JPS60171461A - アミラ−ゼを用いた抗原決定基具有物質測定法 - Google Patents
アミラ−ゼを用いた抗原決定基具有物質測定法Info
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- JPS60171461A JPS60171461A JP2771084A JP2771084A JPS60171461A JP S60171461 A JPS60171461 A JP S60171461A JP 2771084 A JP2771084 A JP 2771084A JP 2771084 A JP2771084 A JP 2771084A JP S60171461 A JPS60171461 A JP S60171461A
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- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
あるいは各種疾患に由来する微量成分などを測定する方
法に関するものである。
法に関するものである。
血清、尿などの体液に含まれる微量成分の分析は病気の
診断あるいは治療経過の判定などに非常に有意義であり
、日常の臨床検査に活用されている。ところが、これら
の体液には多種多様の成分が含まれており、そのなかに
は、分子量の近似した物質、生理活性の似た物質あるい
は構造の近似した物質なども含捷れていることも多い。
診断あるいは治療経過の判定などに非常に有意義であり
、日常の臨床検査に活用されている。ところが、これら
の体液には多種多様の成分が含まれており、そのなかに
は、分子量の近似した物質、生理活性の似た物質あるい
は構造の近似した物質なども含捷れていることも多い。
そこで、この分析法は特異性が高く、かつ微少量まで定
量しうろことが要求される。さらに、日常検査として利
用されるために、簡便かつルーチン化しうろことが望ま
しい。
量しうろことが要求される。さらに、日常検査として利
用されるために、簡便かつルーチン化しうろことが望ま
しい。
このような条件を備えた分析法として免疫学的測定法が
ある。この方法は、抗原一抗体間の高い新和性と、抗体
が抗原決定基を判別する高い特異性全利用しており、ラ
ジオイムノアッセイ、酵素免疫測定法、血球等の凝集反
応全利用した方法等に大別される。
ある。この方法は、抗原一抗体間の高い新和性と、抗体
が抗原決定基を判別する高い特異性全利用しており、ラ
ジオイムノアッセイ、酵素免疫測定法、血球等の凝集反
応全利用した方法等に大別される。
ラノオイムノアッセイは、感度はすぐれているが、人体
に有害である放射性物質を用いるところから使用場所や
使用量が厳しく規制されており、特殊な施設を必要とす
る。一方、酵素免疫法はこのような問題はないが、ラノ
オイムノアッセイもそうであるが、遊離標識物と結合標
識物の分離が必要である。、そして、この分離操作は、
非常に繁雑であり、操作及び測定誤差の両面で問題にな
っていた。面球等の凝集反応を利用した方法の場合には
この分離操作は必要ないが、この方法は感度が低く、数
＋Ｊ〜ｐ、９のような極微量を測定することは困難であ
る。
に有害である放射性物質を用いるところから使用場所や
使用量が厳しく規制されており、特殊な施設を必要とす
る。一方、酵素免疫法はこのような問題はないが、ラノ
オイムノアッセイもそうであるが、遊離標識物と結合標
識物の分離が必要である。、そして、この分離操作は、
非常に繁雑であり、操作及び測定誤差の両面で問題にな
っていた。面球等の凝集反応を利用した方法の場合には
この分離操作は必要ないが、この方法は感度が低く、数
＋Ｊ〜ｐ、９のような極微量を測定することは困難であ
る。
本発明者らは上記のような欠点のない測定方法を開発す
べく種々検討の結果、水に不溶性の高分子物質を基質と
する酵素に測定対象たる抗原決定基具有物質に対する抗
体を結合させてこの結合物の抗体に測定対象の抗原決定
基具有物質全反応させ、その後この結合物の酵素活性を
測定すると測定対象たる抗原決定基具有物質の量に応じ
て酵素活性が顕著に低下すること全見出し、この方法を
用いれば抗原決定基具有物質を高感度で、かつ前述の分
離操作を行なわないで簡便に測定しうろことを見出して
その内容を特許出願（特願昭５８−２３１２４１号）し
た。そして、さらに研究を進め、酵素としてアミラーゼ
を用いた場合に抗原決定基具有物質を最も高感度で測定
できることを見出したが、ヒト血清等の高等動物由来の
検体には通常アミラーゼが含まれているため測定におけ
るブランク値が高くなって測定誤差が大きくなるという
問題を生じた。そこで、このブランク値を低下させるた
めに検体中のアミラーゼを予め失活させる方法及び検体
を希釈する方法を検討したが、前者の場合にはアミラー
ゼを失活させるために検体を加熱処理、酸アルカリ処理
等する際に測定対象の抗原決定基具有物質も変性あるい
は分解されてし捷うことがあり後者の場合には感度が低
下してしまうためこれらの方法はいずれも不適当であっ
た。
べく種々検討の結果、水に不溶性の高分子物質を基質と
する酵素に測定対象たる抗原決定基具有物質に対する抗
体を結合させてこの結合物の抗体に測定対象の抗原決定
基具有物質全反応させ、その後この結合物の酵素活性を
測定すると測定対象たる抗原決定基具有物質の量に応じ
て酵素活性が顕著に低下すること全見出し、この方法を
用いれば抗原決定基具有物質を高感度で、かつ前述の分
離操作を行なわないで簡便に測定しうろことを見出して
その内容を特許出願（特願昭５８−２３１２４１号）し
た。そして、さらに研究を進め、酵素としてアミラーゼ
を用いた場合に抗原決定基具有物質を最も高感度で測定
できることを見出したが、ヒト血清等の高等動物由来の
検体には通常アミラーゼが含まれているため測定におけ
るブランク値が高くなって測定誤差が大きくなるという
問題を生じた。そこで、このブランク値を低下させるた
めに検体中のアミラーゼを予め失活させる方法及び検体
を希釈する方法を検討したが、前者の場合にはアミラー
ゼを失活させるために検体を加熱処理、酸アルカリ処理
等する際に測定対象の抗原決定基具有物質も変性あるい
は分解されてし捷うことがあり後者の場合には感度が低
下してしまうためこれらの方法はいずれも不適当であっ
た。
さらに、これらの方法は、操作が繁雑であるため、簡便
な測定法の開発を目指す本発明者らの意図にそぐわない
ものであった。
な測定法の開発を目指す本発明者らの意図にそぐわない
ものであった。
そこで、本発明者らは、簡便さと高感度を損なわずにこ
のブランク値を低下させる方法全開発すべくさらに検討
の結果、高等動物由来のアミラーゼを特異的に阻害する
アミラーゼインヒビター全使用することによってこの目
的を達成しうろことを見出し、本発明を完成するに至っ
た。
のブランク値を低下させる方法全開発すべくさらに検討
の結果、高等動物由来のアミラーゼを特異的に阻害する
アミラーゼインヒビター全使用することによってこの目
的を達成しうろことを見出し、本発明を完成するに至っ
た。
すなわち、本発明は、高等動物由来のアミラーゼを含有
している検体の抗原決定基具有物質を測定する方法にお
いて、該抗原決定基具有物質と、この抗原決定基具有物
質に対する抗体と検体に実質的に含まれていないアミラ
ーゼとの結合物を接触せしめて反応させ、前記の高等動
物由来のアミラーゼには、このアミラーゼの活性を阻害
する程度が前記の結合物に結合されているアミラーゼの
活性全阻害する程度より大きいアミラーゼインヒビター
を接触せしめて反応させ、さらに、前記の結合物に結合
されているアミラーゼが作用しりろ水に不溶性の高分子
物質に前記の結合物を接触せしめて酵素反応させ、アミ
ラーゼ活性を測定するｔ へ ） ことを特徴とする、抗原決定基具有物質の測定方法に関
するものである。
している検体の抗原決定基具有物質を測定する方法にお
いて、該抗原決定基具有物質と、この抗原決定基具有物
質に対する抗体と検体に実質的に含まれていないアミラ
ーゼとの結合物を接触せしめて反応させ、前記の高等動
物由来のアミラーゼには、このアミラーゼの活性を阻害
する程度が前記の結合物に結合されているアミラーゼの
活性全阻害する程度より大きいアミラーゼインヒビター
を接触せしめて反応させ、さらに、前記の結合物に結合
されているアミラーゼが作用しりろ水に不溶性の高分子
物質に前記の結合物を接触せしめて酵素反応させ、アミ
ラーゼ活性を測定するｔ へ ） ことを特徴とする、抗原決定基具有物質の測定方法に関
するものである。
本発明の方法で測定される検体は高等動物由来のアミラ
ーゼを含有するものである。高等動物由来のアミラーゼ
とは例えば膵臓アミラーゼ、唾液アミラーゼなどであり
、このようなアミラーゼ全含有する検体も通常は高等動
物由来のものである。
ーゼを含有するものである。高等動物由来のアミラーゼ
とは例えば膵臓アミラーゼ、唾液アミラーゼなどであり
、このようなアミラーゼ全含有する検体も通常は高等動
物由来のものである。
検体の種類は限定されないが、例えば血清、尿などであ
る。血清、尿などの場合には、通常は特別な前処理を必
要とせず、そのまま測定を行なうことができる。
る。血清、尿などの場合には、通常は特別な前処理を必
要とせず、そのまま測定を行なうことができる。
抗原決定基具有物質（以下リガンドという。）は抗原決
定基を−又は二以上有しているものであり、例えば、各
種内分泌腺に由来するホルモン類、免疫グロブリン、ア
ルブミン、フェリチン等の血漿蛋白質、ＨＢ抗原等のウ
ィルス、バクテリア類、α−フェトプロティン、癌胎児
性抗原等の各種臓器あるいは血中、尿中に存在する抗原
などである。
定基を−又は二以上有しているものであり、例えば、各
種内分泌腺に由来するホルモン類、免疫グロブリン、ア
ルブミン、フェリチン等の血漿蛋白質、ＨＢ抗原等のウ
ィルス、バクテリア類、α−フェトプロティン、癌胎児
性抗原等の各種臓器あるいは血中、尿中に存在する抗原
などである。
結合物を構成している抗体はリガンドと反応するもので
なければならない。この抗体にはＦ（ａｂす２゜（６） Ｆａｂ’ 、 Ｆａｂなどのフラグメントも含まれる。
なければならない。この抗体にはＦ（ａｂす２゜（６） Ｆａｂ’ 、 Ｆａｂなどのフラグメントも含まれる。
抗体の製造方法としては、リガンド又はリガンドと蛋白
との結合物を兎、山羊、馬、モルモット、ニワトリなど
の混血動物に体重１１（ｇあたり０．３〜２ｍ９ｆ１〜
数回背中皮下、フット・フッド、大腿筋等にアジュバン
トとともに注射して当該動物の体内に形成させる。この
抗原は血清全そのまま用いてもよく、血清から抗体すな
わち免疫グロブリンを採取する公知の方法によって精製
してから用いてもよい。
との結合物を兎、山羊、馬、モルモット、ニワトリなど
の混血動物に体重１１（ｇあたり０．３〜２ｍ９ｆ１〜
数回背中皮下、フット・フッド、大腿筋等にアジュバン
トとともに注射して当該動物の体内に形成させる。この
抗原は血清全そのまま用いてもよく、血清から抗体すな
わち免疫グロブリンを採取する公知の方法によって精製
してから用いてもよい。
一方、この抗体はモノクローナル抗体として取得するこ
ともできる。その場合には、マウスに前記のいずれかの
抗原をアジュバントとともに数回腹腔等に注射し、肺臓
細胞を取り出してポリエチレングリコール等ヲ用いてマ
ウスミエローマ細胞と融合させる。そして、この融合細
胞のなかから当該抗体を産生ずるものをクローニングに
よってモノクローン細胞として増殖させ、マウス腹腔中
で増殖させることによって単一抗体、すなわちモノクロ
ーナル抗体を大量に製造することができる。
ともできる。その場合には、マウスに前記のいずれかの
抗原をアジュバントとともに数回腹腔等に注射し、肺臓
細胞を取り出してポリエチレングリコール等ヲ用いてマ
ウスミエローマ細胞と融合させる。そして、この融合細
胞のなかから当該抗体を産生ずるものをクローニングに
よってモノクローン細胞として増殖させ、マウス腹腔中
で増殖させることによって単一抗体、すなわちモノクロ
ーナル抗体を大量に製造することができる。
結合物を構成しているアミラーゼはα−アミラーゼ、β
−アミラーゼ、グルコアミラーゼなどであり、検体中に
実質的に含まれていないものであっテ、カつ後述するア
ミラーゼインヒビターノ阻害活性が検体中のアミラーゼ
に対する阻害活性よりも低いものである。このようなア
ミラーゼは検体の種類及びアミラーゼインヒビターの種
類などに応じて異なるが、例えば麦芽由来のジアスター
ゼ及びβ−アミラーゼ糸状菌由来のタカジアスターゼ、
バチルス属細菌由来のアミラーゼ、などから適宜選択す
ればよい。
−アミラーゼ、グルコアミラーゼなどであり、検体中に
実質的に含まれていないものであっテ、カつ後述するア
ミラーゼインヒビターノ阻害活性が検体中のアミラーゼ
に対する阻害活性よりも低いものである。このようなア
ミラーゼは検体の種類及びアミラーゼインヒビターの種
類などに応じて異なるが、例えば麦芽由来のジアスター
ゼ及びβ−アミラーゼ糸状菌由来のタカジアスターゼ、
バチルス属細菌由来のアミラーゼ、などから適宜選択す
ればよい。
アミラーゼと抗体との結合方法は双方の官能基を考慮し
て決定すればよい。官能基は、アミノ基、カルボキシル
基、水酸基、チオール基、イミダゾール基、フェニル基
などを利用することができ、例えばアミノ基相互間を結
合させる場合には、ジイソシアネート法、グルタルアル
デヒド法、ジフルオロベンゼン法、ベンゾキノン法等数
多り知うれている。また、アミノ基とカルボキシル基ト
の間を結合させる方法としては、カルボキシル基金サク
シンイミドエステル化する方法のほかカルボジイミド法
、ウッドワード試薬法等が知られており、アミノ基と糖
鎖を架橋する過ヨウ素酸酸化法（Ｎａｋａｎｅ法）もあ
る。チオール基を利用する場合には、例えばもう一方の
側のカルボキシル基をサクシンイミドエステル化してこ
れにシスティンを反応させてチオール基を導入し、チオ
ール基反応性二価架橋試−薬を用いて双方を結合するこ
とができる。フェニル基を利用する方法としてはジアゾ
化法、アルキル化法などがある。結合方法はこれらの例
示に限られるものではなく、このほか例えばｒＭｅｔｈ
ｏｄ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕ
ｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙＪあるいは「酵素免疫測定法ｊ
等の放置に記載されている方法のなかから適宜選択して
利用することができる。結合比は１：１に限らず、目的
に応じて任意の比率をとることができることはいう寸で
もない。反応後は、ケ゛ル濾過法、イオン交換クロマト
グラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどを
適宜組み合わせて精製を行い、必要により凍結乾燥法等
で乾燥する。
て決定すればよい。官能基は、アミノ基、カルボキシル
基、水酸基、チオール基、イミダゾール基、フェニル基
などを利用することができ、例えばアミノ基相互間を結
合させる場合には、ジイソシアネート法、グルタルアル
デヒド法、ジフルオロベンゼン法、ベンゾキノン法等数
多り知うれている。また、アミノ基とカルボキシル基ト
の間を結合させる方法としては、カルボキシル基金サク
シンイミドエステル化する方法のほかカルボジイミド法
、ウッドワード試薬法等が知られており、アミノ基と糖
鎖を架橋する過ヨウ素酸酸化法（Ｎａｋａｎｅ法）もあ
る。チオール基を利用する場合には、例えばもう一方の
側のカルボキシル基をサクシンイミドエステル化してこ
れにシスティンを反応させてチオール基を導入し、チオ
ール基反応性二価架橋試−薬を用いて双方を結合するこ
とができる。フェニル基を利用する方法としてはジアゾ
化法、アルキル化法などがある。結合方法はこれらの例
示に限られるものではなく、このほか例えばｒＭｅｔｈ
ｏｄ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕ
ｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙＪあるいは「酵素免疫測定法ｊ
等の放置に記載されている方法のなかから適宜選択して
利用することができる。結合比は１：１に限らず、目的
に応じて任意の比率をとることができることはいう寸で
もない。反応後は、ケ゛ル濾過法、イオン交換クロマト
グラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどを
適宜組み合わせて精製を行い、必要により凍結乾燥法等
で乾燥する。
（９）
検体に含捷れるリガンドと、前記の抗体とアミラーゼと
の結合物音溶液中で接触させる。その際、溶液の温度は
２０〜４５℃程度、そしてＰＩ］は通常４〜８．５程度
が適当である。ｐＨ全一定に保つために、必要により、
リン酸緩衝液、酢酸緩衝液などの緩衝液を用いてもよい
。その際、結合物の適当な量は、その種類、リガンドの
種類、あるいは接触時の条件などによって異なるので予
め試験をして定めるのがよい。リガンドと結合物との接
触時間はいずれも、通常は充分に反応しうる程度がよく
、例えば３７℃の場合には２０〜６０分間程度が適当で
ある。
の結合物音溶液中で接触させる。その際、溶液の温度は
２０〜４５℃程度、そしてＰＩ］は通常４〜８．５程度
が適当である。ｐＨ全一定に保つために、必要により、
リン酸緩衝液、酢酸緩衝液などの緩衝液を用いてもよい
。その際、結合物の適当な量は、その種類、リガンドの
種類、あるいは接触時の条件などによって異なるので予
め試験をして定めるのがよい。リガンドと結合物との接
触時間はいずれも、通常は充分に反応しうる程度がよく
、例えば３７℃の場合には２０〜６０分間程度が適当で
ある。
一方、検体に含まれている高等動物由来のアミラーゼに
は、このアミラーゼ全阻害する程度が前記の結合物に結
合されているアミラーゼの活性全阻害する程度より大き
いアミラーゼインヒビターを接触させる。
は、このアミラーゼ全阻害する程度が前記の結合物に結
合されているアミラーゼの活性全阻害する程度より大き
いアミラーゼインヒビターを接触させる。
このアミラーゼインヒビターは検体に含まれているすべ
てのアミラーゼを失活させかつ結合物に結合されている
アミラーゼを全く阻害しないもの（１０） が最も望ましいことはいうまでもないが、実用上は検体
中の主たるアミラーゼを失活させうるものであれば足り
る場合が多い。この失活は要は測定時においてブランク
値を上昇させなければよく、測定後にアミラーゼインヒ
ビターが失活するなどしてこのアミラーゼ活性が回復し
てもよい。このアミラーゼインヒビターの作用が問題に
なるもう一方の、検体−に実質的に含まれていないアミ
ラーゼは抗体に結合されている状態のものであり、遊離
状態ではアミラーゼインヒビターによって失活するもの
であってもよい。このようなアミラーゼインヒビターの
例としては、唾液アミラーゼ及び膵臓アミラーゼの両方
を阻害する小麦由来のアミラーゼインヒビター（Ｍ、Ｄ
、 Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ ｃｔ ａ、ｌ 。
てのアミラーゼを失活させかつ結合物に結合されている
アミラーゼを全く阻害しないもの（１０） が最も望ましいことはいうまでもないが、実用上は検体
中の主たるアミラーゼを失活させうるものであれば足り
る場合が多い。この失活は要は測定時においてブランク
値を上昇させなければよく、測定後にアミラーゼインヒ
ビターが失活するなどしてこのアミラーゼ活性が回復し
てもよい。このアミラーゼインヒビターの作用が問題に
なるもう一方の、検体−に実質的に含まれていないアミ
ラーゼは抗体に結合されている状態のものであり、遊離
状態ではアミラーゼインヒビターによって失活するもの
であってもよい。このようなアミラーゼインヒビターの
例としては、唾液アミラーゼ及び膵臓アミラーゼの両方
を阻害する小麦由来のアミラーゼインヒビター（Ｍ、Ｄ
、 Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ ｃｔ ａ、ｌ 。
Ｂｉｏｃｈｉｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、 Ａｃｔａ、 Ｖ
ｏＬ ４２２ ＋ ｐｐ １５９−１６９（１９７６）
）、唾液アミラーゼを優先的に阻害する小麦由来のアミ
ラーゼインヒビター５ａｉｎ （％開昭５８−８５８９
９号公報）及び膵臓アミラーゼを優先的に阻害するスト
レプトミセス属の放線菌が産生ずるアミラーゼインヒビ
ターＡＩ−Ｂ（特開昭５７−２６８４号公報）などがあ
る。そのほか、検体に含捷れている高等動物由来のアミ
ラーゼヲ毘種動物に投与してその抗体を取得し、これを
アミラーゼインヒビターとして用いることもできる。抗
体の取得方法は前述のりガント に対する抗体の取得方法と同様にして取得することがで
きる。これらは単独で用いてもよく、併用してもよい。
ｏＬ ４２２ ＋ ｐｐ １５９−１６９（１９７６）
）、唾液アミラーゼを優先的に阻害する小麦由来のアミ
ラーゼインヒビター５ａｉｎ （％開昭５８−８５８９
９号公報）及び膵臓アミラーゼを優先的に阻害するスト
レプトミセス属の放線菌が産生ずるアミラーゼインヒビ
ターＡＩ−Ｂ（特開昭５７−２６８４号公報）などがあ
る。そのほか、検体に含捷れている高等動物由来のアミ
ラーゼヲ毘種動物に投与してその抗体を取得し、これを
アミラーゼインヒビターとして用いることもできる。抗
体の取得方法は前述のりガント に対する抗体の取得方法と同様にして取得することがで
きる。これらは単独で用いてもよく、併用してもよい。
検体中のアミラーゼにこのようなアミラーゼインヒビタ
ーを接触させる際の溶液の温度及びＰＨは通常は前述の
りガントを結合物に接触させる条件と同一でよい。また
、アミラーゼインヒビターの添加量もその種類、検体中
のアミラーゼの種類と量、結合物を構成しているアミラ
ーゼの種類、あるいは接触させる条件などによって異な
るので予め試験をして定めるのがよい。アミラーゼイン
ヒビターの添加時期は、検体中のアミラーゼによる後述
する水に不溶性の高分子物質の分解全実質的に防止でき
ればよく、通常はこの高分子物質の添加前に添加すれば
よい、しかしながら一般にアミラーゼインヒビターによ
るアミラーゼ阻害作用はアミラーゼによる基質の分解速
度よりもはるかにはやいのでアミラーゼインヒビターを
高分子物質と同時あるいは多少遅れて添加してもよい。
ーを接触させる際の溶液の温度及びＰＨは通常は前述の
りガントを結合物に接触させる条件と同一でよい。また
、アミラーゼインヒビターの添加量もその種類、検体中
のアミラーゼの種類と量、結合物を構成しているアミラ
ーゼの種類、あるいは接触させる条件などによって異な
るので予め試験をして定めるのがよい。アミラーゼイン
ヒビターの添加時期は、検体中のアミラーゼによる後述
する水に不溶性の高分子物質の分解全実質的に防止でき
ればよく、通常はこの高分子物質の添加前に添加すれば
よい、しかしながら一般にアミラーゼインヒビターによ
るアミラーゼ阻害作用はアミラーゼによる基質の分解速
度よりもはるかにはやいのでアミラーゼインヒビターを
高分子物質と同時あるいは多少遅れて添加してもよい。
リガンドと反応させた結合物は高分子物質に接触させて
反応させる。
反応させる。
高分子物質と接触させる結合物は反応物から分離したも
のでもよいが、通常は反応物に含まれている状態のまま
でよい。
のでもよいが、通常は反応物に含まれている状態のまま
でよい。
この高分子物質は結合物のアミラーゼが反応しうるもの
であり、通常はアミラーゼの基質であるが、水に不溶性
であるところに特徴がある。すなわち、高分子物質が不
溶性であるために結合物のアミラーゼ部分との接触の大
部分が同一液間になり、その結果、アミラーゼの高分子
化による立体障害が大きく現われる。本発明者らはこの
ことを確認するためににンタオースを用いて測定を行な
い、不溶性デンプンを用いた場合と比較したところ前者
の場合にはアミラーゼ活性の低下がほとんど認められな
かったのに対し、後者の場合にはア（１３） ミラーゼ活性が顕著に低下した。高分子物質の例として
は不溶性デンプンなどがある。この高分子物質はそれ自
身が可溶性であっても、不溶性の担体に固定化するとか
重合させるなどして不溶化して用いることもできる。こ
の方法の例としては、アガロ−スケ８ルに包括させる方
法がある。
であり、通常はアミラーゼの基質であるが、水に不溶性
であるところに特徴がある。すなわち、高分子物質が不
溶性であるために結合物のアミラーゼ部分との接触の大
部分が同一液間になり、その結果、アミラーゼの高分子
化による立体障害が大きく現われる。本発明者らはこの
ことを確認するためににンタオースを用いて測定を行な
い、不溶性デンプンを用いた場合と比較したところ前者
の場合にはアミラーゼ活性の低下がほとんど認められな
かったのに対し、後者の場合にはア（１３） ミラーゼ活性が顕著に低下した。高分子物質の例として
は不溶性デンプンなどがある。この高分子物質はそれ自
身が可溶性であっても、不溶性の担体に固定化するとか
重合させるなどして不溶化して用いることもできる。こ
の方法の例としては、アガロ−スケ８ルに包括させる方
法がある。
高分子物質に結合物のアミラーゼを作用させる条件はこ
のアミラーゼの理化学的性質などに応じて適当になるよ
うに定めればよい。
のアミラーゼの理化学的性質などに応じて適当になるよ
うに定めればよい。
アミラーゼ全作用させたのちはアミラーゼの活性をめる
。この活性は、この酵素反応による分解物の増加、原料
である高分子物質の減少、その他、この酵素反応による
系の変化を追跡すればよい。
。この活性は、この酵素反応による分解物の増加、原料
である高分子物質の減少、その他、この酵素反応による
系の変化を追跡すればよい。
本発明の方法は、ヒト血清などの高等動物由来のアミラ
ーゼを含む検体中のりガントを特異性高くかつ極めて高
感度で測定できる。また、操作が簡単であり、安価かつ
容易にリガンドを定量することが可能である。本発明の
方法はりガントの種類を問わず測定できるが比較的高分
子の測定に威（１４） 力を発揮する。本発明の方法に用いる試薬にはりガント
を直接使用せず、リガンドは抗体の製造に用いられるだ
けであるから微量で足りるという利点も有する。従って
、本発明の方法は測定対象と同じリガンドが入手しにく
い場合とか、高価な場合に特に有効である。
ーゼを含む検体中のりガントを特異性高くかつ極めて高
感度で測定できる。また、操作が簡単であり、安価かつ
容易にリガンドを定量することが可能である。本発明の
方法はりガントの種類を問わず測定できるが比較的高分
子の測定に威（１４） 力を発揮する。本発明の方法に用いる試薬にはりガント
を直接使用せず、リガンドは抗体の製造に用いられるだ
けであるから微量で足りるという利点も有する。従って
、本発明の方法は測定対象と同じリガンドが入手しにく
い場合とか、高価な場合に特に有効である。
以下、実施例を示す。
実施例１
■ ＣＨＭ化アミラーゼの調製
バチルス・ズブチリスアミラーゼ５ 〃１９ｋ １．０
ｍＭ０−ツェナトロリンを含むｐＨ（３，３の０．１Ｍ
グリセロリン酸緩衝液１ ｍｌに溶かし、４−（マレイ
ミドメチルシクロヘキサン−１−カルボン酸）ザクシン
イミドエステル（（Ｊ（ＭＳ ） ２ ｒｔｔｆｍｅの
ヅメチルホルムアミド（ＤＭＦ ）溶液１００μｌｋ加
えて室温で１時間放置して反応させた。この反応液をセ
ファデックスＧ−２５のカラムに入れ、ｐＨ５，３の０
．１Ｍリン酸緩衝液を流してケゞル濾過を行ない、素通
り分画を分取した。
ｍＭ０−ツェナトロリンを含むｐＨ（３，３の０．１Ｍ
グリセロリン酸緩衝液１ ｍｌに溶かし、４−（マレイ
ミドメチルシクロヘキサン−１−カルボン酸）ザクシン
イミドエステル（（Ｊ（ＭＳ ） ２ ｒｔｔｆｍｅの
ヅメチルホルムアミド（ＤＭＦ ）溶液１００μｌｋ加
えて室温で１時間放置して反応させた。この反応液をセ
ファデックスＧ−２５のカラムに入れ、ｐＨ５，３の０
．１Ｍリン酸緩衝液を流してケゞル濾過を行ない、素通
り分画を分取した。
■ 抗ヒトα−フェトプロティンヤギ■ｇＧＦ（ａｂ′
）２の調製 抗ヒトα−フェトプロティンヤギＩｇＧ １０ ｍ９を
０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４０）２ｍｌにベフ’ シン
３００μｇを加え、３７℃で１８時間攪拌した。Ｑ、
Ｉ ＮＮａＯＨを加えてｐｌｉ ｔ ６．０に調節しこ
の反応液を予めＯＩＭす７’Ｗ緩＠１ ｍＭ ＥＤＴＡ
溶液（ｐＨ６、３）で緩衝化した七フアクリルＳ−３０
０ケゞルカラムに入れ、上記のリン酸緩衝液で溶出した
。分子量約１０万付近に溶出されたピーク部分を集めて
１ ｍｅに濃縮し、目的の抗ヒトα−フェトプロティン
ヤギＩｇＧＦ （ａ ｂ’）２ イヒイ夫十た〇 ■ α−アミラーゼ−抗ヒトα−フェトプロティンヤギ
１．ｇＧ Ｆａｂ’結合物の調製■で調製した抗ヒトα
−フェトグロテインヤギＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２６ ｍ
９を含む０，１Ｍリン酸緩衝１ ｍＭＥＤＴＡ溶液（ｐ
Ｈ５，Ｑ ） １ ｍｌに１０ ｍ９７ｍｅの２−メル
カプトエチルアミン塩酸塩水溶液１００μｌを加え、３
７℃で９０分間攪拌した。この反応液を予め０、１ Ｍ
ＩＪン酸緩衝液（ｐＨ６，３）で緩衝化したセファデ
ックスＧ−２５カラムでケゝルい過して未反応の２−メ
ルカプトメチルアミンを除去し、Ｈ８−Ｆａｂ’を得た
。これに■で調製したＣＨＭ化α−アミラーゼ１ ｍｇ
を加え、３７℃で９０分間反応させた。次にこの反応液
を０．１ Ｍ酢酸緩衝５ ｍＭ塩化カルシウム溶液（ｒ
”６．０）で緩衝化した七フアクリルＳ−３００カラム
でケ８ル濾過して分子量２０万以上の分画を集め、これ
を濃縮して目的の結合物を得た。
）２の調製 抗ヒトα−フェトプロティンヤギＩｇＧ １０ ｍ９を
０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４０）２ｍｌにベフ’ シン
３００μｇを加え、３７℃で１８時間攪拌した。Ｑ、
Ｉ ＮＮａＯＨを加えてｐｌｉ ｔ ６．０に調節しこ
の反応液を予めＯＩＭす７’Ｗ緩＠１ ｍＭ ＥＤＴＡ
溶液（ｐＨ６、３）で緩衝化した七フアクリルＳ−３０
０ケゞルカラムに入れ、上記のリン酸緩衝液で溶出した
。分子量約１０万付近に溶出されたピーク部分を集めて
１ ｍｅに濃縮し、目的の抗ヒトα−フェトプロティン
ヤギＩｇＧＦ （ａ ｂ’）２ イヒイ夫十た〇 ■ α−アミラーゼ−抗ヒトα−フェトプロティンヤギ
１．ｇＧ Ｆａｂ’結合物の調製■で調製した抗ヒトα
−フェトグロテインヤギＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２６ ｍ
９を含む０，１Ｍリン酸緩衝１ ｍＭＥＤＴＡ溶液（ｐ
Ｈ５，Ｑ ） １ ｍｌに１０ ｍ９７ｍｅの２−メル
カプトエチルアミン塩酸塩水溶液１００μｌを加え、３
７℃で９０分間攪拌した。この反応液を予め０、１ Ｍ
ＩＪン酸緩衝液（ｐＨ６，３）で緩衝化したセファデ
ックスＧ−２５カラムでケゝルい過して未反応の２−メ
ルカプトメチルアミンを除去し、Ｈ８−Ｆａｂ’を得た
。これに■で調製したＣＨＭ化α−アミラーゼ１ ｍｇ
を加え、３７℃で９０分間反応させた。次にこの反応液
を０．１ Ｍ酢酸緩衝５ ｍＭ塩化カルシウム溶液（ｒ
”６．０）で緩衝化した七フアクリルＳ−３００カラム
でケ８ル濾過して分子量２０万以上の分画を集め、これ
を濃縮して目的の結合物を得た。
／＋７’１
■ ヒトα−フェトプロティンの測定
濃度Ｏ〜２０００ｎｇのヒトα−フェトプロティン溶液
１００ ｔｒｌに■で調製した結合物溶液にストレプト
ミセス・ビリｌ−９スポラスＡｉ、２９７− Ａ ２
ＦＥＲＭ Ｐｂ２Ｏ３の産生ずるアミラーゼインヒビタ
ー１００μＩＡＩ及びポリエチレングリコール６０００
７％を含有せしめた溶液１００μｇを加えて３０分間反
応させた。反応液にブルースターチ懸濁液］、 Ｑ ｍ
ｌを加えて３７℃で３０分間さらに反応させ、０．５Ｎ
ＮａＯＨ１ｍｌ！を加えて反応を停止させた。これを撹
拌後、３５００ｒｐｍで２分間遠心し、得られた上清の
６２０ ｎｍにおける吸光度を測定した。
１００ ｔｒｌに■で調製した結合物溶液にストレプト
ミセス・ビリｌ−９スポラスＡｉ、２９７− Ａ ２
ＦＥＲＭ Ｐｂ２Ｏ３の産生ずるアミラーゼインヒビタ
ー１００μＩＡＩ及びポリエチレングリコール６０００
７％を含有せしめた溶液１００μｇを加えて３０分間反
応させた。反応液にブルースターチ懸濁液］、 Ｑ ｍ
ｌを加えて３７℃で３０分間さらに反応させ、０．５Ｎ
ＮａＯＨ１ｍｌ！を加えて反応を停止させた。これを撹
拌後、３５００ｒｐｍで２分間遠心し、得られた上清の
６２０ ｎｍにおける吸光度を測定した。
得られた吸光度とヒトα−フェトプロティンの濃度との
関係を示す検量線を第１図に示す。
関係を示す検量線を第１図に示す。
次に、ヒトα−フェトプロティンを含むヒト血清１００
μｔをとり、２０ ｍＭグリ七ロリン酸緩衝濃ＰＴ−１
６０で希釈して２ｎ希釈列を調製した。各々１００μｌ
を小試験管にと如、これに■で調製された結合物溶液に
ストレプトミセス・ビリトスポラスＡ ２９７− Ａ
２ＦＥＲＭ−Ｐ ５４０５の産生するアミラーゼインヒ
ビタ（１８） ＝１００μ！ｊ／ｍｌ及びン」？リエチレングリコール
６０００７チを含有せしめた溶液１００μｌを加えて３
７℃で３０分間加温した。続いて、ブルースターチ１、
０１ｎｌを加えて３７℃で３０分間加温後０．５ ＮＮ
ａＯＨ１−を加えて反応を停止させた。攪拌後、３５０
０ ｒｐｍで２分間遠心し、上清の６２０ ｎｍにおけ
る吸光度を測定した。得られた結果を第２図に示す。図
中−１白丸はアミラーゼインヒビターを加えた場合を表
わし、黒丸は加えなかった場合を表わしている。図に示
す如く、アミラーゼインヒビターを加えない場合には血
清中のアミラーゼによる吸光度の上昇があるが、アミラ
ーゼインヒビターを加えた場合には希釈を必要とせず、
ブランクなしでも正確に測定できる。
μｔをとり、２０ ｍＭグリ七ロリン酸緩衝濃ＰＴ−１
６０で希釈して２ｎ希釈列を調製した。各々１００μｌ
を小試験管にと如、これに■で調製された結合物溶液に
ストレプトミセス・ビリトスポラスＡ ２９７− Ａ
２ＦＥＲＭ−Ｐ ５４０５の産生するアミラーゼインヒ
ビタ（１８） ＝１００μ！ｊ／ｍｌ及びン」？リエチレングリコール
６０００７チを含有せしめた溶液１００μｌを加えて３
７℃で３０分間加温した。続いて、ブルースターチ１、
０１ｎｌを加えて３７℃で３０分間加温後０．５ ＮＮ
ａＯＨ１−を加えて反応を停止させた。攪拌後、３５０
０ ｒｐｍで２分間遠心し、上清の６２０ ｎｍにおけ
る吸光度を測定した。得られた結果を第２図に示す。図
中−１白丸はアミラーゼインヒビターを加えた場合を表
わし、黒丸は加えなかった場合を表わしている。図に示
す如く、アミラーゼインヒビターを加えない場合には血
清中のアミラーゼによる吸光度の上昇があるが、アミラ
ーゼインヒビターを加えた場合には希釈を必要とせず、
ブランクなしでも正確に測定できる。
実施例２
■ ５ＰＤＰ化アミラーゼの調製
バチルス・ズブチリスアミラーゼ１ ｍｇを１０ｍＭ０
−フェナントロリンを含むｐＨ７、５の０．１Ｍグリセ
ロリン酸緩衝液に溶かし、Ｎ−サクシンイミソ＃−３−
（２−ｅリヅルノチオ）プロピオン酸（ＳＰＤＰ） １
ｍ９ ｋ含むＤＭＦ溶液１００ ｔｔｌＪを加えて室温
で３０分間攪拌して反応させた。この反応液を予め、０
．１Ｍグリセロリン酸緩衝液ＰＨ７，５を用いて平衡化
したセファデックスＧ−２５のカラムを用いてグルｐ過
を行ない、５ＰＤＰ化アミラーゼ１ ｍｇを得た。
−フェナントロリンを含むｐＨ７、５の０．１Ｍグリセ
ロリン酸緩衝液に溶かし、Ｎ−サクシンイミソ＃−３−
（２−ｅリヅルノチオ）プロピオン酸（ＳＰＤＰ） １
ｍ９ ｋ含むＤＭＦ溶液１００ ｔｔｌＪを加えて室温
で３０分間攪拌して反応させた。この反応液を予め、０
．１Ｍグリセロリン酸緩衝液ＰＨ７，５を用いて平衡化
したセファデックスＧ−２５のカラムを用いてグルｐ過
を行ない、５ＰＤＰ化アミラーゼ１ ｍｇを得た。
■ 抗ヒトＩｇＥヤギＩ ｇＧ Ｆ （ａ ｂ’）２の
調製抗ヒトＩｇＥヤギＩｇＧ１０ｍ９全０１Ｍ酢酸緩衝
液（ｐＨ４，０） ２ｍｅに波プシン３００ ｔｔｇｋ
加え、３７℃で１８時間攪拌した。０． Ｉ ＮＮａＯ
Ｈを加えてｐ、Ｈｆｆ６．０に調節しこの反応液を予め
Ｏ，ｌ Ｍ ＩＪン酸緩衝１ ｍＭ ＥＤＴＡ溶液（ｐ
’（６，３）で緩衝化したセフアクＩＪ ／ｌ／ Ｓ
−３００ケゝルカラムに入れ、上記のリン酸緩衝液で溶
出した。分子量約１０万付近に溶出されたピーク部分を
集めて１−に濃縮し、目的の抗ヒトＩｇＥヤギＩ ｇＧ
Ｆ （ａ ｂ’）２ ｆ得た。
調製抗ヒトＩｇＥヤギＩｇＧ１０ｍ９全０１Ｍ酢酸緩衝
液（ｐＨ４，０） ２ｍｅに波プシン３００ ｔｔｇｋ
加え、３７℃で１８時間攪拌した。０． Ｉ ＮＮａＯ
Ｈを加えてｐ、Ｈｆｆ６．０に調節しこの反応液を予め
Ｏ，ｌ Ｍ ＩＪン酸緩衝１ ｍＭ ＥＤＴＡ溶液（ｐ
’（６，３）で緩衝化したセフアクＩＪ ／ｌ／ Ｓ
−３００ケゝルカラムに入れ、上記のリン酸緩衝液で溶
出した。分子量約１０万付近に溶出されたピーク部分を
集めて１−に濃縮し、目的の抗ヒトＩｇＥヤギＩ ｇＧ
Ｆ （ａ ｂ’）２ ｆ得た。
■ α−アミラーゼ−抗ヒトＩｇＥヤギＩｇＧＦａｂ’
結合物の調製 ■で調製した抗ヒトＩｇＥヤギＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２
６ ｍ９を含む０．１Ｍリン酸緩衝１ ｍＭ ＥＤＴＡ
溶液（ｐＨ６，０）１ゴに１０ｍ９／ｍｅの２−メルカ
プトエチルアミン塩酸塩水溶液１００μｌを加え、３７
℃で９０分間攪拌した。この反応液を予め０．１Ｍグリ
セロリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）で緩衝化したセファデ
ックスＧ−２５カラムでケゝル濾過して未反応の２−メ
ルカプトメチルアミンを除去し、Ｈ８−Ｆａｂ’を得た
。これに■で調製した５ＰＤＰ化α−アミラーゼ２１ｎ
ｇを加え、４℃で１８時間反応させた。次にこの反応液
を０．１Ｍ酢酸緩衝５ ｍＭ塩化カルシウム溶液（ｐＨ
６，５）で緩衝化したセファクリルＳ−３００カラムで
ケ９ル濾過して分子量２０万以上の分画を集め、これを
濃縮して目的の結合物を得た。
結合物の調製 ■で調製した抗ヒトＩｇＥヤギＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２
６ ｍ９を含む０．１Ｍリン酸緩衝１ ｍＭ ＥＤＴＡ
溶液（ｐＨ６，０）１ゴに１０ｍ９／ｍｅの２−メルカ
プトエチルアミン塩酸塩水溶液１００μｌを加え、３７
℃で９０分間攪拌した。この反応液を予め０．１Ｍグリ
セロリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）で緩衝化したセファデ
ックスＧ−２５カラムでケゝル濾過して未反応の２−メ
ルカプトメチルアミンを除去し、Ｈ８−Ｆａｂ’を得た
。これに■で調製した５ＰＤＰ化α−アミラーゼ２１ｎ
ｇを加え、４℃で１８時間反応させた。次にこの反応液
を０．１Ｍ酢酸緩衝５ ｍＭ塩化カルシウム溶液（ｐＨ
６，５）で緩衝化したセファクリルＳ−３００カラムで
ケ９ル濾過して分子量２０万以上の分画を集め、これを
濃縮して目的の結合物を得た。
■ ヒトＩｇＥの測定
濃度Ｏ〜１２８０Ｕ／ｍ７！のヒトＩｇＥ溶液５０ μ
ｌｌに■で調製した結合物小麦由来のアミラーゼインヒ
ビター混合物１００μ９７ｒｄ及びポリエチレングリコ
ール６０００７％を含有せしめた溶液５０μＡｋ加えて
３０分間反応させた。この反応液５０μｌ’ｒ、ポリス
チレンフィルム１上に陽イオン交換樹脂２、反射層３、
ブルースターチ４の順に積層した第２図に示す多層フィ
ルム上に滴下し、室温２０分後のアミラーゼ活性をリフ
ラクトメータ−で測定した。
ｌｌに■で調製した結合物小麦由来のアミラーゼインヒ
ビター混合物１００μ９７ｒｄ及びポリエチレングリコ
ール６０００７％を含有せしめた溶液５０μＡｋ加えて
３０分間反応させた。この反応液５０μｌ’ｒ、ポリス
チレンフィルム１上に陽イオン交換樹脂２、反射層３、
ブルースターチ４の順に積層した第２図に示す多層フィ
ルム上に滴下し、室温２０分後のアミラーゼ活性をリフ
ラクトメータ−で測定した。
得られた反射強度とヒ） ＩｇＥ濃度との関係を第４図
に示す。
に示す。
次に血清５検体について、本発明法と従来のサンドイッ
チＥＩＡ法でＩｇＥ濃度を測定した結果を下表に示す。
チＥＩＡ法でＩｇＥ濃度を測定した結果を下表に示す。
ＩｇＥ濃度
血清 本発明法 ＥＩＡ法
１ １２８ Ｕ／ｍｌ １２５ Ｕ／ｍ１２ ４、３９
４−５１ ３ ７１ ６８ ４ １１９０ １１２０ ５ ５０ ５１ （２２） 実施例３ ■ ５ＰＤＰ化アミラーゼの調製 バチルス・ズブチリスアミラーゼ１■を実施例２■の場
合と同様に処理して５ＰＤＰ化アミラーゼ１■を得た。
４−５１ ３ ７１ ６８ ４ １１９０ １１２０ ５ ５０ ５１ （２２） 実施例３ ■ ５ＰＤＰ化アミラーゼの調製 バチルス・ズブチリスアミラーゼ１■を実施例２■の場
合と同様に処理して５ＰＤＰ化アミラーゼ１■を得た。
■ 抗ヒトアルブミンヤギＩ ｇＧ Ｆ （ａ ｂ’）
２の調製抗ヒトアルブミンヤギＩｇＧ１０ｍ９を０．１
Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４，０−）２ｍｉ！に一！！ゾシン
３００μｇを加え、３７℃で１８時間攪拌した。０．
Ｉ ＮＮａＯＨを加えてＰＨを６．０に調節しこの反応
液を予め０．１ Ｍ ＩＪン酸緩衝１ ｍＭ ＥＤＴＡ
溶液（ｐＨ６，３）で緩衝化したセファクリルＳ −３
００＋”ルカラムに入れ、上記のリン酸緩衝液で溶出し
た。分子量約１０万付近に溶出されたピーク部分を集め
て１−に濃縮し、目的の抗ヒトアルブミンヤギＩｇＧ
Ｆ（ａｂ’）、 ｆ得た。
２の調製抗ヒトアルブミンヤギＩｇＧ１０ｍ９を０．１
Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４，０−）２ｍｉ！に一！！ゾシン
３００μｇを加え、３７℃で１８時間攪拌した。０．
Ｉ ＮＮａＯＨを加えてＰＨを６．０に調節しこの反応
液を予め０．１ Ｍ ＩＪン酸緩衝１ ｍＭ ＥＤＴＡ
溶液（ｐＨ６，３）で緩衝化したセファクリルＳ −３
００＋”ルカラムに入れ、上記のリン酸緩衝液で溶出し
た。分子量約１０万付近に溶出されたピーク部分を集め
て１−に濃縮し、目的の抗ヒトアルブミンヤギＩｇＧ
Ｆ（ａｂ’）、 ｆ得た。
■ α−アミラーゼ−抗ヒトアルブミンヤギＩｇＧ Ｆ
ａｂ’結合物の調製 ■で調製した抗ヒトアルブミンヤギＩ ｇＧ Ｆ （ａ
ｂ’）２６ ｒｑ）を含む０．１Ｍリン酸緩衝ｌ ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ６，０）１−に１０ダ／ｒｎｌ
の２−メルカプトエチルアミン塩酸塩水溶液１００μｌ
を加え、３７℃で９０分間攪拌した。この反応液を予め
０．１Ｍグリ七コロリン酸緩衝液ＰＨ７，５）で緩衝化
したセファデックスＧ−２５カラムでケゝル濾過して未
反応の２−メルカプトメチルアミンを除去し、Ｈ８−Ｆ
ａｂ’を得た。
ａｂ’結合物の調製 ■で調製した抗ヒトアルブミンヤギＩ ｇＧ Ｆ （ａ
ｂ’）２６ ｒｑ）を含む０．１Ｍリン酸緩衝ｌ ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ６，０）１−に１０ダ／ｒｎｌ
の２−メルカプトエチルアミン塩酸塩水溶液１００μｌ
を加え、３７℃で９０分間攪拌した。この反応液を予め
０．１Ｍグリ七コロリン酸緩衝液ＰＨ７，５）で緩衝化
したセファデックスＧ−２５カラムでケゝル濾過して未
反応の２−メルカプトメチルアミンを除去し、Ｈ８−Ｆ
ａｂ’を得た。
これに■で調製した５ＰＤＰ化α−アミラーゼ１■を加
え、４℃で１８時間反応させた。次にこの反応液をＯ，
］、 Ｍ酢酸緩衝５ ｍＭ塩化カルシウム溶液（ｐＨ６
，５）で緩衝化したセファクリルＳ −３００カラムで
ケ８ル濾過して分子量２０万以上の分画を集め、これを
濃縮して目的の結合物を得た。
え、４℃で１８時間反応させた。次にこの反応液をＯ，
］、 Ｍ酢酸緩衝５ ｍＭ塩化カルシウム溶液（ｐＨ６
，５）で緩衝化したセファクリルＳ −３００カラムで
ケ８ル濾過して分子量２０万以上の分画を集め、これを
濃縮して目的の結合物を得た。
■ ヒトアルブミンの測定
濃度Ｏ〜２５６０ ＋Ｊのヒトアルブミン溶液１００μ
ｌを小試験管に分注し、これに■で調製した結合物情液
にストレプトミセス・ビリトスポラス扁２９７−Ａ２
ＦＥＲＭ−Ｐ ５４．０５の産生ずるアミラーゼインヒ
ビター１００μＥ／／ｍ、ｌ及びポリエチレングリコー
ル６０００ １０％を含有せしめた溶液１００μｌを加
えて３７℃で３０分間反応させた。反応液にブルースタ
ーチ１．Ｑｍｌを加えて３７℃で３０分間加温後、０．
５ Ｎ ＮａＯＨ１ｍ、ｌを加えて反応を停止させた。
ｌを小試験管に分注し、これに■で調製した結合物情液
にストレプトミセス・ビリトスポラス扁２９７−Ａ２
ＦＥＲＭ−Ｐ ５４．０５の産生ずるアミラーゼインヒ
ビター１００μＥ／／ｍ、ｌ及びポリエチレングリコー
ル６０００ １０％を含有せしめた溶液１００μｌを加
えて３７℃で３０分間反応させた。反応液にブルースタ
ーチ１．Ｑｍｌを加えて３７℃で３０分間加温後、０．
５ Ｎ ＮａＯＨ１ｍ、ｌを加えて反応を停止させた。
攪拌後、３５００ｒｐｍで２分間遠心し、上清の６２０
ｎｍにおける吸光度を測定した。得られた結果を第５図
に示す。
ｎｍにおける吸光度を測定した。得られた結果を第５図
に示す。
第１図は本発明の方法で測定して得られたヒトα−フェ
トプロティンの検量線であシ、第２図はヒト血清の希男
率と吸光度の関係をアミラーゼインヒビターを添加した
場合（白丸）と添加しなかった場合（黒丸）について測
定した結果を示すものである。第３図は測定の一例で使
用した多層フィルムの構成を示すものであり、第４図は
この多層フィルムを用いて測定したヒ） ＩｇＥ濃度と
相対反射強度との関係を示すものである。第５図はヒト
アルブミン濃度と吸光度との関係を示すものである。 特許出願人 富士レビオ株式会社 代理人弁理士 １） 中 政 浩 （２５） 第１図 化１負り一４帽か勢 ２０ ８０ ３２０ １２８０ １ｇＥ （Ｕ／而） 第５図
トプロティンの検量線であシ、第２図はヒト血清の希男
率と吸光度の関係をアミラーゼインヒビターを添加した
場合（白丸）と添加しなかった場合（黒丸）について測
定した結果を示すものである。第３図は測定の一例で使
用した多層フィルムの構成を示すものであり、第４図は
この多層フィルムを用いて測定したヒ） ＩｇＥ濃度と
相対反射強度との関係を示すものである。第５図はヒト
アルブミン濃度と吸光度との関係を示すものである。 特許出願人 富士レビオ株式会社 代理人弁理士 １） 中 政 浩 （２５） 第１図 化１負り一４帽か勢 ２０ ８０ ３２０ １２８０ １ｇＥ （Ｕ／而） 第５図
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 高等動物由来のアミラーゼを含有している検体の抗原決
定基具有物質を測定する方法において、該抗原決定基具
有物質と、この抗原決定基共有物質に対する抗体と検体
に実質的に含まれていないアミラーゼとの結合物を接触
せしめて反応させ、前記の高等動物由来のアミラーゼに
は、このアミラーゼの活性全阻害する程度が前記の結合
物に結合されているアミラーゼの活性全阻害する程度よ
り大きいアミラーゼインヒビターを接触せしめて反応さ
せ、 さらに、前記の結合物に結合されているアミラーゼが作
用しうる水に不溶性の高分子物質に前記の結合物を接触
せしめて酵素反応させ、アミラーゼ活性を測定すること
全特徴とする、 抗原決定基具有物質の測定法
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2771084A JPH0246897B2 (ja) | 1984-02-16 | 1984-02-16 | Amiraazeomochiitakogenketsuteikigujubutsushitsusokuteiho |
| US06/699,675 US4757001A (en) | 1984-02-16 | 1985-02-08 | Method of measuring biological ligand by utilizing amylase |
| EP85300991A EP0152305B1 (en) | 1984-02-16 | 1985-02-14 | Method of measuring biological ligand by utilising amylase |
| DE8585300991T DE3584840D1 (de) | 1984-02-16 | 1985-02-14 | Verfahren zur messung eines biologischen ligands unter verwendung von amylase. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2771084A JPH0246897B2 (ja) | 1984-02-16 | 1984-02-16 | Amiraazeomochiitakogenketsuteikigujubutsushitsusokuteiho |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60171461A true JPS60171461A (ja) | 1985-09-04 |
| JPH0246897B2 JPH0246897B2 (ja) | 1990-10-17 |
Family
ID=12228550
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2771084A Expired - Lifetime JPH0246897B2 (ja) | 1984-02-16 | 1984-02-16 | Amiraazeomochiitakogenketsuteikigujubutsushitsusokuteiho |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0246897B2 (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH05232112A (ja) * | 1992-02-20 | 1993-09-07 | Fuji Photo Film Co Ltd | 乾式免疫分析要素 |
| EP2141180A1 (en) | 2008-06-30 | 2010-01-06 | Fujifilm Corporation | Antibody recognizing canine CRP and human CRP |
| EP2336158A1 (en) | 2009-12-21 | 2011-06-22 | Fujifilm Corporation | Dry analytical element for measurement of canine CRP |
| EP2562185A1 (en) | 2011-08-24 | 2013-02-27 | Fujifilm Corporation | Antibody against human TSH and canine TSH |
-
1984
- 1984-02-16 JP JP2771084A patent/JPH0246897B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH05232112A (ja) * | 1992-02-20 | 1993-09-07 | Fuji Photo Film Co Ltd | 乾式免疫分析要素 |
| EP2141180A1 (en) | 2008-06-30 | 2010-01-06 | Fujifilm Corporation | Antibody recognizing canine CRP and human CRP |
| EP2336158A1 (en) | 2009-12-21 | 2011-06-22 | Fujifilm Corporation | Dry analytical element for measurement of canine CRP |
| EP2562185A1 (en) | 2011-08-24 | 2013-02-27 | Fujifilm Corporation | Antibody against human TSH and canine TSH |
| US9296814B2 (en) | 2011-08-24 | 2016-03-29 | Fujifilm Corporation | Antibody against human TSH and canine TSH |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0246897B2 (ja) | 1990-10-17 |
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| EXPY | Cancellation because of completion of term |