JPS60171460A - アミラ−ゼを用いた抗原決定基具有物質の測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 あるいは各種疾患に由来する微量成分などを測定する方
法に関するものである。

血清、尿などの体液に含まれる微量成分の分析は病気の
診断あるいは治療経過の判定などに非常に有意義であり
、日常の臨床検査に活用されている。ところが、これら
の体液には多種多様の成分が含まれており、そのなかに
は、分子量の近似した物質、生理活性の似た物質あるい
は構造の近似した物質なども含まれていることも多い。

そこで、この分析法は特異性が高く、かつ微少量まで定
量しうろことが要求される。さらに、日常検をとして利
用されるために、簡便かつルーチン化しうろことが望ま
しい。

このような条件を備えた分析法として免疫学的測定法が
ある。この方法は、抗原−抗体間の高い親和性と、抗体
が抗原決定基を判別する高い特異性を利用しており、ラ
ジオイムノアッセイ、酵素免疫測定法、血球等の凝集反
応を利用した方法等に大別される。

ラジオイムノアッセイは、感度はすぐれているが、人体
に有害である放射性物質を用いるところから使用場所や
使用量が厳しく規制されており、特殊な施設を必要とす
る。一方、酵素免疫法はこのような問題はないが、ラジ
オイムノアッセイもそうであるが、遊離標識物と結合標
識物の分離が必要である。そして、この分離操作は、非
常に繁雑であり、操作及び測定誤差の両面で問題になっ
ていた。血球等の凝集反応を利用した方法の場合にはこ
の分離操作は必要ないが、この方法は感度が低く、数ｎ
　ｇ　−ｐ　ｆｌのような極微（社）を測定することは
困難である。

本発明者らは上記のような欠点のない１ｌｌｌＪ　ｕ方
法を開発すべく種々検討の結果、水に不溶性の高分子物
質を基質とする酵素に抗原決定基具有物質を結合させ、
この抗原決定基具有物質と測定対象たる抗原決定基具有
物質とを抗体に対して競争反応させ、その後この結合物
の酵素活性を測定すると測定対象たる抗原決定基具有物
質の量に応じて酵素活性が顕著に低下することを見出し
、この方法を用いれば抗原決定基具有物質を高感度で、
かつ前述の分離操作を行なわないで簡便に測定しうろこ
とを見出して、この内容を特許出願（特願昭５８〜２１
７１４５号）した。そして、さらに検討を進め、酵素と
してアミラーゼを用いた場合に抗原決定基具有物質を最
も高感度で測定できることを見出したが、ヒト血清等の
高等動物由来の検体には通常アミラーゼ゛が含まれてい
るだめ測定におけるブランク値が高くなって測定誤差が
大きくなるという問題を生じた。そこで、このブランク
値を低下させるために検体中のアミラーゼを予め失活さ
せる方法及び検体を希釈する方法を検討したが、前者の
場合にはアミラーゼを失活させるために検体を加熱処理
、酸アルカリ処理等する際に測定対象の抗原決定基具有
物質も変性ある層は分解されてしまうことがあり、後者
の場合には感度が低下してしまうだめこれらの方法はい
ずれも不適当であった。さらに、これらの方法は、操作
が繁雑であるため、簡便な測定法の開発を目指す本発明
者らの意図にそぐわないものであった。

そこで、本発明者らは、簡便さと高感度を損なわずにこ
のブランク値を低下させる方法を開発すべくさらに検討
の結果、高等動物由来のアミラーゼを特異的に阻害する
アミラーゼインヒビターを使用することによってこの目
的を達成しうろことを見出し、本発明を完成するに至っ
た。

すなわち、本発明は、高等動物由来のアミラーゼを含有
している検体の抗原決定基具有物質（１）を測定する方
法において、該抗原決定基具有物質（１）と、この抗原
決定基具有物質（１）と少なくとも−の抗原決定基を共
通にする抗原決定基具有物質（２）と検体に実質的に含
まれてい１１’／７　ミラーゼとの結合物を、前記の共
通の抗原決定基と反応する抗体と接触せしめて反応させ
、前記の高等動物由来のアミラーゼには、このアミラー
ゼの活性を１１１　害する（５） ターを接触せしめて反応させ、さらに、前記の結合物に
結合されているアミラーゼが作用しうる水に不溶性の高
分子物質に前記の結合物を接触せしめて酵素反応させ、
アミラーゼ活性を測定することを特徴とする、抗原決定
基具有物質の測定方法に関するものである。

本発明の方法で測定される検体は高等動物由来のアミラ
ーゼを含有するものである。高等動物由来のアミラーゼ
とは例えば膵臓アミラーゼ、唾液アミラーゼなどであり
、このようなアミラーゼを含有する検体も通常は高等動
物由来のものである検体の種類は限定されないが、例え
ば血清、尿などである。血清、尿などの場合には、通常
は特別な前処理を必要とせず、その１ま測定を行なうこ
とができる。

測定対象である抗原決定基具有物質（１）（以下リガン
ド１という。）は抗原決定基を−又は二以上有している
ものであり、例えば、各種内分泌腺に（６） 由来スルホルモン類、免疫グロブリン、アルブミン、フ
ェリチン等の血漿蛋白質、ＨＢ抗原等のウィルス、バク
テリア類、α−フェトプロティン、癌胎児性抗原等の各
種臓器あるいは血中、尿中に存在する抗原などである。

このようなりがンド１の種類は問わないが、本発明の方
法は、特に高分子のものに対して威力を発揮し、例えば
分子附が１万以上のものを高感度で測定することができ
る。

結合物を構成している抗原決定基具有物質（２）（以下
、リガンド２という。）はりがンド１と少なくとも−の
抗原決定基が共通していなければならない。リガンド２
の抗原決定基は１以」二がリガンド１と共通であればよ
く、全てが共通であってもよい。従って、りがンド２は
リガンド１と同一であってもよい。

結合物を構成しているアミラーゼはα−アミラーゼ、β
−アミラーゼ、グルコアミラーゼなどであり、検体中に
実質的に含まれていないものであって、かつ後述するア
ミラーゼインヒビターの阻害活性が検体中のアミラーゼ
に対する阻否活性よりも低いものである。このようなア
ミラーゼは検体の種類及びアミラーゼインヒビターの種
’ｌＪ４ナトに応じて異なるが、例えば麦芽由来のジア
スターセ及ヒβ−アミラーゼ、糸状菌由来のタカ・ゾア
スターセ、バチルス層細菌由来のアミラーゼ、などから
適宜選択すればよい。

アミラーゼとりガント２との結合方法は双方の官能基を
考慮して決定すればよい。官能基は、アミン基、カルボ
キシル基、水酸基、チオール基、イミダゾール基、フェ
ニル基などを利用することができ、例えばアミノ基相互
間を結合させる場合には、ジイソシアネート法、グルタ
ルアルデヒド法、ジフルオロベンゼン法、ベンゾキノン
法等数多く知られている。また、アミン基とカルボキシ
ル基との間を結合させる方法としては、カルボキシル基
をサクシンイミドエステル化する方法のほかカルボジイ
ミド法、ウッドワーＦ°試薬法等が知られており、アミ
ン基と糖鎖を架橋する過ヨウ素酸酸化法（Ｎａｋａｎｏ
法）もある。チオール基を利用する場合には、例えばも
う一方の側のカルボキシル基をサクシンイミドエステル
化してこれにシスティンを反応させてチオール基を導入
し、チオール基反応性二価架橋試薬を用いて双方を結合
することができる。フェニル基を利用する方法としては
ソアゾ化法、アルキル化法などがある。結合方法はこれ
らの例示に限られるものではなく、このほか例えばｒ　
Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄＩ
ｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉ　５ｔｒｙ　Ｊあるいは「酵素免
疫測定法」等の放置に記載されている方法のなかから適
宜選択して利用することができる。結合比は１：１に限
らず、目的に応じて任意の比率をとることができること
はいうまでもない。反応後は、グル濾過法、イオン交換
クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィ
ーなどを適宜組み合わせて精製を行ない、必要により凍
結乾燥法等で乾燥する。

抗体はりガント１と反応するものでなければならず、リ
ガンド２はこの抗体と反応するものでなければならない
。すなわち、リガンド１とリガンド２とは少なくとも−
の抗原決定基が共通していなければならず、抗体はこの
共通の抗原決定基に（９） 対するものでなければならない。この抗体にはＦ（ａｂ
’）２ｒ　Ｆａｂ’　＋　Ｆ’ａｂなどのフラグメント
も含まれる。

抗体の製造方法としては、リガンド１もしくはりガント
２又はこれらのいずれかと蛋白との結合物を兎、山羊、
馬、モルモット、ニワトリなどの温血動物に体重ｌ　ｋ
ｇあたり０．３〜２ｍｇを１〜数回背中皮下、フットパ
ッド、大腿筋等にアジュバントとともに注射して当該動
物の体内に形成させる。

この抗体は血清をそのまま用いてもよく、血清から抗体
すなわち免疫グロブリンを採取する公知の方法によって
精製してから用いてもよい。

一方、この抗体はモノクローナル抗体として取得するこ
ともできる。その場合には、マウスに前記のいずれかの
抗原をアジュバントとともに数回腹腔等に注射し、肺臓
細胞を取り出してポリエチレングリコール等を用いてマ
ウスミエローマ細胞と融合させる。そして、この融合細
胞のなかから当該抗体を産生ずるものをクローニングに
よってモノクローン細胞として増殖させ、マウス腹腔中
（１０） で増殖させることによって単一抗体、すなわちモノクロ
ーナル抗体を大量に製造することができる。

抗体を結合物のりガント２と反応させても高分子物質に
対するアミラーゼ活性の低下が不充分な場合には抗体を
予め高分子化しておいてもよい。

高分子化の方法としては分子量が１０万ダルトン以上で
かつ水溶性の高分子化合物を結合させればよい。高分子
化合物の例としては、可溶性デキストラン、カルボキシ
メチル化デキストラン、アミン化デキストラン、アミロ
ース等の多糖類及びその誘導体、ゼラチン、ヘモシアニ
ン、フェリチン等の蛋白質、ポリエチレングリコールな
どを挙げることができる。結合方法は前述のアミラーゼ
とりガント２との結合方法のなかから適宜選択すればよ
い。

検体に含まれるリガンド１と、リガンド２と前記のアミ
ラーゼとの結合物を溶液中で前記の抗体と接触させる。

その際、溶液の温度は２０〜４５℃程度、そしてＰＨは
通常４〜８．５程度が適当である。ＰＨを一定に保つた
めに、必要により、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液などの緩
衝液を用いてもよい。

その際、結合物の適当な量は、その種類、リガンド１の
種類、あるいは接触時の条件などによって異なるので予
め試験をして定めるのがよい。抗体とりガント１及び結
合物との接触時間はいずれも、通常は充分に反応しうる
程度がよく、例えば３７℃の場合には２０〜６０分間程
度が適当である。

抗体に対するリガンｌ’　１及び結合物の接触順序は問
うところでは々く、いずれが先であってもあるいは同時
であってもよい。

抗体を結合物のりガント２と反応させても高分子物質に
対するアミラーゼ活性の低下が不充分な場合に、前述の
ように予め抗体を高分子化するかわりに、抗体を結合物
のリガンド２と反応させてからさらに第２抗体と反応さ
せて抗体を高分子化してもよい。この場合、第２抗体は
りガント１及び２の抗体を抗原として前述の抗体の取得
方法に準じて取得することができる。

一方、検体に含まれている高等動物由来のアミラーゼに
は、このアミラーゼを阻害する程度が前記の結合物に結
合されているアミラーゼの活性を阻害する程度より大き
いアミラーゼインヒビターを接触させる。

このアミラーゼインヒビターは検体に含まれているすべ
てのアミラーゼを失活させかつ結合物に結合されている
アミラーゼを全く阻害しないものが最も望ましいことは
いうまでもないが、実用上は検体中の主たるアミラーゼ
を失活させうるものであれば足りる場合が多い。との失
活は要は測定時においてブランク値を上昇させなければ
よく、測定後にアミラーゼインヒビターが失活するなど
してこのアミラーゼ活性が回復してもよい。このアミラ
ーゼインヒビターの作用が問題になるもう一方の、検体
に実質的に含まれていないアミラーゼはりガント２に結
合されている状態のものであり、遊離状態ではアミラー
ゼインヒビターニヨって失活するものであってもよい。

このようなアミラーゼインヒビターの例としては唾液ア
ミラーゼ及び膵臓アミラーゼの両方を阻害する小麦由来
のアミラーゼインヒビター（Ｍ、Ｄ、Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌ
ｌ　＠ｔａ＋、。

（１３） Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ＋　Ｖｏｌ
、４２２＋　ｐｐ　１５９−１６９（１，９７６））、
唾液アミラーゼを優先的に阻害する小麦由来のアミラー
ゼインヒビター５ａｉｎ　（特Ｍ　昭５８−８５８９９
号公報）及び膵臓アミラーゼを優先的に阻害するストレ
プトミセス属の放線菌が産生ずルアミラーゼインヒビタ
ーＡＩ−Ｂ　（％開昭５７−２６８４号公報）などがあ
る。そのほか、検体に含まれている高等動物由来のアミ
ラーゼを異種動物に投与してその抗体を取得し、これを
アミラーゼインヒビターとして用いることもできる。

抗体の取得方法は前述のリガンド１及びリガンド２に対
する抗体の取得方法と同様にして取得することができる
。これらは単独で用いてもよく、併用してもよい。

検体中のアミラーゼにこのようなアミラーゼインヒビタ
ーを接触させる際の溶液の温度及びＰＨは通常は前述の
りガント１と結合物を抗体に接触させる条件と同一でよ
い。また、アミラーゼインヒビターの添加量もその種類
、検体中のアミラーゼの種類と量、結合物を構成してい
るアミラーゼの（１４） 種類、あるいは接触させる条件かとによって異なるので
予め試験をして定めるのがよい。アミラーゼインヒビタ
ーの添加時期は、検体中のアミラーゼによる後述する水
に不溶性の高分子物質の分解を実質的に防止できればよ
く、通常はこの高分子物質の添加前に添加すればよい。

しかしながらＪ般にアミラーゼインヒビターによるアミ
ラーゼ阻害作用はアミラーゼによる基質の分解速度より
もはるかにはやいのでアミラーゼインヒビターヲ高分子
物質と同時あるいは多少遅れて添加してもよい。

抗体と反応させた結合物は高分子物質に接触させて反応
させる。

高分子物質と接触させる結合物は反応物から分離したも
のでもよいが、通常は反応物に含まれている状態のまま
でよい。

この高分子物質は結合物のアミラーゼが反応しうるもの
であり、通常はアミラーゼの基質であるが、水に不溶性
であるところに特徴がある。すなわち、高分子物質が不
溶性であるために結合物のアミラーゼ部分との接触の大
部分が固−液間になり、その結果、アミラーゼの高分子
化による立体障害が大きく現われる。本発明者らはこの
ことを確認するためにペンタオースを用いて測定を行な
い、不溶性デンプンを用いた場合と比較したところ、前
者の場合にはアミラーゼ活性の低下がほとんど認められ
なかったのに対し、後者の場合にはアミラーゼ活性が顕
著に低下した。高分子物質の例としては、不溶性デンプ
ンなどがある。この高分子物質はそれ自身が可溶性であ
っても、不溶性の担体に固定化するとか重合させるなど
して不溶化して用いることもできる。この方法の例とし
ては、アガロ−スケ゛ルに２活させる方法がある。

高分子物質に結合物のアミラーゼを作用させる条件はこ
のアミラーゼの理化学的性質などに応じて適当になるよ
うに定めればよい。

アミラーゼを作用させたのちはアミラーゼの活性をめる
。この活性は、この酵素反応による分解物の増加、原料
である高分子物質の減少、その他、この酵素反応による
糸の変化を追跡すればよいＯ 本発明の方法は、リガンド１を特異性高くかつ極めて高
感度で測定できる。また、操作が簡単であり、安価かつ
容易にリガンド１を定量することが可能である。本発明
の方法はりガント１の種類を問わず測定できるが比較的
高分子の測定に威力を発揮する。

これまでジゴキシンやテオフィリン等の低分子・ぐブテ
ンを酵素に結合させてその変化を測定する方法は報告さ
れているが、分子量が１万以上の抗原について＋Ｊ年単
位るいはそれ以下の極微量を測定する方法は全く報告さ
れておらず、極めて困難であると考えられていた。しか
るに、本発明者らはアミラーゼの利用と固−液反応の導
入によって立体障害を活用して高分子の抗原を高感度で
測定することに成功したものであり、従来、μｇＡｌの
レベルまでしか測定しえなかった高分子抗原を本発明の
方法によってｒｌ〜ｐ　ｌ／ＡＩＬｌ　程度にまで測定
できるように、なった。

以下、実施例を示す。

（１７） 実施例１ ■　ＣＨＭ化アミラーゼの調製 バチルス・ズブチリスアミラーゼ１　ｍｇを１０ｍＭｏ
−フェナントロリンを含有するｐＨ６，３の０．１Ｍリ
ン酸緩衝液１　ｍｌに溶かし、４−（マレイミドメチル
シクロヘキサン−１−カルボン酸）サクシンイミドエス
テル（ＣＨＭＳ　）　２　ｍ９Ａｔｔｌのツメチルホル
ムアミド（ＤＭＦ　）溶液１００μｔを加えて室温で１
時間放置して反応させた。この反応液をセファデックス
Ｇ−２５のカラムに入れ、ｐＨ６，３の０，１Ｍリン酸
緩衝液を流してケ°ル沖過を行ない、素通り分画を分取
した。

■　ＳＨ化α−フェトプロティンの調製α−フェトプロ
ティン５　ｍ９　′ｆ：５　ｍＭ　ＥＤＴＡを含むｐＨ
７，５の０．１　Ｍ　ＩＪン酸緩衝液に溶かし、これに
Ｓ−アセチルメルカプトコノ・り酸無水物９４勺のＤＭ
Ｆ溶液１００μｔを加えて３７℃で１時間反応させた。

この反応液に１Ｍヒドロキシルアミン水溶液（ＰＨ７，
５）１１０μｔを加え、３７℃で３０分間加温した。続
いて、セファデックスＧ−２５１（１８） 用いてケゝル沖過し、素通り分画を分取した。

■　アミラーゼ−α−フェトプロティン結合物の調製 前記のＣＨＭ化アミラーゼ溶液とＳＨ化α−フェトプロ
ティン溶液を混合し、１ｍｌまで濃縮後４℃で一夜放置
して反応させた。反応液を七フアクリルＳ−３００を充
填しだカラムに入れ、ｐＨ７，Ｑの２０　ｍＭ　’）ン
酸緩衝生理食塩溶液を流してケ゛ル沖過を行ない、１：
３に結合した結合物の分画を分取した。

■　ヒトα−フェトプロティンの測定 濃度０〜２０００　ｎ、９のα−フェトプロティン溶液
５０μｔに、■で調製した結合物溶液にポリエチレング
リコール６０００を５％含有せしめた溶液５０μを並び
に小麦由来のアミラーゼインヒビター混合物１００μ９
／ｒｎｌ及び抗ヒトα−フェトプロティンヤギＩｇＧ　
８μｍ１／ｒｒｔｌを含有する溶液５０μｔｆ加えて２
０分間反応させた。反応液にブルースターチ懸濁液１．
　Ｏｒｒｔｌを加えて３７℃で２０分間さらに反応させ
、０．５　Ｎ’ＮａＯＨ１ｍｌを加えて反応を停止させ
た。これを攪拌後、３５００ｒｐｍで２分間遠心し、得
られた」二清の６２０　ｎｍにおける吸光度を測定した
。

得られた吸光度とヒトα−フェトプロティンの濃度との
関係を示す検量線を第１図に示す。

次に、ヒト血清をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で
希釈して２ｎ希釈列をつくり、各５０μｔづつを小試験
管に入れた。これに■で調製した結合物溶液にポリエチ
レングリコール６０００を１０％含有せしめだ液５０μ
を並びに小麦由来のアミラーゼインヒビター混合物１０
０μｇＡｎｌを含有しあるいは含有しない８μｇ　Ａｎ
ｌの抗ヒトα−フェトプロティンヤギＩｇＧ溶液５０μ
ｔを加え、３７℃で２０分間反応させた。この反応液に
ブルースターチ懸濁液１．０／Ｉｌｌを加えて３７℃で
２０分間さらに反応させ、０．５Ｎ　ＮａＯＨ１ｍｌを
加えて反応を停止させた。これを攪拌後３５００　ｒｐ
ｍで２分間遠心し、上清液の６２０ｎｍの吸光度を測定
した。

得られた結果を第２図に示す。尚、図中黒丸はアミラー
ゼインヒビターを添加した場合を表わし、白丸は添加し
なかった場合を表わしている。図に示すようにインヒビ
ターを添加しなかった場合には血清自体に含まれるアミ
ラーゼ活性分だけ吸光度が高くなっており、３２倍に希
釈してもまだ幾分高りなっている。これに対してインヒ
ビターを添加した本発明法においてはそのようなことが
なく、希釈やブランクなしに正確な値を得ることができ
た。

実施例２ ■　Ｃ）ｆＭ化アミラーゼの調製 バチルス・ズブチリスアミラーゼ５　ｍｇをＰＨ６，３
の０．１Ｍリン酸緩衝液１　ｍｌに溶かし、ＣＨＭＳ　
２ｍｇ／ｌｎｌのＤＭＦ溶液１００μｔを加えて室温で
１時間放置して反応させた。この反応液をセファデック
スＧ−２５のカラムに入れ、ｐＨ６，３の０．１　Ｍ　
ＩＪン酸緩衝液を流してケ゛ル濾過を行ない、素通り分
画を分取した。

■　ヒトＩｇＧ　Ｆ　（ａｂ’）２の調製ヒトＩｇＧ１
０Ｉｎｙを０，１Ｍ酢酸緩衝液（ｐ”４．０）２ｍｌに
ベゾシン３００　μｌｌを加え、３７℃で１８時間攪拌
した。０．　Ｉ　ＮＮａＱ）（を加えてＰＨを６０に調
節しく２１） この反応液を予め０．１　Ｍ　！Ｊン酸緩衝１　ｍＭ　
ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ６，３）で緩衝化した七フアクリル
Ｓ−３００ケ９ルカラムに入れ、上記のリン酸緩衝液で
溶出した。分子量約１０万付近に溶出されたピーク部分
を集めて１　ｎｒｌに濃縮し、目的のヒトＩｇＧ　Ｆ　
（ａｂ’）２を得た。

■　α−アミラーゼヒ）　ＩｇＧ　Ｆａｂ’結合物結合
膜■で調製したヒトＩｇＧ　Ｆ（ａｂ’）２６　ｍｌを
含む０．１Ｍリン酸緩衝１　ｍＭ　ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ
６，０）　１　ｍｌに１０■／ｍ１（Ｄ２−メルカプト
エチルアミン塩酸塩水溶液１００μｔを加え、３７℃で
９０分間攪拌した。

この反応液を予め０．１　Ｍ　ＩＪン酸緩衝液（ｐＨ６
，３）で緩衝化したセファデックスＧ−２５カラムでグ
ルｐ過して未反応の２−メルカゾトメチルアミンを除去
し、Ｈ８−Ｆａｂ’を得だ。これに■で調製したＣＨＭ
化α−アミラーゼ２ｍｙを加え、３７℃で９０分間反応
させた。次にこの反応液を０．１Ｍ酢酸緩衝５　ｍＭ塩
化カルシウム溶液（ｐＩ（６，０）で緩衝化した七フア
クリルＳ−３００カラムでケ９ル濾過して分子量２０万
以上の分画を集め、これを濃縮して目（２２） 的の結合物を得た。

■　ヒトＩｇＧの測定 濃度０〜３１２５μｊｌＡｌのヒトＴｇＧ溶液５０μｔ
に■で調製した結合物溶液にぼりエチレングリコール６
０００を１０％含有せしめた溶液５０ｔｔｔ並びにスト
レプトミセス・ビリトスポラスＡ２９７−Ａ２ＦＥＲＭ
−Ｐ５４０５の産生ずるアミラーゼインヒビター１００
　μｆ／Ａｌ及び抗ヒ）　ＴｇＧ　ヤ−ｔ’　ＴｇＧ　
Ｉ　ＯＯｉｔｇ／ｍｅを含有する溶液５０μｔを加えて
２０分間皮広させた。反応液にブルースターチ懸濁液］
、　Ｏｍｇを加えて３７℃で１０分間さらに反応させ、
０．５　ＮＮａＯＨ１ｎｉｌを加えて反応を停止させた
。これを攪拌後、３５００ｒｐｍで２分間遠心し、得ら
れた上清の６２０ｎｍにおける吸光度を測定した。

得られた吸光度とヒトＴｇＧの濃度との関係を示す検量
線を第３図に示す。

実施例３ ■　ＣＨＭ化アミラーゼの調製 バチルス・ズブチリスアミラーゼ１　ｍｇをｐＨ６，３
１７）　０．１　Ｍリン酸緩衝液１　ｔｒｔｅに溶かし
、ＣＨＭＳ　２　ｍ９Ａ／ＬｇのＤＭＦ溶液１００μｔ
を加えて室温で１時間放置して反応させた。この反応液
をセファデックスＧ−２５０カラムに入れ、ｐＨ６，３
の０．１　Ｍ　ＩＪン酸緩衝液を流してケ゛ル濾過を行
ない、素通シ分画を分取した。

■　ＳＨ化ＩｇＥの調製 ヒトＴｇＥ５ｍ９を５　ｍ　ＭＥＤＴＡを含むｐＨ７，
５のｏＩＭ　ＩＪン酸緩衝液に溶かし、これにＳ−アセ
チルメルカプトコハク酸無水物９豫匂のＤＭＦ溶液１０
０μｔを加えて３７℃で１時間反応させた。この反応液
にＩＭヒドロキシルアミン水溶液（ｐＨ７，５）■１０
μｔを加え、３７℃・で３０分間加温した。続いて、セ
ファデックスＧ−２５を用いてダル沖過し、素通り分画
を分取した。

■　アミラーゼ−ＩｇＥ結合物の調製 前記のＣＨＭ化アミラーゼ溶液とＳＨ化Ｌ　ｌ−ＩｇＥ
溶液を混合し、１　ｎｔｌまで濃縮後４℃で一夜放置し
て反応させた。反応液を七フアクリルＳ−３００を充填
したカラムに入れ、ｐＨ７，０の２０　ｍＭ　リン酸緩
衝生理食塩浴液を流してケ゛ル沖過を行ない、１：２に
結合した結合物の分画を分取した。

■　ヒトＩｇＥの測定 ＩＯμｇ／ａｌのこの結合α−アミラーゼ溶液５０μｔ
にＰＢＳで２ｎ希釈したヒト血清５０μｔを加え、ヒト
血清アミラーゼの酵素作用を阻害させるだめ、５００μ
９７ｍ１の抗ヒトアミラーゼヤギＩｇＧ　５０μｔを加
え、さらに１０μｆｉＡｌ抗ヒトＩｇＥヤギＩｇＧ５０
μｔを加えて３７℃で３０分間反応させた。この反応液
１００μｔを、ポリスチレンフイ）レム１上に陽イオン
交換樹脂２、反射層３、ブル−スターチ４の順に積層し
た第４図に示す多層フイ）レム上に滴下し、室温２０分
後のアミラーゼ活性をリフラクトメータ−で測定した。

゛　得られた反射強度とヒ）　ＩｇＥ濃度との関係を第
５図に示す。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の方法で測定して得られだα−フェトプ
ロティンの検量線であり、第２図はヒト血清の希釈率と
吸光度の関係をアミラーゼインヒビターを添加した場合
（黒丸）と添加しなかった場合（白丸）について測定し
た結果を示すもので（２５） ある。第３図は本発明の方法で測定して得られだヒ）Ｉ
ｇＧについての検量線である。第４図は測定の一例で使
用した多層フィルムの構成を示すものであり、第５図は
この多層フィルムを用いて測定したヒト血清の希釈率と
相対反射強度との関係を示すものである。 特許出願人　富士レビオ株式会社 代理人　弁理士田中政浩 （２６）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 高等動物由来のアミラーゼを含有している検体の抗原決
   定基具有物質（１）を測定する方法において、 該抗原決定基具有物質（１）と、この抗原決定基具有物
   質（１）と少なくとも−の抗原決定基を共通にする抗原
   決定基具有物質（２）と検体に実質的に含まれていない
   アミラーゼとの結合物を、前記の共通の抗原決定基と反
   応する抗体と接触せしめて反応させ、 前記の高等動物由来のアミラーゼには、このアミラーゼ
   の活性を阻害する程度が前記の結合物に結合されている
   アミラーゼの活性を阻害する程度より大きいアミラーゼ
   インヒビターを接触せしめて反応させ、 さらに、前記の結合物に結合されているアミラーゼが作
   用しりろ水に不溶性の高分子物質に前記の結合物を接触
   せしめて酵素反応させ、アミラーゼ活性を測定すること
   を特徴とする、 抗原決定基具有物質の測定方法