可能な状態で保管してある。抗体産生細胞HAENAI−１〜４から本発明の
モノクローナル抗体AENAI−１〜４を製造する
方法としては以下の方法が挙げられる。ａ HAENAI−１〜４もそれぞれ栄養培地中で
培養して、その上清から採取する方法。ｂ HAENAI−１〜４をそれぞれマウス腹腔内
に投与して腹腔内で増殖させ、該マウスの腹腔
液または血清から採取する方法。就中、目的抗体の収量の面からｂにおける腹腔
液から採取する方法が好ましい。当該腹腔内で増
殖させて腹腔液から本発明モノクローナル抗体を
採取する方法は、例えば以下の如くして実施され
る。 HAENAI−１〜４をそれぞれマウス腹腔内に
投与し、約３週間後腹腔内に貯溜した腹腔液を採
取し、得られた腹腔液から遠心分離、透析等の手
段によりモノクローナル抗体AENAI−１、
AENAI−２、AENAI−３またはAENAI−４を
分離・精製する。得られた本発明モノクローナル抗体AENAI−
１〜４は以下の如き性質を有する。 ○イ AENAI−１、AENAI−２、AENAI−３お
よびAENAI−４は各々免疫グロブリンクラス
IgG_2a、IgG_2a、IgG_2bおよびIgMに属する。酵素抗体法により、AENAI−１〜４は各々
ウサギ抗マウスIgG_2a、IgG_2a、IgG_2b、IgMと
のみ反応する。 ○ロ AENAI−１とAENAI−２の抗原（NAI）
に対する反応性は、AENAI−１＞AENAI−
２の順である。 ○ハ AENAI−１〜４はいずれも抗原（NAI）に
対して高い親和性を示す。酵素抗体法（エリザ
法）による結合阻害実験法において AENAI−１〜３は遊離抗原と強く結合す
る。一方AENAI−４は遊離抗原とほとんど結合
せず、固相化抗原と強く結合する。〔作用および発明の効果〕本発明のモノクローナル抗体は、NAIに対し
て特異的であることから、小麦中のNAI定量用
材料として極めて有用である。さらに小麦種子中
のNAI定量を易ならしめることにより、その品
種改良の面からも極めて有用である。〔実施例〕次に実施例を挙げて本発明を説明する。実施例１抗原（NAI）の調製 Mubdyらの方法〔Mundy，J.，Eejgaard，J.
and Srendsen，I.：FEBS Letters，167，210〜
214（1984）〕に従つて以下の如く行つた。市販小
麦粉（トリチカム，アエステイブム）１Kgを10
の50mMリン酸ナトリウム緩衝液（PH6.0）で抽
出した。大部分の小麦粉残渣を遠心機で除去し、
上澄を得た。この上澄に固型硫酸ナトリウムを60
％（ｗ／ｗ）になるように加え、NAIを含む粗
蛋白質沈殿物を得、遠心機にてこれを集めた。こ
の沈殿物を30mMリン酸−15mMクエン酸緩衝液
（PH5.2）に溶かし、透析した。３〜４回の透析外
液交換を３日間のうちに行ない硫酸アンモニウム
を完全に除去した。得られた蛋白含有上澄液を、
30mMリン酸−15mMクエン酸緩衝液（PH5.2）
で平衡化したCM−セフアデツクスＣ−50カラム
（2.7×35cm）に吸着させ0.1M−0.7Mの塩化ナト
リウムの塩匂配を用いて蛋白分離を行つた。
NAIの存在は、Mundy氏より供与されたNAIに
対するウサギ抗血清を用いて免疫沈降反応（オク
タロニー法）により行つた。CM−セフアデツク
スＣ−50カラムより得た。粗NAIは10μMリン酸
ナトリウム緩衝液（PH6.8）にて透析後、同緩衝
液で平衡化したバイオゲルHPTカラム（1.7×30
cm）に吸着させ10〜100mMの塩匂配を用いて溶
出した。バイオゲルHPTカラムより溶出さる最
初のピークのみがウサギ抗血清と反応し、その区
分はポリアクリルアミド電気泳動上でトリス−塩
酸緩衝液PH9.5の条件下で１本のバンドとして検
出された。このことは、NAIが純粋に単離され
たことを示す。得らた精製NAIのジスルフイド架橋を還元、
開環後、アルキル化した蛋白質を酵素、リシルエ
ンドペプチダーゼにより切断した。生じたペプチ
ドを高速液体クロマトグラフイーにより分離後、
各々のペプチドの構成アミノ酸を自動化（気相法
シークエンサー）及び手動のアドマン分解法によ
りちくじ切断し、遊離してくるアミノ酸残基をフ
エニルチオヒダントイン誘導体に変換し、高速液
体クロマトグラフイーにより同定した。このよう
にしてアミノ酸配列が決つた各々のペプチドの順
列は、蛋白質を別に、異なる酵素、スタフイロコ
ツカスV₈プロテアーゼ、により切断後、生じた
個々のペプチドのアミノ酸配列を上述のごとく決
定し、オーバーラツプをとることにより行つた。
その結果、NAIは第１図に示すアミノ酸配列を
有するものであると判明した。このアミノ酸配列
よりNAIの分子量は19641である。免液 Balb／ｃマウス（♀25ｇ）に、フロインド完
全アジユバントに溶解させた30μgの抗原（NAI）
を皮下注射する。３週間後に同様の皮下注射を行
ない、更に２週間後30μgのNAIを生理食塩水に
溶かし静脈に注射した。最終投与の３日後に脾細
胞を採取し、細胞融合に用いる細胞を得た。細胞融合のためのミエローマ細胞の調製マウスミエローマ細胞Ｐ−３−NS−1/1−Ag4
−１は、10％ウシ胎児血清を含むRPMI1640培地
（日水製薬(株)製）を用いた、95％空気及び５％炭
酸ガスを含む気流を流した炭酸ガスインキユベー
ターにて37℃で継代培養した。細胞融合 Koehler及びMilsteinが確立した方法
〔Koehler，G.and Milstein，C.：Nature，256，
495（1975）〕に準じ、ミエローマ細胞２×10⁷個と
上述した方法で得られた脾細胞２×10⁸個を
RPMI1640培地に37℃で懸濁させ、１mlの50％ポ
リエチレングリコール（ポリエチレングリコール
4000、メルク社製）を１分間にわたりピペツトの
先端で細胞を軽く撹拌しながら添加する。添加後
更に１分間ゆつくり撹拌する。次にウシ胎児血清
を含まない10mlのRPMI1640培地をゆつくり加え
ポリエチレングリコールを希釈し、室温にて400
×ｇで５分間遠心分離を行ない、上清を捨てる。
約80mlの10％RPMI1640培地を細胞ペレツトに直
接注ぎながらピペツトで撹拌し細胞懸濁液をつく
る。２×10⁶個／ml脾臓細胞を含む懸濁液を24穴
のカルチヤープレートに１mlづつまき、95％空気
−５％炭酸ガスより成る混合気流中で炭酸ガス培
養器を用いて24時間培養した後、それぞれのウエ
ルに１mlのHAT培地を加える。培養後10〜14日
後に残存するクローンにつき、目的とする抗体産
生株のアツセイを酵素免疫法で行なう。抗体産生
株を含むウエル内容物を、HAT培地で希釈して
96穴プートにまき、目的とする細胞のクローニン
グを繰り返して行つた。クローニングは希釈法を
用い、１ウエルあたり１個の融合細胞が含まれる
ようにした。このの様にしてクローニングを繰り
返し、１つのクローンから出た全てのシングルク
ローンが抗体産生であるときをもつて、クローン
が確立されたとした。このようにしてNAIに対
する抗体産生細胞HAENAI−１、HAENAI−
２、HAENAI−３およびHAENAI−４を得た。抗体の製法マウス腹腔内での継代培養又は組織培養で継代
したHAENAI−１、HAENAI−２、HAENAI
−３又はHAENAI−４株の細胞約10⁷個をあらか
じめプリステンを投与したマウスの腹腔内に投写
する。約３週間後腹腔内に貯溜した腹腔液を採取
し、ヘパリンを数滴滴下した撹拌する。400ｇで
５分間遠心分離を行ない血球及び雑種細胞を除
き、上清液を得る。得られた腹水上清液に硫酸ナ
トリウムを16％（ｗ／ｗ）になる様加え、撹拌後
37℃にて45分間保持する。次いで3000Gで遠心分
離し、目的とする抗体の沈殿物を得る。これを生
理食塩水に溶解させ、透析膜にて生理食塩水に対
して透析処理理を行ない、抗体の生理食塩水溶液
を得た。実施例２ AENAI−１、AENAI−２、AENAI−３及び
AENAI−４の免疫グロブリンクラス上記抗体を酵素免疫法により96穴プレート上で
各種標品免疫グロブリンと反応させた。その結果
を第１表に示す。

【表】表中、＋は反応陽性を、−は反応陰性を示す。第１
表より、AENAI−１及びAENAI−２は免疫グ
ロブリンクラスIgG_2a、AENAI−３はIgG_2b、そ
してAENAI−４はIgMに属する。実施例３パーオキシダーゼで標識されたウサギ抗マウス
免疫グロブリンとAENAI−１、AENAI−２、
AENAI−３およびAENAI−４との反応性親ミエローマ細胞養液（対照）及び融合細胞
HAENAI−１、HAENAI−２、HAENAI−３
およびHAENAI−４の培養液上清につき、その
存在する免液グロブリンについて酵素免疫法を用
いて調べた。結果は第２表のとうりである。融合
細胞上清液のみ抗マウス免疫グロブリンと反応を
示した。これは親ミエローマ細胞培養液中には抗
体としての免疫グロブリンが存在しないが培養上
清中には、免疫グロブリンが産生されていること
を示している。

【表】

【表】実施例４ HAENAI−１、HAENAI−２、HAENAI−
３およびHAENAI−１のモノクローン細胞性クローニングを４回繰り返し、得られた
HAENAI−１〜４系列の細胞を各々96穴のプレ
ートにまき、得られたシングルクローンが全て抗
体産生株であることを、パーオキシダーゼ標識ウ
サギ抗マウス免疫グロブリンを用いて酵素免疫法
により確認した。その結果を第３表に示す。な
お、第３表には、得られた数多くの抗体産生シン
グルクローンのうち、各７個についての490nmに
おける吸光度の平均値を示した。

【表】実施例５モノクローナル抗体AENAI−１〜４と抗原で
あるNAIとの親和性得られた抗体の抗原に対する親和性を酵素免疫
法（エリザ法）による結合阻害測定法で検討し
た。まず、抗原であるNAIを１mg／mlになるよ
うに生理食塩水に溶解した。この抗原溶液を３、
９、27、81、…と３倍づつ希釈し、各々の希釈液
50μlをウエルに分注し、HAENAI−１、
HAENAI−２、HAENAI−３およびHAENAI
−４の培養上清50μlを加え、４℃で24時間インキ
ユベーシヨンした。一方抗原の固相化は次のよう
に行つた。抗原を5μg／mlになるように0.05M重
炭酸ナトリウム緩衝液に溶かし、50μlを96穴イミ
ユノプレート（ヌンク社）の各穴に入れる。４℃
で一晩静置後、抗原液を回収、リン酸緩衝生理食
塩水で各穴を３回洗浄し、その後、１％血清アル
ブミンを入れて４℃１晩静置した。１％牛血清ア
ルブミンを含んだイミユノプレートの各穴を0.05
％ツイーン20を含むリン酸緩衝生理食塩水で３回
洗浄後イミユノプレートを定量操作に用いた。こ
の抗原を固相化したプレートに、上記抗原−抗体
混合物50μlを入れ37℃20分間インキユベーシンし
た。過剰な抗体及び遊離の抗原を0.05％ツイーン
20を含むリン酸緩衝生理食塩水で３回洗浄後、固
相化された抗原に結合した抗体量を測定した。パ
ーオキシダーゼ標識されたウサギ抗マウス免疫グ
ロブリン（２次抗体、バイオラツド社）50μlを各
穴に入れ37℃で20分静置する。過剰な２次抗体を
0.05％ツイーン20を含むリン酸緩衝生理食塩水で
３回洗浄し除く。次いで、150μlの基質−発色液
（１mgｏ−フエニレンジアミン、1μl30％H₂O₂／
ml0.1Mリン酸カリウム緩衝液PH6.0）を加え、暗
所で５分間反応させる。パーオキシダーゼの反応
は50μlの6N Hclを加えることによつて行つた。
固相化された抗原に結合した抗体量は490nmにお
ける吸光度を測定することによつて得られた。結
果（４回の平均値）を第２図に示す。その結果、
AENAI−１〜３は遊離抗原と強く結合するこ
と、またAENAI−４は遊離抗原とはほとんど結
合しないことが判明した。次に上記の如く作製された固相化イミユノプー
ト中にAENAI−４の培養上清の連続希釈溶液を
入、（遊離抗原とのインキユベーシヨンを行なわ
ず）ただちに、上記同様の定量操作を行つた。そ
の結果、第３図（４回の平均値）に示した如く、
パーオキシダーゼ標識２次抗体が抗体量に比例し
て結合し、AENAI−４は固相化抗原と強く結合
することがわかる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、NAIのアミノ酸配列を示す図面で
ある。第２図は、AENAI−１〜４を用いた場合
における抗原（NAI）の希釈倍率と、固相化さ
れた抗原に結合した抗体量（２次抗体結合パーオ
キシダーゼ量）との関係を示す図面である。第３
図は、AENAI−４を用いた場合における抗体の
希釈倍率と、固相化された抗原に結合した抗体量
（２次抗体パーオキシダーゼ量）との関係を示す
図面である。

Claims

【特許請求の範囲】１小麦由来の小麦α−アミラーゼ阻害蛋白質に
対するモノクローナル抗体。２小麦由来の小麦α−アミラーゼ阻害蛋白質が
分子量19641を有するものである特許請求の範囲
第１項記載のモノクローナル抗体。３免疫グロブリンクラスがIgG_2a、IgG_2bまたは
IgMに属するものである特許請求の範囲第１項記
載のモノクローナル抗体。４小麦由来であつて分子量19641の小麦α−ア
ミラーゼ阻害蛋白質によつて免疫されたマウスか
ら採取される脾細胞と、動物ミエローマ細胞とを
融合させて得たハイブリドーマ細胞系HAENAI
−１、HAENAI−２、HAENAI−３または
HAENAI−４が産生するものである特許請求の
範囲第１項記載のモノクローナル抗体。