PT92885B - Processo de preparacao de moleculas cataliticas compreendendo um sitio de ligacao com anticorpos e contendo ioes metalicos polivalentes e de composicoes contendo as mesmas bem como processo de realizacao de uma reaccao quimica predeterminada - Google Patents

Description

MEMÕRIA DESCRITIVA

Campo Técnico

O presente pedido de patente refere-se ao processo de preparação de imunogénios, anticorpos e antigénios, e mais especificamente de moléculas receptoras contendo sítios de combinação com anticorpos que se ligam a um imunoligando antigénico e catalisam uma reacção química no imunoligando antigénico que inclui um ião metálico polivalente.

Antecedentes do Invento

Os fenômenos de ligação entre ligandos e receptores podem desempenhar muitos papéis cruciais nos sistemas biológicos. Exemplos de tais fenómenos são a ligação das moléculas de oxigénio à desoxi-hemoglobina para formar oxi-hemoglobina, e a ligação de um substrato a uma enzima que actua sobre ele, tal como a ligação entre uma proteína e uma protease, tal como a tripsina. Ainda exem pios adicionais de fenómenos biológicos de ligação, incluem a ligação de um antigénio a um anticorpo, e a ligação do componente de complemento C3 ao assim denominado receptor CRI.

Muitas drogas e outros agentes terapêuticos são também considerados como dependentes dos fenómenos de ligação. Por exemplo, os opiáceos tais como a morfina são referidos como ligando-se a receptores específicos no cérebro. Descreve-se que os agonis tas e antagonistas dos opiáceos competem com drogas tais como a morfina na ligação aqueles sítios de combinação.

Os ligandos tais como as drogas preparadas pelo homem, tais como a morfina e os seus derivados, e aqueles que estão naturalmente presentes nos sistemas biológicos, tais como endorfinas e hormonas, ligam-se aos receptores que estão naturalmente presentes nos sistemas biológicos, e serão aqui tratados conjuntamente. Uma tal ligação pode conduzir a um número de fenómenos biológicos, incluindo particularmente a hidrólise de ligações amida e éster, assim como a fenómenos onde são hidrolisadas proteínas, nos seus

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SCRF 174.0 POR constituintes polipeptídicos, por uma enzima tal como a tripsina ou a papaína, ou onde uma gordura ê clivada em glicerina e em três ácidos carboxílicos, respectivamente, ou ã síntese de um composto não proteinãceo tal como colesterol.

Slobin, Biochemistry, _5:2836-2844 (1966) descreveu a pre paração de anticorpos para um conjugado de p-nitrocarbobenzoxilo de albumina de soro de bovino. Aqueles anticorpos foram subsequentemente utilizados para hidrolisar o acetato de p-nitrofenilo e ésteres de êpsilon-aminocaproato. A reacção do éster de acetato foi descrita por uma constante de velocidade de segunda ordem e referiu-se que a reacção parecia ser não específica. Referiu-se que a constante de velocidade de segunda ordem, obtida utilizando gama globulina normal, era aproximadamente igual à dos anticorpos especialmente preparados. Referiu-se que a presença dos anticorpos especialmente preparados inibia a hidrólise do éster de aminocaproato.

Kohnen e colaboradores também descreveram tentativas para catalisar a esterólise utilizando anticorpos. Os anticorpos uti lizados por este grupo foram, em cada caso, cultivados para uma porção da molécula de substrato finalmente utilizada que não continha a ligação a ser hidrolisada.

Nos seus trabalhos iniciais /FEBS Letters, 100: 137-140 (1979) e Biochim. Biophys. Acta, 629:328-337 (1980)_/ foram utilizados anticorpos anti-esteróides para hidrolisar ésteres de 7-umbeliferona (7-hidroxicumerina) de um tioéter de carboxietilo de um esteróide. Em cada caso, observou-se um aumento na velocidade hidrolítica quando comparada com a residual ou com uma velocidade obtida com IgG normal. Em ambos os casos, os valores de rendimento foram baixos (cerca de uma mole de substrato por mole de anticorpo por minuto, ou menos), e as velocidades de reacção diminuíram com o tempo, alcançando uma plataforma com a saturação do anticorpo. Essa descida lenta na velocidade foi atribuída a uma ligação irreversível do produto ãcido de esteróide ao anticorpo.

Kohen et al. descreveram também hidrólises de 7-/-N-(2,4

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-7 /

SCRF 174.0 POR dinitrofenil)-6-amino-hexanoíl/-cumerina utilizando anticorpos monoclonais criados para as porções dinitrofenilo daquela molécula de substrato /FEBS Letters 111:427-431 (1980//. Aqui, foi também descrito um aumento na velocidade em relação à residual, mas referiu-se que a reacção era estequiométrica em vez de catalitica. Referiu-se uma diminuição na velocidade que tendia para zero com a saturação do anticorpo. De novo, a diminuição foi atribuída à inibição do produto causada pela ligação do produto ácido ao anticorpo, uma vez que alguma da actividade de hidrólise inicial podia ser regenerada por cromatografia de uma mistura de anticorpo-substrato-produto.

Quando a forte ligação de anticorpo ê dirigida a estados estáveis de moléculas de substrato, a velocidade lenta de dissociação do complexo irá impedir a catálise. Esta é considerada ser a situação para os resultados descritos por Kohnen e colaboradores .

As construções anteriores, embora interessantes, estão severamente limitadas pela incapacidade em endereçar o mecanismo de utilização da energia de ligação que é essencial para as enzimas /W.P. Jencks, Adv. Enzymol., 43, 219 (1975//.

Essas deficiências podem ser rearranjadas pela utilização de um análogo do estado de transição tal como o hapteno para induzir os anticorpos desejados. Este hapteno pode assumir o papel de um inibidor no sistema catalítico.

Assim, a ligação imunológica pode ser utilizada para desviar experimentalmente as interacções de ligação para os processos catalíticos. Por exemplo, foi sugerido que a utilização de um anticorpo para um grupo hapténico, que se assemelha ao estado de transição de uma dada reacção, devia causar uma aceleração na reacção do substrato por forçar os substratos a assemelharem-se ao estado de transição. Jencks, W.P. Catalysis in Chesmitry and Enzymology, página 288 (McGraw-Hill, Nova Iorque 1969). Apesar desta sugestão genérica, não foram sugeridos haptenos de estado de transição específicos, nem foram sugeridas reacções específicas nas

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SCRF 174.0 POR quais podia ser testado o conceito.

A hidrólise de ligações amida e éster é considerada, pela teoria química presentemente aceite, ocorrer em meios aquosos por uma reacção no átomo de carbono de carbonilo para formar um estado de transição que contêm um átomo de carbono tetraédrico ligado (a) a um átomo de carbono da porção ácida da amida ou do éster, (b) a dois átomos de oxigénio, sendo um do grupo carbonilo e o outro de um ião hidroxilo ou de uma molécula de ãgua do meio, e (c) ao átomo de oxigénio da porção ãlcool de um éster ou ao átomo de azoto da porção amina de uma amida. Os estados de transição destas reacções são estruturas mentais úteis que por definição, não podem ser isoladas, quando comparadas a intermediários, que são isoláveis.

Embora os estados de transição hidrolíticos anteriores não possam ser isolados, tem sido dedicada ao tema uma grande quantidade de literatura científica. Alguma dessa literatura ê aqui a seguir discutida.

Enquanto que se considera que o estado de transição, anteriormente descrito para a hidrólise de amida e de éster, é bem entendido, os parâmetros da topologia, por exemplo, tamanho, forma e carga, dos sítios de combinação com receptores, nos quais as amidas particulares, tais como proteínas, ou ésteres, tais como gorduras, que reagem através daqueles estados de transição, não são tão bem entendidos. Deste modo, seria benéfico se a topologia de uma pluralidade de sítios de combinação fosse conhecida de modo que pudessem ser estudadas as interacções dos ligandos que se ligam naqueles sítios. Infelizmente, a topologia dos sítios de combinação com receptores em hidrólises biológicas e geralmente desconhecida, exceptuando a de um número relativamente pequeno de enzimas cujas estruturas foram determinadas por cristalografia de raios X.

Esta falta de conhecimento da topologia dos sítios de combinação provém em parte de uma falta de conhecimento, mesmo da localização nas células de muitos sítios de combinação com receptores. Adicionalmente, para os sítios de combinação de receptores

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SCRF 174.0 POR cuja localização é conhecida, a identidade química; i.e., a composição :en proteínas e carbo-hidratos, do sítio de combinação é geralmente desconhecida. Assim, o investigador estã geralmente bloqueado na procura para compreender os requisitos topológicos dos sítios de combinação de receptores e, deste modo, na procura para construir agentes terapêuticos que possam preencher aqueles requisitos .

Os investigadores têm de, consequentemente, avaliar agentes terapêuticos potenciais em estudos em animais ou em culturas de células para averiguar se um agente terapêutico potencial pode ser útil. Estes sistemas, embora úteis, são caros e demasiado morosos para serem utilizados.

Mesmo quando são conhecidas a topologia e a reactividade química de um receptor hidrolitico tal como uma enzima, as enzimas tais como as proteases hidrolíticas clivam tipicamente os seus substratos, cadeias polipeptidicas, numa posição adjacente a um resíduo de aminoâcido particular que pode ocorrer várias vezes na cadeia polipeptídica da proteína. Embora possa ser útil uma tal clivagem relativamente aleatória, na obtenção de um mapa polipeptídico da proteína, essa clivagem relativamente aleatória não é tão útil quando se desejam produzir sequências de resíduos aminoácidos particulares.

Por exemplo, as técnicas modernas de engenharia genética têm sido úteis na preparação de proteínas de fusão que contêm uma proteína ou polipéptido desejado fundidos com o produto de transcrição de um gene vector tal como o gene lac ζ. A utilização de tais proteínas de fusão é, contudo, impedida pela presença de fragmentos do produto do gene vector. Deste modo, seria também benéfico que pudessem ser desenvolvidas moléculas semelhantes a enzimas proteolíticas, que clivassem tais produtos de fusão entre as porções de polipéptidos ou proteínas de fusão desejadas e as não desejadas.

Recentemente, Lerner, Tramontano e Janda /_ Tramontano et al., Science, 234, 1566 (1986)/ descreveram anticorpos monoclo70 532 jgf’

Zí·' <A g’·'

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Υ⁷ nais que hidrolisaram cataliticamente um éster. Tramontano e Lerner, descrevem também, na Patente US N9 4 656 567, a utilização de anticorpos monoclonais na hidrólise de ésteres. Pollack, Jacobs e Schultz /Science, 234, 1570 (1986// descreveram uma proteína de mieloma denominada MOPC167 / Leon et al., Biochem, 10, 1424 (1971// que catalisa a hidrólise de um carbonato.

Nas duas referências de Lerner e Tramontano, os anticorpos foram criados para um fosfonato que foi sintetizado para representar um análogo estável do estado de transição hidrolitico tetraédrico do éster de ãcido carboxílico ou do éster de carbonato. O anticorpo de Pollack et al. principalmente descrito foi uma proteína de mieloma que se ligava a um fosfonato que era estruturalmente análogo ao análogo de carbonato hidrolisado. Assim, no trabalho de Lerner e Tramontano et al., o substrato a ser hidrolisado foi pré-seleccionado, com o análogo de imunização e com os anticorpos hidroliticos sendo sintetizados de acordo com o produto desejado. Pollack et al. conceberam o substrato a ser hidrolisado, uma vez que eles conheciam a especificidade da proteína de mieloma. Pollack et al. descreveram também (acima) a existência de um sistema catalítico de anticorpo, substrato e análogo de substrato para a hidrólise de carbonato, similar em conceito ao de Lerner et al. 0 trabalho relativo a esse sistema é descrito em Jacobs et al., J. Am. Chem. Soc., 109, 2174 (1987) .

pedido de patente publicado WO 85/02414 discute a possível utilização de anticorpos como catalisadores, e apresenta dados relativos ã utilização de soro policlonal na hidrólise de o-nitrofenil-beta-D-galactosido. Refere-se que os anticorpos uteis naquele pedido de patente são induzíveis por um reagente, por um intermediário de reacção ou por um análogo do reagente, produto ou intermediário de reacção. 0 termo análogo é aí definido para abranger os isómeros, homólogos ou outros compostos, suficientemente semelhantes ao reagente em termos de estrutura química de modo que um anticorpo cultivado para um análogo pode participar numa reacção imunológica com o reagente, mas não catalisará necessariamente uma reacção do análogo.

Os dados fornecidos nessa descrição apenas indicam que

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...Λ

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A- &, ~

- 9 ocorreu alguma clivagem do galactósido substrato (reagente), durante um período de tempo de dezoito horas, utilizando uma preparação de anticorpos relativamente concentrada (diluições a 1:10 e 1:20). Embora fosse referida a catálise, não se mostrou a actividade catalítica uma vez que não se mostrou o regeneramento do anticorpo alegadamente catalítico, nem havia uma indicação da percentagem de galactósido substrato clivado. Aquele pedido de patente indicou que a beta-D-galactosidase clivou cerca de dez vezes mais substrato do que os anticorpos policlonais, supondo uma linearidade da absorvância para a concentração anónima de substrato estudado .

Dos dados apresentados naquele pedido de patente, ê possível que ocorresse uma substituição nucleofílica do grupo o-nitrofenilo por um grupo amino terminal de um resíduo de lisina da preparação de anticorpos utilizada. Assim, a absorvância observada podia ter sido devida ã formação de êpsilon-aminolisinil-o-nitrofenilanilina ou â formação de um épsilon-aminolisinilgalactósido e de o-nitrofenol, não podendo ser catalítica qualquer uma das ocorrências uma vez que o anticorpo foi consumido em vez de ser regenerado.

Num trabalho mais recente, tem sido descrita a formação de uma amida bimolecular, catalisada por moléculas de anticorpo /Benkovic et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 85:5355 (1988//, bem como um rearranjo de Claisen catalisado por anticorpos /Jackson et al., J, Am. Chem. Soc., 110:4841 (1988//. A estereospecificidade foi mostrada numa reacção de formação de lactona catalisada por anticorpos /Napper et al., Science, 237:1041 (1987// e numa reacção de Claisen catalisada por anticorpos /Hilvert et al., Proc. Natl. Acad, Sei. USA, 85:4953 (1988//.

Rearden et al., Nature, 318:266-268 (1985) e Meares et al., Patente US N9 4 722 892 descrevem anticorpos que se ligam a iões metálicos complexados. 0 ácido etilenodiaminatetra-acético (EDTA) e os seus derivados foram especificamente referidos como agentes de quelação bidentados.

^2

- 10 ΊΟ 532

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As especificidades dos anticorpos descritos, quer no artigo de Rearden et al., quer na patente de Meares et al., foram referidas como particulares para um ião metálico complexado com EDTA, idêntico ao ião metálico, complexado com EDTA de imunização, exceptuando a ausência de um grupo de ligação utilizado para ligar o ião metálico complexado com EDTA ã hemocianina de lapa (Fissurella) (KLH) para formar um conjugado imunizante. A mudança do ião metálico no complexo resultou em diferenças de constante de associação (K ) entre o anticorpo e o ião metálico complexado de ^a 3 tanto quanto 10 . A patente de Meares et al., mostra que os seus anticorpos têm um K para o complexo que é pelo menos cerca de dez vezes maior do que o K^ para o agente de quelação sozinho ou para o seu complexo com um outro metal.

Nenhum dos ensinamentos de Rearden et al. ou de Meares et al. inclui o conceito de utilizar os seus anticorpos como catalisadores como aqui a seguir se descreve. Por consequência, esses ensinamentos não podiam também contemplar a utilização de um complexo de coordenação cineticamente inerte, como imunogenio, e de um complexo de coordenação cineticamente lãbil, como antigénio reactivo, como também aqui a seguir se descreve. Serão ainda evidentes outras diferenças entre aquelas referências e o presente invento a partir da descrição que se segue.

O artigo anteriormente referido de Tramontano et al., Science, 234:1566-1570 (1986) descreve também reacções hidrolíticas catalisadas por anticorpos cultivados para um análogo do estado de transição, contendo fosfonato, do substrato hidrolitico proposto. Um dos análogos continha um derivado de ãcido dipicolínico covalentemente ligado perto do grupo fosfonato que mimetizou o átomo de carbono de carbonilo tetraédrico cindível. Referiu-se que o grupo de ãcido dipicolinico foi concebido para incluir um sítio de coordenação de ião metálico polivalente por analogia com um modelo de metaloenzima para as reacções de hidrólise. Embora os anticorpos induzidos por aquele análogo de estado de transição fos sem capazes de catalisar a hidrólise de ésteres antigénicos, essa hidrólise catalítica foi realizada na ausência de um ião metálico

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- 11 polivalente, e não foi feita nenhuma referência adicional naquele artigo quanto ã utilização de ura complexo de ião metálico polivalente-ãcido dipicolínico para auxiliar na catálise das reacções hidrolíticas estudadas.

Breve Sumário do Invento

O presente invento contempla moléculas de anticorpo aqui designadas por moléculas de receptor, imunogénios aqui designados por primeiros imunoligandos ou imunoligandos de imunização, e antigénios aqui designados por segundos imunoligandos ou imunoligandos antigénicos. Uma molécula de receptor catalisa uma reacção de uma segunda molécula de imunoligando. São também contemplados os processos de preparação e a utilização das moléculas anteriores.

Mais particularmente, é contemplada uma molécula catalítica compreendendo uma molécula de receptor contendo um sítio de combinação de anticorpos. Aquele receptor liga-se imunologicamente a uma pluralidade de imunoligandos contendo, cada um, um complexo de coordenação de ião metálico polivalente. 0 complexo de coordenação de um primeiro imunoligando é cineticamente inerte e o complexo de coordenação de um segundo imunoligando é cineticamente lãbil. A molécula de receptor catalisa uma reacção química do segundo imunoligando, e não catalisa nenhuma reacção química no primeiro imunoligando. De preferência, os receptores são moléculas de receptores monoclonais presentes numa composição.

Uma molécula de receptor monoclonal, catalítica, preferida, forma um imunocomplexo com o primeiro imunoligando, tendo — —8 uma constante de dissociação de cerca de 10 ou inferior. O primeiro imunoligando compreende um complexo de coordenação de ião metálico, cineticamente inerte, que contém um primeiro ião metálico polivalente coordenado a dois ou mais ligandos de coordenação de ião metálico individuais. O primeiro dos ligandos de coordenação individuais é uni- ou multidentado, e o segundo dos ligandos individuais é uni- ou bidentado. O segundo ligando de coordenação individual inclui adicionalmente uma primeira estrutura orgânica

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- 12 não reactiva que contém uma cadeia, um anel ou um anel substituído com cadeias de pelo menos 10 átomos.

segundo imunoligando compreende um complexo de coordenação de ião metálico cineticamente lãbil que contém um segundo ião metálico polivalente, diferente do ião metálico do primeiro complexo de coordenação, ou de um estado de oxidação mais baixo do mesmo metal que o presente no primeiro complexo de coordenação. Esse ião metálico estã coordenado a dois ou mais ligandos de coordenação de ião metálico individuais. O primeiro dos ligandos de coordenação individuais é uni- ou multidentado e tem um tamanho substancialmente similar, uma funcionalidade de coordenação de ligando e uma estrutura substancialmente similar ao primeiro ligando de coordenação do complexo de coordenação cineticamente inerte. O segundo dos ligandos individuais é uni- ou bidentado, e inclui, adicionalmente, uma estrutura orgânica reactiva que contém uma cadeia, um anel ou um anel substituído com cadeias de pelo menos 10 átomos, com uma similaridade configuracional atómica, suficiente, em relação ã primeira estrutura orgânica não reactiva, de forma a que a constante de dissociação para um imunocomplexo, formado entre a molécula catalítica e o segundo ligando de coor-2 denaçao, seja no máximo 10

De preferência, o número de coordenação do ião metálico do segundo imunoligando é igual, ou não inferior, ao número de coordenação do ião metálico do primeiro imunoligando menos um. É também preferido que cada um dos complexos de coordenação de ião metálico, cineticamente inerte e cineticamente lãbil tenha duas ou mais faces que sejam reiativamente hidrofõbicas e uma ou duas faces que sejam reiativamente hidrofílicas, e que as faces reiativamente hidrofóbicas sejam proporcionadas, pelo menos em parte, pelos primeiros ligandos de coordenação.

Na prática particularmente preferida, a molécula de receptor é uma absin que catalisa a cisão de uma ligação peptídica, pré-seleccionada, de um péptido contendo pelo menos 3 resíduos aminoácidos. Aqui, a estrutura orgânica reactiva do comple70 532

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S?

- 13 xo de coordenação cineticamente lãbil contém um péptido de pelo menos 3 resíduos aminoácidos, incluindo o resíduo cuja ligação peptídica é clivada. A estrutura orgânica não reactiva do complexo de coordenação cineticamente inerte contém um péptido com 3 a cerca de 10 resíduos aminoácidos, tendo um carbono amidocarbonilo que está ligado, por uma cadeia de 2 a cerca de 7 átomos, a um grupo funcional de coordenação e que estã numa posição análoga ao carbono carbonilo cindivel da ligação peptídica hidrolisada.

Quando o ião metálico do primeiro imunoligando cineticamente inerte é Co(III), o ião metálico do segundo imunoligando cineticamente lãbil ê, de preferência, um membro do grupo constituído por Zn(II), Fe(III), Co(II), Cu(II), Ga(III), Lu(III), In(III), Ni(II), Mn(II), Al(III), e Mg(II).

De acordo com um aspecto do processo deste invento, mistura-se uma quantidade catalítica de uma molécula de receptor anteriormente descrita, num meio aquoso, com o segundo imunoligando, e a mistura assim formada ê mantida durante um período de tempo suficiente para que a reacção desejada ocorra.

É conveniente descrever a reacção catalisada nos termos geralmente utilizados para descrever reacções de enzimas. Utilizando essa terminologia, a molécula de receptor ê análoga ã enzima, e o segundo imunoligando é constituído por um cofactor, compreendendo o ião metálico polivalente e o primeiro ligando de coordenação individual, e um substrato que é constituído pelo segundo ligando de coordenação individual. Numa reacção típica, a molécula de receptor estã presente numa quantidade catalítica e a concentração de cofactor ê de cerca de 0,1 a cerca de 10 vezes a do substrato.

As moléculas de receptores úteis são preparadas por imunização de um animal adequado, tal como um ratinho ou um outro animal de laboratório, com um inoculo contendo um primeiro imunoligando previamente descrito. Tipicamente, o primeiro imunoligando está ligado a uma molécula transportadora antigénica tal como KLH para a imunização.

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Os animais imunizados são subsequentemente testados para avaliar a secreção de moléculas de anticorpo que se ligam (imunorreagem com) ao primeiro imunoligando, sozinho ou ligado a uma outra molécula transportadora, tal como BSA, diferente da primeira molécula transportadora. Quando se desejam moléculas de receptor policlonal, recolhem-se os anticorpos que imunorreagem com.o primeiro imunoligando. Esses anticorpos recolhidos são subsequentemente analisados utilizando um segundo imunoligando anteriormente descrito, e aqueles que catalisam uma reacção predeterminada, desejada, do segundo imunoligando são recolhidos para utilização.

Quando se desejam os receptores monoclonais preferidos, as células secretoras de anticorpos, tais como as células do baço de um animal que segrega anticorpos para o primeiro imunoligando, são fundidas com células de mieloma adequadas para formar hibridomas. Os hibridomas produzidos são tipicamente testados para avaliar a produção de anticorpos monoclonais que imunorreagem com o primeiro imunoligando. Os hibridomas são de preferência testados para avaliar a sua capacidade para segregar anticorpos monoclonais que se ligam e catalisam a reacção predeterminada, desejada, do segundo imunoligando. Esses últimos hibridomas são então cultivados e recolhem-se os seus anticorpos monoclonais.

O presente invento tem vários benefícios e vantagens.

O mais notável dos benefícios resulta do facto de ele ter permitido pela primeira vez, a preparação e utilização de um catalisador não enzimãtico que é capaz de catalisar a hidrólise de uma ligação peptídica.

Entre as vantagens do invento estã o facto de que a sua utilização permite a preparação de catalisadores que podem ser usa dos para catalisar substancialmente qualquer reacção susceptível de ser catalisada por um ãcido de Lewis num meio aquoso.

A partir da discussão que se segue serão ainda evidentes para os peritos na arte outros benefícios e vantagens do invento.

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SCRF 174.0 POR «?te.

Breve Descrição dos Desenhos

Nos desenhos que constituem parte desta descrição:

A Figura 1 é uma representação esquemática que ilustra a síntese da estrutura orgânica hapténica não reactiva 1, que foi utilizada como primeiro imunoligando imunogénico, e tamhém como inibidor. A porção peptídica da molécula foi sintetizada por processos de síntese de fase sólida e foi construida a partir do ter minai carboxilo na direcção do terminal amino, utilizando um processo de adição por passos.

No passo a, usou-se um protocolo de fase sólida convencional utilizando uma resina SASRIN (Bachem Biosciences Inc.) e aminoácidos de N-fluoren-9-ilmetoxicarbonilo (FMOC) como se descreveu em Stewart, J. M. e Young, J. D., em Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Company, Illinois, (1984) página 82, cuja descrição é aqui incorporada como referência.

No passo b, alquilaram-se redutivamente 2 equivalentes de 3-fenilpiruvato na amina desbloqueada do terminal amino do pép tido ligado ã resina (1 equivalente), utilizando 2,5 equivalente de borohidreto de sódio em THF:1^0 4:1 (v:v) como solvente, a pH 7,5 para formar o aminoácido secundário que é racémico como se in dica pela linha ondulada. A reacção foi realizada num dispositivo agitado, e passadas 12 horas verificou-se, por análise com ninidrina, que a reacção estava completa.

produto da alquilação redutiva foi clivado da resina no passo c, usando ácido trifluoroacético a um por cento em diclo rometano (v:v), e o solvente foi removido in vacuo. O resíduo foi dissolvido em ãgua a pH 7,0 e purificado utilizando técnicas convencionais de HPLC de fase inversa numa coluna PepRPC eluída com um gradiente linear de acetonitrilo em ãgua, de 0-40 por cento, em volume.

O complexo Co(III) (trieno) (CO^) foi convertido no cofac tor de complexo diaquo no passo d, por reacção com 1,2 equivalen3

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SCRF 174.0 POR y·- - 16 tes de HC1 em ãgua.

O complexo diaquo do passo d (um equivalente) foi misturado no passo e com o péptido do passo c (1,1 equivalentes) em água, a um valor de pH de 8,5, durante um período de 6 horas. O imunoligando resultante foi purificado por cromatografia de permuta iónica em Sephadex CM-50-120 por eluição com KC1 0,2 N. A fracção apropriada foi liofilizada até ã secura, e o produto puro foi retomado em etanol.

Os péptidos de N-acilo 2“Z foram preparados por acilação de péptidos preparados similarmente. Os imunoligandos preparados a partir dos péptidos 2“Z θ do cofactor foram preparados in situ.

A Figura 2 é uma fotografia de uma cromatografia de camada fina que ilustra a clivagem, catalisada pelo receptor 28F11, de um imunoligando compreendendo um complexo de coordenação do pêptido 2 ^e ãe um ião metálico polivalente - trieno 1:1. Para cada reacção, foram colocados 10/iM de receptor 28F11, 1,2 mM de péptido 2 ^e 3 mM de ião metálico polivalente - trieno em NaCl 50 mM tampão fosfato 75 mM a pH 6,5. Todas as reacçoes foram realizadas durante 5 dias a 37°C. Foi manchada uma alíquota de cada solução reaccional (3,5 microlitros; çil) numa placa de cromoatografia de camada fina de sílica que foi eluida com metanol: ãgua a 4:1 (v:v). A placa foi então pulverizada com uma solução de fluorescamina a 0,2 por cento em acetona, e visualizada com luz de comprimento de onda elevado. 0 produto de clivagem aparece como o material reactivo com fluorescamina sendo eluído próximo da frente de solvente. O receptor e o metal-trieno permanecem na origem. Os vários iões metálicos utilizados estão enumerados ao longo do fundo da fotografia, com a faixa mais ã direita ilustrando uma re acção de controlo que continha o receptor, o péptido 2_, e o trieno, mas não o ião metálico polivalente. A reacção do trieno com a fluorescamina parece atenuada nas reacçoes contendo os iões metálicos corados Co(II), Cu(II) e Pd(II). Antes da reacção, o receptor purificado foi dialisado contra EDTA para remover os iões

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- 17 metálicos, e todas as soluções foram feitas com ãgua bidestilada tratada com Chelex. Todos os sais de metais utilizados foram da mais elevada pureza comercialmente disponível.

A Figura 3 contém três painéis (3A, 3B e 3C) que são cópias de espectros de RMN de ^ΧΗ a 300 MHz em ppm, tomados em D₂ ^0, do péptido 2 (3A) e dos dois produtos observados (3B e 3C) na reacção catalisada pelo receptor 28F11, na presença de Zn(II)(trieno) . As estruturas do péptido 2_ e dos dois produtos estão representadas nos respectivos espectros.

Descrição Detalhada do Invento

I. DEFINIÇÕES

O presente invento refere-se a imunogénios, anticorpos e antigénios que envolvem complexos de coordenação de ião metálico polivalente. Assim, estão envolvidos dois tipos de fenómenos de ligação; i.e., (a) entre o sítio de combinação com anticorpos e o seu imunogénio ou antigénio, e (b) entre o ião metálico polivalente e o(s) seu(s) ligando(s) coordenado(s). Ambos os tipos de fenómenos são interacções ligando-receptor num sentido geral. A discussão que se segue imediatamente a seguir descreve as várias palavras e frases aqui utilizadas referentes a receptores e a ligandos.

O termo receptor é aqui utilizado para significar uma molécula biologicamente activa, contendo um sítio de combinação com anticorpos, que se liga a um imunogénio, a um antigénio ou a um inibidor especifico cuja estrutura se assemelha à do antigénio ou à do imunogénio. Essas moléculas de receptor são anticorpos ou porções de anticorpos contendo paratopo, e contêm, por consequência, um sítio de combinação com anticorpos.

A actividade biológica de uma molécula de receptor é evidenciada pela ligação do receptor a um imunogénio, antigénio, ou ligando inibidor, apõs a sua mistura num meio aquoso, pelo menos, a valores fisiológicos de pH e de forças iõnicas. De prefe70 532

/.?

SCRF 174.0 POR rência, os receptores ligam-se também a um imunoligando dentro de um intervalo de valores de pH de cerca de 5 a cerca de 9, e a forças iõnicas com um valor compreendido entre o da ãgua destilada e o de uma solução de cloreto de sódio de cerca de um molar.

O termo imunoligando é aqui utilizado para significar um imunogénio, um antigénio ou uma molécula inibidora, como anteriormente se referiu que estã ligada a uma molécula de receptor.

Os imunoligandos anteriores são, cada um, um complexo de coordenação de ião metálico polivalente. Estes complexos de coordenação são geralmente bem conhecidos, pelo menos em química inorgânica, embora se pense que os complexos aqui contemplados sao novos. Um complexo de coordenação de ião metálico polivalente é algumas vezes aqui designado por complexo de coordenação ou, mais simplesmente, por complexo.

O ião metálico polivalente dos complexos de coordenação estã coordenadamente ligado aos grupos funcionais de, pelo menos, dois ligandos de coordenação, com o número mãximo destes ligandos de coordenação sendo determinado pelo número de coordenação do ião metálico polivalente, como ê bem conhecido. Esse número de coordenação ê normalmente seis, embora sejam conhecidos alguns complexos com um número de coordenação de dez. Um ligando de coordenação será aqui referido como tal, ou por uma frase similar, para distinguir estes grupos de um ligando, tal como um antigénio, imunogénio ou inibidor, que estã ligado a uma molécula contendo sítios de combinação com anticorpos.

São aqui utilizados dois tipos de complexos de coordenação que são designados por cineticamente inertes e cineticamente lãbeis. Esses termos referem-se ã estabilidade cinética e não ã estabilidade termodinâmica dos complexos, e, mais especificamente, ãs velocidades relativas com as quais os ligandos de coordenação podem ser substituídos em cada complexo. De facto, alguns complexos que são termodinamicamente instáveis num dado meio podem persistir inalterados durante semanas naquele meio devido ao facto de serem cineticamente inertes.

ΊΟ 532

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- 19 A maior parte da evidência disponível referente aos complexos de coordenação pode ser explicada com base na sua configuração electrónica tal como é apresentada pela teoria do enlace de valência. Em geral, os complexos lãbeis são, quer do tipo de orbital exterior, quer do tipo de orbital interior com pelo menos uma orbital d de mais baixa energia, vazia. Contudo, esta explicação nem sempre se mantém em face dos resultados experimentais.

Devido ao facto de a configuração electrónica do ião metálico polivalente, num complexo de coordenação, poder ser difícil de avaliar, e não ser sempre previsível, é utilizada na arte uma definição operacional. Uma definição operacional útil,para um complexo cineticamente lábil, é a de que uma reacção de substituição estã completa dentro do tempo de mistura; i.e., cerca de um minuto, ã temperatura ambiente, utilizando soluções aproximadamente 0,01 molares. Um complexo cineticamente inerte sofre uma reacção de subs tituição a uma velocidade que é, quer demasiadamente lenta para ser medida, quer suficientemente lenta para ser seguida ãs condições usuais por técnicas convencionais. /Basolo, F. e Pearson, R., Mechanisms of Inorganic Reactions, John Wiley & Sons, Inc., Nova Iorque (1963) página 104, cujo texto é aqui incorporado como referência/. Aquela definição operacional tem sido um pouco aperfeiçoada quando se diz que os complexos, cujas reacções podem ser estudadas por processos estáticos,são inertes, e os cujas reacções são mais rápidas são lábeis. /Cotton, F. A. e Wilkinson, G., Advanced Inorganic Chemistry, Interscience Publishers, Nova Iorque (1972) página 653, cujas descrições são incorporadas como referência/. Ê aqui utilizada a definição anterior com o seu aperfeiçoamento.

As frases e os termos adicionais aqui utilizados, são definidos ou explicados onde são utilizados.

II. INTRODUÇÃO

A. Aspecto Geral

O presente invento refere-se a moléculas de receptor,definidas como anteriormente,que se ligam imunologicamente a uma plu70 532

SCRF 174.0 POR ralidade de imunoligandos. As moléculas de receptor são induzidas por e, deste modo, ligam-se a um primeiro imunoligando imunogénico, e ligam-se também a um segundo imunoligando antigenico. As moléculas de receptor catalisam uma reacção do segundo imunoligando, e assim as moléculas de receptor partilham as propriedades de ligação e de reacção exibidas pelas enzimas.

Cada um dos imunoligandos ligados a uma molécula de receptor contém um complexo de coordenação de ião metálico polivalente. 0 complexo do primeiro imunoligando imunogénico é cineticamente inerte, enquanto que o complexo do segundo imunoligando, antigénico e reactivo, é cineticamente lãbil.

Os anticorpos são induzidos utilizando um primeiro imunoligando imunogénico que está tipicamente ligado a uma molécula transportadora antigénica (imunogênica). Os anticorpos assim induzidos são colhidos e ensaiados quanto à sua capacidade para se ligarem (imunorreagirem com) ao imunoligando de imunização, ligado a uma molécula transportadora diferente, e/ou livre em solução,como uma molécula de inibidor.

As células produtoras deimunoglobulina, tais como as do baço de um animal cujos anticorpos se ligam ao imunoligando de imunização, são recolhidas e são fundidas com células de mieloma para formar células de hibridoma. As células de hibridoma são cultivadas num meio de cultura e o meio sobrenadante das células de hibridoma em cultura é ensaiado de novo para determinar a presença de anticorpos que se ligam ao imunoligando de imunização.

As células de hibridoma cujo sobrenadante contém estes anticorpos de ligação são então analisadas para determinar quais as células que segregam anticorpos que também se ligam a e catalisam uma reacção de um segundo imunoligando reactivo. As células de hibridoma, cujos anticorpos segregados se ligam ao primeiro imunoligando de imunização e se ligam a um segundo imunoligando reactivo e catalisam uma reacção desse segundo imunoligando, são então clonadas para proporcionar os anticorpos monoclonais desejados, a partir do sobrenadante do meio de cultura ou a partir de ascites

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de um mamífero hospedeiro no qual é introduzido o hibridoma.

Os anticorpos monoclonais descritos podem ser utilizados como os receptores deste invento. Alternativamente, as porções Fc ou Fc', assim denominadas, dos anticorpos podem ser removidas por clivagem enzimática para proporcionar moléculas de receptor contendo sítios de combinação com anticorpos, tais como porções de anticorpos Fab, F(ab')₂ ou Fab', respectivamente.

B. Comparação entre Enzima/Anticorpo Catalítico

Os anticorpos e as enzimas são ambos proteínas cuja função depende da sua capacidade para se ligarem a moléculas alvo especificas. As reacções enzimáticas diferem das reacções imunolõgicas no facto de, numa reacção enzimática, a ligação da enzima ao seu substrato conduzir tipicamente ã catálise química, enquanto que um complexo não catalítico ê o resultado usual da ligação anticorpo-antigénio.

Crê-se que as enzimas catalisam reacções, tais como a hidrólise de proteínas por combinação com a proteína, para estabilizar o estado de transição da reacção de hidrólise. Geralmente, considera-se que a velocidade de uma reacção enzimática ê aumentada relativamente ã velocidade de uma reacção não enzimática em virtude da capacidade da enzima para estabilizar o estado de transição da reacção; i.e., para reduzir a energia livre do estado de transição, e assim, a energia livre de activação, da reacção /Jencks,

W. P., Adv. Enzymology, 43, 219 (1975) e Pauling, L., Amer. Scientist, 36, 58 (1948//. O suporte para esta teoria provém da observação de que, as substâncias que são consideradas como modeladoras dos estados de transição presumidos estão muitas vezes fortemente ligadas âs enzimas como inibidores competitivos. Leinhard, G., Science, 180, 149 (1973) e Wolfenden, R. , Acc, Chem. Res., 5, 10 (1972). Adicionalmente, considera-se que a enzima consegue esta diminuição da energia livre de reacção ligando-se mais fortemente â geometria do estado de transição do reagente do que ao(s) correspondente (s) substrato(s) ou produto(s).

Isto significa que a energia de ligação intrínseca da

ΊΟ 532

SCRF 174.0 POR enzima é muito maior do que a que pode ser medida a partir da ligação aos substratos ou produtos. Essencialmente, a energia de ligação da enzima ê utilizada para realizar a reacção química /Jencks, W. Ρ., XVII International Solvay Conference (Novembro de 1983X/.

A proposição recíproca é a de que um anticorpo que é preparado para se ligar optimamente a um análogo adequado de um estado de transição podia funcionar como um catalisador. A demonstração deste resultado por Lerner e colaboradores e por Schultz e colaboradores nos artigos previamente citados e nos que a seguir se citam, completa a correlação entre função da enzima e a estrutura do anticorpo,e constitui uma abordagem útil na idealização de enzimas artificiais.

Assim, como anteriormente se referiu, tem-se verificado que os anticorpos monoclonais são capazes de catalisar um número de reacções químicas incluindo a hidrólise de ésteres /Tramontano et al., Science 234: 1566 (1986) e Tramontano et al., J. Am. Chem. Soc. 110: 2282 (1988/7, a hidrólise do carbonato /Pollack et al., Science 234: 1570 (1986) e Jacobs et al., J. Am. Chem. Soc. 109:

2174 (1987//, uma reacção de lactonização estereoespecífica /Napper et al., Science 237: 1041 (1987/7, a formação de amida bimolecular /Benkovic et al., Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 85: 5355 (1988) e Janda et al., J. Am. Chem. Soc., 110: 4835 (1988/7, um rearranjo de Claisen /Jackson et al., J. Am. Chem. Soc. 110: 4841 (1988) e Hilvert et al., Proc. Nat. Acad. Soc. USA, 85: 4953 (1988/7, a hidrólise de uma amida de p-nitroanileto /Janda et al., Science,

110: 7888 (1988/7 θ uma clivagem fotoquímica de dímeros de timina /Cochran et al., J. Am. Chem. Soc., 110: 7888 (1988/7· Recentemente, foi também descrito um sistema no qual um grupo cofactor estava covalentemente ligado a um sítio de ligação com anticorpos /Pollack et al., Science 242: 1038 (1988/7A maioria dos anticorpos catalíticos anteriores foram produzidos por imunização de um animal com um composto de análogo do estado de transição que se assemelha, quer na forma, quer na distribuição de carga, a uma estrutura de energia elevada que se considera que ocorre ao longo do precurso reaccicnal. Os anticorpos resultantes ca70 532

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f..

<' talisaram então a reacção desejada, presumivelmente, utilizando forças de ligação para diminuir a energia da estrutura de energia elevada, baixando assim a barreira reaccional global. Em alguns casos, as cadeias laterais de resíduos de aminoácidos quimicamente reactivos, nos sítios de ligação de anticorpos, têm sido implicadas na reacção catalisada. / Janda et al., Science 241: 1188 (1988); Cochran et al., J. Aro. Chem. Soc. 110: 7888 (1988) e Tramontano et al. , Proc. Nat. Acad. Scl. USA, 83: 6736 (1986),/.

O mecanismo pelo qual um anticorpo hidrolisa uma ligação éster ou amida, de um ligando substrato, ligado, anteriormente descrito, pode ser imaginado em termos de um modelo de ajuste induzido. Como o substrato, fracamente ligado, se distorce ou rearranja para se ajustar â geometria de ligação do anticorpo, a tensão pode ser aliviada por reorganização química de uma única ligação éster ou amida predeterminada de modo que esta reorganização conduza ã hidrólise da ligação.

A participação do ião metálico na hidrólise da ligação amida tem sido observada quer nos sistemas enzimáticos /Lipscomb, Acc. Chem. Res., 15: 232 (1982)_/ e Mathews, Acc. Chem. Res., 21: 333 (1988)_7quer nos sistemas de modelo /Collman et al. , J. Am. Chem. Soc. , 85: 3039 (1963) ; Buckingham et al. , J. Am. Chem. Soc. , 92:6151 (1970).; Schepartz et al. , J. Am. Chem. Soc., 109:1814 (1987) e Groves et al. , J. Am. Chem. Soc. , 106:630 (1984),/. Têm sido identificados pelo menos dois tipos de interacções entre o metal e a amida.

No primeiro tipo, o átomo metálico coordena-se directamente com o oxigénio do carbonilo da amida. A polarização resultante do grupo carbonilo facilita o ataque nucleofílico do hidróxido ou da ãgua ao átomo de carbono de carbonilo. Um outro modo de catálise consiste no ataque de um nucleófilo, de hidróxido ou de ãgua ligados a metal, ao átomo de carbono de carbonilo da amida.

No caso da hidrólise estequiométrica da amida promovida por Co(III), em solução aquosa, no intervalo de valores de pH de

9-14, verificou-se que ambos os tipos de interacções aumentavam

532 »«•^«*,533

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- 24 significativamente a velocidade de hidrólise da amida; contudo, verificou-se que o segundo tipo de interacção envolvendo o nucleófilo de hidróxido ligado a metal era o mais eficiente /D. A. Buckingham et al., J.Am. Chem. Soc., 92:6151 (1970),/. Para as enzimas protease contendo Zn(II), a termolisina e a carboxipeptidase A, é possível que ambos os tipos de interacções estejam a funcionar para aumentar a velocidade de hidrólise da amida /Mathews et al., Acc. Chem. Res., 21:333 (1988) e Christianson et al., J.Am. Chem. Soc., 108:4998 (1988),/.

É aqui descrita uma nova abordagem pela qual um imunoligando, compreendendo um complexo de ião metálico polivalente (cofactor) e um ligando de coordenação reactivo (substrato), estã lião gado, nao covalentemente,/anticorpo (receptor) de forma a proporcionar reactividade química no sítio de combinação com anticorpos. Descreve-se seguidamente a produção e a caracterização inicial de exemplos de anticorpos monoclonais catalíticos (moléculas de recep tor) que podem catalisar a hidrólise específica no sítio de uma li gação peptídica glicina-fenilalanina (Gly-Phe), a pH 6,5, utilizan do vários cofactores contendo ião metálico. O termo absin ê utilizado para designar esta nova classe de anticorpos catalíticos proteolíticos.

Utilizando essa nova aproximação, previu-se e verificou-se que um reacção, mesmo uma tão energeticamente exigente como a hidrólise de péptidos, podia ser mediada por um anticorpo. Além di so, a especificidade da ligação, tão caracteristica das interacçõe anticorpo-antigénio, proporcionou ãs absin conjuntos facilmente programáveis de especificidades de sequência, totais e selectivas.

A hidrólise de péptidos é apenas um exemplo de um grande número de reacções que podia beneficiar da incorporação de um complexo, contendo ião metálico, lábil, no sítio de combinação de anticorpos de uma molécula de receptor. Os constrangimentos geométri cos possíveis com estes sistemas podem ser explorados para reforçar o controlo estereoelectrõnico em reacções adicionais, tais como condensações aldõlicas e epoxidações quirais.

III. Moléculas de receptor

Uma molécula de receptor do invento é catalítica e contém um sítio de combinação com anticorpos que se liga imunologicamente; i.e., que se liga via o paratopo, numa relação anticorpo-an·

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- 25 tigénio, a uma pluralidade de imunoligandos que contêm, cada um, complexo de coordenação de ião metálico polivalente. O complexo de coordenação de um primeiro imunoligando de imunização é cineticamente inerte, enquanto que o complexo de coordenação de um segundo imunoligando antigênico é cineticamente lábil. Uma molécula de receptor do invento exibe também uma ligação imunológica às porções do imunoligando cineticamente lãbil, tais como a um complexo de ião metálico formado a partir do ião metálico polivalente e de um primeiro ligando de coordenação individual (cofactor), assim como a um segundo ligando de coordenação individual na ausência do ião metálico polivalente (substrato).

Os complexos de coordenação contendo um ião metálico polivalente, adicionais, (imunoligandos) podem ligar-se a uma molécula de receptor, e podem ser cineticamente inertes ou lábeis. Essa reacção catalisada é uma reacção catalisada por um ãcido de Lewis, e essencialmente qualquer reacção catalisada por um ácido de Lewis que possa ser realizada num meio aquoso, que possa ser catalisada por uma molécula de receptor como aqui se descreve, com um cofactor, contendo ião metálico, apropriado. Uma molécula de receptor catalisa também uma reacção química no segundo imunoligando, mas não catalisa uma reacção química no primeiro imunoligando.

primeiro imunoligando de imunização compreende, ele próprio, um complexo de coordenação de ião metálico cineticamente inerte, que contém um primeiro ião metálico polivalente coordenado a dois, ou mais, ligandos de coordenação de ião metálico individuais .

Um ião metálico polivalente pode muitas vezes exibir uma pluralidade de formas tridimensionais de complexos de coordenação. A forma do complexo depende, inter alia, do elemento, do seu estado de oxidação, do seu número de coordenação e dos ligandos que estão coordenados ao ião metálico. Exemplos de complexos de coordenação, cineticamente inertes, úteis são formados a partir de Co(III) e de Pt(II) que formam normalmente complexos octaêdricos e quadrangulares planos, respectivamente, com ligandos saturados contendo amina.

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A primeira destas duas, ou mais, coordenações de ião metálico individuais pode ser unidentada ou multidentada e pode, por consequência, formar uma ou uma pluralidade de ligações coordenadas com o ião metálico.

Exemplos de ligandos unidentados incluem a água, o amoníaco, o ião hidróxido, um ião halogeneto, tal como os iões fluoreto, cloreto, brometo ou iodeto, os iões monocarboxilato contendo 1 a cerca de 8 átomos de carbono, o ião cianeto e similares. Aqueles ligandos são normalmente designados por aquo, amino, hidroxo, fluoro, cloro, bromo, iodo, monocarboxilato e ciano, respectivamente .

Exemplos de ligandos multidentados incluem ligandos bi-, tri-, e tetradentados, e são constituídos, por exemplo, pelo ião carbonato, ião oxalato, 2,2'-bipiridina, etilenodiamina, ião acetilacetonato, 1,10-fenantrolina, 2,2',2-triaminotrietilamina, trietilenotetraamina e ião etilenodiaminatetraacetato. Esses ligandos são normalmente designados por carbonato, oxalato (oxo),

2,2'-bispiridina (bipi), etilenodiamina (eno), acetilacetonato (acaco), 1,10-fenantrolina (feno), 2,2',2-triaminotrietilamina (treno), trietilenotetraamina (trieno), e etilenodiaminatetraacetato (EDTA), respectivamente, com as abreviaturas normalmente utilizadas entre parêntesis. São também conhecidos os ligandos pentadentados e hexadentados.

Prefere-se que o primeiro ligando de coordenação individual seja multidentado e que seja capaz de formar ligações coordenadas com pelo menos metade dos sítios de coordenação disponíveis Assim, prefere-se que o primeiro ligando de coordenação individual do primeiro imunoligando de imunização seja, pelo menos, tridentado, quando o ião metálico polivalente tem um numero de coordenação de seis, como ê o caso dos complexos de Co(III) com aminas saturadas. 0 ligando trieno, que é tetradentado, é particularmente preferido para utilização com o Co(III). Um ligando bidentado tal como o eno é preferivelmente usado para um ião metálico tal como Pt(II) que forma complexos quadrangulares planos com ligandos saturados de amina.

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- 27 O segundo ligando de coordenação individual complexo pode ser unidentado ou bidentado, e inclui, ., jo—Mct Μ*.

do primeiro adicionalmente , uma primeira estrutura orgânica não reactiva que contém uma cadeia, um anel ou um anel substituído com cadeias, com pelo menos 10 átomos. A funcionalidade de ligação deste ligando de coordenação contém, de preferência, um grupo funcional que ê aniónico ao valor de pH ao qual o ligando vai ser utilizado, tal como um grupo carboxilato, que é preferido. Outros grupos funcionais que podem proporcionar a função de ligação aniónica incluem iões fosfonato e hidroximato.

O segundo ligando de coordenação é grandemente responsável pelo fornecimento da especificidade de ligação e de reacção do catalisador, e assim, o ligando de coordenação seleccionado contêm uma porção que tem uma similaridade configuracional atómica substancial com o ligando de coordenação ou com o substrato no qual a reacção é catalisada (que aqui depois se discute). Assim, este segundo ligando de coordenação não reactivo, do primeiro imunoligando, contém uma cadeia, um anel ou um anel substituído com cadeias, que contêm pelo menos 10 átomos para além da funcionalidade de ligação, de modo que, este ligando de coordenação pode induzir e pode ligar-se ao sítio de combinação com anticorpos.

Considera-se que um sítio de combinação com anticorpos é geralmente capaz de acomodar cerca de cinco a cerca de sete resíduos aminoácidos. Uma vez que cada resíduo contribui com uma cadeia de três átomos, este ligando de coordenação tem de comprimento mínimo cerca de três resíduos aminoácidos, quando medido em termos dos péptidos. O restante do sítio de combinação é ocupado pelo ião metálico polivalente e pelo seu primeiro ligando de coordenação individual que é, possivelmente, outro.

Este segundo ligando de coordenação individual não reactivo pode ser maior do que uma cadeia, anel ou anel substituido com cadeias, de cerca de 10 átomos, e pode ser tão grande quanto a solubilidade do imunoligando de imunização, no sangue de um animal imunizado, o permita. Contudo, quando são utilizados neste ligando mais do que cerca de 30 átomos numa cadeia, anel ou anel subs

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tituído com cadeias, esses átomos podem ser inúteis na medida em que eles ou induzem moléculas de anticorpos que são inúteis, ou não induzem anticorpos.

Este segundo ligando de coordenação é não reactivo, como jã se observou, uma vez que ele não sofre uma reacção química na presença de um anticorpo induzido pelos seus anticorpos, exceptuando talvez a ionização de um ou mais protões. Contudo, visto que este ligando de coordenação ê grandemente responsável pela especificidade de ligação e de reacção do catalisador, este ligando de coordenação, não sõ se assemelha estruturalmente ao ligando de coordenação reactivo, mas inclui uma ligação ao grupo funcional de ligação ao metal a uma distância de cerca de 2 a cerca de 7, e mais preferivelmente, de cerca de 2 a cerca de 5 átomos, de um sítio que é estruturalmente análogo ao sítio, na coordenação reactiva, no qual se pretende catalisar uma reacção desejada.

Assim, por exemplo, se na reacção a ser catalisada se pretende quebrar uma ligação a um grupo carbonilo particular, o grupo carbonilo cindível é considerado o sítio de reacção, e o segundo ligando de coordenação do primeiro imunoligando contém um grupo carbonilo a uma distância de cerca de 2 a cerca de 7 átomos, do grupo funcional de ligação ao metal. Esse grupo carbonilo estã também numa configuração estrutural que é substancialmente similar ã do grupo carbonilo no qual a reacção ocorre. Esta proximidade ajuda a assegurar que o sítio da reacção a ser catalisada esteja próximo do ião metálico polivalente.

A estrutura restante deste segundo ligando de coordenação não reactivo pode ser uma cadeia de hidrocarbonetos ou de hidrocarbonetos substituídos, tal como a que se encontra no esqualeno ou num péptido, respectivamente. As estruturas em anel tais como as de um composto aromático, tal como o benzeno, o naftaleno ou a piridina, podem ser incluídas, bera como os compostos cíclicos e os compostos cíclicos substituídos com cadeias, mais pequenas, tais como os derivados da decalina, e os derivados de esteróides tais como os derivados do estradiol e da testosterona.

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Numa concretização preferida, a estrutura orgânica não reactiva é um peptido. Este peptido pode estar na configuração L, de ocorrência natural, ou na configuração D, pode conter resíduos tais como a beta-alanina, e pode ser uma mistura de dois ou mais destes resíduos aminoácidos.

É de notar que o segundo ligando de coordenação não reactivo não é um análogo do estado de transição da reacção a ser catalisada, embora esse ligando de coordenação seja grandemente responsável pelo fornecimento da especificidade de ligação e de reactividade das moléculas de receptor. Assim, de novo, a abordagem aqui utilizada em relação â indução de um sítio de combinação com anticorpos por configuração, ê bastante diferente das abordagens previamente usadas, bem como o são os receptores e os resultados obtidos.

Uma vez determinados os primeiros dois ligandos de coordenação, as posições de coordenação restantes, se existirem, são tipicamente preenchidas utilizando ligandos unidentados ou bidentados, tais como os aqui anteriormente referidos. A ãgua, o ligando aquo, é um ligando de coordenação particularmente preferido para utilização no acabamento do complexo de coordenação, se o pri meiro e o segundo imunoligandos não preencherem a esfera de coordenação do ião metálico polivalente.

Uma molécula receptora exibe tipicamente uma constante de dissociação, K,, para um imunocomplexo formado com um primeiro o* “8 imunoligando, de pelo menos 10 . Mais de preferência, essa cons-12 tante de dissociação e de 10 ou menos.

O segundo imunoligando antigênico compreende um complexo de coordenação de ião metálico, cineticamente lãbil, que contém um segundo ião metálico polivalente que é diferente do ião metálico do primeiro imunoligando (complexo de coordenação) ou, esse ião metálico é do mesmo metal que o primeiro ião metálico num estado de oxidação mais baixo. Assim, quando o primeiro ião metálico polivalente é Co(III), o segundo ião metálico é Co(II) ou pode ser um ião tal como Zn(II), Ga(III), In(III), Fe(III), Cu(II), Ni(II),

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Lu(III), Mn(II), Al(III), ouMg(II), ou semelhante. O zinco(II) é particularmente preferido quando se utiliza Co(III) como ião metálico do complexo cineticamente inerte. Quando o complexo cineticamente inerte contém um ião metálico tal como Pt(II) que forma complexos quadrangulares planos, o Cu(II) é um ião metálico preferido do complexo de coordenação cineticamente lãbil do segundo imunoligando.

Embora um imunocomplexo, formado entre uma molécula de receptor e um primeiro imunoligando, possa ser visto como uma interacção usual anticorpo-antigénio para a qual se pode exprimir adequadamente uma constante de dissociação, o mesmo não é verdadeiro para o imunocomplexo formado entre o receptor e o segundo imunoligando. A razão para esta anomalia aparente deriva do facto de o segundo imunoligando conter um complexo de coordenação cineticamente lãbil e do segundo ligando de coordenação individual, reactivo, poder não ter grupos funcionais de ligando de coordenação usuais, e de qualquer coordenação com o ião metálico e o primeiro ligando de coordenação ocorrer apenas, substancialmente, na presença da molécula de receptor.

Assim, o segundo imunoligando tende a comportar-se duma maneira similar a um sistema de enzima, substrato e cofactor no qual o receptor é análogo ã enzima, o segundo ligando de coordenação reactivo é análogo ao substrato, e o ião metálico e o seu primeiro ligando de coordenação (e possivelmente outros ligandos de coordenação) são, conjuntamente, análogos a um cofactor tal como NAD ou FAD. A discussão que a seguir se apresentairã contudo considerar geralmente, o segundo imunoligando como uma entidade única exceptuando onde a clareza da descrição ou da explicação for melhor servida por referência à sua ou ãs suas partes tais como receptor, substrato ou cofactor.

Todos os critérios para a selecção do ião metálico polivalente do segundo imunoligando, adicionalmente ao ião que forma um complexo de coordenação cineticamente lãbil, não são completamente entendidos. Contudo, é conhecido o suficiente, de modo que, pode preparar-se de maneira relativamente fãcil um catalisador útil.

532 ,SCRF. 174.0 POR .

Em primeiro lugar, o ião metálico do complexo cineticamente lábil deverá ser capaz de formar um complexo de coordenação da mesma forma (geometria) tal como o ião metálico do complexo cineticamente inerte. Assim, quando se usa o Co(III), que forma complexos octaédricos com aminas saturadas, no complexo cineticamente inerte, pode ser utilizado um ião metálico que forme complexos octaédricos planos com estas aminas, tal como o ião metálico do complexo cineticamente lábil.

Quando se discute a forma ou a geometria de um complexo de coordenação, não ê necessário que o complexo seja isolável e que a sua estrutura seja determinada por raios X ou por técnicas similares. Em vez disso, são adequadas as técnicas de inferição normalmente utilizadas para estas determinações de estrutura.

Os números de coordenação exibidos pelo segundo ião metálico são iguais aos do primeiro ião metálico polivalente, ou não inferiores aos do primeiro ião metálico polivalente menos um. Assim, quando o primeiro ião metálico polivalente é Co(III) com um número de coordenação de seis, o segundo ião metálico polivalente exibe um número de coordenação que ê de preferência seis, mas que pode ser cinco.

O tamanho do ião metálico parece também ter um papel a desempenhar. Por exemplo, o Co(III) tem um raio iónico de 0,63 angstroms determinado a partir de medições cristalogrãficas. Quatro dos iões metálicos cujos complexos de coordenação não catalisaram a reacção de clivagem do péptido que aqui a seguir se descreve, o Cd(II), Tb(III), Hg(II) e La(III) têm raios iónicos de 0,97, 0,923, 1,10 e 1,02 angstroms, respectivamente, determinados de um modo similar. Por outro lado, cada um dos segundos iões metálicos polivalentes úteis, anteriormente referidos, tem um raio iónico entre 0,51 angstroms /Ã1(III)_7 e 0,85 angstroms /Lu(III)_7. Assim, o raio iónico de um segundo ião metálico útil é de aproximadamente cerca de um terço do do ião metálico do complexo cineticamente inerte, enquanto que os raios iónicos de iões metálicos que não eram úteis, eram de cerca de metade, ou maiores, do que o do ião metálico polivalente do complexo cineticamente inerte. /Rai70 532

SCRF 174.0 POR

os iónicos de cristal de Handbook of Chemistry and Physics, Weast, ed., 549 ed., CRC press, Cleveland (1973) pgs. F-194-195/.

Os quatro critérios anteriores; i.e., (1) tamanho (raio iónico) de aproximadamente cerca de um terço do do ião metálico do imunoligando de imunização, (2) formação de um complexo cineticamente lãbil que (3) tem a mesma geometria e (4) o mesmo número de coordenação que o complexo cineticamente inerte, quando se usa o mesmo primeiro ligando de coordenação individual, parecem ser úteis para a selecção de um ião metálico operávei. Assim, um ião metálico útil preenche tipicamente esses critérios, embora alguns iões metálicos úteis possam não os satisfazer.

Deste modo esses critérios são suficientes para definir a maioria dos iões metálicos que são úteis, mas não todos. Por exem pio, o ião Yb(III) tem um raio iónico de 0,86 angstroms e pode satisfazer os outros três critérios, mas ser incapaz de proporcionar a catálise. Contudo, o perito na arte utilizando os critérios anteriores pode obter facilmente resultados catalíticos.

O primeiro ligando de coordenação individual, do complexo de ião metálico cineticamente lãbil, é unidentado ou multidentado, preferivelmente, é multidentado, e mais preferivelmente, tem o mesmo número de coordenação, de grupos funcionais de ligação, que o primeiro ligando de coordenação individual do complexo de ião metálico cineticamente inerte. Adicionalmente, este primeiro ligando de coordenação tem um tamanho e uma estrutura substancialmente similares, e o mesmo tipo de funcionalidade de coordenação de ligando, que o primeiro ligando de coordenação individual do complexo de ião metálico cineticamente inerte.

Assim, é mais preferível que, quando o primeiro ligando de coordenação do complexo cineticamente inerte é uni-, bi-, triou tetradentado, o primeiro ligando de coordenação correspondente do complexo cineticamente lãbil seja uni-, tri- ou tetradentado, respectivamente. Similarmente, os grupos funcionais que formam ligações de coordenação, por exemplo, amina saturada, amina não saturada, carboxilato, enolato, fosfina ou semelhantes, do primeiro

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ligando de coordenação do complexo cineticamente inerte de imunização, estão também presentes no primeiro ligando de coordenação do segundo complexo antigênico cineticamente lãbil.

A similaridade substancial, em tamanho e estrutura, dos dois primeiros ligandos de coordenação, assim como a semelhança de dentados e de funcionalidade da ligação, referem-se a uma semelhança imunológica relativa entre os dois complexos (cineticamente inerte e lãbil). Assim, se estes ligandos são substancialmente diferentes em tamanho, e de estrutura e tipo de ligação substancialmente diferentes, o segundo imunoligando pode não ser ligado por um anticorpo induzido pelo primeiro.

É bem conhecido que a mudança, mesmo de um único resíduo de aminoácido, numa sequência polipeptídica pode significar a diferença entre uma ligação de um dado anticorpo a uma sequência e não a outra. É também conhecido que os requisitos de ligação de anticorpos não são normalmente tão rigorosos, e que os grupos laterais de aminoácidos, que possuem tamanhos ou funcionalidades similares, podem usualmente ser interpermutados com efeitos mínimos na ligação cora anticorpos.

Assim, um ãcido aspártico ou uma amida podem normalmente substituir um ãcido glutâmico ou uma amida, respectivamente, tal como uma arginina e uma lisina, ou uma alanina, uma leucina e uma isoleucina que podem substituir-se umas ãs outras, e similares. Ainda adicionalmente, Houghten, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 82:5131 (1985) descreveu que cada um, de doze dos treze resíduos de um polipéptido particular, podia ser individualmente trocado por qualquer dos outros dezanove aminoácidos naturais, mantendo constantes os outros resíduos sem prejudicar substancialmente a capacidade de um anticorpo monoclonal para se ligar aos treze resíduos de péptido da estrutura alterada.

Existe, consequentemente, uma razão para as diferenças em tamanho e forma, entre os dois primeiros ligandos de coordenação assim como para seu número e tipo de funcionalidade de ligação diferentes. Essa diferença pode ser expressa em termos de uma cons

- 34 70 532

SCRF 174.0 POR tante de dissociação do complexo de ligação, da molécula de receptor e do cofactor formado pelo ião metálico polivalente e pelo primeiro ligando de coordenação individual. As constantes de dissociação entre uma molécula de receptor útil e o cofactor sozinho não foram medidas, mas parecem ser cerca de uma ou de três ordens de grandeza maiores do que as do mesmo receptor e de um primeiro imunoligando de imunização, dependendo da molécula de receptor e do ião metálico polivalente seleccionados para o estudo.

O complexo de coordenação cineticamente lãbil, formado a partir do segundo ião metálico polivalente e do seu primeiro ligando de coordenação individual, anteriores, constitui o cofactor, quando se usa a terminologia de receptor, cofactor e substrato para o segundo imunoligando. Podem também estar presentes como parte do cofactor um ou mais ligandos de coordenação adicionais tais como ligandos de coordenação aquo.

O segundo dos ligandos de coordenação individuais (o substrato) do segundo imunoligando cineticamente lãbil é unidentado ou bidentado e inclui uma estrutura orgânica reactiva contendo um sítio para a reacção catalisada. Contudo, a funcionalidade de ligação não necessita de ser a mesma que a do segundo ligando de coordenação individual do complexo cineticamente inerte, e ê, de preferência, diferente.

De facto, a funcionalidade de ligação não necessita de ser um grupo funcional que forma uma ligação com o ligando de coordenação usual. De preferência, a ligação de ligando de coordenação que ocorre, pode ser forçada pelo efeito de ligação (entrópico) do sítio de combinação de moléculas de receptor e do cofactor contendo ião metálico. Por exemplo, os grupos funcionais de ligação do segundo péptido, ligando de coordenação bidentado, ilus trativo do imunoligando de imunização que aqui a seguir se descreve, são uma amina secundária e um grupo carboxilato, enquanto que o segundo ligando de coordenação reactivo (substrato) utilizado, não tem nenhum destes grupos mas possui um grupo amido na posição análoga ã da amina secundária.

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O segundo ligando de coordenação individual (susbtrato) inclui adicionalmente uma estrutura orgânica reactiva que contêm uma cadeia, um anel ou um anel substituído com cadeias, de pelo menos 10 átomos, que é suficientemente semelhante, em configuração atómica, ã primeira estrutura orgânica não reactiva, de modo que a constante de dissociação para um imunocomplexo entre a molécula de receptor e este segundo ligando de coordenação é, pelo menos, 10 ou inferior, quando medida na ausência do primeiro complexo de coordenação contendo ião metálico (cofactor). Os resultados preliminares para um tal imunocomplexo entre um receptor e um substrato forneceram valores para a constante de dissociação na -3 ordem de 5 x 10 .

Não existe, presentemente, limite superior conhecido ao tamanho do segundo ligando de coordenação reactivo (substrato), a não ser a sua solubilidade no meio no qual a reacção vai ser realizada, por exemplo num meio aquoso. Por exemplo, pode usar-se uma molécula de receptor deste invento, tal como uma peptidase, para clivar uma ligação peptídica predeterminada entre os terminais de uma proteína. Nesse caso, a proteína total ou uma sua porção mais pequena pode ser usada como segundo ligando de coordenação reactivo.

Assim, a segunda estrutura orgânica reactiva que compreende o segundo ligando de coordenação individual do complexo cineticamente lãbil (o substrato) é suficientemente similar, em estrutura, à segunda estrutura orgânica não reactiva do complexo cineticamente inerte a ser ligado pelo catalisador. Muito preferivelmente, os dois segundos ligandos de coordenação individuais têm as mesmas estruturas orgânicas no interior de uma cadeia de cerca de 10 átomos, adjacentes ao sítio no qual ocorre a reacção catalisada .

O sítio no qual ocorre uma reacção catalisada é, tipicamente, um grupo carbonilo, tal como numa reacção de clivagem de éster ou de amida ou num grupo cetona ou aldeído tal como numa condensação aldólica. Os átomos de carbono das ligações duplas etilê70 532

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- 36 nicas podem também ser o sítio no qual ocorre a reacção catalisada.

As reacções catalisadas por uma molécula dereceptor são realizadas em meios aquosos nos quais uma molécula de água ou um ião hidróxido toma parte na reacção e serve como um ligando de coordenação adicional para o ião metálico polivalente. Assim, pode ter alguma importância o acesso da água ou do ião hidróxido ao imunocomplexo, receptor-segundo imunoligando.

Esse acesso, quando desejado, pode ser facilitado fornecendo ao primeiro imunoligando de imunização áreas relativamente hidrofóbicas e hidrofílicas. Uma vez que os complexos de ião metálico, tais como os complexos octaédricos, bipiramidais triangulares e tetraédricos, podem ser encarados como estruturas tridimensionais ou poliedros, ê conveniente descrever áreas relativamente hidrofóbicas ou hidrofílicas como as faces de um poliedro, com os grupos funcionais de ligação de ligando coordenado nos vértices.

Por exemplo, os três grupos etileno da molécula de trieno, conjuntamente com o péptido e com as porções de anel de fenilo do imunoligando de imunização e do segundo imunoligando aqui a seguir descritos, fornecem faces relativamente hidrofóbicas àqueles complexos. As porções amina primária e secundária desses ligandos proporcionam vértices relativamente mais hidrofílicos. Contudo, o grupo funcional carboxilato, anionicamente carregado, do segundo ligando de coordenação do primeiro imunoligando e mais hidrofílico do que as aminas, e uma vez que ele estã num terminal de um ligando, proporciona um vértice relativamente hidrofílico e uma face ou faces adjacentes ao primeiro imunoligando. Era de esperar que a face relativamente hidrofílica estivesse orientada em direcção ao exterior ou lado aquoso de um imunocomplexo, contendo receptor, resultante, com a porção relativamente mais hidrofóbica (faces) dirigida na direcção da superfície interior do sítio de combinação com anticorpos desse imunocomplexo.

Assim, as moléculas receptoras exemplares aqui usadas foram concebidas para proporcionar um acesso relativamente fácil

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- 37 de ãgua ou de um ião hidróxido para o imunocomplexo. Esse acesso relativamente fãcil foi adicionalmente facilitado concebendo o segundo imunoligando para conter menos grupos funcionais de ligação de ligando de coordenação, do que os que estavam presentes no imunoligando de imunização. Consequentemente, com um segundo ião metálico, aproximadamente do mesmo tamanho, e com o mesmo número de coordenação que o primeiro ião metálico, e com menos grupos funcionais de coordenação disponíveis, uma molécula de água ou um ião hidróxido do meio reaccional aquoso podiam facilmente proporcionar um ligando aquo ou hidroxo para completar a esfera de coordenação do complexo de ião metálico cineticamente lãbil.

A estratégia anterior de utilização de complexos de ião metálico com duas ou mais faces relativamente hidrofóbicas e uma ou mais faces relativamente hidrofílicas, conjuntamente com a utilização de um segundo imunoligando tendo grupos funcionais que for mam pelo menos, menos uma ligação de ligando, é geral para proporcionar um ligando aquo ou hidroxo para o imunocomplexo, formado pelo receptor e pelo segundo imunoligando, num meio aquoso.

A utilização de um grupo funcional de ligando de coordenação, anionicamente carregado, no primeiro imunoligando de imunização que não esteja presente no segundo imunoligando antigénico, reactivo, pode ser vantajosa. Assim, aquela utilização pode ajudar a proporcionar um vértice hidrofílico e uma face adjacente ao segundo imunoligando por indução de um resíduo carregado positivamente, por exemplo, arginina, lisina ou histidina, no sítio de combinação, que por seu lado induz um ião hidróxido para equilíbrio de carga quando não está presente nenhum grupo funcional anio nicamente carregado no ligando de coordenação.

IV. PROCESSOS

Um aspecto do processo do presente invento contempla a catálise de uma reacção química predeterminada utilizando uma molécula de receptor tal como aqui se descreve. Uma reacção catalisada por uma tal molécula de receptor ocorre em ãgua, a um valor

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SCRF 174.0 POR de pH óptimo e a uma atmosfera de pressão, a uma velocidade que - 3 e, tipicamente, pelo menos 10 vezes mais rapida do que a da mesma reacção, sob as mesmas condições de temperatura, pressão, valor de pH e concentração de substrato, na ausência de moléculas de receptor e de cofactores. De preferência, as velocidades são 4 diferentes de factor de pelo menos 10 .

Por exemplo, Kahne, J. Am. Chem. Soc., 110:7529 (1988) descreveu que o tempo de meia vida para a hidrólise espontânea de uma ligaçao peptídica em água neutra é cerca de 3 x 10 s , ou cerca de 7 anos. Por outro lado, o péptido 2 (que aqui a seguir se descreve) como substrato foi completamente hidrolisado a pH 6,5 a 37°C, após oito dias, utilizando um receptor deste invento e um cofactor contendo ião metálico.

De acordo com um processo do invento, mistura-se uma quantidade eficaz de moléculas de receptor anteriormente descritas com um segundo imunoligando antigénico (como anteriormente se descreveu) , num meio aquoso para formar uma mistura. Essa mistura é mantida durante um período de tempo suficiente para que a reacção predeterminada desejada ocorra. O(s) produto(s) da reacção pode(m) ser subsequentemente isolado(s), se desejado, bem como o podem ser as moléculas de receptor.

Um processo deste invento utiliza um meio aquoso como parte da mistura reaccional. Esse meio contém, tipicamente, ãgua e sais tampão. Adicionalmente, o meio pode conter outros sais tais como cloreto de sódio, bem como sais de magnésio e cãlcio solúveis em água tais como os que se encontram frequentemente em meios contendo proteína. Podem também estar presentes solventes orgânicos tais como metanol, etanol, acetonitrilo, diametilsulfóxido, dioxano, hexametilfosforamida e Ν,Ν-dimetilformamida. Podem também estar presentes agentes tensioactivos que emulsionam o ligando reagente e a molécula de receptor. A caracteristica crítica dos ingredientes presentes no meio aquoso é a de que esses ingredientes não interferem substancialmente com, ou inibem a reacção catalítica, por exemplo, por desnaturação da molécula de receptor. Adicio70 532

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nalmente, o meio aquoso estã, substancialmente, isento de sal, geralmente, isento de proteínas e, especificamente, isento de enzimas que inibem a reacção catalisada pela molécula de receptor.

O meio aquoso tem, tipicamente, um valor de pH de cerca de 5 a cerca de 9, e, de preferência, um pH de cerca de 6,0 a cerca de 8,0. Podem também ser utilizados valores de pH superiores e inferiores aos valores indicados, desde que não interfiram substan cialmente com, nem inibam a reacção catalisada.

As reacções catalíticas são tipicamente realizadas â temperatura ambiente; i.e., a cerca de 20 a cerca de 25 graus C, ou a 37 graus, e a uma pressão atmosférica ambiente; i.e., a cerca de uma atmosfera. Contudo, podem também ser utilizadas temperaturas mais baixas atê próximo do ponto de congelação do meio aquoso e mais altas até perto do ponto de ebulição do meio â pressão atmosférica. Como é bem conhecido, as proteínas, tais como a molécula de receptor, tendem a desnaturar a temperaturas elevadas tais como a temperatura de ebulição do meio aquoso, por exemplo, a cerca de 100 graus C, e assim são preferidas temperaturas inferiores a cerca de 40 graus C. Como é também bem conhecido, as reacções que seguem expressões de cinética multimolecular diminuem em velocidade ã medida que a temperatura diminui. Assim, prefere-se uma temperatura mínima de cerca de 15 graus.

A mistura formada a partir do receptor, cofactor e substrato é mantida nas condições anteriores durante um período de tem po suficiente para permitir que a reacção predeterminada desejada ocorra. Esse tempo de manutenção pode ser de segundos até dias, ou de semanas, e depende, inter alia, da molécula de receptor particular, das moléculas de cofactor e de substrato, da temperatura da mistura reaccional e do valor de pH, bem como de se pretender obter o produto ou examinar as cinéticas de reacção. Nas reacções exemplares que aqui a seguir se descrevem, foram utilizados tempos de manutenção de 5 e 8 dias, quando se desejaram mostrar e iso lar os produtos, e foram utilizados tempos de minutos e horas para determinações cinéticas.

O substrato (segundo ligando de coordenação do segundo

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S£~ imunoligando) estã presente numa mistura reaccional numa quantidade até à sua solubilidade no meio aquoso. Pode também ser utilizado um sistema de duas fases que inclui o substrato insolúvel, mas que não é normalmente tão usado. As concentrações normalmente usadas de substrato são de cerca de 0,1 micromolar (jxM) a cerca de 10 milimolar (mM) . Quando se deseja o produto, per se, usam-se concentrações relativamente mais elevadas em comparação com concentrações mais baixas quando se estão a estudar um mecanismo de reacção ou a cinética da reacção.

Está também presente uma quantidade eficaz de molécula de receptor. Essa quantidade eficaz é, tipicamente, uma quantidade catalítica; i.e., o receptor é usado numa razão molar para subs trato de cerca de 1:2 a cerca de 1:10 000, preferindo-se uma razão molar de cerca de 1:10 a cerca de 1:1 000.

A razão da molécula de receptor para substrato depende, tipicamente, da actividade específica da molécula de receptor em relação ao substrato e o propósito do utilizador ao realizar a reacção. Assim, quando se deseja obter o produto, usa-se uma concentração relativamente mais elevada de receptor e um razão de receptor para substrato mais elevada. Quando se estão a estudar o mecanismo de reacção ou a cinética da reacção, usam-se, tipicamente, uma concentração e uma razão mais baixas. Pode usar-se também uma quantidade estequiométrica de receptor ou uma quantidade superior, mas uma vez que o receptor é uma molécula catalítica, a utilização, mesmo de uma quantidade estequiométrica, pode ser inútil. Assim, usa-se, pelo menos, uma quantidade catalítica de receptor .

A porção de cofactor do segundo imunoligando (o ião metálico polivalente e o primeiro ligando de coordenação) pode estar presente numa quantidade igual ã da molécula de receptor até uma quantidade cerca de dez vezes maior do que a de substrato. A quantidade utilizada numa reacção específica pode variar com a velocidade de reacção desejada e a constante de dissociação do imunocomplexo receptor-cofactor.

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É, normalmente, desejável que o cofactor permaneça ligado no sítio de combinação com anticorpos enquanto que o substrato se pode difundir para dentro, reagir, e o(s) produto(s) de reacção pode(m)-se difundir para fora. Utilizando moléculas de receptor, cofactores e substratos como aqui se descrevem, o cofactor é tipicamente proporcionado numa concentração de cerca de 0,1 a cerca de 10 vezes a do substrato, e mais preferivelmente numa razão para substrato de cerca de 1:1 a cerca de 5:1.

V. RESULTADOS

A discussão que se segue refere-se ã preparação e utilização de moléculas de receptor que exibem actividade de peptidase. Tal como anteriormente se observou, essas moléculas de receptor são designadas por moléculas de absin ou absinas.

De forma a induzir as absinas que são aqui ilustrativamente utilizadas, o hapteno .1 usado para a imunização consistiu num grupo Co(III)(trieno) relativamente inerte, cineticamente complexado ao sítio de aminoácidos secundário de um péptido de quatro resíduos (Figura 1). Uma vez que um metal cineticamente inerte não irá, provavelmente, substituir os ligandos, de modo suficientemente rápido para ser um cofactor de hidrólise ideal, /os complexos de Co(III) podem clivar ligações amida, mas a natureza cineticamente inerte dos complexos resulta numa clivagem estequiométrica em vez de numa clivagem catalítica. Ver, por exemplo, Coll man et al., J. Am. Chem. Soc. 85:3039 (1963/7, considerou-se que os anticorpos monoclonais para 1 teriam um sítio de combinação algo promíscuo capaz de acomodar complexos de trieno não só de Co(III), mas também de metais cineticamente lãbeis, tais como Zn(II) ou Fe(III), que deviam ser cofactores hidroliticamente activos. Assim, como anteriormente se observou, as descrições da patente E.U.n? 4 722 892 de Meares et al. e de Reardon et al. , Nature, 318: 265-268 (1985) mostram que os anticorpos induzidos por um complexo de In(III) EDTA se ligam a vários complexos de EDTA-metal diferentes .

Pretendia-se que os sítios de combinação com anticorpos

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X-'·· das absinas, induzidas pelo hapteno _1, associassem um complexo de metal e um péptido numa geometria apropriada, para depois permitir e facilitar a reacção de hidrólise de péptidos, catalisada por metais, e, finalmente, para libertar os produtos. Neste aspecto, o hapteno _1 difere de um verdadeiro análogo de estado de tarnsição devido ao facto de não haver nenhuma porção da molécula de hapteno que se assemelhe exactamente ao suposto átomo tetraédrico, ligado a metal, do estado de transição da reacção. A molécula foi concebida mais como um molde á volta do qual iria ser produzido um sítio de combinação de absina complementar que era capaz de se ligar simultaneamente a um complexo de cofactor de metal octaédrico e ao péptido substrato, conjuntamente, como um imunoligando.

Dependendo da conformação do imunogénio (hapteno 1 contendo péptido), previu-se que o sítio de combinação de absina acomodaria a ligação cindível da porção de péptido do imunoligando antigénico,numa orientação que iria colocar o grupo carbonilo perto do átomo metálico de um complexo de trieno de metal ligado s imultaneamente.

O complexo de metal podia então facilitar a hidrólise da ligação amida por (a) ligação ao átomo de oxigénio do carbonilo, polarizando assim o grupo carbonilo, (b) promoção do ataque nucleofílo de uma espécie de hidróxido ligado a metal (água ou ião hidróxido), ou (c) pelas duas operações em conjunto. Qualquer um dos percursos, ou uma combinação dos dois, conduziria a um intermediário tetraédrico ligado a metal. A quebra deste intermediário tetraédrico ligado a metal, conjuntamente com a protonação da função amina rejeitada, e a libertação dos produtos, completam a reacção de hidrólise.

Ligou-se covalentemente o hapteno 1 ã hemocianina de lapa (Fissurella) (KLH) e imunizaram-se ratinhos 129G1X* com o conjugado resultante, utilizando um regime de imunização padrão, que aqui a seguir se descreve. Colheu-se metade do baço do ratinho com o qual se obteve a maior resposta e usou-se para fusão com células de mieloma SP2/O. Identificarara-se e mantiveram-se um total de treze hibridomas que segregaram anticorpos monoclonais que se

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SCRF 174.0 POR ligam especificamente ao hapteno tal como é determinado por ELISA, que aqui também a seguir se descreve.

Os estudos ELISA de competição indicaram que os treze anticorpos podiam acomodar uma variedade de complexos de metal-trieno nos seus sítios de combinação, e observaram-se diferenças subtis nas especificidades de ligação ao metal entre os diferentes anticorpos. Em geral, Cd(II)(trieno), Co(III)(trieno), Cu(II) (trieno), Fe(III)(trieno), Ni(II)(trieno), Pd(II)(trieno), e Zn(II)(trieno) foram ligados com uma afinidade mais elevada, embora a ligação a complexos de metal tais como Co(II)(trieno), Ga(III)(trieno), Sc(III)(trieno), In(III)(trieno), La(III)(trieno) , Tb(III)(trieno), Yb(III)(trieno), Mg(II)(trieno), Mn(II)(trie no) e Lu(III)(trieno) pudesse também ser detectada, com alguns dos anticorpos. Foram observadas quantidades desprezáveis de competição quando apenas se adicionou sal de metal (sem ligando de trieno).

Cada um dos treze anticorpos monoclonais foi avaliado quanto â sua actividade de clivagem de ligação peptídica (hidrólise de amida) com os seis peptidos de substrato 2-? (seguintes) utilizando vãrios complexos de metal-trieno, diferentes, como cofactores possíveis para o imunoligando formado. Desenvolveu-se um ensaio de clivagem de péptido, rãpido e sensível, que detectou os grupos amina livres revelados durante qualquer hidrólise de ligação peptídica (amida) dos substratos.

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O ensaio envolveu manchar a mistura reaccional numa placa de sílica (cromatografia de camada fina) (TLC) que foi então eluída com uma mistura de solventes, água:metanol, 1:4 (v:v). Todo o produto peptídico hidrolisado foi eluído próximo da frente de solvente, enquanto que a absina e o cofactor de metal-trieno permaneceram na origem. Após a eluição, pulverizou-se a placa com uma solução de acetona de fluorescamina, e qualquer material verde fluorescente (UV de onda longa) próximo da frente do solvente indicou a hidrólise do substrato. Com este procedimento puderam ser detectadas um mínimo de 2 micromoles (jxM) da amina produto. A natureza de rotina do ensaio facilitou a investigação de um grande número de parâmetros de reacção com cada absina.

Vários dos anticorpos exibiram uma clivagem substancial dos substratos peptídicos 2 e usando vários dos cofactores de complexo de ião metálico. Os complexos de trieno Zn(II), Fe(III), Ga(III), Cu(II) e Ni(II) foram cofactores particularmente eficazes . Os péptidos 4-T_ não foram substratos para qualquer um dos anticorpos. Seleccionou-se uma absina, a 28F11, para estudo ime70 532

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diato e analisou-se em detalhe a actividade de hidrólise de péptidos desta absina utilizando o péptido _2.

Numa reacção típica, misturaram-se 10 ,ζχΜ de 28F11 com 3 mM de complexo de ião metálico de trieno, conjuntamente com 1,2 mM de péptido substrato em tampão fosfato 75 mM, e a mistura resultante foi mantida durante um período de dias para a reacção ocorrer. A reacção necessitou rigorosamente do sistema, totalmente complementado, de absina e de imunoligando antigênico /metal(trieno) e substrato/. Observou-se uma clivagem óptima, no intervalo de valores de pH de 6,0-7,5, com a maioria dos metais, metais diferentes exibindo contudo diferentes valores de pH óptimo.

Como se pode observar na Figura 2, após cinco dias a 37 graus C e a pH 6,5, observou-se a clivagem do péptido 2 com os complexos de ião metálico de trieno (em ordem relativa decrescente de actividade) Zn(II), Ga(III), In(III), Fe(III), Cu(II), Ni(II), Lu(III), Mn(II) e Mg(II). Observou-se um pequeno, mas reproductível, valor de clivagem com os imunoligandos antigénicos compreendendo os complexos de ião metálico com trieno de Al(III), e Co(II) e de péptido 2. Não foi observada a clivagem do péptido 2 pelo receptor 28F11 sem um cofactor, quando se utilizou o trieno sozinho, ou com 28F11 mais os complexos com trieno de Cd(II), Pd(II), Sc(III), Tb(III) e Yb(III). O substrato 3. tinha uma dependência do metal, similar à da reacção de clivagem do substrato 2.

Observou-se que o Zn(II)(trieno) era o complexo de cofactor metálico mais eficiente, exibindo uma eficiência óptima a uma concentração de 1,5 mM. A hidrólise catalisada do substrato 2 com o cofactor Zn(II)(trieno) foi óptima entre pH 6,0 e 8,0 e a concentrações de NaCl abaixo de 800 mM.

As várias evidências confirmam que a actividade proteolítica (clivagem da ligação peptídica) observada, utilizando receptor 28F11, ê devida ao sítio de combinação de absina. Em primeiro lugar, a especificidade do substrato estã de acordo com a es trutura do hapteno 1 utilizado no imunoligando imunogénico. Em segundo lugar, os fragmentos Fab' purificados, produzidos por pro70 532

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teólise limitada do receptor 28F11, com pepsina, mantiveram uma actividade catalítica completa. Em terceiro lugar, o ligando de trieno mostrou ser um requisito da reacção de hidrólise, uma vez que o Zn(II) sozinho apenas exibiu uma actividade mínima. O facto de não se ter observado qualquer clivagem sem o trieno, reflecte, provavelmente, a capacidade limitada do sítio de combinação de absina de acomodar um aquo complexo de Zn(II). Em quarto lugar, a reacção foi efectivamente inibida pelo hapteno 1, e a inibição por hapteno ê uma característica dos anticorpos catalíticos. Todos os dados são compatíveis com uma reacção catalítica de hidróli se que ocorre no sítio, de combinação com anticorpos, de absina, envolvendo o Zn(II) (trieno) como cofactor não covalentemente ligado.

Os produtos de reacções em maior escala com os péptidos / e _3 foram isolados e verificou-se que estes eram o resultado da clivagem específica entre a ligação gly-phe de cada um deles. Utilizando 4 mg do substrato peptídico, deixou-se prosseguir, até ao fim, uma reacção utilizando 3 mM de Zn (II) (trieno) e 10 /xM de receptor 28F11, durante um período de 8 dias. Isto corresponde a

400 regenerações por sitio de combinação com anticorpos, e, por

- - -4-1 consequência, a um numero de turnover de 6 x 10 s . Das reacções só foram observados dois fragmentos e estes foram isolados e caracterizados por RMN (Figura 3 para o péptido 2). As estruturas dos fragmentos só podiam ter resultado de uma clivagem única entre a glicina e a fenilalanina de cada substrato.

Uma interpretação detalhada do mecanismo desta reacção de hidrólise de péptido, catalisada por absina, depende, provavelmente, de uma análise conformacional do hapteno 1 e/ou dos péptidos substratos. Uma vez que se mostrou que o complexo de metal-tri eno era um cofactor necessário para um imunoligando antigênico, é razoável supor que a ligação cindivel do substrato peptídico estã directamente coordenada ao metal, em algum momento da reacção.

Num primeiro exame, a ligação gly-phe dos substratos pep tídicos 2 e 3 parece estar um pouco afastada do sítio de combinação do metal. A construção de modelos preliminares indicou que a

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- 47 colocação de ambos os anéis de fenilo numa posição adjacente no hapteno 1 devia criar de facto um sítio de combinação de absina que requereria a ligação dos peptidos 2 e 3 numa geometria que coloca a ligação amida cindivel (Gly-Phe) adjacente ao sítio de ligação de metal.

A especificidade de peptidase observada é compatível com este modelo uma vez que os peptidos _4-_7 não são capazes de adoptar uma geometria similar. Uma análise conformacional dos compostos 1-7 estã actualmente a decorrer para auxiliar a compreensão dos detalhes desta reacção de hidrólise de peptido.

VI. PREPARAÇÃO DE RECEPTORES ESPECÍFICOS

Os receptores úteis no presente invento são, de preferência, anticorpos monoclonais, embora possam ser utilizados anticorpos policlonais ou suas porções com sítios de combinação. Um anticorpo monoclonal é ura receptor produzido pelos clones de uma única célula, denominada hibridoma, que segrega apenas um tipo de molécula de receptor. A célula de hibridoma é resultado da fusão de uma célula produtora de anticorpos e de uma célula de mieloma ou de outra linha de células auto-perpetuante.

São bem conhecidas as técnicas para a preparação de anti corpos monoclonais do presente invento. Estes receptores foram pri meiro descritos por Kohler e Milstein, Nature, 256, 495 (1975), que é aqui incorporado como referência. Os anticorpos monoclonais são tipicamente obtidos a partir de culturas de tecidos de hibridoma ou a partir de fluídos de ascites obtidos dos mamíferos nos quais se introduziu o tecido de hibridoma. Descrevem-se aqui ambos os processos.

Os receptores monoclonais são aqui preferidos em virtude da sua especificidade única na ligação a um epitopo particular, tal como um ligando análogo e um ligando reagente de imunização, particular, bem como devido ã sua actividade catalítica, especifica, relativamente mais elevada quando comparada com a dos anticorpos policlonais. Podem-se aqui usar preparações de anticorpos

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policlonais, mas estas têm, tipicamente, de ser separadas nas fracções que se ligam ao ligando análogo de imunização e nas fracções que se ligam aos epítopos estranhos tais como os do transportador antigénico.

Os anticorpos policlonais que se ligam ao imunoligando imunogênico podem ser separados, por separação de afinidade, usando um imunoligando como o sorvente de afinidade. Após mistura e manutenção de uma preparação de anticorpos com o sorvente de afinidade, durante um tempo suficiente para ocorrer uma imunorreacção apropriada, o sorvente de afinidade é separado da porção restante da preparação de anticorpos.

A porção de anticorpos restante, separada, ligada ao sorvente de afinidade, contem os anticorpos que se ligam ao imunoligando imunogênico, enquanto que os anticorpos na porção restante, separada, da preparação de anticorpos, se ligam aos epítopos estranhos. Esses anticorpos, ligados por afinidade, podem ser subsequentemente isolados pelas técnicas usuais para a separação de entidades ligadas de sorventes de afinidade, tais como lavagem do sorvente com cloridrato de glicina a pH2.

As porções de poliamida contendo idiotipo (sítios de combinação com anticorpos) dos anticorpos são as porções de moléculas de anticorpos que incluem o idiotipo e se ligam ao ligando ou ao ligando análogo. Estas porções incluem os fragmentos Fab, Fab' e F(ab')₂ preparados a partir dos anticorpos pelas técnicas de clivagem enzimática bem conhecidas. Ver, por exemplo, Patente dos EUA N9 4 342 566 de Theofilopoulos e Dixon, em geral, e especificamente Pollack et al., /Science, 234, 1570 (1987//, que descreveram que as velocidades hidrolíticas aceleradas para os fragmentos Fab eram as mesmas do que as da Ig nativa. Na medida em que os anticorpos a partir dos quais as poliamidas contendo idiotipo são obtidas, são descritos como sendo cultivados contra ou induzidos por imunogénios, os receptores de poliamida contendo idiotipo (contendo sítios de combinação com anticorpos) são descritos como sendo cultivados ou induzidos, estando pressuposto que é, tipicamente, requerido um passo de clivagem para obter uma poliamida, conten

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do idiotipo, de um anticorpo. Preferem-se os anticorpos intactos.

Para preparar as moléculas de receptor aqui ilustrativamente usadas, imunizaram-se ratinhos 129GIX*, com 6-8 semanas de idade, com um imunogénio preparado por acoplamento de 2,5 mg de imunoligando contendo péptido 1, não reactivo, em 250 μΥ de DMF, com 2 mg de KLH em 750 μΥ de tampão de fosfato de sódio 0,01 M, pH 7,2, com agitação, a 4 graus C durante 1 hora, para formar um conjugado, usando l-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida seguindo as instruções de Pierce Chemical Company Catalogue. Administrou-se um inoculo preparado contendo 600 μΥ de uma solução de conjugado, 900 /il de tampão de PBS e 1500 μΥ de adjuvante de Freund completo (3000 yxl) , com 500 μΥ por ratinho, para proporcionar 100 /tg de conjugado por ratinho. A administração foi efectuada por injecção i.p.

Aos ratinhos, administraram-se injecções i.p. de reforço, duas semanas apõs as imunizações iniciais. O inoculo de reforço foi preparado para conter 300 μΥ da solução de conjugado, 1200 μΐ de tampão de PBS e 1500 μΥ de uma dispersão de adjuvante de alu men (3000 μΥ) . Cada ratinho recebeu 500 μΥ para proporcionar 50 ^.g de conjugado por ratinho.

Quatro semanas mais tarde, os ratinhos levaram outra injecção de reforço. Aqui, o inoculo continha 100 μΥ da solução de conjugado e 300 μΥ de tampão PBS. Cada ratinho recebeu 200 ytxl i.p. que continham 100 μς; do conjugado.

Usou-se um ELISA para pesquisar os anticorpos monoclonai produzidos pelos ratinhos imunizados. O antigénio usado foi um con jugado preparado por ligação do péptido haptênico 1 ã albumina de soro de bovino (BSA) seguindo os mesmos procedimentos que se descreveram para a preparaçao do conjugado com KLH. Os anticorpos policlonais foram também pesquisados usando o primeiro imunoligando como um inibidor para assegurar que se estava a observar a ligação específica. Avaliou-se a ligação positiva utilizando IgG+IgM de ca bra anti-ratinho, marcada com peroxidase. Os ensaios de ligação foram também realizados na presença de péptido haptênico livre 1

Λ.?

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-·Ύ>

- 50 como inibidor para ajudar a assegurar que a ligação observada era específica.

As células de metade do baço do ratinho, cujos anticorpos exibiram o título mais elevado no ELISA, foram fundidas com células de mieloma P3X63AG8.653 (ATCC CRL 1580) em soro de feto de vitelo a 10 por cento. As células da outra metade do baço foram fundidas com células de mieloma SP2/O-Agl4 (ATCC CRL 1581) em nutridoma a 1 por cento e BSA a 2 por cento. Usaram-se técnicas de fusão convencionais.

As células de cada uma das fusões foram implantadas em dez placas de 96 cavidades. Cerca de 10 por cento das cavidades da fusão P3X63 cresceram em meio de HAT-DMEM sem qualquer sobrenadante das cavidades exibindo ligação positiva no ELISA anterior. Cerca de 30 por cento das cavidades da fusão SP2/O exibiram crescimento em meio de HAT-DMEM. Das 300 cavidades com crescimento, sobrenadantes de cavidade foram positivos no ELISA. Desses 35 inicialmente positivos, 15 mantiveram a sua actividade durante a subclonação e foram introduzidos em ratinhos para a produção de ascites.

Esses quinze hibridomas foram analisados para determinar as suas composições em cadeias leves e pesadas. Verificou-se que doze deles eram kapa, gama 1; dois lambda, gama 1; e um kapa, mu. Treze dos quinze foram ensaiados para avaliar a possível actividade catalítica, e verificou-se que exibiam essa actividade, com dois hibridomas ainda a crescerem nos ratinhos. É agora conhecido que os treze hibridomas contêm, pelo menos, dois hibridomas diferentes, e a investigação prossegue para determinar se os onze hibridomas restantes são os mesmos ou se são diferentes das duas linhas de células identificadas.

Injectou-se cada um dos treze hibridomas em ratinhos

BALB/c X 129GIX* inoculados com pristano, para produzir fluído ascítico. Os anticorpos monoclonais foram purificados a partir dos ascites por precipitação com solução saturada de sulfato de amónio, seguida por cromatografia de permuta iõnica em DEAE-Sephadex, e deΊΟ 532 <*·· SCRF 174.0 POR & /Li—

pois, por cromatografia de afinidade era Prot-G Sepharose. As concentrações de proteínas foram determinadas pelo método de Lowry /J. Biol. Chem., 193: 265 (1951)./.

As soluções aquosas contendo receptor, resultantes, foram concentradas por ultrafiltração Araicon e dialisadas em tampão de fosfato 5 mM contendo NaCl 20 mM, e EDTA 20 mM, a pH 7, para re mover os iões metálicos. As soluções contendo EDTA foram então dialisadas num tampão de fosfato 5 mM e NaCl 20 mM, a pH 7, para uso Prepararam-se soluções de reserva de receptor 28F11, por concentra ção das soluções.preparadas acima no filtro Amicon, até uma concen tração de cerca de 4 a cerca de 20 mg/ml.

A porção de fragmento Fab' foi preparada como se segue. Dissolveu-se o receptor monoclonal purificado, 28F11, (28 mg) em tampão de citrato 0,1 M, a pH 3,7, para proporcionar uma concentração de proteínas de 1 mg/ml. Adicionaram-se pequenas quantidades de tampão de citrato 1,0 M, ã solução de receptor, para ajustar o valor de pH a 3,7.

Subsequentemente, adicionaram-se 1,4 mg de pepsina, ã solução de receptor de pH ajustado, e manteve-se a mistura resultante a 37 graus C durante um período de 2 horas e 20 minutos para formar fragmentos Fíab')^· Parou-se a reacção por adição de 2 ml de tampão Tris-HCl 3M com um valor de pH de 8,0, o que aumentou o valor de pH da solução para 7,5.

à solução anterior contendo F(ab')₃ adicionou-se cisteína (36,4 mg) e a mistura resultante foi mantida a 22 graus C durante um período de tempo de 3 horas. Adicionou-se iodoacetamida suficiente para proporcionar uma concentração final de iodoacetamida de 30 mM. A solução contendo iodoacetamida foi mantida a 4 graus C durante 4 horas, na ausência de luz. A mistura reaccional foi então dialisada num tampão contendo 200 mg de acetato de sódio de tampão de fosfato 10 mM a pH 6,8, mantendo a concentração de proteína de receptor a 1 mg/ml.

As porções de fragmentos de anticorpos Fab¹, resultantes foram purificadas por cromatografia de exclusão de tamanhos em

HPLC de sílica, utilizando uma coluna TSKG-300 e o ultimo tampão

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referido. As fracções de eluição foram analisadas por SDS-PAGE para determinar os fragmentos Fab' desejados, de dimensão adequada

As fracções contendo fragmento Fab' foram dialisadas num tampão contendo NaCl 20 mM, EDTA 5 mM e fosfato 5 mM a pH 7, para remover os iões metálicos multivalentes. O EDTA foi subsequentemen te removido por diálise num tampão contendo NaCl 20 mM e fosfato 5 mM, a pH 7. As soluções de reserva das porções de anticorpos Fab foram concentradas num aparelho de ultrafiltração Amicon atê uma concentração de proteínas de cerca de 4 a cerca de 10 mg/ml.

Um desses hibridomas, como exemplo da classe, foi deposi tado na American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD EUA. Esse hibridoma, designado por 28F11, e com o numero de acesso no ATCC, HB 9971, foi depositado a 13 de Janeiro de 1989.

O depósito anterior foi efectuado de acordo com os requisitos do Tratado de Budapeste,no qual a duração dos depósitos deverá ser de 30 anos a partir da data do depósito, ou de 5 anos apõs o último pedido para o depósito no depositário, ou durante a vida possível de uma Patente dos EUA que resultara do pedido de Patente, adoptando-se o prazo mais longo. Os hibridomas serão substituídos ã medida quese tornarem não viãveis no depositário.

Para uma outra preparação das moléculas de receptor, o gene que codifica um fragmento formando sítios de combinação com anticorpos pode ser obtido a partir de qualquer célula que produza uma molécula de anticorpo que imunorreaja como aqui se descreveu. Uma célula preferida é uma célula de hibridoma.

Para exemplos de processos gerais de clonação de ADN recombinante, ver Molecular Cloning, Maniatis et al., Cold Spring Harbor Lab., N.Y., 1982; DNA Cloning, Glover, ed., IRL Press, McLean VA (1985). Para a clonação e expressão genõmicas dos genes de imunoglobulina em células linfõides, ver Neuberger et al., Nature , 312:604-8 (1984); Ochi et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA,

80:6351-55 (1987); e Oi et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 80:

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825-29 (1983). Para a clonação de genes de imunoglobulina a partir de células de hibridoma e expressão em oócitos de Xenopus, ver Roberts et al. , Protein Engineering, 1:59-65 (1986), e ver Wood et al. para a expressão em leveduras. Nature, 314:446-9 (1985)

A descrição anterior, incluindo as concretizações e exemplos específicos, pretende ser ilustrativa do presente invento e não deve ser entendida como limitante. Podem ser efectuadas numerosas outras variações e modificações sem afastamento do verdadeiro espírito e âmbito do presente invento.

Claims (30)

1. REIVINDICAÇÕES

   1 - Processo de preparação de uma molécula catalítica compreendendo uma molécula de receptor contendo um sítio de combinação com anticorpos que se liga imunologicamente a uma pluralidade de imunoligandos contendo, cada um, um complexo de coordenação de ião metálico polivalente, sendo o referido complexo de coordenação, de um primeiro imunoligando, cineticamente inerte, e sendo o referido complexo de coordenação, de um segundo imunoligando, cineticamente lãbil, catalisando, adicionalmente, a referida molécula de receptor uma reacção química do referido segundo imunoligando, e não catalisando a mesma reacção química no referido primeiro imunoligando tal como é catalisada no referido segundo imunoligando, caracterizado por compreender os passos de:

   (a) proporcionar anticorpos produzidos por um animal hospedeiro previamente imunizado com o referido primeiro imunoligando de modo a formar anticorpos contra o referido primeiro imuno ligando;

   (b) pesquisa nos anticorpos formados, de anticorpos que se ligam ao referido primeiro imunoligando;

   (c) pesquisa nos referidos anticorpos recuperados, de anticorpos que se ligam ao referido segundo imunoligando e que catalisam uma reacção química do referido segundo imunoligando; e (d) recuperação dos anticorpos que se ligam quer ao referido primeiro imunoligando do passo (b) quer ao referido segundo imunoligando do passo (c).
2. 2 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a referida molécula catalítica ser uma molécula de receptor monoclonal produzida pelos passos adicionais de:

   (e) proporcionar células do baço do animal hospedeiro imunizado cujos anticorpos se ligam quer ao referido primeiro imunoligando do passo (b) quer ao referido segundo imunoligando do passo (c);

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   - 55 - _: ;

   (f) fusão das referidas células do baço com células de mieloma para formar células de hibridoma;

   (g) clonação das referidas células de hibridoma até monoclonicidade e cultura das células monoclonais;

   (h) pesquisa, no meio de crescimento das referidas cul turas de células de hibridoma monoclonais, de anticorpos segregados que se ligam quer ao referido primeiro imunoligando quer ao referido segundo imunoligando e que catalisam uma reacção química do referido segundo imunoligando; e (i) recuperação dos anticorpos do passo (h).
3. 3 - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracte rizado por a reacção química catalisada ser a de cisão de uma ligação peptídica, predeterminada.
4. 4 - Processo de preparação de uma composição de molécula catalítica monoclonal, compreendendo moléculas de receptor contendo um sítio de combinação com anticorpos que se liga imunologicamente a um primeiro imunoligando, formando um imunocomplexo com uma constante de dissociação de cerca de 10 ou menor, e a um segundo imunoligando, e que catalisa uma reacção química do re ferido segundo imunoligando;

   compreendendo, o referido imunoligando, um complexo, de coordenação de ião metálico, cineticamente inerte, que contém um primeiro ião metálico polivalente coordenado com dois ou mais ligandos de coordenação de ião metálico individuais, sendo o primei ro, dos referidos ligandos de coordenação individuais, uni ou mui tidentado, e sendo o segundo, dos referidos ligandos individuais, uni ou bidentado, incluindo ainda, o referido segundo ligando de coordenação individual, uma primeira estrutura orgânica não reactiva que contém uma cadeia, anel ou anel substituído por cadeias, com pelo menos 10 átomos; e compreendendo, o referido segundo imunoligando, um complexo de co ordenação de ião metálico, cineticamente lábil, que contêm um segundo ião metálico polivalente, diferente do ião metálico do refe· rido primeiro complexo de coordenação ou do mesmo metal que o do

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   SCRF 174.0 POR referido primeiro complexo de coordenação individual, com um estado de oxidação mais baixo, que estã coordenado a dois ou mais ligandos de coordenação de ião metálico individuais, sendo o primeiro dos referidos ligandos de coordenação individuais uni ou multidentado e tendo um tamanho substancialmente similar, uma funcionalidade de coordenação de ligando e uma estrutura substancialmente similares aos do referido primeiro ligando de coordenação do referido complexo de coordenação cineticamente inerte, e sendo o segundo dos referidos ligandos individuais uni ou bidentado, incluindo ainda o referido segundo ligando de coordenação uma estrutura orgânica reactiva, que contém uma cadeia, um anel ou um anel substituído por cadeias, com pelo menos 10 átomos, numa configuração atómica suficientemente similar ã da referida primeira estrutura orgânica não reactiva, de modo que a constante de dissociação de um imunocomplexo formado entre a referida molécula catalítica e o referido segundo ligando de coordenação seja de, no mãximo,

   10 , caracterizado por compreender os passos de:

   (a) proporcionar anticorpos produzidos por um animal hospedeiro previamente imunizado com o referido primeiro imunoligando de modo a formar anticorpos contra o referido primeiro imunoligando ;

   (b) pesquisa, nos anticorpos formados, de anticorpos que se ligam ao referido primeiro imunoligando;

   (c) proporcionar células do baço do animal hospedeiro imunizado, cujos anticorpos se ligam ao referido primeiro imunoligando do passo (b);

   (d) fusão das referidas células do baço com células de mieloma para formar células de hibridoma;

   (e) clonação das referidas células de hibridoma, até monoclonicidade, e cultura das células monoclonais;

   (f) pesquisa, no meio de crescimento das referidas culturas de células de hibridoma monoclonais, de anticorpos segregados que catalisam uma reacção química do referido segundo imunoligando ; e (g) recuperação dos anticorpos do passo (f).

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5. 5 - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o número de coordenação do ião metálico do referido segundo imunoligando ser igual ou não inferior ao numero de coordenação do ião metálico do referido primeiro imunoligando.
6. 6 - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por cada um dos referidos complexos de coordenação de ião metálico, cineticamente inerte e cineticamente lãbil, ter duas ou mais faces que são relativamente hidrofóbicas e uma ou duas faces que são relativamente hidrofílicas.
7. 7 - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por as referidas faces relativamente hidrofóbicas serem proporcionadas, pelo menos em parte, pelos referidos primeiros imunoligandos de coordenação.
8. 8 - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por a face, ou faces, relativamente hidrofóbica(s) ser(em proporcionada(s) por um grupo, carregado anionicamente, dos referidos segundos ligandos uni ou bidentados.
9. 9 - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por a referida reacção quimica catalisada ser a de cisão de uma ligação peptídica, prê-seleccionada, de um péptido contendo pelo menos 3 resíduos de aminoácido, contendo, a referida estrutura orgânica reactiva do referido complexo de coordenação cineticamente lãbil, um péptido com pelo menos 3 resíduos de aminoácido, incluindo o resíduo cuja ligação peptídica ê clivada, e contendo a referida estrutura orgânica não reactiva do referido complexo de coordenação cineticamente inerte, um péptido tendo 3 a cerca de 10 resíduos de aminoácido tendo um carbono de amidocarbonilo numa posição análoga à do carbono de carbonilo cindível da ligação peptídica hidrolisada que está ligado a um grupo funcional de coordenação por uma cadeia de 2 a cerca de 7 átomos.
10. 10 - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por a ãgua ou o ião hidróxido ser um ligando de coordena/9

    ΊΟ 532

    SCRF 174.0 POR

    -τ

    - 58 - /'/......

    ção do referido segundo complexo de coordenação cineticamente lãbil.
11. 11 - Processo de preparação de uma composição de molécula de absin monoclonal compreendendo moléculas de receptor contendo um sitio de combinação com anticorpos, que se liga imunologicamente a um primeiro imunoligando contendo péptido, forman— 8 do um imunocomplexo com uma constante de dissociação de 10 ou menor, e a um segundo imunoligando contendo péptido e que exibe actividade catalítica da hidrolase em relação a uma ligação peptídica predeterminada do referido segundo imunoligando;

    compreendendo, o referido primeiro imunoligando, um complexo de coordenação de ião metãlico, cineticamente inerte, que contém um primeiro ião metãlico coordenado com dois ou mais ligandos de coordenação de ião metálico individuais, sendo, o primeiro dos referidos ligandos individuais, uni ou multidentado e sendo, o segundo dos referidos ligandos individuais, uni ou bidentado e incluindo um péptido não reactivo que contém 3 a cerca de 10 resíduos de aminoácido, tendo um carbono de amidocarbonilo ligado a um grupo funcional de coordenação de ião metãlico por uma cadeia de 2 a cerca de 7 átomos, estando o referido carbono de amidocarbonilo ligado, numa posição análoga, ao carbono de carbonilo cindível da ligação peptídica hidrolisada; e compreendendo, o referido segundo imunoligando, um complexo de coordenação de ião metálico, cineticamente lãbil, que con tém um segundo ião metálico, diferente do ião metãlico do referido primeiro complexo de coordenação, ou do mesmo metal que o do referido primeiro complexo de coordenação, com um estado de oxidação mais baixo, que estã coordenado a dois ou mais ligandos de coordenação de ião metálico individuais, sendo o primeiro, dos referidos ligandos de coordenação, uni ou multidentado, tendo um tamanho substancialmente similar, uma funcionalidade de coordenação de ligando e uma estrutura substancialmente similares aos do referido primeiro ligando de coordenação individual do referido complexo de coordenação cineticamente inerte, e sendo o segundo, dos referidos ligandos de coordenação individuais, uni ou bidentado, e incluindo ainda um péptido reactivo contendo pelo menos 3 resí70 532

    SCRF 174.0 POR duos de aminoácido, que tem uma configuração atómica suficientemente similar à do referido péptido não reactivo, de modo que a constante de dissociação para um imunocomplexo formado entre a re- - - -2 ferida absin e o referido péptido reactivo e de, no máximo, 10 caracterizado por compreender os passos de:

    (a) proporcionar anticorpos produzidos por um animal hospedeiro previamente imunizado com o referido primeiro imunoligando de modo a formar anticorpos contra o referido primeiro imunoligando;

    (b) pesquisa, nos anticorpos formados, de anticorpos que se ligam ao referido primeiro imunoligando;

    (c) proporcionar células do baço do animal hospedeiro imunizado cujos anticorpos se ligam ao referido primeiro imunoligando do passo (b);

    (d) fusão das referidas células do baço com células de mieloma, para formar células de hibridoma;

    (e) clonação das referidas células de hibridoma, atê monoclonicidade, e cultura das células monoclonais;

    (f) pesquisa, no meio de crescimento das referidas culturas de células de hibridoma monoclonais, de anticorpos segregados que se ligam ao referido segundo imunoligando e que catalisam uma reacção química do referido segundo imunoligando; e (g) recuperação dos anticorpos do passo (f).
12. 12 - Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por o ião metálico do referido primeiro imunoligando, cineticamente inerte, ser Co(III), e o ião metálico do referido segundo imunoligando, cineticamente lãbil, ser um elemento do grupo constituído por Zn(II), Fe(III), Co(II), Cu(II), Ga(III), Lu(III), In(III), Al(III), Mn(II), Ni(II) e Mg(II).
13. 13 - Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por o referido primeiro ligando de coordenação individual, quer do referido primeiro ligando, cineticamente inerte, quer

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    SCRF 174.0 POR do referido segundo ligando, cineticamente lãbil, ser a trietilenotetramina.
14. 14 - Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por o referido péptido, nãò reactivo, do segundo ligando de coordenação individual do referido complexo de coordenação, cineticamente inerte, ter uma estrutura que e representada pela fórmula :

    O

    ΌΗ e por o referido segundo ligando de coordenação individual, conten do péptido reactivo do referido complexo de coordenação, cineticamente lãbil, ter uma estrutura que ê representada pelas fórmulas:

    O

    H ou

    H

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    SCRF 174.0 POR
15. 15 - Processo para realizar uma reacção química predeterminada caracterizado por compreender os passos de:

    (a) mistura, num meio aquoso, de uma quantidade cataliticamente eficaz de uma molécula de receptor, de uma molécula de cofactor e de uma molécula de substrato para formar uma mistura onde a referida molécula de receptor contém um sítio de combinação com anticorpos, que se liga imunologicamente a uma pluralidade de imunoligandos que contêm, cada um, um complexo de coordenação de um ião metálico polivalente, um primeiro, dos referidos imunoligandos, sendo cineticamente inerte e um segundo, dos referidos imunoligandos, sendo cineticamente lãbil, o referido cofactor e o referido substrato compreendendo o referido segundo imunoligando, catalisando, a referida molécula de receptor, a referida reacção predeterminada no referido substrato e não catalisando qualquer reacção química no referido primeiro imunoligando; e (b) manutenção da referida mistura por um período de tempo suficiente para que ocorra a referida reacção, predeterminada .
16. 16 - Processo de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por a referida molécula reactiva ser monoclonal.
17. 17 - Processo de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por a referida reacção predeterminada ser a de cisão de uma ligação peptídica predeterminada.
18. 18 - Processo para promover uma reacção quimica predeterminada, caracterizada por compreender os passos de:

    a) mistura, num meio aquoso, de uma quantidade cataliticamente eficaz de uma molécula de receptor monoclonal, de uma molécula de cofactor e de uma molécula de substrato para formar uma mistura, onde o referido receptor contém um sítio de combinação com anticorpos que se liga, imunologicamente, a um primeiro imunoligando e a um segundo imunoligando, e que catalisa a referida reacção química predeterminada no referido segundo imunoligando, o referido primeiro imunoligando compreendendo um comΊΟ 532

    SCRF 174.0 POR plexo de coordenação de um ião metálico, cineticamente inerte, que contém um primeiro ião metálico polivalente coordenado com dois ou mais ligandos de coordenação de um ião metálico individuais, um dos referidos ligandos de coordenação individuais sendo uni ou multidentado e o outro, dos referidos ligandos de coordenação individuais, sendo uni ou bidentado, o referido outro ligando de coordenação individual incluindo, ainda, uma primeira estrutura orgânica não reactiva que contém uma cadeia, anel ou anel substituído com uma cadeia, com pelo menos 10 átomos, sendo a constante de dissociação para um imunocomplexo entre a referida molécula de re— 8 ceptor e o referido primeiro imunoligando, de 10 ou inferior; e o referido segundo imunoligando compreendendo um complexo de coordenação de um ião metálico, cineticamente lãbil, que contém um segundo ião metálico polivalente, diferente do referido primeiro ião metálico polivalente e que estã coordenado com dois ou mais ligandos de coordenação de um ião metálico individuais, o primeiro, dos referidos ligandos de coordenação individuais, sendo uni ou multidentado e tendo um tamanho substancialmente similar, uma funcionalidade de coordenação a ligandos e uma estrutura substancialmente similares aos do referido primeiro ligando de coordenação individual do referido complexo de coordenação cineticamente inerte, e o segundo, dos referidos ligandos de coordenação individuais, sendo uni ou bidentado o referido segundo ligando de coordenação incluindo ainda uma estrutura orgânica reactiva que contém uma cadeia, anel ou anel substituído com uma cadeia, com pelo menos 10 ãtomos, com uma semelhança configuracional atómica suficiente, em relação ã referida primeira estrutura orgânica não reactiva, tal que a constante de dissociação para um imunocomplexo formado entre a referida molécula catalítica e o referido se~ - -2 gundo ligando de coordenação e, no máximo, de 10 , o referido segundo ião metálico e o referido primeiro ligando de coordenação individual compreendendo a referida molécula de cofactor e o referido segundo ligando de coordenação individual constituindo a referida molécula de substrato; e

    b) manutenção da referida mistura por um período de tempo suficiente para que a referida reacção química, predeterminada,

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    SCRF 174.0 POR ocorra.
19. 19 - Processo de acordo com a reivindicação 18, caracterizado por o numero de coordenação do ião metálico do referido segundo imunoligando ser igual, ou inferior, em pelo menos um, ao numero de coordenação do referido primeiro imunoligando.
20. 20 - Processo de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por cada um, dos referidos complexos de coordenação de iões metálicos, cineticamente inerte e cineticamente lãbil, ter duas ou mais faces que são relativamente hidrofõbicas e uma ou duas faces que são relativamente hidrofílicas.
21. 21 - Processo de acordo com a reivindicação 18, caracterizado por a referida reacção química catalisada, ser a de cisão de uma ligação peptídica pré-seleccionada, de um péptido contendo pelo menos 3 resíduos de aminoâcido, a referida estrutura orgânica reactiva do referido complexo de coordenação, cineticamente lãbil, contendo um péptido com pelo menos 3 resíduos de aminoãcido, incluindo o resíduo cuja ligação peptídica vai ser clivada e a referida estrutura orgânica não reactiva do referido complexo de coordenação cineticamente inerte, contendo um péptido com 3 a cerca de 10 resíduos de aminoâcido, com um carbono de amidocarbonilo numa posição análoga à do carbono de carbonilo cindivel da ligação peptídica hidrolisada que estã ligada por uma cadeia de 2 a 7 ãtomos a um grupo funcional de coordenação.
22. 22 - Processo de acordo com a reivindicação 18, caracterizado por o referido cofactor estar presente, na referida mistura, numa concentração de cerca de 0,1 a cerca de 10 vezes a concentração do referido substrato.
23. 23 - Processo de hidrólise de uma ligação peptídica pré-seleccionada compreendendo os passos de:

    a) mistura num meio aquoso de uma quantidade catalicamente eficaz de uma molécula de absin que contém um sítio de com-

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    SCRF 174.0 POR binação com anticorpos que se liga imunologicamente a um primeiro imunoligando contendo um peptido e a um segundo imunoligando contendo um peptido e que exibe uma actividade catalítica da hidrolase, em relação a uma ligação peptídica predeterminada do referido segundo imunoligando, o referido primeiro imunoligando compreendendo um complexo de coordenação de um ião metálico, cineticamente inerte, que contêm um primeiro ião metálico coordenado com dois ou mais ligandos de coordenação a um ião metálico, individuais, o primeiro dos referidos ligandos de coordenação individuais sendo uni ou multidentado, e o segundo dos referidos ligandos de coordenação individuais sendo uni ou bidentado, e incluindo um peptido não reactivo que contém 3 a cerca de 10 resíduos de aminoácido, com um carbono de amidocarbonilo ligado, por uma cadeia de 2 a cerca de 7 átomos, a um grupo funcional de coordenação a iões metálicos, estando o referido carbono de amidocarbonilo ligado, numa posição análoga a do carbono de carbonilo cindivel da ligação peptídica hidrolisada, a constante de dissociação para um imunocomplexo entre a referida molécula de receptor e o referido primeiro imunoligando sendo 10 ou inferior; e o referido segundo imunoligando compreendendo um complexo de coordenação de um ião metálico, cineticamente lãbil, que contém um segundo ião metálico, diferente do ião metálico do referido primeiro complexo de coordenação, ou do mesmo metal que o do referido primeiro complexo de coordenação num estado de oxidação mais baixo, e que estã coordenado com um ou mais ligandos de coordenação a um ião metálico, individuais, o primeiro dos seus referidos ligandos de coordenação individuais sendo uni ou multidentado, tendo um tamanho substancialmente similar, uma funcionalidade de coordenação a ligandos e uma estrutura substancialmente similares aos do referido primeiro ligando de coordenação individual, do referido complexo de coordenação, cineticamente inerte, e o segundo, dos seus ligandos de coordenação individuais, sendo uni ou bidentado e incluindo ainda um peptido reactivo, contendo pelo menos 3 resíduos de aminoácido, que têm uma semelhança configuracional atómica suficiente com o referido pêptido não reacΊΟ 532 'SCRF 17 4.0 POR jg ((

    - 65 tivo, para que a constante de dissociação de um imunocomplexo, formado entre a referida absin e o referido péptido reactivo, seja

    -2 ~ no máximo de 10 , o referido segundo iao metálico e o primeiro seu ligando de coordenação individual compreendendo o referido cofactor, e o péptido reactivo do referido seu segundo ligando de coordenação individual constituindo o referido substrato; e

    b) manutenção da referida mistura por um período de tempo suficiente para que a reacção ocorra.
24. 24 - Processo de acordo com a reivindicação 23, caracterizado por o ião metálico do referido primeiro imunoligando, cineticamente inerte, ser Co(III) e por o ião metálico do referido segundo imunoligando, cineticamente lãbil, ser um elemento do grupo consistindo de Zn(II), Fe(III), Co(II), Cu(II), Ga(III), Lu(III), In(III), Al(III), Mn(II), Ni(II) e Mg(II).
25. 25 - Processo de acordo com a reivindicação 24, caracterizado por o referido primeiro ligando de coordenação individual de ambos os referidos primeiro ligando, cineticamente inerte, e do segundo ligando, cineticamente lábil, ser a trietilenotetramina.
26. 26 - Processo de acordo com a reivindicação 24, caracterizado por o referido péptido não reactivo do segundo ligando de coordenação individual do referido complexo de coordenação, cineticamente inerte, ter uma estrutura que é representada pela fórmula

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    SCRF'174.0 POR

    - 66 - /+/ e por o referido segundo ligando de coordenação individual, conten do o péptido reactivo do referido complexo de coordenação, cineticamente lãbil, ter uma estrutura que é representada pelas fórmulas ou

    H
27. 27 - Processo de preparaçao de um hibridoma que segrega uma molécula de receptor monoclonal, cujo sítio de combinação com anticorpos catalisa uma reacção química predeterminada, ligando-se o referido sítio de combinação com anticorpos a uma pluralidade de imunoligandos que contêm, cada um, um complexo de coordenação de ião metálico polivalente, no qual um primeiro, dos referidos imunoligandos, ê cineticamente inerte e um segundo, dos referidos imunoligandos, é cineticamente lãbil, catalisando, a referida molécula de receptor, a referida reacção química no referido segundo imunoligando, e não catalisando nenhuma reacção química no referido primeiro imunoligando, caracterizado por compreender os passos de:

    (a) proporcionar anticorpos produzidos por um animal hospedeiro, previamente imunizado com o referido primeiro imunoligando de modo a formar anticorpos contra o referido primeiro imunoligando ;

    (b) pesquisa, nos anticorpos formados, de anticorpos que se ligam ao referido primeiro imunoligando;

    (c) proporcionar células do baço do animal hospedeiro

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    - 67 imunizado cujos anticorpos se ligam ao referido primeiro imunoligando do passo (b);

    (d) fusão das referidas células do baço com células de mieloma, para formar células de hibridoma; e (e) pesquisa, no meio de crescimento das referidas cul turas de células de hibridoma monoclonais, de anticorpos segregados que se ligam ao referido segundo imunoligando e que catalisam uma reacção química do referido segundo imunoligando; e (f) clonação, até monoclonicidade, das referidas células de hibridoma do passo (e) cujos anticorpos catalisam uma reacção química do referido segundo imunoligando, e cultura das células monoclonais.
28. 28 - Processo de acordo com a reivindicação 27, carac terizado por a referida reacção química ser a de cisão de uma ligação peptídica predeterminada.
29. 29 - Processo de acordo com a reivindicação 27, carac terizado por o sítio de combinação com anticorpos, da referida mo lécula de receptor, e o referido primeiro imunoligando formarem um imunocomplexo tendo uma constante de dissociação de 10 ou me nor.
30. 30 - Processo de acordo com a reivindicação 25, carac terizado por o referido hibridoma ser denominado 28H11 e ter o nu mero de acesso no ATCC, HB 9971.