JPH0532034B2

JPH0532034B2 -

Info

Publication number: JPH0532034B2
Application number: JP60094468A
Authority: JP
Inventors: Koji Maeda
Original assignee: Nisshin Seifun Group Inc
Current assignee: Nisshin Seifun Group Inc
Priority date: 1985-05-01
Filing date: 1985-05-01
Publication date: 1993-05-14
Also published as: JPS61254600A

Description

【発明の詳細な説明】

〔産業上の利用分野〕本発明はα−アミラーゼ阻害物質に対するモノ
クローナル抗体に関する。〔従来の技術〕小麦中には20種を越える蛋白質性の動物のα−
アミラーゼを阻害する物質（以下「アミラーゼイ
ンヒビター」と称す）が含まれている。これらの
アミラーゼインヒビターは分子の大きさ及び阻害
するアミラーゼの由来により３つのグループに大
別される。第一のグループは分子量1.2万ダルト
ンのものであり、このグループに属するアミラー
ゼインヒビターは昆虫由来のアミラーゼを阻害す
る。第２のグループは分子量2.4万ダルトンで、
昆虫及びホ乳類由来のアミラーゼを阻害する。第
３のグループは分子量６万ダルトンであるが、ま
だ充分に研究がなされておらず、よくわからない
部分が多い〔デポンテ、アール等：セリアルケ
ミストリー（Deponte、R.et al：Cereal
Chemistry）53巻805−819、1976年〕。これらの
アミラーゼインヒビター群は、立体構造上極めて
コンパクトな型をとつており、それが故に極めて
熱安定である。例えば90℃、１時間加熱してもそ
の活性は失われない。特に分子量2.4万ダルトン
に属するアミラーゼインヒビターは、ヒトの唾液
及び膵液アミラーゼを阻害するので、小麦粉製品
の調理・加工条件は、当該アミラーゼインヒビタ
ー活性を大きく左右し、消化管における全ての食
品の消化吸収に重大な影響をおよぼしているもの
と考えられている。一方欧米諸国では小麦および
ライ麦に対するアレルギーを持ち、これらを食す
ると激しい下痢を起こす人が数多く知られてお
り、大きな問題となつている。このアレルギー性
下痢は、上記アミラーゼインヒビターよるもので
はないかとの研究が発表された〔ストロメイヤ
ー、デー．エツチ．：ユニートリツシヨンリポ
ート、インターナシヨナル（Strumeyer、D.H：
Nutrition Report、International）１巻（５
号）、第45頁1972年〕。〔発明が解決しようとする問題点〕従つて、小麦粉製品の調理加工中におけるアミ
ラーゼインヒビターの状態を追跡できれば、該小
麦粉製品の消化吸収に対する最良の加工状態を知
ることができる。また、小麦種子中のアミラーゼインヒビターの
追跡は、品種改良の面からも重要である。すなわ
ち、アミラーゼインヒビター群は小麦には含量の
少ない必須アミノ酸をバランスよく含むこと、更
に昆虫による被害を昆虫のアミラーゼを阻害する
ことによつて最小限におさえていると考えられる
ことから重要である。従つてアミラーゼインヒビ
ターの存在量は、小麦の品種改良に欠くべからざ
る指標となり得る。通常、アミラーゼインヒビターの測定は、アミ
ラーゼ活性を測定する系の中に該インヒビターを
加え、アミラーゼ活性がどの程度低下するかによ
り逆算される。しかしながら、この方法は操作が
複雑で測定誤差が大きく、しかも結果を得るのに
長時間を要するという欠点を有する。従つて、上
記目的のために管便且つ正確なアミラーゼインヒ
ビターの測定手段の開発が望まれている。〔問題点を解決するための手段〕上記実状に鑑み本発明者はアミラーゼインヒビ
ターの実用的な測定手段を見い出すべく種々検討
した結果、その測定を可能ならしめるアミラーゼ
インヒビターに対するモノクローナル抗体を見い
出し、本発明を完成した。すなわち、本発明は小麦由来の動物α−アミラ
ーゼ阻害物質に対するモノクローナル抗体を提供
するものである。本発明のモノクローナル抗体には、ハイブリド
ーマ細胞系HAWAI−１、HAWAI−２又は
HAWAI−３がぞれぞれ産生するAWAI−１、
AWAI−２およびAWAI−３の３種類が含まれ、
これらはいずれも免疫グロブリンクラスがIgG₁
に属するものである。本発明のモノクローナル抗体は、ハイブリドー
マ細胞系HAWAI−１、HAWAI−２又は
HAWAI−３の培養上清から、あるいはこれらの
細胞系を腹腔内に投与されたマウスの腹腔液又は
血清から採取することにより製造される。本発明モノクローナル抗体を産生するハイブリ
ドーマ細胞系は、抗原として分子量（ゲル過
法）24000であり、ポリアクリルアミドゲル電気
泳動において移動度0.53を示すアミラーゼインヒ
ビター（以下「0.53−インヒビター」と称す）を
用いて動物を免疫し、その動物から採取した脾細
胞とマウスミエローマ細胞とを融合させることに
より得られる。抗原である前記0.53−インヒビターは前田等の
方法〔前田等：アグリカルチユラルアンドバ
イオロジカルケミストリー（Agricultural and
Biological Chemistry）、41巻、第2873−2875
頁、1982年〕に従つて小麦より単離される。 0.53−インヒビターを抗原とする脾細胞を採取
するには、マウス等の動物を0.53−インヒビター
で免疫し、その動物の脾臓から採取することによ
り行なわれる。免疫は、抗原とフロインド完全ア
ジユバントとの混合物を皮下注射し、免疫を増強
するために３週間後に再度皮下注射し、更に２週
間後に抗原を静脈注射することにより行なわれ
る。脾細胞の採取は、最終投与の３日後に動物を
屠殺し、摘出した脾臓より分離することにより行
なわれる。マウスミエローマ細胞としては、Ｐ−Ｓ−NS
−１／１−Ag4−１株又はこの株を継代培養した
ものが用いられる。継代培養は、例えば10％ウシ
胎児血清を含むRPMI1640培地を用い、炭酸ガス
インキユベータにて37℃付近で行なわれる。細胞融合は、前記の脾細胞とミエローマ細胞と
を、例えばケーラー、ジー．（Koehler、G.）及
びミルシユタイン、シー・（Milstein、C.）が確
立した方法〔ネイチヤー（Nature）、256巻、第
495頁、1954年〕に準じて融合させることにより
行なわれる。すなわち、ミエローマ細胞と脾細胞
とを１：10の割合でRPMI1640培地に懸濁させ、
これにポリエチレングリコールを添加し、おだや
かに撹拌することにより融合せしめる。ポリエチ
レングリコール等を除去し融合細胞懸濁液を作製
し、これを培養した後、細胞性放射免疫法
（cellular radio immunoassay）にて抗体産生株
を選択する。更に目的とする抗体産生細胞のみを単離するに
は、希釈法によるクローニングを繰り返して、１
つのクローンから発生した全てのシングルクロー
ンが抗体産生である様にすることにより行なわれ
る。斯くして得られたハイブリイドーマ細胞系には
前記本発明のモノクローナル抗体AWAI−１、
AWAI−２又はAWAI−３をそれぞれ産生する
３種類の細胞が存在する。これらのハイブリドー
マ細胞の特性は以下の通りである。３種類ともに、Ｐ−３−NS−１／１−Ag4
−１マウスミエローマ細胞とマウス脾細胞を
融合させた雑種細胞である。３種類ともにHAT培地で増殖可能である。３種類ともにRPMI−1640培地（10％ウシ胎
児血清補添）で増殖可能であり、この培地での
doubling time（細胞が２倍に増殖するのに要
する時間）は約24時間である。３種類ともにの培地に懸濁させた状態で−
80℃以下で凍結保存可能である。３種類ともにの培地に懸濁させ、37℃で長
期継代培養可能である（植え継ぎ周期は約４
日）。３種類ともにマウス（Balb／ｃ）の腹腔内
にて継代培養可能である（植え継ぎ周期は約３
週間）。３種類の細胞は0.53−インヒビターとクロス
する免疫グロブリンIgG₁に属するモノクロー
ナル抗体AWAI−１、AWAI−２および
AWAI−３をそれぞれ永久的に産生する。以上の特性を有する３種類の細胞は、AWAI
−１を産生する細胞をHAWAI−１、AWAI−２
を産生する細胞をHAWAI−２、AWAI−３を産
生する細胞をHAWAI−３と命名し、通商産業省
工業技術院微生物工業技術研究所に寄託すべく手
続を行つたが、受託を拒否された（寄託受託拒否
通知番号60微寄文第484号、同第485号、同第486
号）。尚、これらの細胞は出願人において譲渡可
能な状態で保管してある。抗体産生細胞HAWAI−１、HAWAI−２又は
HAWAI−３から本発明のモノクローナル抗体
AWAI−１、AWAI−２又はAWAI−３を製造
する方法としては以下の方法が挙げられる。 (a) HAWAI−１、HAWAI−２又はHAWAI−
３を栄養培地中で培養して、その上清から採取
する方法。 (b) HAWAI−１、HAWAI−２又はHAWAI−
３をマウス腹腔内に投与して腹腔内で増殖さ
せ、腹腔液又は該マウスの血清から採取する方
法。就中、目的抗体の収量の面から(b)における腹腔
液から採取する方法が好ましい。当該腹腔内で増
殖させて腹腔液から本発明モノクローナル抗体を
採取する方法は、例えば以下の如くして実施され
る。 HAWAI−１、HAWAI−２又はHAWAI−３
をマウス腹腔内に投与して約３週間後、腹腔内に
貯溜した腹腔液を採取し、得られた腹腔液から遠
心分離、透析等の手段によりモノクローナル抗体
AWAI−１、AWAI−２又はAWAI−３が分
離・精製される。得られた本発明モノクローナル抗体AWAI−
１、AWAI−２及びAWAI−３は以下の如き性
質を有する。 ○イ AWAI−１、AWAI−２及びAWAI−３は
いずれも免疫グロブリンクラスがIgG₁に属す
る。免疫沈降反応法（オクタロニー法）により、
本発明抗体はいずれもウサギ抗マウスIgM、
IgG₂a、IgG₂bと反応せず、ウサギ抗マウス
IgG₁とのみ反応する。 ○ロ AWAI−１、AWAI−２及びAWAI−３は
いずれも抗Ｆ（ab）′と反応するが、その反応
性はAWAI−３＞AWAI−２＞AWAI−１の
順である。 ○ハ AWAI−１、AWAI−２及びAWAI−３は
いずれも0.53−インヒビターに対し高い親和性
を示す（結合阻害実験法）。〔作用及び発明の効果〕本発明のモノクローナル抗体は、アミラーゼイ
ンヒビターに対し高い親和性を有することから、
小麦製品中のアミラーゼインヒビター測定用材料
として極めて有用である。更に小麦種子中のアミ
ラーゼインヒビターの測定を容易ならしめれば、
その品種改良の面からも極めて有用である。〔実施例〕次に実施例を挙げて本発明を説明する。実施例１抗原（0.53−インヒビター）の調製：これは、前田等の方法〔アグリカルチユラル
アンドバイオロジカルケミストリー
（Agri−cultural and Biological Chemistry）、
41巻、2873−2875ページ、1982年〕にしたがつ
て行つた。小麦粉１Kgを10の水で抽出し、上
澄を凍結乾燥した。凍結乾燥粉末を５倍量の水
に溶解し、70℃で30分間加熱処理し、熱に不安
定な蛋白質を除去した。得られたアミラーゼイ
ンヒビター含有上澄にエタノール（99.9％）を
撹拌しながら３℃において加え、エタノール濃
度が60％になるようにした。この濃度で不要蛋
白は沈澱する。アミラーゼインヒビター群は上
澄に残つているので、更にエタノールを加え、
最終濃度が90％になるようにする。この濃度で
アミラーゼインヒビターは沈澱する。沈澱物を
遠心機にて集め、カラムクロマトグラフイーの
出発物とする。第１段のカラムクロマトは、セ
フアデツクスＧ−75（2.7×70cm）上で行う。緩
衝液は、25ｍＭ酢酸ナトリウム−酢酸、PH4.6
である。0.53−インヒビター含有区分は２つ目
の大きなピークとなりカラムから溶出する。こ
のピーク更に同一緩衝液で平衡化したCMセフ
アロースCL−6B（2.7×30cm）上において、０
より0.3Mの塩化ナトリウムのグラジエントで
クロマトすると、塩化ナトリウム濃度0.1Mの
ところで0.53−インヒビターは溶出する。この
インヒビターは、７％ポリアクリルアミドゲル
電気泳動上で、トリス−塩酸緩衝液PH9.5の条
件下で、色素プロムフエノールブルーを１とし
たとき0.53の移動度を示す１本のバンドとして
検出された。免疫 Balb／ｃマウス（♀25ｇ）に、フロインド
完全アジユバントに溶解させた30μｇの抗原
（0.53−インヒビター）を皮下注射する。３週
間後に同様の皮下注射を行ない、更に２週間後
30μｇの0.53−インヒビターを静脈に注射した。
最終投与の３日後に脾細胞を採取し、細胞融合
に用いる細胞を得た。細胞融合のためのミエローマ細胞の調製マウスミエローマ細胞Ｐ−３−NS−１／１
−Ag4−１は、10％ウシ胎児血清を含む
RPMI1640培地（日水製薬(株)製）を用い、95％
空気及び５％炭酸ガスを含む気流を流した炭酸
ガスインキユベーターにて37℃に継代培養し
た。細胞融合ケーラー及びミルシユタインが確立した方法
（ケーラー、Ｇ、及びミルシユタインＣ：ネイ
チユアー（Nature）、256巻、495ページ、1975
年）に準じ、ミエローマ細胞２×10⁷個と上述
した方法で得られた脾細胞２×10⁸個を
RPMI1640培地に37℃で懸濁させ、１mlの50％
ポリエチレングリコール（ポリエチレングリコ
ール4000、メルク社製）を１分間にわたりピペ
ツトの先端で細胞を軽く撹拌しながら添加す
る。添加後更に１分間ゆつくり撹拌する。ウシ
胎児血清を含まない10mlのRPMI1640培地をゆ
つくり加えてポリエチレングリコールを希釈
し、室温にて400×ｇで５分間遠心分離を行な
い、上清を捨てる。約80mlの10％RPMI1640培
地を細胞ペレツトに直接注ぎながらピペツトで
撹拌し、細胞懸濁液をつくる。２×10⁶個／ml
の脾臓細胞を含む懸濁液を24穴のカルチヤープ
レートに１mlづつまき、95％の空気−５％の炭
酸ガスより成る混合気流中で、炭酸ガス培養器
を用いて24時間培養した後、それぞれのウエル
に１mlのHAT培地を加える。培養後10〜14日
後に残存するクローンにつき、目的とする抗体
産生株のアツセイを細胞性放射免疫法
（cellular radio immunoassay）で行なう。抗
体産生株を含むウエル内容物を、HAT培地で
希釈して96穴プレートにまき目的とする細胞の
クローニングをくり返し行つた。クローニング
は希釈法を用い、１ウエルあたり１個の融合細
胞が含まれるようにした。この様にしてクロー
ニングを繰り返し、１つのクローンから出た全
てのシングルクローンが抗体産生であるときを
もつて、クローンが確立されたとした。このよ
うにして、0.53−インヒビターに対する抗体産
生細胞HAWAI−１、HAWAI−２及び
HAWAI−３株を得た。抗体の製法マウス腹腔内での継代培養又は組織培養で継
代したHAWAI−１、HAWAI−２又は
HAWAI−３株の細胞約10⁷ケを、あらかじめ
プリステンを投与したマウスの腹腔内に投与す
る。約３週間後、腹腔内に貯溜した腹腔液を採
取し、ヘパリンを数滴滴下して撹拌する。
2000rpmで５分間遠心分離を行ない血球及び雑
種細胞を除き、上清液を得る。得られた腹水上
清液に硫酸ナトリウムを16％ｗ／ｗになる様に
加え、撹拌後37℃にて45分間保持する。次いで
5000rpmで遠心分離し、目的とする抗体の沈澱
物を得る。これを生理食塩水に溶解させ、透析
膜にて生理食塩水に対して透析処理を行ない、
抗体の生理食塩水溶液を得た。実施例２ AWAI−１、AWAI−２及びAWAI−３の免
疫グロプリンクラス上記抗体を免疫沈降反応法（オクタロニー法）
により１％アガロース上で各種標品免疫グロブリ
ンと反応させた。その結果を第１表に示す。

【表】表中、＋は反応陽性を、−は反応陰性を示す。第
１表より、AWAI−１、AWAI−２及びAWAI
−３はいずれも免疫グロプリンクラスがIgG₁に
属する。実施例３¹²⁵ Iで標識されたウナギ抗マウス免疫グロブリ
ンとAWAI−１、AWAI−２及びAWAI−３
との反応性親ミエローマ細胞培養液（対照）及び融合細胞
HAWAI−１、HAWAI−２及びHAWAI−３の
培養液上清につき、その存在する免疫グロブリン
について、ラジオイミユノアツセイ法（¹²⁵I標
識ウサギ抗マウスＦ（ab）′使用を用いて調べた。
結果は第２表のとおりである。融合細胞上清液の
み抗Ｆ（ab）′と反応性を示した。これは親ミエ
ローマ細胞培養液中には抗体としてのIgGは存在
しないが、培養上清中にはIgGが産生されている
ことを示している。

【表】実施例４ HAWAI−１、HAWAI−２及びHAWAI−３
のモノクローン細胞性クローニングを３回繰り返し得られたHAWAI
−１、HAWAI−２及びHAWAI−３系列の細胞
を各７個のウエルにまきそれぞれの培養上清の
IgGの存在を¹²⁵I標識ウサギＦ（ab）′を用いて調
べた。結果を第３表に示す。その結果、全てのウ
エルでIgG抗体の産生が認められた。

【表】実施例５抗体AWAI−１、AWAI−２及びAWAI−３
と抗原である0.53−インヒビターとの親和性得られた抗体の抗原に対する親和性は、細胞性
ラジオイムノアツセイ法により調べた。細胞性
ラジオイムノアツセイ法には、結合阻害測定法
（binding inhibition assay）を用い、長谷らの方
法〔ブラントアンドセルフイジオロジー
（Plant and Cell Physiology）、24巻、1143ペー
ジ、1983年〕に準じて行つた。即ち、抗原である
0.53−インヒビターを１mg／mlになるように生理
食塩水に溶解した。この抗原溶液を３、９、27、
81、…と３倍づつ希釈し、各々の希釈液25μを
ウエルに分注し、AWAI−１、AWAI−２及び
AWAI−３の培養上清を25μ加え、３℃で24時
間インキユベーシヨンした。次いで長谷らの方法
（ブラントセルフイジオロジー、24巻、1143
ページ、1983年）に準じて調製した羊赤血球結合
0.53−インヒビター50μを加え、３℃で１時間
インキユベーシヨンした。遠心分離で羊赤血球を
沈降させ、リン酸緩衝生理食塩水で３回洗滌して
遊離の抗体を除去し、次いで２次抗体である¹²⁵I
標識ウサギ抗マウスＦ（ab）′溶液50μ
（300000cpm）を加える。３℃で１時間インキユ
ベーシヨンし、遠心分離した後、上述のごとくリ
ン酸緩衝生理食塩水で３回洗滌する。羊赤血球−
抗原に結合した抗体量（アイソトープ量）をγ−
カウンターで測定した。結果を第１図〜第３図に
示す。これらの図より、本発明のモノクローナル
抗体は抗原である小麦由来の動物α−アミラーゼ
阻害物質に対して少なくとも2187倍希釈まで反応
するという高い親和性を有することが判明した。実施例６抗体AWAI−１、AWAI−２及びAWAI−３
の異種蛋白に対する交叉性マウス腹水より調製した抗体（10mg）を、２ml
のブロモシアンにより活性化セフアロース（フア
ルマシア社）に結合させ、アフイニテイーカラム
を作製した。このカラムに小麦抽出物を流し、25
ｍＭトリス−塩酸緩衝液、PH7.5、で洗滌後、
0.1M酢酸緩衝液（含1M食塩）で、カラムに結合
した蛋白を溶出した。この溶出蛋白を、前述のポ
リアクリルアミド電気泳動法で解析したところ、
0.53−インヒビターと共に、0.19−、0.36−及び
0.38−インヒビターが検出された。以上の結果
は、得られた３種のモノクローナル抗体に対し
て、0.19−、0.36−、0.38−及び0.53−インヒビ
ターが同一抗原部位を有する事を示している。

【図面の簡単な説明】

第１図〜第３図は、AWAI−１、AWAI−２
又はAWAI−３を用いた場合における抗原蛋白
（0.53−インヒビター）の希釈倍率と羊赤血球結
合0.53−インヒビターに結合した抗体量（アイソ
トーブ量）との関係をそれぞれ示す図面である。

Claims

【特許請求の範囲】１小麦由来の動物α−アミラーゼ阻害物質に対
するモノクローナル抗体。２免疫グロブリンクラスがIgG₁に属するもの
である特許請求の範囲第１項記載のモノクローナ
ル抗体。３小麦由来の動物α−アミラーゼ阻害物質が、
分子量（ゲル過法）24000であり、ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動において移動度0.53を示す
ものである特許請求の範囲第１項記載のモノクロ
ーナル抗体。４小麦由来の動物α−アミラーゼ阻害物質の少
なくとも2187倍希釈まで反応するものである特許
請求の範囲第１項記載のモノクローナル抗体。５小麦由来の動物α−アミラーゼ阻害物質によ
つて免疫されたマウスから採取される脾細胞と動
物ミエローマ細胞とを融合させて得たハイブリド
ーマ細胞系HAWAI−１、HAWAI−２又は
HAWAI−３が産生するものである特許請求の範
囲第１項記載のモノクローナル抗体。