JPS6123970A - アミラ−ゼを利用した抗原決定基具有物質測定法 - Google Patents
アミラ−ゼを利用した抗原決定基具有物質測定法Info
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- JPS6123970A JPS6123970A JP14380184A JP14380184A JPS6123970A JP S6123970 A JPS6123970 A JP S6123970A JP 14380184 A JP14380184 A JP 14380184A JP 14380184 A JP14380184 A JP 14380184A JP S6123970 A JPS6123970 A JP S6123970A
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- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は、例えば血清、尿などに含まれる薬物あるいは
各種疾患に由来する微量成分などを測定する方法に関す
るものである。
各種疾患に由来する微量成分などを測定する方法に関す
るものである。
血清、尿などの体液に含まれる微量成分の分析は病気の
診断あるいは治療経過の判定などに非常に有意義であシ
、日常の臨床検査に活用されている。ところが、これら
の体液には多種多様の成分が含まれており、そのなかに
は６１分子量の近似した物質、生理活性の似た物質ある
いは構造の近似した物質なども含まれていることも多い
。そこで、この分析法は特異性が高く、かつ微少量まで
定量しうろことが要求される。さらに、日常検査として
利用される尼めに、簡便かつルーチン化しうろことが望
ましい。
診断あるいは治療経過の判定などに非常に有意義であシ
、日常の臨床検査に活用されている。ところが、これら
の体液には多種多様の成分が含まれており、そのなかに
は６１分子量の近似した物質、生理活性の似た物質ある
いは構造の近似した物質なども含まれていることも多い
。そこで、この分析法は特異性が高く、かつ微少量まで
定量しうろことが要求される。さらに、日常検査として
利用される尼めに、簡便かつルーチン化しうろことが望
ましい。
（従来の技術及び発明が解決しようとする問題点）この
ような条件を備えた分析法として免疫学的測定法がある
。この方法は、抗原−抗体間の高い新和性と、抗体が抗
原決定基を判別する高い特異性を利用しており、ラジオ
イムノアッセイ、酵素免疫測定法、血球等の凝集反応を
利用した方法等に大別される。
ような条件を備えた分析法として免疫学的測定法がある
。この方法は、抗原−抗体間の高い新和性と、抗体が抗
原決定基を判別する高い特異性を利用しており、ラジオ
イムノアッセイ、酵素免疫測定法、血球等の凝集反応を
利用した方法等に大別される。
ラジオイムノアッセイは、感度はすぐれているが、人体
に有害である放射性物質を用いるところから使用場所や
使用量が厳しく規制されておシ、特殊な施設を必要とす
る。一方、酵素免疫法はこのような問題はないが、ラジ
オイムノアッセイもそうであるが、遊離標識物と結合標
識物の分離が必要である。そして、この分離操作は、非
常に繁雑であり、操作及び測定誤差の両面で問題になっ
ていた。血球等の凝集反応を利用した方法の場合にはこ
の分離操作は必要ないが、この方法は感度が低く、数ｎ
ｇ−ｐ９のような極微量を測定することは困難である。
に有害である放射性物質を用いるところから使用場所や
使用量が厳しく規制されておシ、特殊な施設を必要とす
る。一方、酵素免疫法はこのような問題はないが、ラジ
オイムノアッセイもそうであるが、遊離標識物と結合標
識物の分離が必要である。そして、この分離操作は、非
常に繁雑であり、操作及び測定誤差の両面で問題になっ
ていた。血球等の凝集反応を利用した方法の場合にはこ
の分離操作は必要ないが、この方法は感度が低く、数ｎ
ｇ−ｐ９のような極微量を測定することは困難である。
本発明者らは上記のような欠点のない測定方法を開発す
べく種々検討の結果、水に不溶性の高分子物質を基質と
する酵素に測定対象たる抗原決定基具有物質に対する抗
体を結合させてこの結合物の抗体に測定対象の抗原決定
基具有物質を反応させ、その後この結合物の酵素活性を
測定すると測定対象たる抗原決定基具有物質の量に応じ
て酵素活性が顕著に低下することを見出し、この方法を
用いれば抗原決定基具有物質を高感度で、かつ前述の分
離操作を行なわないで簡便に測定しうろことを見出して
その内容を特許出願（特願昭５８−２３１２４１号）し
た。そして、さらに研究を進め、酵素としてアミラーゼ
を用いた場合に抗原決定基具有物質を最も高感度で測定
できることを見出したが、ヒト血清等の高等動物由来の
検体には通常アミラーゼが含まれているため測定におけ
るブランク値が高くなって測定誤差が大きくなるという
問題を生じた。そこで、このブランク値を低下させるた
めに検体中のアミラーゼを予め失活させる方法及び検体
を希釈する方法を検討したが、前者の場合にはアミラー
ゼを失活させるために検体を加熱処理、酸アルカリ処理
等する際に測定対象の抗原決定基具有物質も変性あるい
は分解されてしまうことがあり、後者の場合には感度が
低下してしまうたδこれらの方法はいずれも不適蟲で−
あった。さらに、これらの方法は、操作が繁雑であるた
め、簡便な測定法の開発を目指す本発明者らの意図にそ
ぐわないものであった。
べく種々検討の結果、水に不溶性の高分子物質を基質と
する酵素に測定対象たる抗原決定基具有物質に対する抗
体を結合させてこの結合物の抗体に測定対象の抗原決定
基具有物質を反応させ、その後この結合物の酵素活性を
測定すると測定対象たる抗原決定基具有物質の量に応じ
て酵素活性が顕著に低下することを見出し、この方法を
用いれば抗原決定基具有物質を高感度で、かつ前述の分
離操作を行なわないで簡便に測定しうろことを見出して
その内容を特許出願（特願昭５８−２３１２４１号）し
た。そして、さらに研究を進め、酵素としてアミラーゼ
を用いた場合に抗原決定基具有物質を最も高感度で測定
できることを見出したが、ヒト血清等の高等動物由来の
検体には通常アミラーゼが含まれているため測定におけ
るブランク値が高くなって測定誤差が大きくなるという
問題を生じた。そこで、このブランク値を低下させるた
めに検体中のアミラーゼを予め失活させる方法及び検体
を希釈する方法を検討したが、前者の場合にはアミラー
ゼを失活させるために検体を加熱処理、酸アルカリ処理
等する際に測定対象の抗原決定基具有物質も変性あるい
は分解されてしまうことがあり、後者の場合には感度が
低下してしまうたδこれらの方法はいずれも不適蟲で−
あった。さらに、これらの方法は、操作が繁雑であるた
め、簡便な測定法の開発を目指す本発明者らの意図にそ
ぐわないものであった。
そこで、本発明者らは、簡便さと高感度を損なわずにこ
のブランク値を低下させる方法を開発すべくさらに検討
の結果、高等動物由来のアミラーゼを特異的に阻害する
アミラーゼインヒビターを使用することによってこの目
的を達成しうろことを見出し、このアミラーゼインヒビ
ターヲ利用した２種の抗原決定基具有物質の測定方法を
案出してその内容も既に特許出願（特願昭５９〜２７７
０９号、特願昭５９−２７７１０号）した。
のブランク値を低下させる方法を開発すべくさらに検討
の結果、高等動物由来のアミラーゼを特異的に阻害する
アミラーゼインヒビターを使用することによってこの目
的を達成しうろことを見出し、このアミラーゼインヒビ
ターヲ利用した２種の抗原決定基具有物質の測定方法を
案出してその内容も既に特許出願（特願昭５９〜２７７
０９号、特願昭５９−２７７１０号）した。
（問題点を解決するための手段）
本発明はこのアミラーゼインヒビターを利用スる方法の
ひとつ全改良するものであり、前回測定対象の抗原決定
基具有物質に抗体とアミラーゼの結合物を作用きせてい
たところを、４回この抗体と異なる抗原決定基に作用す
る別異の抗体を新たに加えることによって測定感度が１
桁ないし２桁高ｌることを見出し、この知見に基いて本
発明を完成する（ｔＣ至った。
ひとつ全改良するものであり、前回測定対象の抗原決定
基具有物質に抗体とアミラーゼの結合物を作用きせてい
たところを、４回この抗体と異なる抗原決定基に作用す
る別異の抗体を新たに加えることによって測定感度が１
桁ないし２桁高ｌることを見出し、この知見に基いて本
発明を完成する（ｔＣ至った。
すなわち、本発明は、高等動物由来のアミラーゼを含有
している検体中の２以上の抗原決定基を具有する物質を
測定する方法において、該抗原決定基具有物質に、この
抗原決定基具有物質の一の抗原決定基に対する抗体と検
体に実質的に含１れていないアミラーゼとの結合物及び
他の抗原決定基に対する抗体を接触せしめて反応させ、
前記の高等動物由来のアミラーゼには、このアミラーゼ
の活性を阻害する程度が前記の結合物に結合されている
アミラーゼの活性を阻害する程度より大きいアミラーゼ
インヒビクーを接触せしめて反応させ、さらに、前記の
結合物に結合されているアミラーゼが作用しうる水に不
溶性の高分子物質に前記の結合物を接触せしめて酵素反
応させ、アミラーゼ活性を測定することを特徴とする、
抗原決定基具有物質の測定方法に関するものである。
している検体中の２以上の抗原決定基を具有する物質を
測定する方法において、該抗原決定基具有物質に、この
抗原決定基具有物質の一の抗原決定基に対する抗体と検
体に実質的に含１れていないアミラーゼとの結合物及び
他の抗原決定基に対する抗体を接触せしめて反応させ、
前記の高等動物由来のアミラーゼには、このアミラーゼ
の活性を阻害する程度が前記の結合物に結合されている
アミラーゼの活性を阻害する程度より大きいアミラーゼ
インヒビクーを接触せしめて反応させ、さらに、前記の
結合物に結合されているアミラーゼが作用しうる水に不
溶性の高分子物質に前記の結合物を接触せしめて酵素反
応させ、アミラーゼ活性を測定することを特徴とする、
抗原決定基具有物質の測定方法に関するものである。
本発明の方法で測定される検体は高等動物由来のアミラ
ーゼを含有するものである。高等動物由来ノアミラーゼ
とは例えば膵臓アミラーゼ、唾液アミラーゼなどであり
、このようなアミラーゼを含有する検体も通常は高等動
物由来のものである。
ーゼを含有するものである。高等動物由来ノアミラーゼ
とは例えば膵臓アミラーゼ、唾液アミラーゼなどであり
、このようなアミラーゼを含有する検体も通常は高等動
物由来のものである。
検体の種類は限定されないが、例えば血清、尿などであ
る。血清、尿などの場合には、通常は特別な前処理を必
要とせず、そのまま測定を行なうことができる。
る。血清、尿などの場合には、通常は特別な前処理を必
要とせず、そのまま測定を行なうことができる。
抗原決定基具有物質（以下リガンドという。）は゛抗原
決定基を二以上有しているものであシ、例えば、各種内
分泌腺に由来するホルモン類、免疫グロブリン、アルブ
ミ／、フェリチン等の血漿蛋白質、ＨＢ抗原等のウィル
ス、バクテリア類、α−フェトプロティン、癌胎児性抗
原等の各種臓器あるいは血中、尿中に存在する抗原など
である。
決定基を二以上有しているものであシ、例えば、各種内
分泌腺に由来するホルモン類、免疫グロブリン、アルブ
ミ／、フェリチン等の血漿蛋白質、ＨＢ抗原等のウィル
ス、バクテリア類、α−フェトプロティン、癌胎児性抗
原等の各種臓器あるいは血中、尿中に存在する抗原など
である。
結合物を構成している抗体はリカ゛ンドと反応するもの
でなければならない。この抗体にはＦ（ａｂ′）２゜Ｆ
ａｂ’ 、 Ｆａｂなどの７ラグメントも含捷れる。
でなければならない。この抗体にはＦ（ａｂ′）２゜Ｆ
ａｂ’ 、 Ｆａｂなどの７ラグメントも含捷れる。
抗体の製造方法としては、りが／ド又はリガンドと蛋白
との結合物を兎、山羊、馬、モルモット、ニワト″す々
どの温血動物に体重１ ｋｇあたｐｏ、３〜２ｍりを１
〜数回背中皮下、フットパッド、大腿筋等にアジ−パン
トとともに注射して当該動物の体内に形成させる。この
抗体は各種の抗原決定基全認識する抗体の混合物である
からこれを分離して用いる。分離方法にはアフィニティ
ーりロマトグラフィーを用いるのがよく、例えば、リガ
ンドを酵素あるいは化学試薬により分解してケ゛ル濾過
、イオン交換クロマトグラフィーなどで分離し、この各
抗原クラクションを不溶化したアフィニティーカラムを
作製し、とのカラムを用いて前記の抗体混合物を分離す
ることができる。また、この抗体は市販品も存在する。
との結合物を兎、山羊、馬、モルモット、ニワト″す々
どの温血動物に体重１ ｋｇあたｐｏ、３〜２ｍりを１
〜数回背中皮下、フットパッド、大腿筋等にアジ−パン
トとともに注射して当該動物の体内に形成させる。この
抗体は各種の抗原決定基全認識する抗体の混合物である
からこれを分離して用いる。分離方法にはアフィニティ
ーりロマトグラフィーを用いるのがよく、例えば、リガ
ンドを酵素あるいは化学試薬により分解してケ゛ル濾過
、イオン交換クロマトグラフィーなどで分離し、この各
抗原クラクションを不溶化したアフィニティーカラムを
作製し、とのカラムを用いて前記の抗体混合物を分離す
ることができる。また、この抗体は市販品も存在する。
本発明の方法においては、抗体は単一抗体に分離しなく
ともよく、少なくとも２群に分割すれば足シる。
ともよく、少なくとも２群に分割すれば足シる。
一方、この抗体はモノクローナル抗体として取得するこ
ともできる。その場合には、マウスに前記のいずれかの
抗原をアジ−パントとともに数回腹腔等に注射し、肺臓
細胞を取り出してポリエチレングリコール等ヲ用いてマ
ウスミエローマ細胞と融合させる。そして、この融合細
胞のなかから当該抗体を産生ずるものをクローニングに
よってモノクローン細胞として増殖させ、マウス腹腔中
で増殖させることによって単一抗体、すなわちモノクロ
ーナル抗体を大量に製造することができる。
ともできる。その場合には、マウスに前記のいずれかの
抗原をアジ−パントとともに数回腹腔等に注射し、肺臓
細胞を取り出してポリエチレングリコール等ヲ用いてマ
ウスミエローマ細胞と融合させる。そして、この融合細
胞のなかから当該抗体を産生ずるものをクローニングに
よってモノクローン細胞として増殖させ、マウス腹腔中
で増殖させることによって単一抗体、すなわちモノクロ
ーナル抗体を大量に製造することができる。
結合物を構成しているアミラーゼはα−アミラーゼ、β
−アミラーゼ、グルコアミラーゼなどであり、検体中に
実質的に含まれていないものであって、かつ後述するア
ミラーゼインヒビターの阻害活性が検体中のアミラーゼ
に対する阻害活性よりも低いものである。このようなア
ミラーゼは検体の種類及びアミラーゼインヒビターの種
類などに応じて異なるか、例えば麦芽由来のノアスター
ゼ及びβ−アミラーゼ、糸状菌由来のタカノアスターゼ
、バチルス属細菌由来のアミラーゼ、などから適宜選択
すればよい。
−アミラーゼ、グルコアミラーゼなどであり、検体中に
実質的に含まれていないものであって、かつ後述するア
ミラーゼインヒビターの阻害活性が検体中のアミラーゼ
に対する阻害活性よりも低いものである。このようなア
ミラーゼは検体の種類及びアミラーゼインヒビターの種
類などに応じて異なるか、例えば麦芽由来のノアスター
ゼ及びβ−アミラーゼ、糸状菌由来のタカノアスターゼ
、バチルス属細菌由来のアミラーゼ、などから適宜選択
すればよい。
アミラーゼと抗体との結合方法は双方の官能基を考慮し
て決定すればよい。官能基は、アミン基、カルボキシル
基、水酸基、チオール基、イミグゾール基、フェニル基
などを利用することができ、例えばアミノ基相互間を結
合させる場合には、ジイソシアネート法、グルタルアル
テ゛ヒト法、ジフルオロベンゼン法、ベンゾキノン法等
数多く知うれている。また、アミン基とカルボキシル基
との開音結合させる方法としては、カルボキシル基をサ
クシンイミドエステル化する方法のほかカルボソイミ１
゛法、ウッドワード試薬法等が知られておシ、アミノ基
と糖鎖全架橋する過ヨウ素酸酸化法（Ｎａｋａｎｅ法）
もある。チオール基を利用する場合には、例えばもう一
方の側のカルボキシル基をサクシンイミドエステル化し
７てこれにシスティンを反応させてチオール基を導入し
、チオール基反応性二価架橋試薬を用いて双方を結合す
ることができる。フェニル基を利用する方法としてはノ
アゾ化法、アルキル化法などがある。結合方法はこれら
の例示に限られるものではなく、このほか例えばｒ Ｍ
ｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｉｒｎｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ
Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｒｎｉｓｔｒｙ Ｊあるいは「酵素
免疫測定法」等の底置に記載されている方法のなかから
適宜選択して利用することができる。結合比は１：１に
限らず、目的に応じて任意の比率をとることができるこ
とはいうまでもない。反応後は、グルＥ過法、イオン交
換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフ
ィーなどを適宜組み合わせて精製を行い、必要により凍
結乾燥法等で乾燥する。
て決定すればよい。官能基は、アミン基、カルボキシル
基、水酸基、チオール基、イミグゾール基、フェニル基
などを利用することができ、例えばアミノ基相互間を結
合させる場合には、ジイソシアネート法、グルタルアル
テ゛ヒト法、ジフルオロベンゼン法、ベンゾキノン法等
数多く知うれている。また、アミン基とカルボキシル基
との開音結合させる方法としては、カルボキシル基をサ
クシンイミドエステル化する方法のほかカルボソイミ１
゛法、ウッドワード試薬法等が知られておシ、アミノ基
と糖鎖全架橋する過ヨウ素酸酸化法（Ｎａｋａｎｅ法）
もある。チオール基を利用する場合には、例えばもう一
方の側のカルボキシル基をサクシンイミドエステル化し
７てこれにシスティンを反応させてチオール基を導入し
、チオール基反応性二価架橋試薬を用いて双方を結合す
ることができる。フェニル基を利用する方法としてはノ
アゾ化法、アルキル化法などがある。結合方法はこれら
の例示に限られるものではなく、このほか例えばｒ Ｍ
ｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｉｒｎｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ
Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｒｎｉｓｔｒｙ Ｊあるいは「酵素
免疫測定法」等の底置に記載されている方法のなかから
適宜選択して利用することができる。結合比は１：１に
限らず、目的に応じて任意の比率をとることができるこ
とはいうまでもない。反応後は、グルＥ過法、イオン交
換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフ
ィーなどを適宜組み合わせて精製を行い、必要により凍
結乾燥法等で乾燥する。
この結合物の抗体とともにリガンドに作用させる抗体は
結合物の抗体が反応する抗原決定基と異なる抗原決定基
に対して反応するものである。この抗体はＩｇＧ 、
ＩｇＭあるいはＩｇＡでアリ、Ｆ （ａ ｂ ′）２１
Ｆａｂなどのフラグメントであってもよく、マた、例え
ばＤＮＰ化、アセチル化、ビオチニル化、ニトロ化など
の化学修飾が施されたものであってもよい。この抗体は
１種類に限られるものではなく、２種類以上あってもよ
い。
結合物の抗体が反応する抗原決定基と異なる抗原決定基
に対して反応するものである。この抗体はＩｇＧ 、
ＩｇＭあるいはＩｇＡでアリ、Ｆ （ａ ｂ ′）２１
Ｆａｂなどのフラグメントであってもよく、マた、例え
ばＤＮＰ化、アセチル化、ビオチニル化、ニトロ化など
の化学修飾が施されたものであってもよい。この抗体は
１種類に限られるものではなく、２種類以上あってもよ
い。
この異なる抗原決定基を認識する抗体は前述の細胞融合
法によるモノクローナル抗体を製造する方法により容易
に取得することができる。また、前述の温血動物を利用
して抗体群を産生させ、これを分離してもよい。その場
合には単一抗体まで分離しなくともよく、例えば２群に
分割してその一方を前述のアミラーゼと結合させ、もう
一方をこの抗体に利用してもよい。捷た、この抗体は完
全に分離しなくともよく、測定を阻害しない程度に他方
の抗体が混入していてもよい。
法によるモノクローナル抗体を製造する方法により容易
に取得することができる。また、前述の温血動物を利用
して抗体群を産生させ、これを分離してもよい。その場
合には単一抗体まで分離しなくともよく、例えば２群に
分割してその一方を前述のアミラーゼと結合させ、もう
一方をこの抗体に利用してもよい。捷た、この抗体は完
全に分離しなくともよく、測定を阻害しない程度に他方
の抗体が混入していてもよい。
この抗体には水溶性高分子を結合させたほうが感度を高
める点で好ましい場合がある。水溶性高分子は分子量が
１０００以上のものでちゃ、例えばアルブミン、ヘモ７
アニン等の蛋白質、ポリサ。
める点で好ましい場合がある。水溶性高分子は分子量が
１０００以上のものでちゃ、例えばアルブミン、ヘモ７
アニン等の蛋白質、ポリサ。
カライド、ポリエチレングリコール、ポリヌクレオチド
等である。結合方法は前述のアミラーゼに抗体を結合さ
せる方法のなかから適宜選択すればよい。
等である。結合方法は前述のアミラーゼに抗体を結合さ
せる方法のなかから適宜選択すればよい。
同様に、この抗体にさらにこの抗体に対する抗体を反応
させて高分子化してもよい。この第２抗体は例えばヤギ
ＩｇＧに対するウサギＩｇＧなとであり、第１抗体ある
いは第１抗体とリガンドの結合物音抗原として前述の抗
体の取得方法に準じて取得することができる。この第２
抗体を接触させる時期は第１抗体ヲリガンドに接触させ
る前であっても後であってもよいが、同時に加えること
が操作上簡便である。
させて高分子化してもよい。この第２抗体は例えばヤギ
ＩｇＧに対するウサギＩｇＧなとであり、第１抗体ある
いは第１抗体とリガンドの結合物音抗原として前述の抗
体の取得方法に準じて取得することができる。この第２
抗体を接触させる時期は第１抗体ヲリガンドに接触させ
る前であっても後であってもよいが、同時に加えること
が操作上簡便である。
検体に含まれるリガンドに、前記の一の抗原決定基に対
する抗体とアミラーゼとの結合物及び他の抗原決定基に
対する抗体を溶液中で接触させる。
する抗体とアミラーゼとの結合物及び他の抗原決定基に
対する抗体を溶液中で接触させる。
その際、溶液の温度は２０〜４５℃程度、そしてＰＨは
通常４〜８５程度が適当である。ｐＨｋ一定□に保つた
めに、必要により、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液々どの緩
衝液を用いてもよい・その際、結合物及び抗体の適当な
量は、その種類、リガンドの種類、あるいは接触時の条
件などによって異なるので予め試験をして定めるのがよ
い。リガンドへの結合物及び抗体の接触順序は問うとこ
ろではなく、いずれが先であってもまた両方同時であっ
てもよい。接触時間は通常は充分に反応しつる程度がよ
く、例えば３７℃の場合には２０〜６０分間程度が適当
である。
通常４〜８５程度が適当である。ｐＨｋ一定□に保つた
めに、必要により、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液々どの緩
衝液を用いてもよい・その際、結合物及び抗体の適当な
量は、その種類、リガンドの種類、あるいは接触時の条
件などによって異なるので予め試験をして定めるのがよ
い。リガンドへの結合物及び抗体の接触順序は問うとこ
ろではなく、いずれが先であってもまた両方同時であっ
てもよい。接触時間は通常は充分に反応しつる程度がよ
く、例えば３７℃の場合には２０〜６０分間程度が適当
である。
一方、検体に含まれている高等動物由来のアミラーゼに
は、このアミラーゼを阻害する程度が前記の結合物に結
合されているアミラーゼの活性を阻害する程度より大き
いアミラーゼインヒビターを接触させる。
は、このアミラーゼを阻害する程度が前記の結合物に結
合されているアミラーゼの活性を阻害する程度より大き
いアミラーゼインヒビターを接触させる。
このアミラーゼインヒビターは検体に含寸れているすべ
てのアミラーゼを失活させかつ結合物に結合されている
アミラーゼを全く阻害しないものが最も望ましいことは
いうまでもないが、実用上は検体中の主たるアミラーゼ
を失活させうるものであれば足りる場合が多い。この失
活は要は測定時においてブランク値を上昇させなければ
よく、測定後にアミラーゼインヒビターが失活するなど
してこのアミラーゼ活性が回復してもよい。このアミラ
ーゼインヒビターの作用が問題になるもう一方の、検体
に実質的に含まれていないアミーラ−ゼは抗体に結合さ
れている状態のものであり、遊離状態ではアミラーゼイ
ンヒビターによって失活するものであってもよい。この
ようなアミラーゼインヒビターの例としては、唾液アミ
ラーゼ及び膵臓アミラーゼの両方を阻害する小麦由来の
アミラーゼインヒビター（Ｍ、Ｄ、Ｏ’ Ｄｏｎｎｅｌ
ｌ ｅｔ ａｌ 。
てのアミラーゼを失活させかつ結合物に結合されている
アミラーゼを全く阻害しないものが最も望ましいことは
いうまでもないが、実用上は検体中の主たるアミラーゼ
を失活させうるものであれば足りる場合が多い。この失
活は要は測定時においてブランク値を上昇させなければ
よく、測定後にアミラーゼインヒビターが失活するなど
してこのアミラーゼ活性が回復してもよい。このアミラ
ーゼインヒビターの作用が問題になるもう一方の、検体
に実質的に含まれていないアミーラ−ゼは抗体に結合さ
れている状態のものであり、遊離状態ではアミラーゼイ
ンヒビターによって失活するものであってもよい。この
ようなアミラーゼインヒビターの例としては、唾液アミ
ラーゼ及び膵臓アミラーゼの両方を阻害する小麦由来の
アミラーゼインヒビター（Ｍ、Ｄ、Ｏ’ Ｄｏｎｎｅｌ
ｌ ｅｔ ａｌ 。
Ｂｉｏｃｈｉｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ 、 Ａｃｔａ 、
Ｖｏｌ ４２２ 、 ｐｐ １５９−１．６９（１９
７６））、唾液アミラーゼを優先的に阻害する小麦由来
のアミラーゼインヒビター５ａｉｎ（特開昭５８−８５
８９９号公報）及び膵臓アミラーゼを優先的に阻害する
ストレプトミセス属の放線菌が産生ずるアミラーゼイン
ヒビターＡＩ−Ｂ（特開昭５７−２６８４号公報）など
がある。そのほか、検体に含まれている高等動物由来の
アミラーゼを異種動物に投与してその抗体を取得し、こ
れをアミラーゼインヒビターとして用いることもできる
。抗体の取得方法は前述のリガンドに対する抗体の取得
方法と同様にして取得することができる。これらは単独
で用いてもよく、併用してもよい。
Ｖｏｌ ４２２ 、 ｐｐ １５９−１．６９（１９
７６））、唾液アミラーゼを優先的に阻害する小麦由来
のアミラーゼインヒビター５ａｉｎ（特開昭５８−８５
８９９号公報）及び膵臓アミラーゼを優先的に阻害する
ストレプトミセス属の放線菌が産生ずるアミラーゼイン
ヒビターＡＩ−Ｂ（特開昭５７−２６８４号公報）など
がある。そのほか、検体に含まれている高等動物由来の
アミラーゼを異種動物に投与してその抗体を取得し、こ
れをアミラーゼインヒビターとして用いることもできる
。抗体の取得方法は前述のリガンドに対する抗体の取得
方法と同様にして取得することができる。これらは単独
で用いてもよく、併用してもよい。
検体中のアミラーゼにこのようなアミラーゼインヒビタ
ーを接触させる際の溶液の温度及びＰＨは通常は前述の
リガンドを結合物に一接触させる条件と同一でよい。ま
た、アミラーゼインヒビターの添加量もその種類、検体
中のアミラーゼの種類と量、結合物を構成しているアミ
ラーゼの種類、あるいは接触させる条件などによって異
なるので予め試験をして定めるのがよい。アミラーゼイ
ンヒビターの添加時期は、検体中のアミラーゼによる後
述する水に不溶性の高分子物質の分解を実質的に防止で
きればよく、通常はこの高分子物質の添加前に添加すれ
ばよい、しかしながら一般にアミラーゼインヒビターに
よるアミラーゼ阻害作用はアミラーゼによる基質の分解
速度よりもはるかにはやいのでアミラーゼインヒビター
を高分子物質と同時あるいは多少遅れて添加してもよい
。
ーを接触させる際の溶液の温度及びＰＨは通常は前述の
リガンドを結合物に一接触させる条件と同一でよい。ま
た、アミラーゼインヒビターの添加量もその種類、検体
中のアミラーゼの種類と量、結合物を構成しているアミ
ラーゼの種類、あるいは接触させる条件などによって異
なるので予め試験をして定めるのがよい。アミラーゼイ
ンヒビターの添加時期は、検体中のアミラーゼによる後
述する水に不溶性の高分子物質の分解を実質的に防止で
きればよく、通常はこの高分子物質の添加前に添加すれ
ばよい、しかしながら一般にアミラーゼインヒビターに
よるアミラーゼ阻害作用はアミラーゼによる基質の分解
速度よりもはるかにはやいのでアミラーゼインヒビター
を高分子物質と同時あるいは多少遅れて添加してもよい
。
リガンドと反応させた結合物は高分子物質に接触させて
反応させる。
反応させる。
高分子物質と接触させる結合物は反応物から分離したも
のでもよいが、通常は反応物に含まれている状態のまま
でよい。
のでもよいが、通常は反応物に含まれている状態のまま
でよい。
この高−分子物質は結合物のアミラーゼが反応しうるも
のであり、通常はアミラーゼの基質であるが、水に不溶
性であるところに特徴がある。すなわち、高分子物質が
不溶性であるために結合物のアミラーゼ部分との接触の
大部分が固−液間になり、その結果、アミラーゼの高分
子化による立体障害が大きく現われる。本発明者らはこ
のことを確認するためにペンタオースを用いて測定を行
ない、不溶性デンプンを用いた場合と比較したところ前
者の場合にはアミラーゼ活性の低下がほとんど認められ
なかったのに対し、後者の場合にはアミラーゼ活性が顕
著に低下した。高分子物質の例としては不活性デンプン
などがある。この高分子物質はそれ自体が可溶性であっ
ても、不溶性の担体に固定化するとか重合させるなどし
て不溶化して用いることもできる。この方法の例として
は、アガロ−スケ゛ルに包括させる方法がある。
のであり、通常はアミラーゼの基質であるが、水に不溶
性であるところに特徴がある。すなわち、高分子物質が
不溶性であるために結合物のアミラーゼ部分との接触の
大部分が固−液間になり、その結果、アミラーゼの高分
子化による立体障害が大きく現われる。本発明者らはこ
のことを確認するためにペンタオースを用いて測定を行
ない、不溶性デンプンを用いた場合と比較したところ前
者の場合にはアミラーゼ活性の低下がほとんど認められ
なかったのに対し、後者の場合にはアミラーゼ活性が顕
著に低下した。高分子物質の例としては不活性デンプン
などがある。この高分子物質はそれ自体が可溶性であっ
ても、不溶性の担体に固定化するとか重合させるなどし
て不溶化して用いることもできる。この方法の例として
は、アガロ−スケ゛ルに包括させる方法がある。
高分子物質に結合物のアミラーゼを作用させる条件はこ
のアミラーゼの理化学的性質などに応じて適当になるよ
うに定めればよい。
のアミラーゼの理化学的性質などに応じて適当になるよ
うに定めればよい。
アミラーゼを作用させたのちはアミラーゼの活性を求め
る。この活性は、この酵素反応による分解物の増加、原
料である高分子物質の減少、その他、この酵素反応によ
る系の変化を追跡すればよい。
る。この活性は、この酵素反応による分解物の増加、原
料である高分子物質の減少、その他、この酵素反応によ
る系の変化を追跡すればよい。
（作用及び発明の効果）
本発明の方法は、ヒト血清などの高等動物由来のアミラ
ーゼを含む検体中のりカ゛ンドを特異性高くかつ極めて
高感度で測定できる。この本発明の方法は先願（特願昭
５９−２７７１０号）の方法に比し、感度をさらに１桁
ないし２桁向上させることができる。また、操作が簡単
であり、安価かつ容易にリガンドを定量することが可能
である。本発明の方法はリガンドの種類を問わず測定で
きるが比較的高分子の測定に威力を発揮する。本発明の
方法に用いる試薬にはリガンドを直接使用せず、リガン
ドは抗体の製造に用いられるだけであるから微量で足シ
るという利点も有する。従って、本発明の方法は測定対
象と同じリガンドが入手しにくい場合とか、高価な場合
に特に有効である。
ーゼを含む検体中のりカ゛ンドを特異性高くかつ極めて
高感度で測定できる。この本発明の方法は先願（特願昭
５９−２７７１０号）の方法に比し、感度をさらに１桁
ないし２桁向上させることができる。また、操作が簡単
であり、安価かつ容易にリガンドを定量することが可能
である。本発明の方法はリガンドの種類を問わず測定で
きるが比較的高分子の測定に威力を発揮する。本発明の
方法に用いる試薬にはリガンドを直接使用せず、リガン
ドは抗体の製造に用いられるだけであるから微量で足シ
るという利点も有する。従って、本発明の方法は測定対
象と同じリガンドが入手しにくい場合とか、高価な場合
に特に有効である。
（実施例）
実施例］
■ ＣＩ（Ｍ化アミラーゼの調製
バチルス・ズブチリスアミラーゼ５ ”／ ！ ］、
００ｍＭ０−フエナトロリを含むｐＨ６，３の０．１
Ｍグ−リセロリン酸緩衝液１ ｍｌに溶かし、４−（マ
レイミドメチルシクロヘキサン−１−カルボン酸）サク
シンイミドエステル（ＣＨＭＳ ） ２ｍｇ／ｍｌのジ
メチルホルムアミド（ＤＭＦ ）溶液１００μｔを加え
て室温で１時間放置して反応させた。この反応液をセフ
ァデックスＧ−２５のカラムに入れ、ｐＨ６，３の０．
１Ｍ ＩＪン酸緩衝液を流してグル濾過を行ない、素通
り分画を分取した。
００ｍＭ０−フエナトロリを含むｐＨ６，３の０．１
Ｍグ−リセロリン酸緩衝液１ ｍｌに溶かし、４−（マ
レイミドメチルシクロヘキサン−１−カルボン酸）サク
シンイミドエステル（ＣＨＭＳ ） ２ｍｇ／ｍｌのジ
メチルホルムアミド（ＤＭＦ ）溶液１００μｔを加え
て室温で１時間放置して反応させた。この反応液をセフ
ァデックスＧ−２５のカラムに入れ、ｐＨ６，３の０．
１Ｍ ＩＪン酸緩衝液を流してグル濾過を行ない、素通
り分画を分取した。
■ 抗ヒトフェリチンマウスモノクローナルＩｇＧＦ（
ａｂ’）２の調製 抗ヒトフェリチンマウスモノクローナル−ＩｇＧ１０ｍ
ｇ’ｔ０．１Ｍ酢酸緩衝３ ｍＭ ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ
５，５）２ ｍｌにパフ４イン３００μｇを加え、３７
℃で１８時間攪拌した。０． Ｉ ＮＮａＯＨを加えて
ＰＨを６０に調節しこの反応液を予め０．１ Ｍ ＩＪ
ン酸緩衝］、 ｍＭ ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ６：つ）で緩
衝化した七フアクリルＳ−３００グルカラムに入れ、上
記のリン酸緩衝液で溶出した。分子量約１０万付近に溶
出されたピーク部分を集めてｌ ｍｌに濃縮し、目的の
抗ヒトフェリチンマウスモノクローナルＩｇＧ Ｆ（−
ａｂ′）２ｆ得た。
ａｂ’）２の調製 抗ヒトフェリチンマウスモノクローナル−ＩｇＧ１０ｍ
ｇ’ｔ０．１Ｍ酢酸緩衝３ ｍＭ ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ
５，５）２ ｍｌにパフ４イン３００μｇを加え、３７
℃で１８時間攪拌した。０． Ｉ ＮＮａＯＨを加えて
ＰＨを６０に調節しこの反応液を予め０．１ Ｍ ＩＪ
ン酸緩衝］、 ｍＭ ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ６：つ）で緩
衝化した七フアクリルＳ−３００グルカラムに入れ、上
記のリン酸緩衝液で溶出した。分子量約１０万付近に溶
出されたピーク部分を集めてｌ ｍｌに濃縮し、目的の
抗ヒトフェリチンマウスモノクローナルＩｇＧ Ｆ（−
ａｂ′）２ｆ得た。
■ α−アミラーゼ−抗ヒトフェリチンマウスモノクロ
ーナルＩｇＧＦａｂ’結合物の調製■で調製した抗ヒト
フェリチンマウスモノクローナルＩｇＧ Ｆ（、ｔｂ’
）２６ ｍ９を含む０． ］、 Ｍリン酸緩衝１ｍＭ
ＥＤＴＡ溶液（ｐｔ（６，０） １ｍｌにＩ Ｑ ｍ９
７ｍ１の２−メルカプトエチルアミン塩酸塩水溶液１０
０μｔを加え、３７℃で９０分間攪拌した。この反応液
を予め０．１ Ｍ ！Ｊン酸緩衝液（ＰＨ７，０）で緩
衝化したセファデックスＧ−２５カラムでグル濾過して
未反応の２−メルカグトメチルアミンを除去し、Ｈ３−
Ｆａｂ’を得た。これに■で調製したＣＨＭ化α−アミ
ラーゼ１ ｍｇを加え、３７℃で９０分間反応させた。
ーナルＩｇＧＦａｂ’結合物の調製■で調製した抗ヒト
フェリチンマウスモノクローナルＩｇＧ Ｆ（、ｔｂ’
）２６ ｍ９を含む０． ］、 Ｍリン酸緩衝１ｍＭ
ＥＤＴＡ溶液（ｐｔ（６，０） １ｍｌにＩ Ｑ ｍ９
７ｍ１の２−メルカプトエチルアミン塩酸塩水溶液１０
０μｔを加え、３７℃で９０分間攪拌した。この反応液
を予め０．１ Ｍ ！Ｊン酸緩衝液（ＰＨ７，０）で緩
衝化したセファデックスＧ−２５カラムでグル濾過して
未反応の２−メルカグトメチルアミンを除去し、Ｈ３−
Ｆａｂ’を得た。これに■で調製したＣＨＭ化α−アミ
ラーゼ１ ｍｇを加え、３７℃で９０分間反応させた。
次にこの反応液を０．１ Ｍ酢酸緩衝５ｍＭ塩化カルシ
ウム溶液（ｐＨ６，０）で緩衝化した七フアクリルＳ−
３００カラムでグル濾過して分子量２０万以上の９画を
集め、これを濃縮して目的の結合物を得た。
ウム溶液（ｐＨ６，０）で緩衝化した七フアクリルＳ−
３００カラムでグル濾過して分子量２０万以上の９画を
集め、これを濃縮して目的の結合物を得た。
■ ヒト血清のフェリチンの測定
ヒトフェリチンを含むヒト血清１００１１ｔｆとシ、ヤ
ギ血清で希釈して３ｎ希釈列を調製した。各々１００μ
ｔを小試験管にとり、゛これに■で調製された結合物情
液にストレゾトミセス・ピリトス前ラス／１６２９７−
Ａ ２ ＦＥＲＭ−Ｐ５４０５の産生するアミラーゼ
インヒビター１００μｇ／ｍｌ結合物の抗体と認識部位
の異なる２種の抗ヒトフェリチンモノクローナル抗体１
０μ９７ｍｌ及びポリエチレングリコール６０００７％
を含有せしめた溶液１００μｔｆ加えて３７℃で３０分
間加温した。続いて、ブルースターチ］、、 Ｑ ｍｌ
ｆ加えて３７℃で３０分間加温後０、５ Ｎ ＮａＯ
Ｈ］ ｍｌを加えて反応を停止させた。攪拌後、３５０
０ｒｐｍで２分間遠心し、上清の６２０ｎｍにおける吸
光度を測定した。得られた結果を第１図に示す。図中、
白丸は結合物の抗体と認識部位の異なる２種の抗ヒトフ
ェリチンモノクローナル抗体を加えた場合を表わし、黒
丸は加えなかった場合を表わしている。図に示す如く、
結合物の抗体と認識部位の異なる２種の抗ヒトフェリチ
ンモノクローナル抗体を加えた場合は加えなかった場合
に比べて測定感度が約１０倍に力っている。
ギ血清で希釈して３ｎ希釈列を調製した。各々１００μ
ｔを小試験管にとり、゛これに■で調製された結合物情
液にストレゾトミセス・ピリトス前ラス／１６２９７−
Ａ ２ ＦＥＲＭ−Ｐ５４０５の産生するアミラーゼ
インヒビター１００μｇ／ｍｌ結合物の抗体と認識部位
の異なる２種の抗ヒトフェリチンモノクローナル抗体１
０μ９７ｍｌ及びポリエチレングリコール６０００７％
を含有せしめた溶液１００μｔｆ加えて３７℃で３０分
間加温した。続いて、ブルースターチ］、、 Ｑ ｍｌ
ｆ加えて３７℃で３０分間加温後０、５ Ｎ ＮａＯ
Ｈ］ ｍｌを加えて反応を停止させた。攪拌後、３５０
０ｒｐｍで２分間遠心し、上清の６２０ｎｍにおける吸
光度を測定した。得られた結果を第１図に示す。図中、
白丸は結合物の抗体と認識部位の異なる２種の抗ヒトフ
ェリチンモノクローナル抗体を加えた場合を表わし、黒
丸は加えなかった場合を表わしている。図に示す如く、
結合物の抗体と認識部位の異なる２種の抗ヒトフェリチ
ンモノクローナル抗体を加えた場合は加えなかった場合
に比べて測定感度が約１０倍に力っている。
実施例２
■ ＣＩ帰化アミラーゼの調製
バチルス−ズブチリスアミラーゼ］、 ｍ？’を実施例
１■の場合と同様に処理してＣＨＭ化アミラーゼ１〃ノ
！７を得た。
１■の場合と同様に処理してＣＨＭ化アミラーゼ１〃ノ
！７を得た。
■ 抗ヒｌ□ＩｇＧＦｃ特異ヤギＩｇＧＦ（ａｂ’）２
の調製抗ヒトＩｇＧヤギＦ （ａ ｂ ′）２ （カッ
イル社）ｉ２０綱リン酸緩衝０．１５ Ｍ ＮａＣ１溶
液（ＰＨ７０） ｆ緩衝化したヒトエｇＧ結合セファロ
ース−４Ｂ−カラムに通し、上記の緩衝液で洗浄後、２
０ ｍＭ ’）ン酸緩衝３ Ｍ Ｎａ５ＣＮ溶液（ｐＨ
７，０）で溶出した。次に、この溶出液を０． ］ Ｍ
！Ｊン酸緩衝１． ｍＭ ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ６，０
）に透析した後濃縮し、目的の抗ヒトＩｇＧＦｃ％異ヤ
ギＩｇＧＦ（ａｂ’）２ｆ、３）得た。
の調製抗ヒトＩｇＧヤギＦ （ａ ｂ ′）２ （カッ
イル社）ｉ２０綱リン酸緩衝０．１５ Ｍ ＮａＣ１溶
液（ＰＨ７０） ｆ緩衝化したヒトエｇＧ結合セファロ
ース−４Ｂ−カラムに通し、上記の緩衝液で洗浄後、２
０ ｍＭ ’）ン酸緩衝３ Ｍ Ｎａ５ＣＮ溶液（ｐＨ
７，０）で溶出した。次に、この溶出液を０． ］ Ｍ
！Ｊン酸緩衝１． ｍＭ ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ６，０
）に透析した後濃縮し、目的の抗ヒトＩｇＧＦｃ％異ヤ
ギＩｇＧＦ（ａｂ’）２ｆ、３）得た。
■ α−アミラーゼ−抗ヒ） ＩｇＧＦｃ％異ヤギＩｇ
ＧＦａｂ’結合物の調製 ■で調製した抗ヒトＩｇＧＦｃ特異ヤギＩ ｇＧ Ｆ（
ａ ｂ ’） ２６ ｍｇを含む０．１ Ｍリン酸緩衝
１ ｍＭ ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ６，０）１ｍｌに１０ｍ
９／ｍ１ｔＤ ２− ） ルカｆ ト：ｒ−ｆル７ミン
塩酸塩水溶液１００μｔを加え、３７℃で９０分間攪拌
した。この反応液を予め０．１ Ｍ ＩＪン酸緩１ｉ（
ｐＨ７，０）で緩衝化し７たセファデックスＧ−２５カ
ラムでブルｖ５過して未反応の２−メルカプトエチルア
ミンを除去し、Ｈ８−Ｆａｂ’を得た。これに■で調製
したσ■化α−アミラーゼ１ｍりを加え３７℃で９０分
間反応させた。次に、この反応液を０．１ Ｍ酢酸緩衝
５ｍＭ塩化カルシウム溶液（ｐＨ６，０）で緩衝化した
セファクリルＳ−３００カラムでケ８ル濾過して分子量
２０万以上の分画を集め、これを濃縮して目的の結合物
を得た。
ＧＦａｂ’結合物の調製 ■で調製した抗ヒトＩｇＧＦｃ特異ヤギＩ ｇＧ Ｆ（
ａ ｂ ’） ２６ ｍｇを含む０．１ Ｍリン酸緩衝
１ ｍＭ ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ６，０）１ｍｌに１０ｍ
９／ｍ１ｔＤ ２− ） ルカｆ ト：ｒ−ｆル７ミン
塩酸塩水溶液１００μｔを加え、３７℃で９０分間攪拌
した。この反応液を予め０．１ Ｍ ＩＪン酸緩１ｉ（
ｐＨ７，０）で緩衝化し７たセファデックスＧ−２５カ
ラムでブルｖ５過して未反応の２−メルカプトエチルア
ミンを除去し、Ｈ８−Ｆａｂ’を得た。これに■で調製
したσ■化α−アミラーゼ１ｍりを加え３７℃で９０分
間反応させた。次に、この反応液を０．１ Ｍ酢酸緩衝
５ｍＭ塩化カルシウム溶液（ｐＨ６，０）で緩衝化した
セファクリルＳ−３００カラムでケ８ル濾過して分子量
２０万以上の分画を集め、これを濃縮して目的の結合物
を得た。
■ ヒトＩｇＧの測定
濃度０〜１０００ ｎｊｊ／ｍｌのヒトＩｇＧ溶液１０
０ μｍに■で調製した結合物情液に、ｆｆ ’Ｊエチ
レングリコール６０００７ ％を含有せしめた溶液ｔｏ
ｏｌｌｚを加え、３７℃で３０分間反応させた。次に、
抗ヒトＩｇＧＦａｂ特異ヤギＩｇＧ（１０μｇ含有）溶
液５０μｔを加え３７℃で３０分間反応させた。この反
応液にブルースターチ懸濁液１．０ ｍｌを加えて３７
℃で３０分間さらに反応させ、０．５ Ｎ ＮａＯＨ］
ｍｌｆ加えて反応を停止させた。これを攪拌後、３５
００ ｒｐｍで２分間遠心し、得られた上清の６２０ｎ
ｍにおける吸光度を測定した。
０ μｍに■で調製した結合物情液に、ｆｆ ’Ｊエチ
レングリコール６０００７ ％を含有せしめた溶液ｔｏ
ｏｌｌｚを加え、３７℃で３０分間反応させた。次に、
抗ヒトＩｇＧＦａｂ特異ヤギＩｇＧ（１０μｇ含有）溶
液５０μｔを加え３７℃で３０分間反応させた。この反
応液にブルースターチ懸濁液１．０ ｍｌを加えて３７
℃で３０分間さらに反応させ、０．５ Ｎ ＮａＯＨ］
ｍｌｆ加えて反応を停止させた。これを攪拌後、３５
００ ｒｐｍで２分間遠心し、得られた上清の６２０ｎ
ｍにおける吸光度を測定した。
得られた吸光度とヒト１ｇＧの濃度との関係を示す検量
線を第２図に示す。図中、黒丸は抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂ
％異ヤギＩｇＧを加えない場合を表わし白丸は加えた
場合を表わしている。図に示すごとく、抗ヒトＩｇＧＦ
ａｂ特異ヤギＩｇＧｆ：加えた場合、加えない場合に比
べて測定感度は約１０倍はど良くなっている。
線を第２図に示す。図中、黒丸は抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂ
％異ヤギＩｇＧを加えない場合を表わし白丸は加えた
場合を表わしている。図に示すごとく、抗ヒトＩｇＧＦ
ａｂ特異ヤギＩｇＧｆ：加えた場合、加えない場合に比
べて測定感度は約１０倍はど良くなっている。
第１図はヒトフェリチンについて、そして第２図はヒト
１．ｇＧについて、いずれも本発明の方法（白丸）及び
先願の方法（黒丸）で測定して得られた検量線を示して
いる。 第１図 ０ １．４ １２．３ １１１
１０００とドア１り子ン劣し”ｊｌ （ｎｇ／ｍｌ
）第２図 ０ ０．９８ ３．９ １５．６ ６２．５ ２５０
１０００じトエｇｃ遠ル（ｎｑ／ｍｌ）
１．ｇＧについて、いずれも本発明の方法（白丸）及び
先願の方法（黒丸）で測定して得られた検量線を示して
いる。 第１図 ０ １．４ １２．３ １１１
１０００とドア１り子ン劣し”ｊｌ （ｎｇ／ｍｌ
）第２図 ０ ０．９８ ３．９ １５．６ ６２．５ ２５０
１０００じトエｇｃ遠ル（ｎｑ／ｍｌ）
Claims (3)
- （１）高等動物由来のアミラーゼを含有している検体中
の２以上の抗原決定基を具有する物質を測定する方法に
おいて、 該抗原決定基具有物質に、この抗原決定基具有物質の一
の抗原決定基に対する抗体と検体に実質的に含まれてい
ないアミラーゼとの結合物及び他の抗原決定基に対する
抗体を接触せしめて反応させ、 前記の高等動物由来のアミラーゼには、このアミラーゼ
の活性を阻害する程度が前記の結合物に結合されている
アミラーゼの活性を阻害する程度より大きいアミラーゼ
インヒビターを接触せしめて反応させ、 さらに、前記の結合物に結合されているアミラーゼが作
用しうる水に不溶性の高分子物質に前記の結合物を接触
せしめて酵素反応させ、アミラーゼ活性を測定すること
を特徴とする 抗原決定基具有物質の測定方法 - （２）他の抗原決定基に対する抗体が水溶性高分子が結
合されたものである特許請求の範囲第１項記載の測定方
法 - （３）他の抗原決定基に対する抗体にこの抗体に対する
抗体をさらに接触せしめることを特徴とする特許請求の
範囲第１項又は第２項記載の測定方法
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14380184A JPH0246898B2 (ja) | 1984-07-11 | 1984-07-11 | Amiraazeoryoshitakogenketsuteikigujubutsushitsusokuteiho |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14380184A JPH0246898B2 (ja) | 1984-07-11 | 1984-07-11 | Amiraazeoryoshitakogenketsuteikigujubutsushitsusokuteiho |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6123970A true JPS6123970A (ja) | 1986-02-01 |
| JPH0246898B2 JPH0246898B2 (ja) | 1990-10-17 |
Family
ID=15347291
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP14380184A Expired - Lifetime JPH0246898B2 (ja) | 1984-07-11 | 1984-07-11 | Amiraazeoryoshitakogenketsuteikigujubutsushitsusokuteiho |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0246898B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH05232112A (ja) * | 1992-02-20 | 1993-09-07 | Fuji Photo Film Co Ltd | 乾式免疫分析要素 |
-
1984
- 1984-07-11 JP JP14380184A patent/JPH0246898B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH05232112A (ja) * | 1992-02-20 | 1993-09-07 | Fuji Photo Film Co Ltd | 乾式免疫分析要素 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0246898B2 (ja) | 1990-10-17 |
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