JPS63247661A - アミラ−ゼインヒビタ−の定量方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、α−アミラーゼ、例えば小麦α−アミラーゼ
を特異的に阻害するα−アミラーゼインヒビター（Ａｍ
ｙｌａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ；以下これをＡＩと呼
ぶ）の定量方法に関する。

一般にアミロ粘度の高い小麦粉を産生ずる小麦はアミラ
ーゼ活性が低く、逆にアミロ粘度の低い小麦粉を産生ず
る小麦はアミラーゼ活性が高いことが知られている。こ
の小麦のアミラーゼ活性は小麦中に存在するアミラーゼ
の滑と内在性（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ）　Ａ　Ｉの量と
によって決定される。すなわち、アミラーゼの量が大で
あっても内在性ＡＩの量が同様に大であればアミラーゼ
の効果の発現が阻止されアミラーゼ活性は小となる。ま
たアミラーゼの量が小であっても内在性ＡＩの量がこの
アミラーゼを阻止する量以下であればアミラーゼ活性が
発現することになる。

すなわち、小麦のアミラーゼ活性は存在する内在性ＡＩ
の量によって大きく支配され、従って小麦中の内在性Ａ
Ｉの量の測定によってこの小麦から得られる小麦粉のア
ミロ粘度の高低の指標が得られることになる。

さらにこのＡＩの定量方法によって小麦中のＡｌｆｉの
測定が簡易化するので、この定量方法を用いてＡＩｊｌ
の多い品種を選抜することによりアミロ粘度の高い小麦
粉を産生ずる小麦の選抜が容易化することが期待できる
。

〔従来の技術〕

小麦粉を種々の用途に利用する場合、しばしばアミロ粘
度の高いものが求められる。例えばパン、クツキー、麺
などの小麦粉の二次加工製品の製造原料としてはアミロ
粘度の低い小麦粉は製品の品質を低下させるので好まし
くない。

このアミロ粘度は小麦粉を構成する澱粉が酵素的に分解
をうけた場合に低下することが知られている。そしてこ
の澱粉の分解を行う酵素が小麦中に存在するアミラーゼ
である。ところで上述のようにこのアミラーゼの作用は
これと拮抗する内在性ＡＩによって阻止されるところか
ら、内在性ＡＩ量の測定が小麦のアミラーゼ活性の評価
のための指標として大きな意味を有しており、そしてこ
れまでに活性が既知のα−アミラーゼに測定しようとす
るインヒビター溶液を加えα−アミラーゼの活性の低下
率からインヒビター虫を求める方法（Ｓｔｒｕｍｅｙｅ
ｒ。

”Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ　Ｒｅｐｏｒｔｓ　Ｉｎｔｅｒｎ
ａｔｉｏｎａｌ”　５　ｐ４５（１９７２）　）やゲル
が適法でインヒビターの溶出ピークから定量化する方法
（Ｈｏｕｇｌｕｍ、　Ｃｈａｐｐｅｌｌ。

Ｇｒａｙ、“Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｌｉｑｕｉｄ　Ｃ
ｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ″７　ｐ２８９５　（１９
８４））が内在性ＡＩ量の測定のために用い得ることが
知られている。

〔発明が解決しようとする問題点〕

しかしながら、これらの既知の方法では測定のために多
量の試料と長時間の作業を必要とする他に高度の熟練を
も要し、そして再現性にも問題があった。従って少量の
試料で短時間（三かつ簡便にＡ（３１を測定する方法の
開発が求められていたのである。

本発明はわずかな量の小麦の多数の試料がら、きわめて
正確ですぐれた再現性をもって短時間の操作によってＡ
Ｉ量を測定する方法を提供するものである。しかしてこ
のようにＡＩｆｉの測定を正確に行うことにより、小麦
の品質の評価の指標として使用することのできるＡＩｆ
ｉの多寡を多数の試料の小麦について決定することがで
きる。

〔問題を解決するための手段〕

本発明者らは、α−アミラーゼとそのアミラーゼインヒ
ビターとの特異的な結合を利用し、固定化したα−アミ
ラーゼにアミラーゼインヒビターをコンプレックス化し
て結合させ、この結合したインヒビター量を抗アミラー
ゼインヒビター抗体を用いて定量しうろことを見出して
本発明を完成した。

すなわち、本発明は固定化したα−アミラーゼにＡＩを
含有する試料を加えて試料中のＡＩをα−アミラーゼ上
にコンプレックス化して結合させ、この結合したＡ１１
ｌを抗、ＩＭ抗体を用いて定量する方法に関する。

さらに具体的には本発明は、α−アミラーゼを担体、例
えばプラスチックプレート上に固定化し、この固定化し
たα−アミラーゼにＡＩを含有する試料を加えてα−ア
ミラーゼ上にＡＩをコンプレックス化して結合させ、こ
のＡＩをコンプレックス化して結合させたα−アミラー
ゼに抗ＡＩ抗血清を加えて血清中の抗ＡＩ抗体をα−ア
ミラーゼに結合させたＡＩに結合させ、次いでこのＡＩ
に結合した抗ＡＩ抗体遣をこれまでに知られた方法で定
量することによってＡＩを含有する試料中のＡｌｆｆ１
を求めることを特徴とするものである。

上記したα−アミラーゼの固定化は常法によって行われ
る。すなわち、精製したα−アミラーゼを緩衝液に溶解
し、プラスチックプレート例えばポリスチレン製のプレ
ートのウェルに加える。この場合緩衝液としては濃度が
０．０１モルのリン酸緩衝液（以下これをＰＢと称する
）かトリス（ヒドロキシルメチル）アミノメタン・塩酸
緩衝液（以下これをＴＢと称する）が用いられる。また
これら緩衝液はその［）Ｈを６．０〜８．０の範囲に調
節して用いることが好ましい。さらにα−アミラーゼの
固定化を確実にするために緩衝液中にカルシウムイオン
を存在させることが好ましく、カルシウムイオン源とし
て塩化カルシウム等が用いられる。このカルシウムイオ
ンは１〜５ミリモルの範囲の濃度で存在することが好ま
しい。

上記のようにα−アミラーゼ溶液を加えたプラスチック
プレートを冷蔵庫中で一夜放置し、α〜アミラーゼをプ
ラスチックプレート上に固定化させる。その後このプラ
スチックプレートを０．１５モルの食塩を含むｐＨ７，
２のＰＲ（以下これをＰＢＳと称する）か、あるいは０
．１５モルの食塩を含むｐＨ７，４のＴＢ（以下これを
ＴＢＳと称する）で洗い血清アルブミンを含むＰＢＳあ
るいはＴＢＳ例えば牛血清アルブミンを含むＰＢＳある
いはＴＢＳを加えてα−アミラーゼか固定化されていな
いプラスチックプレートの領域を血清アルブミンで覆っ
ておく。この場合の血清アルブミンの上記溶液処理は２
０〜４０℃の範囲の温度および３０分〜６０分の時間に
行うことが好ましい。このように血清アルブミンの上記
溶液で処理されたプラスチックプレートはＰＢＳあるい
はＴＢＳで洗い次のＡＩとのコンプレックス化のために
用いられる。

このようにα−アミラーゼを固定化したプラスチックプ
レートに次いでＡＩを含有する試料溶液を加える。この
ようにして試料中に存在するＡＩは特異的にα−アミラ
ーゼとコンプレックスを作る。この場合ＡＩを含有する
試料溶液中のＡＩ量は例えば１　ｎｇ（ナノグラム）〜
ｌｉ／ｘＱでありうる。このＡＩとα−アミラーゼとの
コンプレックス化の完結のためには２０〜４０℃の温度
で３０分〜６０分の間インキュベートすることが好まし
い。コンプレックス化が完結したプラスチックプレート
を０．０５％のトウイーン２０　（Ｔｗｅｅｎ−２０）
（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製商品名）を含むＰＢＳあるいはＴ
ＢＳ（以下これらをＰＢＳ−ＴｗｅｅｎあるいはＴＢＳ
−Ｔｗｅｅｎと称する）で洗浄する。

次いで、このプラスチックプレートに抗ＡＩ抗血清の希
釈液を加える。この抗ＡＩ抗血清は、ＡＩを実験動物、
例えば兎、マウス、ラット、山羊、羊、犬など（大規模
実験では大型獣例えば牛、馬も可能である）に抗原とし
て投与して、その血液中に抗ＡＩ抗体を生成せしめその
血液から得られる血清である。

この抗Ａｔ抗血清は１００〜１０，０００倍に希釈して
用いる。希釈液としては牛血清アルブミンを含むＰＢＳ
あるいはＴＢＳを用いる。このように抗ＡＩ抗血清の希
釈液を加えたプラスチックプレートは２０６Ｃ〜４０℃
の温度で３０分〜６０分の間インキュベートされＡＩと
抗ＡＩ抗体との肩の抗原−抗体反応を完結させたのち、
ＰＢＳ−ＴｗｅｅｎあるいはＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄
する。この場合に用いる抗ＡＩ抗血清は前記のように種
々の動物種に由来するものを用いうるが、次に述べるよ
うに抗ＡＩ抗体の定量のために用いる試薬により特定さ
れる動物種に由来するものを用いることが必要となる。

例えばウサギからの抗ＡＩ抗血清を用いて上記の抗原−
抗体反応を行った場合についてはこのＡＩに結合したウ
サギの抗ＡＩ抗体すなわち、ウサギの免疫グロブリンを
定量することが必要になり、そのために例えば適当な手
段で標識化された抗ウサギ免疫グロブリンが用いられる
。

次にＡＩに結合した抗ＡＩ抗体の定型が行われるが、こ
れには公知のイムノアッセイの手段が用いうる。

すなわち前記の工程において用いられた特定の動物種の
血清に特異的に反応する抗血清中の免疫グロブリンを標
識化し、この標識化した免疫グロブリンを用いてＡＩに
結合した抗ＡＩ抗体に結合させ、結合した免疫グロブリ
ンを定量する。免疫グロブリンの標識化手段としては、
例えば放射性同位元素による標識、蛍光染料その他の染
料による標識、酵素による標識など種種のものを挙げる
ことができる。酵素による標識の具体例としては西洋ワ
サビペルオキシダーゼ（ｔｉｏｒｓｅ　Ｒａｄｉｓｈ　
ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　：以下ＨＲＰと略称する）によ
る標識が挙げられる。この場合、例えば前工程において
ウサギの抗ＡＩ抗血清を用いて同血清中のＡＩ抗体（す
なわちウサギ由来の免疫グロブリン）をＡＩに結合せし
めたときには、ウサギの免疫グロブリンを抗原とじて動
物に投与して動物の血清中に得られる抗ウサギ免疫グロ
ブリンについてこれをＩ−（ＲＰで標識したもの（抗ウ
サギ免疫グロブリン−ＨＲＰ）を用いることになる。こ
の抗ウサギ免疫グロブリン−ＨＲＰを溶解した溶液を上
記の抗ＡＩ抗血清で処理したプラスチックプレートに加
えてインキュベートし、プラスチックプレート上に抗ウ
サギ免疫グロブリン−ＨＲＰを結合させる。

そしてこの結合した抗ウサギ免疫グロブリン−ＨＲＰに
ついてその）ＩＲＰ活性を測定する。この操作を濃度既
知のＡＩ試料で行い検量線を作成する。他方濃度未知の
ＡＩ試料について同様の操作を行い得られたＨＲＰ活性
値を上記検量線と比較することにより濃度未知試料のＡ
Ｉａ度を決定することができる。

放射性同位元素による標識の場合は、例えばヨウ素の放
射性同位元素である１！５Ｉで抗ウサギ免疫グロブリン
を標識化し、ＨＲＰＩ識抗体の時と同様に抗ＡＩ抗体と
結合させ、その放射活性をγ線計測機で追跡測定するこ
とにより定量する。

蛍光染料による標識の場合は、例えばフルオレセインイ
ソチオシアネートで抗ウサギ免疫グー　　ロブリンを標
識化し、ＨＲＰ標識抗体の時と同様に抗ＡＩ抗体と結合
させ、蛍光分光光度計で検出測定することにより定量す
る。

以上本発明について、小麦α−アミラーゼを特異的に阻
害するＡＩの定量に関して説明したが、本発明の方法は
かかる小麦α−アミラーゼのＡＩの定量方法に限られる
ことはなく、α−アミラーゼとコンプレックスを作りう
るＡＩのすべての定量に適用可能である。このようなα
−アミラーゼとコンプレックスを作り得るＡＩとの組み
合わせとしては、小麦α−アミラーゼと大麦のＡＩ、ヒ
トの唾液中のα−アミラーゼと小麦の外在性（ｅｘｏｇ
ｅｎｏｕｓ）　Ａ　Ｉ、ヒトの膵液中のα−アミラーゼ
と小麦の外在性ＡＩ、あるいはヒトの膵液中のα−アミ
ラーゼと放線菌のＡＩの組み合わせなどが挙げられる。

〔発明の効果〕

本発明によってアミラーゼインヒビターの定量が簡便迅
速かつ多数の試料について行うことができる。そして本
発明の方法は抗原−抗体反応を用いるものであることか
ら測定感度が鋭く試料中のＡＩ濃度が希薄なものであっ
てもこれを濃縮または前処理することなく中性または弱
酸性の緩衝液で抽出すればそのまま測定試料として用い
ることができる。そして予めα−アミラーゼを固定化し
たプレートを作っておくことにより３０分〜１時間ずつ
の３度のインキュベーション時間を含めても２〜４時間
の短時間で最終結果をうろことができる。また用いるプ
ラスチックプレートによって最大９６点の測定を同時に
行うことができる。

〔実施例〕

次に本発明を実施例によって具体的に説明する。この実
施例は本発明を例示するためのものであって、本発明が
この実施例によって限定されるものではない。

実施例　１ アミラーゼインヒビターの測定 測定サンプルとして小麦品種ルイス（ＬＥＴ　Ｉｓ）及
びランサー（ＬＡＮＣＥＲ）を用いた。各種子を充分吸
水した濾紙を置き２５℃に維持したシャーレ中で２４．
４８時間発芽させた。また発芽していない種子も用いた
。

発芽種子１０粒と０．１モルリン酸緩衝液（ｐＨ６，７
）　４．ＯｍＱをガラスホモゲナイザーに入れて外部を
水冷しながら３分間ホモゲナイズした。この乳化液を遠
心管に移しホモゲナイザー容器を更に１ｍｇの前記リン
酸緩衝液で洗い、この液も遠心管に移した。４℃、１１
００００ｒｐで２０分遠心分離しその上澄み液を採取し
て測定液とした。

発芽していない種子は、１０粒をコーヒーミルで粗く粉
砕したのち、乳鉢で細かくすりつぶした。試験管に移し
前記リン酸緩衝液５　、　ＯｍＱを加えて振盪機で２０
分間室温で振盪抽出した後、冷却遠心を行いその上澄み
液を測定液とした。

小麦α−アミラーゼは、発芽小麦より精製した。硫安沈
澱、βサイクロデキストリン・アフィニティー中クロマ
トグラフィー、ジエチルアミノエチル・クロマトグラフ
ィー、吸着クロマトグラフィーの後、ドデシル硫酸ナト
リウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動（以後５ＤＳ
−ＰＡＧＥと呼ぶ）でシングルバンドになることを確認
して精製α−アミラーゼとした。

内在性ＡＩは、小麦粉より抽出し、α−アミラーゼと同
様にクロマトグラフィーで精製した。

５ＤＳ−ＰＡＧＥでシングルバンドになることを確認し
た。

抗内在性ＡＩ抗体は以下の手順で作った。精製内在性Ａ
Ｉ０．５ｍｇを等量のフロイント・アジュバントと混合
し家ウサギ（日本内色種、雌、３ｋｇ）の背部皮下に注
射した。２週間ごとに１０回免疫をかけ、最終免疫後８
日目に採血した。３７°Ｃで１時間凝固させたのち、遠
心分離して血清を得、５６℃で３０分処理して抗血清を
得た。

手順 １；ポリスチレン製マイクロウェルプレート（Ｎｕｎｃ
社製）へアミラーゼを固相化する。

・精製小麦α−アミラーゼをＣａＣ（Ｉｔ　５ｍＭを含
むＴＢで希釈して５０ｔ４／ｍＱの濃度にし５０成ずつ
各ウェルに添加する。４℃で一晩放置して固相化する。

２；プレートをＴＢＳで洗浄したのち、１％牛血清アル
ブミンを含むＴＢＳ３００ｄを加えて、３７℃で１時間
放置する。

３、ＴＢＳで洗浄する。

４；測定サンプル５０Ｉｉ！、中に、アミラーゼインヒ
ビター１０　ｎ　ｇ〜３００　ｎ　ｇを含むようにＴＢ
Ｓで希釈し、各ウェルに添加する。３７℃で１時間放置
する。今回は種子抽出液を３００倍に希釈して用いた。

５　；　ＴＢＳ　−Ｔｗｅｅｎで洗浄する。

６；ウサギの抗内在性ＡＩ抗血清（０，１％牛血清アル
ブミンを含むＴＢＳで１０００倍希釈）を加え１時間、
３７℃で放置する。

７　；　ＴＢＳ　−Ｔｗｅｅｎで洗浄する。

８；抗ウサギ免疫グロブリン抗体（ＨＲＰでラベルした
もの（Ｂｉｏ−Ｒｅｄ社製）〕を０．１％牛血清アルブ
ミンを含むＴＢＳで１０００倍希釈して各ウェルに５０
成加え１時間３７°Ｃで放置する。

９　；　ＴＢＳ　−Ｔｗｅｅｎで洗浄する。

１０；発色液（１ｍｇ／ｍ（ｌｏ−フェニレンジアミン
、０．０３％過酸化水素、０．１モルリン酸バッファー
（ｐＨ６，０）を１５０成加えて発色させ、６Ｎ塩酸で
反応を停止後、４９０ｎｍの吸光度を測定した。

１１；また精製内在性ＡＩを０．１％牛血清アルブミン
を含むＴＢＳで検量線作成に必要な濃度に希釈し前記４
〜１０の手順によって吸光度を測定して検量線を作成す
る。この検量線に基づいて各測定サンプルの内在性ＡＩ
含量を求めた。得られた結果を表−１に示す。

表−１各品種の発芽時間の変化による 内在性ＡＩ含量 品種名　　　ルイス　　　ランサー 発芽時間　　　　０　　２４　　４８　　　０　　２４
　　４８内在性ＡＩ含量　６．１５　４．８０　４．８
０　　５．８５　７．３５　７．９５（４７粒）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. α−アミラーゼを固定化し、このα−アミラーゼを特異
   的に阻害するα−アミラーゼインヒビターを含有する試
   料を加えてα−アミラーゼ上にα−アミラーゼインヒビ
   ターを結合させ、この結合したα−アミラーゼインヒビ
   ター量をこのα−アミラーゼインヒビターの抗体を用い
   て定量することを特徴とする、α−アミラーゼインヒビ
   ターの定量方法。