JPS62186798A - 小麦α−アミラ−ゼ阻害蛋白質に対するモノクロ−ナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、小麦由来の小麦α−アミラーゼ阻害蛋白質に
対するモノクローナル抗体に関する。

〔従来の技術〕

小麦中に種々のアミラーゼ阻害蛋白質が存在しているこ
とが数十午前から知られていたが、それらは全て動物な
いし昆虫由来のアミラーゼを阻害する蛋白質であった。

最近、Ｍｕｎｄｙらは、小麦中に小麦α−アミラーゼを
阻害する蛋白質が存在することを発見し、これを単離し
た［　Ｍｕｎｄｙ、　　Ｊ−ｒＨｅｊｇａａｒｄ　、　
　Ｊ、　ａｎｄ　５ｒｅｎｄｓｅｎ　、　　１．　：　
ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ、　１６７、２１０−２１４（
１９８４）　）ｏこの小麦α−アミラーゼ阻害蛋白質は
、小麦が発芽の際、ジベレリンによりα−アミラーゼを
生合成し、この酵素により種子中のデンプンを分解し、
発芽に必要なエネルギーを得ていることから、この発芽
の際生成したａ−アミラーゼを阻害し、小麦の発芽を制
御しているものと考えられている。

〔発明が解決しようとする問題点〕

一方、小麦は収穫直前に雨等により水分を受けると、ａ
−アミラーゼの生合成が誘起され、一部デンプンの分解
を始める。こうした状態の小麦は、低アミロ小麦と呼ば
れ、その物性が通常の小麦と異なシ、製パン等に適さな
い為商品価値が著しく劣る。低アミロ小麦の問題は、世
界的なものでらシ、今だに有効な解決方法が見゛つかっ
ていない。

考えられる一つの方法は、水分によって生合成が誘起さ
れるａ−アミラーゼを有効に阻害できる阻害蛋白質を含
む種子を遺伝子操作により作り出すことである。そのた
めには発芽の機構を理解することがｆｉ要であり、発芽
におけるａ−アミラーゼ阻害蛋白質の挙動を知る上で、
同物質に特異的に結合するモノクローナル抗体は極めて
有効な道具となる。

また、該阻害蛋白の遺伝子操作においても、モノクロー
ナル抗体は、遺伝子が適切に操作されているかどうかを
知る上での必須の道具となる。更に現在、低アミロ化現
象を起こしやすい小麦、起こしにくい小麦が存在するこ
とが知られているが、これら各種小麦と上述ａ−アミラ
ーゼ阻害蛋白質の含量との間には相関関係があることが
考えられ、該阻害蛋白質の簡便かつ正確な定量にはモノ
クローナル抗体を使用することが適している。

しかしながら、未だ小麦α−アミラーゼ阻害蛋白質に対
して特異的なモノクローナル抗体は見い出されていなか
った。

〔問題点を解決するための手段〕

そこで本発明者らは、上記問題点を解決すべく鋭意検討
した結果、小麦由来の小麦ａ−アミラーゼ阻害蛋白質に
対して特異的であるモノクローナル抗体を見い出し、本
発明を完成した。

本発明のモノクローナル抗体には、ハイブリドーマ細胞
系ＨＡＥＮＡＩ　−１、ＨＡＥＮＡＩ　−２、ＨＡＥＮ
ＡＩ　−３またはＨＡＥＮＡＩ　−４がそれぞれ産生す
るＡＥＮＡＩ　−ｌ、ＡＥＮＡＩ　−２、ＡｇＮＡｌ　
−３およびＡＥＮＡＩ　−４の４種類が含まれ、これら
は七味チ れぞれ免疫グロブリンクラスＩ　ｇＧ２３　　　ｇＧｚ
ｂ　およびＩｇＭに属するものである。

本発明のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ細胞系
ＨＡＥＮＡＩ　−１、ＨＡＥＮＡＩ　−２、ＨＡＥＮＡ
Ｉ−３またはＨＡＥＮＡＩ　−４の培養上清から、ある
いはこれらの細胞系を腹腔内に投与されたマウスの腹腔
液若しくは血清から採取することにより製造される。

本発明モノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマ細
胞系は、抗原として、小麦に含有される分子量１９６４
１（アミノ酸配列より算出）の小麦ａ−アミラーゼ阻害
蛋白質〔以下［ＮＡＩＪ（ネイティブアミラーゼインヒ
ビターの略）と称す〕を用いて動物を免疫し、その動物
から採取した牌細胞とマウスミエローマ細胞とを融合さ
せることにより得られる。抗原であるＮＡＩは前記Ｍｕ
ｎｄｙらの方法に従って小麦より単離される。

ＮＡＩを抗原とする牌細胞を採取するには、マウス等の
動物をＮＡＩで免疫し、その動物の牌臓から採取するこ
とにより行なわれる。免疫は、抗原とフロイント完全ア
ジュバントとの混合物を皮下注射し、免疫を増強するた
めに３週間後に再度皮下注射し、更に２週間後に抗原を
静脈注射することにより行なわれる。牌細胞の採取は、
最終投与の３日後に動物を層殺し、摘出した牌臓より分
離することによ）行なわれる。

マウスミエローマ細胞としては、Ｐ　−３−ＮＳ−１／
１−Ａｇ４−１株又はこの株を継代培養したものが用い
られる。継代培養は、例えば１０％ウシ胎児血清禽含む
ＲＰＭＩ　　１６４０培地を用い、炭酸ガスインキュベ
ータにて３７℃付近で行なわれる。

細胞融合は、前記の牌細胞とミエローマ細胞とを、例え
ばＫｏｅｈｌｅｒ　、　Ｇ、及びＭｉ　１ｓｔｅｉｎ　
、　Ｇ、が確立した方法［Ｎａｔｕｒｅ、　　２５６　
、４９５（１９５４））に準じて融合させることにより
行なわれる。すなわち、ミエローマ細胞と牌細胞とを１
：１０の割合でＲＰＭＩ　　１６４０培地に懸濁させ、
これにポリエチレングリコールを離別し、おだやかに攪
拌することにより融合せしめる。ポリエチレングリコー
ル等を除去して融合細胞懸濁液を作製し、これを培養し
た後、酵素免疫法（ｅｎｚｙｍｅ　ｉｒｎｍｕｎｏａｓ
ｓａｙ　）にて抗体産生株を選択する。

更に目的とする抗体産生細胞のみを単離するには、希釈
法によるクローニングを繰υ返して、１つのクローンか
ら発生した全てのシングルクローンが抗体産生である様
にすることにより行なわれる。

斯くして得られたハイブリドーマ細胞系には前記本発明
のモノクローナル抗体ＡＥＮＡＩ　−１、ＡＥＮＡＩ　
−２、ＡＥＮＡＩ　−３又はＡＥＮＡＩ　−４をそれぞ
れ産生ずる４種類の細胞が存在する。これらのハイブリ
ドーマ細胞の特性は以下の通りである。

■　４種ガ１ともに、Ｐ−３−ＭＳ−１／１−Ａｇ４−
１マウスミエローマ細胞とマウス牌細胞を融合させた雑
種細胞である。

■　４種類ともにＨＡＴ培地で増殖可能である。

■　４ｓ類ともＫＲＰＭＩ−１６４０培地（１０％ウシ
胎児血清補添）で増殖可能であわ、この培地でのｄｏｕ
ｂｌｉｎｇ　ｔｉｍｅ　（細胞が２倍に増殖するのに要
する時間）は約２４時間である。

■　４ａ＃毒ともに■の培地に懸濁させた状態で一８０
℃以下で凍結保存可能である。

■　４種類ともに■の培地に懸濁させ、３７℃で長期継
代培養可能である（植え継ぎ周期は約４日）。

■　４種類ともにマウス（Ｂａ１ｂ　／　ｃ　）の腹腔
内にて継代培養可能である（植え継ぎ周期は約３週間）
。

■　４種類の細胞、′はＮＡＩとクロスする免疫グロブ
リンＩ　ｇＧ２３　ｓ　　工ｇＧ２ａｓ　　ＩｇＧｚｌ
）またはＩｇＭに属するモノクローナル抗体ＡＥＮＡＩ
　−１、ＡＥＮＡＩ　−２、ＡＫＮＡＩ　−３またはＡ
ＥＮＡＩ　−４をそれぞれ永久的に産生ずる。

以上の特性を有する４種類の細胞は、ＡＥＮＡＩ−１を
産生する細胞をＨＡＥＮＡＩ　−１、ＡＥＮＡＩ　−２
を産生ずる細胞をＨＡＥＮＡＩ　−２、ＡＫＮＡＩ　−
３を産生ずる細胞をＨＡＥＮＡＩ　−３、ＡＥＮＡＩ　
−４を産生ずる細胞をＨＡＥＮＡＩ　−４と命名し、通
商産業省工業技術院微生物工業技術研究所に寄託すべく
手続を行なったが、受託を拒否された（寄託受託拒否通
知番号６１微寄文第７２号、同第７３号、同第７４号、
同第７５号）。尚、これらの細胞は出願人において譲渡
可能な状態で保管しである。

抗体産生細胞Ｉ（ＡＥＮＡＩ　−１〜４から本発明のモ
ノクローナル抗体ＡＥＮＡＩ　−１〜４を製造する方法
としては以下の方法が挙げられる。

ａ）　　ＨＡＥＮＡＩ　−１〜４をそれぞれ栄養培地中
で培養して、その上清から採取する方法。

ｂ）　　Ｈ／ｌＮＡｌ　−１〜４をそれぞれマウス腹腔
内に投与して腹腔内で増殖させ、該マウスの腹腔液また
は血清から採取する方法。

就中、目的抗体の収量の面からｂ）における腹腔液から
採取する方法が好ましい。当該腹腔内で増殖させて腹腔
液から本発明モノクローナル抗体を採取する方法は、例
えば以下の如くして実施される。

ＨＡＥＮＡＩ　−１〜４をそれぞれマウス腹腔内に投与
し、約３週間後腹腔内に貯溜した腹腔液を採取し、得ら
れた腹腔液から遠心分離、透析等の手段によりモノクロ
ーナル抗体ＡＥＮＡＩ　−１、ＡＥＮＡＩ−２、ＡＥＮ
ＡＩ　−３またはＡＥＮＡＩ　−４を分離・精製する。

得られた本発明モノクローナル抗体ＡＥＮＡｒ−１〜４
は以下の如き性質を有する。

■　ＡＥＮＡＩ　−１、ＡＥＮＡＩ　−２、ＡＥＮＡＩ
　−３およびＡＥＮＡＩ　−４は各々免疫グロブリンク
ラスＩｇＧ２３１１ｇＧｚａ　％ＩｇＧｚｂおよびＩｇ
Ｍに属する。

酵素抗体法によシ、ＡＥＮＡＩ　−１〜４は各々ウサギ
抗マウスＩｇＧ２ａ、　　ＩｇＧ２ａ　、　　ＩｇＧ２
ｂ。

ＩｇＭとのみ反応する。

ＯＡＥＮＡＩ−１とＡＥＮＡＩ　−２の抗原（ＮＡＩ　
）に対する反応性は、ＡＥＮｈｌ　−１＞ＡＥＮＡＩ−
２の順である。

θ　ＡＥＮＡＩ　−１〜４はいずれも抗原（ＮＡＩ）に
対して高い親和性を示す。酵素抗体法（エリザ法）によ
る結合阻害実験法においてＡＥＮＡＩ　−１〜３は遊離
抗原と強く結合する。

一方ＡＥＮＡＩ　−４は遊離抗原とほとんど結合せず、
固相化抗原と強く結合する。

〔作用および発明の効果〕

本発明のモノクローナル抗体は、ＮＡＩに対して特異的
であることから、小麦中のＮＡＩ定量用材料として極め
て有用である。さらに小麦種子中のＮＡＩ定量を容易な
らしめることにより、その品種改良の面からも秘めて有
用である。

〔実施例〕

次に実施例を挙げて本発明を説明する。

実施例１ ■　抗原（ＮＡＩ）のＡ製 Ｍｕｎｄｙらの方法（Ｍｕｎｄｙ　、　Ｊ、、　Ｈｅｊ
ｇａａｒｄ　。

Ｊ、ａｎｄ　　５ｒｅｎｄｓｅｎ　　、　　１．　　：
　　ＦＥＢＳ　　Ｌｅｔｔｅｒｓ　　。

１６７．２１０〜２１４（１９８４）］に従って以下の
如く行った。市販小麦粉（トリチウム。

アエステイブム）ｌＫＦを１０ｔの５ＱｍＭリン酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ６，０）で抽出した。

大部分の小麦粉／Ａ渣を遠心機で除去し、上澄を得た。

この上澄に固型硫酸ナトＩＪウムを６０％（ｗ／ＡＷ）
になるように加え、ＮＡＩを含む粗蛋白質沈殿物を得、
遠心機にてこれを集めた。この沈殿物を３０ｍＭリン酸
−１５ｔｎＭクエン酸緩衝Ｗ（ｐＨ５，２）に謂かし、
透析した。３〜４回の透析外液交換を３日間のうちに行
ない硫酸アンモニウムを完全に除去した。得られた蛋白
含有上澄液を、３０ｍＭ’Ｊン酸−１５＋ｎＭクエン酸
緩衝ｌ　（ｐＨ５，２）で平衡化したＣＭ−セファデッ
クスＣ−５０カラム（２，７ｘ３５Ｃｎ１）に吸着させ
０、１　Ｍ　−０，７Ｍの塩化す）　ＩＪウムの塩勾配
を用いて蛋白分離を行った。ＮＡＩの存在は、Ｍｕｎｄ
ｙ氏よシ供与されたＮＡＩに対するウサギ抗血清を用い
て免疫沈降反応（オフタロニー法）により行った。ＣＭ
−セファデックスＣ−５０カラムより得た。＠ＮＡｌｌ
−１．１０μＭリン酸ナトリクム緩衝液（ｐＨ６，８）
にて透析後、同緩衝液で平衡化したバイオゲルＨＰＴカ
ラム（１，７Ｘ３０　ｔ：ｍ　）に吸着させ１０”１０
０＋ｎＭの塩勾配を用いて溶出した。バイオゲルＨＰＴ
カラムより溶出される最初のピークのみがウサギ抗血清
と反応し、その区分はポリアクリルアミド電気泳動上で
トリス−塩酸緩衝ｅ、ｐＨ９，５の条件下で１本のバン
ドとして検出された。このことは、ＮＡＩが純粋に単離
されたことを示す。

得られた精製ＮＡＩのジスルフィド架橋を還元、開環後
、アルキル化した蛋白質を酵素、リシルエンドペプチダ
ーゼによ多切断した。生じド たペプｆ＝ｆ高速液体クロマトグラフィーにより分離後
、各々のペプチドの構成アミノ酸を自動化（気相法シー
クエンサー）及び手動のエドマン分解法によりちくじ切
断し、遊離してくるアミノ酸残基をフェニルチオヒダン
トイン誘導体に変換し、高速液体クロマトグラフィーに
より同定した。このようにしてアミノ酸配列が決った各
々のペプチドの順列は、蛋白質を別に、異なる酵素、ス
タフィロコッカスｖ８プロテアーゼ、により切断後、生
じた個々のペプチドのアミン酸配列を上述のごとく決定
し、オーバーラツプをとることにより行った。その結果
、ＮＡＩは第１図に示すアミノ酸配列を有するものであ
ると判明した。このアミノ酸配列よりＮＡｌ０分子（栓
ば１９６４１である。

Ｃ二・　免疫 Ｂａ１ｂ／Ｃマウス（♀２５２）に、フロイント完全ア
ジュバントに溶解させた３０μ２の抗原（ＮＡＩ）を皮
下注射する。３週間後に同様の皮下注射を行ない、更に
２週間後３０μ２のＮＡＩを生理食塩水に溶かし静脈に
注射した。

最終投与の３日後に牌細胞を採取し、細胞融合に用いる
細胞を得た。

■　細胞融合のためのミエローマ細胞の調製マウスミエ
ローマ細胞Ｐ　−３−ＮＳ　−１／１−Ａｇ４−１は、
１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭ１１６４０培地（白水
製薬■製）を用い、９５％空気及び５％炭酸ガスを含む
気流を流した炭酸ガスインキュベーターにて３７℃で継
代培養した。

■　細胞融合 Ｋｏｅｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｌｎが確立した方法（
Ｋｏｅｈｌｅｒ　、　Ｇ、　ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ
　、　Ｃ，：　Ｎａｔｕｒｅ　。

２５６．４９５（１９７５））に準じ、ミエローマ細胞
２Ｘ１０’個と上述した方法で得られた牌細胞２Ｘ１０
”個をＲＰＭＩ　１６４０培地に３７℃で懸濁させ、１
　ｍｌの５０係ポリエチレングリコール（ホＩＪエチレ
ンクリコール４０００、メルり社製）を１分間にわたり
ピペットの先端で細胞を軽く撹拌しながら添加する。砲
加後史に１分間ゆっくり撹拌する。次にウシ胎児血清を
含まないＩＱｍｌのＲＰＭＩ　１６４０培地をゆっくり
加えポリエチレングリコールを希釈し、室温にて４００
１’で５分間遠心分離を行ない、上清を捨てる。約８０
ｍ１の１０％ＲＰＭＩ　１６４０培地を細胞ペレットに
直接注ぎながらピペットで攪拌し細胞懸ＰＡ液をつくる
。２Ｘ１０’個／　ｍｅ牌臓細胞を含む懸濁液を２４穴
のカルチャープレートに１ゴづつまき、９５％空気−５
％炭酸ガスより成る混合気流中で炭酸ガス培養器を用い
て２４時間培養した後、それぞれのウェルに１＃！ｌＯ
ＨＡ　Ｔ培地を加える。培養後１０〜１４日後に残存す
るクローンにつき、目的とする抗体産生株のアッセイを
酵素免疫法で行なう。抗体産生株を含むウェル内容物を
、ＨＡＴ培地で希釈して９６穴プレートにまき、目的と
する細胞のクローニングを繰り返して行った。クローニ
ングは希釈法を用い、１ウエルあたり１個の融合細胞が
含まれるようにした。この様にしてクローニングを繰り
返し、１つのクローンから出た全てのシングルクローン
が抗体産生であるときをもって、クローンが確立された
とした。このようにしてＮＡＩに対する抗体産生細胞Ｈ
ＡＥＮＡＩ−１、ＨＡＥＮＡＩ−２、ＨＡＥＮＡＩ−３
，およびＨＡＥＮＡＩ−４を得た。

■　抗体の製法 マウス腹腔内での継代培養又は組織培養で継代したＨＡ
ＥＮＡＩ−１、ＨＡＥＮＡＩ−２、ＨＡＥＮＡＩ−３又
はＨＡＥＮＡＩ−４株の細胞約１０’個をあらかじめプ
リステンを投与したマウスの腹腔内に投与する。約３週
間後腹腔内に貯溜した腹腔液を採取し、ヘパリンを数滴
滴下して攪拌する。４００ｆで５分間遠心分離を行ない
血球及び雑種細胞を除き、上清液を得る。得られた腹水
上清液に硫酸す）　ＩＪウムを１６％（φ）になる様加
え、攪拌後３７℃にて４５分間保持する。次いで３００
０Ｇで遠心分離し、目的とする抗体の沈殿物を得る。こ
れを生理食塩水に溶解させ、透析膜にて生理食塩水に対
して透析処理を行ない、抗体の生理食塩水溶液を得た。

実施例２ ＡＥＮＡＩ　−１、ＡＥＮＡＩ　−２、ＡＥＮＡＩ　−
３及びＡＥＮＡＩ　−４の免疫グロブリンクラス上記抗
体を酵素免疫法により９６穴プレート上で各種標品免疫
グロブリンと反応させた。その結果を第１衣に示す。

第１表 表中、＋は反応陽性を、−は反応陰性を示す。第１°、
パトリ、ＡｇＮＡｌ　−１及びＡＥＮＡＩ−２は免疫グ
ロブリンクラスＩｇＧ２ａ　％ＡＥＮＡＩ　−３はＩｇ
Ｇｚｂ。

セしてＡＥＮＡＩ　−４はＩｇＭに属する。

実施例３ パーオキシダーゼで標識されたウサギ抗マウス免疫グロ
ブリンとＡＥＮＡＩ　−１、ＡＥＮＡＩ　−２、ＡＥＮ
ＡＩ　−３およびＡＥＮＡＩ−４との反応性親ミエロー
マ細胞培養ｉ（対照）及び融合細胞ＨＡＥＮＡＩ　−１
、ＨＡＥＮＡＩ　−２、ＨＡＥＮＡＩ　−３およびＨＡ
ＥＮＡＩ　−４の培養液上清につき、その存在する免疫
グロブリンについて酵素免疫法を用いて調べた。結果は
第２弐のとうシである。融合細胞上清液のみ抗マウス免
疫グロブリンと反応を示した。

これは親ミエローマ細胞培養液中には抗体としての免疫
グロブリンが存在しないが培養上溝中には、免疫グロブ
リンが産生されていることを示している。

以下式−；］ 第２表 ＊　４９０　ｎｒｎにおける吸光度 実施例４ ＨＡＥＮＡＩ　−１、ＨＡＢＮＡＩ　−２、ＨＡＥＮＡ
ｉ　−３およびＨＡＥＮＡＩ　−４のモノクローン細胞
性クローニングを４回繰り返し、得られたＨＡＥＮＡＩ
　−１〜４系列の細胞を各々９６大のプレートにまき、
得られたシングルクローンが全て抗体産生株であること
を、パーオキシダーゼ標識ウサギ抗マウス免疫グロブリ
ンを用いて酵素免疫法により確認した。その結果を第３
表に示す。なお、第３表には、得られた数多くの抗体産
生シングルクローンのうち、各７個についての４９Ｑｎ
ｍＫおける吸光度の平均値を示した。

第３表 実施例５ モノクローナル抗体ＡＥＮＡＩ　−１〜４と抗原である
ＮＡＩとの親和性 得られた抗体の抗原に対する親和性を酵素免疫法（エリ
ザ法）による結合阻害測定法で検討した。

まず、抗原であるＮＡＩを１ｑ／ｍｔになるように生理
食塩水に溶解した。この抗原溶液を３．９．２７．８１
、・・・と３倍づつ希釈し、各々の希釈液５０μｔをウ
ェルに分注し、ＨＡＥＮＡＩ　−１、ＨＡＥＮＡＩ　−
２、ＨＡＥＮＡＩ　−３およびＨＡＥＮＡＩ　−４の培
養上清５０μｔを加え、４℃で２４時間インキュベーシ
ョンした。一方抗原の固相化は次のように行った。抗原
を５μｆ／ｍｌになるように０．０５ＭＮ炭酸ナトリウ
ム緩衝液に沼かし、５０μｔを９６穴イミユノプレート
（ヌンク社）の各穴に入れる。４℃で一晩靜置後、抗Ｗ
、液を回収、リン酸緩衝生理食塩水で各穴を３回洗浄し
、その後、１チ牛血清アルブ、ミンを入れて４℃１晩静
置した。１％牛血清アルブミンを含んだイミュノプレー
トの各穴ｅ　０．０５％ツイー′２０を含むリン酸緩衝
生理食塩水で３回洗浄後イミュノプレートを定量操作に
用いた。この抗原を固相化したプレートに、上記抗原−
抗体混合物５０μｔを入れ３７℃２０分間インキュベー
ションした。過剰な抗体及び遊離の抗原を０．０５　％
ツイーン２０を含むリン酸緩衝生理食塩水で３回洗浄後
、同相化された抗原に結合した抗体量を測定した。パー
オキシダーゼ標識されたウサギ抗マウス免疫グロブリン
（２次抗体、バイオランド社）５０μｔを各穴に入れ３
７℃で２０分静置する。過剰な２次抗体を０．０５％゛
′イーン２０を含むリン酸緩衝生理食塩水で３回洗浄し
除く。次いで、１５０μｔの基質−発色液（１ｑｏ−フ
ェニレンジアミン、１μｔ３０Ｔ。

Ｈ２Ｏ２／ゴ０．１　Ｍリン酸カリウム緩衝液ｐＨ６，
０）を加え、暗所で５分間反応させる。パーオキシダー
ゼの反応は５０μｔの６ＮＨＣ１を加えることによって
行った。固相化された抗原に結合した抗体量は４９０１
ｍにおける吸光度を測定することによって得られた。結
果（４回の平均値）を第２図に示す。その結果、ＡＥＮ
ＡＩ　−１〜３は遊離抗原と強く結合すること、またＡ
ＥＮＡＩ−４は遊離抗原とはほとんど結合しないことが
判明した。

次に上記の如く作製された固相化イミュノプレート中に
ＡＥＮＡＩ　−４の培養上清の連続希釈溶液を入れ、（
遊離抗原とのインキュベーションを行なわず）ただちに
、上記同様の定量操作を行った。

その結果、第３図（４回の平均値）に示した如く、パー
オキシダーゼ標識２欠抗体が抗体量に比例して結合し、
ＡＥＮＡＩ　−４は固相化抗原と強く結合することがわ
かる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ＮＡＩのアミノ酸配列を示す図面である。 第２図は、ＡＥＮＡＩ　−１〜４を用いた場合における
抗原（ＮＡＩ）の希釈倍率と、固相化された抗原に結合
した抗体量（２次抗体結合パーオキシダーゼ量）との関
係を示す図面である。 第３図は、ＡＥＮＡＩ　−４を用いた場合における抗体
の希釈倍率と、固相化された抗原に結合した抗体ｔ（２
次抗体パーオキシダーゼ量）との関係を示す図面である
。 以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、小麦由来の小麦α−アミラーゼ阻害蛋白質に対して
   特異的であるモノクローナル抗体。 ２、小麦由来の小麦α−アミラーゼ阻害蛋白質が分子量
   １９６４１を有するものである特許請求の範囲第１項記
   載のモノクローナル抗体。 ３、免疫グロブリンクラスがＩｇＧ＿２＿ａ、ＩｇＧ＿
   ２＿ｂまたはＩｇＭに属するものである特許請求の範囲
   第１項記載のモノクローナル抗体。 ４、小麦由来であつて分子量１９６４１の小麦α−アミ
   ラーゼ阻害蛋白質によつて免疫されたマウスから採取さ
   れる脾細胞と、動物ミエローマ細胞とを融合させて得た
   ハイブリドーマ細胞系ＨＡＥＮＡＩ−１、ＨＡＥＮＡＩ
   −２、ＨＡＥＮＡＩ−３またはＨＡＥＮＡＩ−４が産生
   するものである特許請求の範囲第１項記載のモノクロー
   ナル抗体。