JPH04504526A - 多価金属イオン―含有抗体結合部位触媒 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 多価金属イオン−含有抗体結合部位触媒本願は免疫原、抗体及び抗原に関し、更 に詳しくは多価金属イオンを含む抗原免疫リガンド中の化学反応を触媒し結合す る部位含有レセプター分子を結合する抗体に関する。

発明の背景 リガンドとレセプターの間の結合現象は、生物シスチル中で決定的な役割を演じ る。そのような現象の例は、酸素原子のデオキシヘモグロビンへの結合によるオ キシヘモグロビンの形成であり、及びタンパク質とトリプリンのようなプロテア ーゼの間のような基質とその上で作用する酵素の結合である。生物的結合現象の 別の例は、抗原と抗体の結合、補体成分Ｃ３といわゆるＣＲＩレセプターとの結 合がある。

多の医薬品及び他の治療薬も、結合現象に依存していると考えられている。例え ば、モルヒネのような麻酔薬は、脳の中の特定のレセプターに結合すると報告さ れている。麻酔薬作動薬及び非作働薬は、これら結合部位でモルヒネの様な薬と 競合すると報告されている。

モルヒネ及びその誘導体のような人造薬並びにエンドルフィン（ｅｎｄｏｒｐｈ ｉｎｓ）及びホルモンのような生体系に自然に存在するものは、生体系に自然に 存在するレセプターと結合し、ここで−緒に処理されるであろう。そのような結 合は生物学の現象の多く、特にタンパク質がトリプシンやパパインのような酵素 により構成ポリペプチドに加水分解される場合、又は脂肪がグリセリン及び３つ のカルボン酸にそれぞれ分解される場合のようなアミン及びエバク質性化合物の 合成を含む、に導びくてあろう。

ソルビン、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　、５　：２８３ ６−２８４４　（１９６６）は牛血清アルブミンのｐ−パラニトロカルボベンゾ キシ共役体に対する抗体の製造を報告した。これら抗体はその後、ｐ−ニトロフ ェニルアセテート及びイプシロン−アミノカプロエートエステル類の加水分解に 用いられた。アセテートエステルとの反応は、秒単位速度定数により記載され、 非特異的であろうと述べられていた。普通のガンマグロブリンを用いて得た秒単 位速度定数は、特別に調製した抗体のそれとほぼ等しかったと記載されていた。

特別に調製した抗体の存在は、アミノカプロエートエステルの加水分解を阻害す ると記載されていた。

コーエンと共同研究者もエステル分解（ｅｓｔｅｒｏｌｙｓｉｓ）を触媒する抗 体の使用の企てを報告した。このグループにより用いられた抗体は、いずれの例 でも、加水分解されるべき結合を含まない最終的に用いた基質分子を与えた。

彼らの最初の仕事［ＦＥＢＳレターズ（Ｌｅｔｔｅｒｓ）、上且旦：１３７−１ ４０　（＋９７９）及びバイオキミ、バイオフィシ、アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ、 　Ｂｊｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ、６２９　：　３２８−３３７　（１９８０）］ で、］抗−ステロイド抗がステロイドのカルボキシエチルチオエーテルの７−ウ ンベリフェロン（７−ヒトロキシコウメリン）エステルの加水分解に用いられた 。いずれの例も、加水分解速度の増加が、バックグランド又は普通のＩｇＧで得 られた速度との比較で観測された。両者の例とも、ターンオーバー数は低（（分 当り抗体モル当り約１モルの基質又は以下）、かつ反応速度は時間とともに低下 し、抗体の飽和によりプラトーになった。速度のこのようなスローダウンは、ス テロイド様酸生成物の抗体に対する不可！的結合に寄因した。

コーエンらはまた７−［−Ｎ−（２，４−ジニトロフェニル）−６−アミンヘキ サツイルコーコウメリン（ｃｏｕｍｅｒｉｎ）のモノクローナル抗体を用いた加 水分解はその基質分子のジニトロフェニル部分を与えることを報告した［ＦＥＢ Ｓレターズ（Ｌｅｔｔｅｒｓ）　。

１１１　：４２７−４３１　（１９８０）、］。ここでババックグランドに対す る速度増加も報告されたが、反応は触媒的よりは化学量論的であると述べられた 。ゼロに達した速度の低下は、抗体の飽和になったときと報告された。再度、こ の低下は生成物酸の抗体に対する結合により生じる生成阻害によった。なぜなら 、初期の加水分解活性のいく分かは、抗体−基質−生成物混合物のクロマトグラ フィーにより再生されたからである。

強力な抗体結合が基質分子の安定状態に向けられるとき、複合体の分解の遅い速 度は触媒を妨げるであろう。それはコーエンと共同研究者によって報告された結 果の状況であると考えられる。

上記構成は、興味深いけれど、酵素に本質的な結合エネルギー利用のメカニズム の説明がないことにより非常に限定される〔Ｗ。

Ｐ、ジエンシス（Ｊｅｎｃｋｓ）、Ａｄｖ、　：ｒ−ンチモル（Ｅｎｚｙｍｏｌ ）、、４３゜２１９　（１９７５））。

これらの不足は、所望の抗体を引き出すためにハブテンとして遷移状態アナログ を用いることにより救済できる。このハブテンは触媒系中で阻害剤の役割である と推定できる。

従って、免疫的結合は触媒プロセスに対する実験的転換結合相互作用に用いるこ とができる。例えば、与えられた反応の遷移的状態に似たハブテングループに対 する抗体の使用は、基質を遷移状態に似せることによって基質反応を加速させる ことが示唆された。ジェンシス（Ｊｅｎｃｋｓ）、　Ｗ、　Ｐ、、キャタリシス 　イン　ケミストリー、アンド　エンチモロジ−（Ｃａｔａｌｙｓｉｓ　ｉｎ　 Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、　２８８ページ（マツク ロー−ヒル（ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉ　１１）。

ニューヨーク９６９）。

この広い示唆にもかかわらず、特定の遷移状態ハブテンは、示唆されなかったか 、あるいはこの概念がテストされた特定反応を示唆しなかった。

アミンとエステル結合の加水分解は、現在受は入れられている化学理論によって 、カルボニル炭素原子での反応により水性媒体中で進行して（ａ）アミン又はエ ステルの酸部分の炭素原子、（ｂ）２つの酸素原子、一方はカルボニル基からの もので、他方は水酸イオン又は媒体の水分子からのものである、及び（Ｃ）エス テルのアルコール部分の酸素原子又はアミンのアミン部分の窒素原子と結合した 四面体炭素原子を含む遷移状態を形成する。そのような反応の遷移状態は、定義 による有用な心理的構成であり、単離可能な中間体に比べて単離することはでき ない。

上記加水分解遷移状態は単離することはできないけれど、多量の科学文献は、こ の主題に対して熱心であった。いくつかの文献は、以下で述べる。

アミン及びエステル加水分解の前述の遷移状態は良く理解されていると考えられ ているにもかかわらず、特定のアミン例えばタンパク質又はエステル例えば脂肪 がこれら遷移状態を経由して反応するレセプター結合部位のトポロジーのパラメ ーター、例えば大きさ、形及び電荷は良く理解されていない。従って複数の結合 部位のトポロジーが知られ、これら部位に結合するリガンドの相互作用が研究で きれば有益であろう。不幸にして、生物学的加水分解におけるレセプター結合部 位のトポロジーは、Ｘ−線結晶構造が決定されている比較的少数の酵素を除いて 、一般に知られていない。

この結合部位トポロジーの知識の欠如は、一部は、レセプターの多数の結合部位 の細胞内での位置についての知識の欠如に由来する。加えて、位置は知られてい るこれらレセプター結合部位について、結合部位の化学的同一性、即ちタンパク 質及び炭水化物組成は一般に知られていない。従って、研究者は、レセプター結 合部位のトポロジー的要件を理解するための探査を一般に妨害され、そのためこ れら要件を満たし得る治療薬の構築を妨害される。

従って、研究者は、潜在的治療薬が有用かどうかを確めるため動物又は細胞培養 研究において潜在的治療薬のスクリーニングをしなければならない。そのような システムは、有用ではあるが、高価であり、使用に時間か掛かる。

酵素のような加水分解レセプターの化学的反応性とトポロジーが知られている場 合であっても、加水分解性プロテアーゼのような酵素は典型的には、タンパク質 のポリペプチド鎖中で多数回生じるかもしれない特定のアミノ酸残基に隣接した 基質であるポリペプチド鎖を分解する。そのような比較的にランダムな分解はそ のタンしくり質のポリペプチド地図を得るときには有用であり得るが、この比較 的ランダムな分解は特定のアミノ酸残基配列を生成させたいときには有用ではな い。

例えば、近代の遺伝子工学技術は１ａｃＺ遺伝子のようなベクター遺伝子の転写 生成物に融合された所望のタンパク質又はポリペプチドを含む融合タンパク質の 製造の際には有用であった。しかし、そのような融合タンパク質の使用は、ベク ター遺伝子生成物の断片の存在によって妨げられる。従ってタンパク質分解的酵 素様分子、それは必要な及び不必要な融合ポリペプチド又はタンパク質部分の間 でそのような融合生成物を分解するであろう、を製造できれば有益であろう。

最近、レーナー（Ｌｅｒｎｅｒ）、ｈラモンタノ（Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏ）及び ヤング（Ｊａｎｄａ）　（トラモンタノ（Ｔｒａｍｏｎ　ｔａｎｏ）ら、サイエ ンス（Ｓｃｉ−ｅｎｃｅ）、２３４．１５６６　（１９８６））はエステルを触 媒的に加水分解するモノクローナル抗体を報告した。トラモンタノとレーナは、 又、米国特許第４．６５６．５６７号でモノクローナル抗体を用いてエステルを 加水分解することを記載している。ボラック（Ｐａｌ　１ａｃｋ）。

質を報告した。

２つのレーナーとトラモンタノの報告において、抗体はカルボン酸エステル又は カーボネートエステルの四面体加水分解的遷移状態の安定なアナログを表わすた めに合成されたホスホネートを与える。ボラック（Ｐｏｌ　１ａｃｋ）らが主に 述べた抗体は、加水分解されたカーボネートアナログに構造的に類似したホスホ ネートと結合することがあるミエローマタンパク質であった。従って、レーナー とトラモンタノらの研究で、加水分解されるべき基質は免疫アナログと所望の生 成物に従って合成される加水分解的抗体とともに予め選択された。ボラックらは 、一度ミエローマタンパク質の特異性を知ると、加水分解されるべき基質をデザ インした。ボラックらは、又、レーナー（Ｌｅｒｎｅｒ）らの概念と似たカーボ ネート加水分解のだめの触媒的抗体、基質及びアナログ基質系の存在を（上記で ）報告した。この系に関する研究は、ヤコブス（Ｊａｃｏ−ｂｓ）公開された特 許出願ＷＯ３５１０２４１４は触媒としての抗体の可能な使用について延べ、０ −ニトロフェニル−ベーターＤ−ガラクトシドの加水分解におけるポリクローナ ル血清の使用に関するデータを示している。この出願において有用な抗体は反応 体、反応中間体によって、又は反応体、生成物又は反応中間体のアナログに誘導 できると述べられている。用語“アナログは異性体、同族体又はアナログを与え る抗体が反応体との免疫反応において認識できるが、アナログの反応を必然的に 触媒するであろう程に化学構造に関して反応体に十分に似ている他の化合物を包 含すると定義される。

その明細書において提供されたデータは、単に、比較的濃縮された抗体調製物（ ］：１０と１＝２０希釈）を用いて１８時間の間、基質（反応体）ガラクトシド の分解が起こったことを示す。

触媒は記載されているが、触媒活性は示されていない。なぜなら記載された触媒 抗体のターンオーバーが示されておらず、分解した基質ガラクトシドのパーセン トが示されていないからである。

その出願は、ベーターＤ−ガラクトシドが、検討された基質の明記されていない 濃度における吸光度の直線性を仮定して、ポリクローナル抗体より約１０倍多い 基質を分解したことを示した。

その出願に示されたデータから、０−ニトロフェニル基の親核置換が使用した抗 体調製物のりジン残基の末端アミノ基によって生じることが可能である。従って 、観測された吸光度は、イブシロン−アミノクジニトロ−ニトロフェニルアニリ ンの形成又はイブシロンーアミノーリジニルガラクトシド及びＯ−ニトロフェノ ールの形成によるものであり、抗体がターンオーバーよりも消費されていること からこのいずれの発生も触媒的ではなかった。

より最近の研究では、抗体分子で触媒された２分子アミド形成Ｓｃｉ、　ＬＩＳ Ａ、８５：、５３５５　（１９８８））、抗体触媒クライゼン転位がある〔ジャ クソン（Ｊａ、ｃｋｓｏｎ）ら、Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、、１１０ ：４８４１　（１９８８））。立体特異性が抗体触媒ラクトン形成反応において 〔ナッパ（Ｎａｐｐｅｒ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、　２３７　：１ ０４１　（１９８７））、及び抗体触媒クライゼン反応において示された（Ｐｒ ｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８５　：　４９５３（ １９８８））。

リールデン（Ｒｅａｒｄｅｎ）ら、ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、３１８　：　 ２６６−２６８（１９８５）及びメアレス（Ｍｅａｒｅｓ）ら米国特許第４．７ ２２．８９２号は、キレート金属イオンに金属する抗体を記載する。エチレンジ アミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）及びその誘導体は歯状突起が２つあるキレート剤 を特に説明した。

リールデンの報告及びメアレスらの特許の双方に記載された抗体の特異性は、Ｅ ＤＴＡ−キレート金属イオンをキーホールリンベットヘモシアニン（Ｋ　Ｌ　Ｅ ）に結合して免疫共役物を形成するのに用いる連結基がないことを除いて免疫Ｅ ＤＴＡ−キレート金属イオンと同一のＥＤＴＡでキレートされた金属イオンにつ いて伝えるところによると特別であった。このキレート中のイオンの変更は、１ ０”という抗体とキレート金属イオンとの間の解離定数（Ｋａ）の違いを生じる 。メアレスらの特許はその抗体は、キレート剤単独又はそれと他の金属との複合 体についてのＫａより少なくとも約１０倍大きい複合体についてのＫａを有する と教示する。

リールデン（Ｒｅａｒｄｅｎ）ら及びメアレス（Ｍｅａｒｅｓ）らのいずれの教 示も、後述のように彼らの抗体を触媒として使うというコンセプトを含むもので はない。従って、これらの教示は、免疫原としての動力学的に不活性な配位複合 体及び反応性抗原としての動力学的に不安定な配位複合体の使用、これらも以下 で開示するものであるが、を示唆することはできなかった。これらの開示と本発 明との間のさらなる相異点は、以下の記載から明らかになるであろう。

トラモンタノ（Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏ）らによる前述のレポート、サイエンス（ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２３４　：１５６６−１５７０　（１９８６）は、抗体によ り触媒され、提案された加水分解基質のホスホネ−１・含有遷移状態アナログを 与える加水分解反応も教示する。これらアナログの１つは、切れやすい四面体カ ルボニル炭素原子を模造したホスホネート基付近に共有結合したジピコリン酸を 含有した。このジピコリン酸基は、加水分解反応のための金属酵素モデルとの類 似によって多価金属イオン配位部位を含むようにデザインされたと言われている 。その遷移状態アナログによって誘導された抗体は抗原エステル類の加水分解を 触媒できるが、その触媒的加水分解は多価金属イオンの存在なしに行なわれ、検 討された加水分解反応の触媒を援助するだめの多価金属イオン−ジピコリン酸キ ［ノートの使用について、それ以上の報告はされていなかった。

発明の簡単な要約 本発明は、抗体分子、以下レセプター分子という、免疫原、以下第１の又は免疫 する免疫リガンドという、及び抗原、以下第２の又は抗原性免疫リガンドという 、に関する。レセプター分子は第２の免疫リガンド分子の反応を触媒する。又、 上記の作成法及び使用法にも関する。

特に、抗体結合部位を含むレセプター分子を含む触媒分子に関する。このレセプ ターは、それぞれは多価金属イオン配位複合体を含む複数の免疫リガンドと免疫 的に結合する。第１の免疫リガンドの配位複合体は、動力学的に不活性であり、 第２の免疫リガンドの配位複合体は動力学的に不安定である。レセプター分子は 第２免疫リガンドの化学反応を触媒し、第１免疫リガンド中の化学反応は触媒し ない。好ましくは、レセプターは組成物中に存在するモノクローナルレセプター 分子である。

好ましい触媒モノクローナルレセプター分子は、約１０−”以下の解離定数を存 する第１の免疫リガンドとの免疫複合体を形成する。第１の免疫リガンドは２つ 以上の独立の金属イオン配位リガンドに配位した第１の多価金属イオンを含む動 力学的に不活性な金属イオン配位複合体を含む。独立の配位リガンドの第１は、 単座配位又は多価配位であり、独立のりガントの第２は単座配位又は２座配位で ある。第２の独立配位リガンドはさらに第１の不反応性有機構造体、少なくとも １０分子の鎖式、環式又は鎖式置換基で置換された環式構造を含む、を包含する 。

第２の免疫リガンドは、第１の配位複合体の又は第１の配位複合体とは異なる金 属イオン又は同じ金属の低酸化状態の金属イオンである第２の多価金属イオンを 含む動力学的に不安定な金属イオン配位複合体を含む。その金属イオンは２つ以 上の独立の金属イオン配位リガンドに配位している。この独立配位リガンドの第 １は単座配位か多価配位であり、実質的に類似した大きさ、リガンド配位機能及 び動力学的に不活性な配位複合体の第１の配位リガンドと実質的に類似した構造 を有する。独立リガンドの第２は単座配位又は２座配位てあり、かつ触媒分子と 第２発振りガント間で形成された免疫複合体についての解離定数が多くとも１０ −’である第１の非反応性有機構造と十分な原子立体配置的類似性で、少なくと も１０原子の鎖式、環式又は鎖式置換基で置換された環式構造体を含む反応性有 機構造体を含む。

好ましくは、第２の免疫リガンドの金属イオンの配位数は、第１の免疫リガンド の金属イオンの配位数と同じであるか、１以上小さい。動力学的に不安定な及び 動力学的に活性な金属イオン配位複合体のそれぞれが、比較的疎水性の２つ以上 の面と、比較的位リガンドにより少なくとも一部が提供されることが好ましい。

特に好ましい実施では、レセプター分子は少なくとも３つのアミノ酸残基を含む ペプチドの予め選ばれたペプチド結合の解裂を触媒するアブシン（ａｂｓｉｎ） である。ここで動力学的に不安定な配位複合体の反応性有機構造体は、そのペプ チド結合が分解される残基を含む少なくとも３つのアミノ酸残基のペプチドを含 む。動力学的に不活性な配位複合体の非反応性有機構造体は、配位官能基に２か ら約７の鎖によって結合しており、かつ加水分解ペプチド結合の解裂され易いカ ルボニル炭素に類似した位置であるアミドカルボニル炭素を育する３から約１０ のアミノ酸残基を育するペプチドを含有する。

動力学的に不活性な第１の免疫リガンドがＣｏ　（ＩＩＩ）の場合、動力学的に 不安定な第２の免疫リガンドは好ましくはＺｎ　（ＩＩ）、Ｆｅ（Ｉ［）　、Ｃ ｏ（Ｉ［）、Ｃｕ（ＩＴ）　、Ｇａ（ＩＩ［）　、Ｌｕ（Ｉ［）、Ｉｎ（Ｉｎ） 　、Ｎｉ　（ＩＩ）　、　Ｍｎ（ＩＩ）　、Ａｉ’　（Ｉ［）　、及びＭｇ（Ｉ Ｉ）からなる群から選ばれる一員である。

本発明の方法の態様によれば、前述のレセプター分子の触媒量か第２の免疫リガ ンドと水性媒体中で混合され、かつ形成した混合物は所望の反応が進行するに十 分な時間保持される。酵素反応の記述に通常用いられる用語中の触媒反応を述べ ることは便利である。その用語、レセプター分子の使用はその酵素に類似し、第 ２の免疫リガンドは多価金属イオンと第１の独立配位リガンドとを含む共同因子 （ｃｏｆａｃｔａｒ）及び第２の独立配位リガンドにより構成される基質により 構成される。典型的反応において、レセブタ−分子は、触媒量存在し、共同因子 の濃度は基質のそれの約０．１〜約１０倍である。

宵月なレセプター分子はマウス又は他の実験動物のような適当な動物を前記の接 種材料で免疫することにより調製する。典型的には、第１の免疫リガンドは免疫 用にＫＬＨのような抗原担持分子と結合させる。

免疫した動物は、その後第１の免疫リガンド単独と結合（免疫反応）するか、第 １のキャリヤー分子とは異なるＢＳＡのような他のキャリヤー分子と連結する抗 体分子の分泌のスクリーニングをする。ポリクローナルレセプター分子が所望の 場合、第１の免疫リガンドと免疫反応した抗体が採取される。これら採取された 抗体は、その後前記第２の免疫リガンドを用いてスクリーニングし、かつ第２の 免疫リガンドの所望の予備決定された反応を触媒するものを使用のため採取する 。

好ましいモノクローナルレセプターが所望の場合、第１の免疫リガンドに対する 抗体を分泌する動物からの牌臓細胞のような抗体分泌細胞は適当なミエローマ細 胞と融合してハイブリドーマを形成する。生成したハイブリドーマは、第１の免 疫リガンドと免疫反応するモノクローナル抗体の生成用に典型的にはスクリーニ ングされる。ハイブリドーマはより重要には、第２の免疫リガントの所望の予備 決定された反応を触媒し、結合するモノクローナル抗体を分泌する能力をスクリ ーニングされる。後者のハイブリドーマは生育され、かつそのモノクローナル抗 体か採取される。

本発明はいくつかの利益と利点を有する。

顕著な利益は、ペプチド結合の加水分解を触媒できる非酵素触媒の調製及び使用 を最初に許したことである。

本発明の利点のうち、水性媒体中ルイス酸により触媒可能な反応を実質的に触媒 するのに用いることができる触媒の調製を、その使用により許す事実である。

本発明のさらなる利益及び利点は、以下の記述から当業者には明らかであろう。

図面の簡単な記述 本開示の一部を形成する図面ウニ 図１は、免疫原的第１の免疫リガンドとして、及び阻害剤として用られたハブテ ン的無反応性性有機構成１の合成を説明する模式的描写である。分子のペプチド 部分は固相合成法により合成され、段階的添加法を用いてカルボキシ末端からア ミノ末端に向けて構築された。

工程ａにおいて、５ＡＳＲＩＮ樹脂（バケミ　バイオサイエンス社（Ｂａｃｈｅ ｍ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ　Ｉｎｃ、））とＮ−フルオレン−９−イルメトキ シカルボニル（ＦＭＯＣ）アミノ酸とを用いた標準固相プロトコールを、スチワ ート（Ｓｔｅｗａｒｔ）、　Ｊ、　Ｍ、及びヤング（Ｙｏｕｎｇ）。

Ｊ、　Ｐ、の固相ペプチド合成（Ｓｏｌｉｄ　Ｐｈａｓｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　５ ｙｎｔｈｅｓｔｓ）、ビールス′ケミカル社（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ 　Ｃｏｍｐａｎｙ）、イリノイ、（１９８２）８２ページに記載のように用いた 。その開示は参照として含められる。

工程すでは、３−フェニルピルベートの２当量を、ｐＨ７，５で溶媒としての４ 　：　Ｉ　ＴＨＦ　：　Ｈ＊Ｏ（ｖ　：　ｖ）中ノ２．５当量のナトリウムポロ ハイドライドを用いて樹脂一連結ペプチド（１当量）の脱ブロックしたアミノ− 末端アミン上に還元的にアルキル化して波線で示したようにラセミ体である第２ アミノ酸を形成した。

反応は振とう機中で行い、１２時間後にニンヒドリン分析により完了が確認され た。

還元的アルキル化の生成物は、ジクロロメタン中の１％トリフルオロ酢酸（Ｖ： Ｖ）を用いて工程Ｃて樹脂から分解し、溶媒を真空中で除去した。残渣は７．０ の水に溶解し、常法を用いＰｅｐＲＰＣカラム上の逆相ＦＰＬＣにより０〜４０ 容積％水中アセトニトリルの直線勾配で溶離して精製した。

Ｃｏ　（ＩＩ［）　（トリエン）（ＣＯ２）複合体は、水中で１．２当量の）Ｉ Ｃｆて反応により工程ｄで２水性複合体余因子に変換した。

工程ｄの２水性複合体（１当りは、工程ｅで６時間８．５のｐＨ値で水中で工程 Ｃのペプチド（１，１当量）と混合した。得られた免疫リガンドは、０．２ＮＫ Ｃｊ７で溶離したＣＭ−３０−１２０セフアデツクス上でイオン交換クロマトグ ラフィーにより精製した。

適当な留分を凍結乾燥し、純粋な生成物をエタノール中に吸い取った。

Ｎ−アシルペプチド２−７は同様にして調製したペプチドをアソル化して調製し た。ペプチド２−７及び全因子から調製した免疫リガンドは、その場で作られた 。

図２は、ペプチド２の配位複合体と１：１多価金属イオンートリエンからなる免 疫リガンドのレセプター２８Ｆ１１−触媒解裂を説明する薄層クロマ）・グラフ の写真である。各反応において、１０μＭレセプター２８Ｆ１１．１．２ｍＭペ プチド及び３ｎ＋Ｍトリエンー多価金属イオンを５０　ｍＭ　ＮａＣｌ！、７５ ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ６，５に入れた。全ての反応は３７°Ｃて５日間行った。

各反応からのアリコー１−（３，５マイクロリットル：ＩＩりを４：ｌメタノー ル：水（Ｕ　：　Ｖ）て溶離されるシリカ薄層クロマトグラフィープレート上に 点滴した。プレートはアセトン９０．２％蛍光アミン溶液をスプレーし、長波長 光で可視化した。解離した生成物は、溶媒前面近くに溶出する蛍光アミン反応性 物質として現われる。レセプターと金属−トリエンは元に残る。用いられた種々 の金属イオンは、レセプター、ペプチド２及びトリエンを含むが多価金属イオン は含まないコントロール反応を示す最右手レーンとともに写真の底に沿って残挙 される。蛍光アミンとのトリエン反応は、育色金属イオンＣｏ　（Ｉ［）　、Ｃ ｕ　（Ｉ［）及びＰｄ　ＣＴＩ’）を含む反応中薄められたようだ。反応前、精 製レセプターはＥＤＴＡに対して限外口過されて金属イオンを除去し、全ての溶 液はキレッシス（Ｃｈｅｌｅｘ）処理２倍希釈水となされた。用いられた全ての 金属塩は、全て高純度のものが市販されていた。

図３は、ペプチド２　（３Ａ）とＺｎ（ｎ）（トリエン）の存在下レセプター２ ８Ｆ１１により触媒された反応中で観察された２つの生成物（３Ｂと３Ｃ）のＤ ２０中の３００ＭＨ！　’ＨＮＭＲスペクトル（ｐｐｍ）のコピーである３枚の 図（３Ａ、３Ｂと３Ｃ）を含む。

ペプチド２及び２つの生成物の構造は各スペクトル中に示す。

本発明は、多価金属イオン配位複合体を含む免疫原、抗体及び抗原に関する。従 って２つのタイプの結合現象に関し、即ち、（ａ）抗体結合部位とその免疫原又 は抗原の間、及び（ｂ）多価金属イオン及びその配位リガンドの間。いずれのタ イプの現象も一般的なレセプターリガンド相互作用である。すぐ後にくる議論は 、レセプターとリガンドに関するここで用いられる種々の単語及び語句を記載す る。

用語“レセプター“は、その構造が抗原又は免疫原に似ている特定の阻害剤、抗 原又は免疫原と結合する抗体結合部位を含む生物学的に活性な分子をここでは意 味するように用いられる。これらレセプター分子は抗体又はバラトープ含存抗体 部分てあり、従って抗体結合部位を含む。

レセプター分子の生物学的な活性は、レセプターの免疫原、抗原又は阻害リガン ドに対する、少なくとも生理学的ｐＨ値及びイオン強度における、水性媒体中で の混合における結合によって証明される。好ましくは、レセプターは、約５〜約 ９のｐＨ値範囲内及び蒸留水から約１モル塩化ナトリウムのイオン強度のような イオン強度において免疫リガンドと結合する。

用語“免疫リガンド”は、レセプター分子により結合させられる前述の免疫原、 抗原又は阻害分子を意味するためにここで用いる。

上記免疫リガンドは各々は、多価金属イオン配位複合体である。

そのような配位複合体は少なくとも無機化学では一般に良く知られている。しか し、ここで提案する複合体はしかし新規であると考えられる。多価金属イオン配 位複合体は、ときどき“配位複合体”又はより簡単に“複合体”と呼ばれる。

配位複合体の多価金属イオンは、良く知られているように多価金属錯体の配位数 により支配されるそのような配位リガンドの最大数とともに、少なくとも２つの “配位リガンド”の官能基と配位的に結合する。その配位数は、いくつかの複合 体は配位数１０を育することか知られているが、通常６である。免疫リガンドは そのように呼ばれるか、又は部位−含存分子を結合する抗体により結合される阻 害剤、免疫原又は抗原のようなリガンドからそのような基を区別するために類似 の語句で呼ばれる。

“動力学的に不活性な”及び“動力学的に不安定な”と呼ばれる配位複合体の２ つのタイプがここで用いられている。これらの用語は、複合体の熱力学的安定性 より動力学に関し、より詳しくは配位リガンドが各複合体中で置換しえる相対速 度に関する。事実、与えられた媒体中で熱力学的に不安定はいくつかの複合体は 、それらは動力学的に不活性であるから、その媒体中で数週間不変のままであり 得る。

配位複合体に固有の入手可能な証拠の多くは、原子価結合理論により与えられる ような電子配置に基いて説明することができる。

一般に、変化しやすい複合体は、少なくとも１原子価低いｄ軌道を有する内部軌 道タイプ又は外部軌道タイプのいずれかである。

しかし、この説明は実験結果を常には支持しない。

配位複合体中の多価金属イオンの電子配置は評価しにくく、かつ常には予測でき ないから、実用的定義を当該分野では用いられる。動力学的に不安定な複合体の 宵月な実用的定義は、置換反応が混合時間、即ち約１分間以で、０．０１モル溶 液を用い、室温で完了することである。動力学的に不活性な複合体は、測定する には遅すぎるか、又は常法によって通常の条件では追跡できるに十分に遅い速度 で置換反応を受ける。〔バソロ（Ｂａｓｏｌｏ）、　Ｆ、及びビールソン（Ｐｅ ａｒｓｏｎ）、　Ｒ，メカニズム　オブ　インオーガニラフリアクション（Ｍｅ ｃｈａｎｉｓｍｓ　ｏｆ　Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ　ｒｅａｃｔｉｏｎｓ）、ジョン ウィリーアンドサンズ社（Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ、　Ｉｎｃ、） 、ニューヨーク（１９６３）、１０４ページ、その記載はここに含める。〕その 実用的定義は、その反応が静的方法によって検討されるかもしれない複合体は不 活性であり、より速い反応は不安定であるということによりいく分、わかりやす くなった〔コツトン（Ｃｏｔｔｏｎ）、　Ｆ、　Ａ。

とウィルキンソン（Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ）、　Ｇ、アドバンスト　インオーガニ ック　ケミストリー（Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔ ｒｙ）、インターサイエンス　パブリッシャーズ（Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ　 Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）、ニューヨーク（１９７２）　６５３ページ、その開示 は参照として含められる〕。改善された上記定義かここで用いられる。

さらなる用いられた語句及び用語は、それらが用いられたところで定義又は説明 する。

本発明は、上で定義したように多数の免疫リガンドと免疫的に結合するレセプタ ー分子に関する。このレセプター分子は、免疫原、第１の免疫リガンド、さらに 抗原、第２の免疫リガンドにより誘発されかつこれらと結合する。レセプター分 子は第２の免疫リガンドの反応を触媒し、従ってレセプター分子は酵素によって 持たれている結合及び反応性を共存する。

レセプター分子により結合された免疫リガンドは多価金属イオン配位複合体を含 む。免疫原、第１の免疫リガンドの複合体は、動力学的に不活性であり、一方、 抗原と反応性の第２の免疫リガンドとの複合体は動力学的に不安定である。

抗体は典型的には抗原（免疫原）キャリヤー分子と結合する第１の免疫原免疫リ ガントを用いて誘発される。このようにして誘発された抗体は、採取され、異な るキャリヤー分子と連結している、及び／又は阻害分子として溶液中に遊離した 免疫する免疫リガンドとの結合（免疫反応）の能力を分析される。

その抗体が免疫する免疫リガンドに結合する動物の肺臓からのもののような免疫 グロブリン生成細胞を採取し、かつミエローマ細胞と融合されてハイブリドーマ 細胞を形成する。ハイブリドーマ細胞は、培地中で生育され、生成するハイブリ ドーマ細胞からの上清を、免疫する免疫リガンドと結合する抗体の存在のため再 度分析する。

その上清がそのような結合する抗体を含存するハイブリドーマ細胞は、次いで、 第２の反応性免疫リガンドと結合し、かつその反応を触媒する抗体を分泌するの はこれら細胞のどれなのかを決定するためにスクリーニングされる。その分泌さ れた抗体が免疫する第１の免疫リガンドと結合し、反応性の第２の免疫リガンド と結合し、その第２の免疫リガンドの反応を触媒するハイブリドーマ細胞は、次 いてクローン化して培地上清又はハイブリドーマが、導入された宿主哺乳類の腹 水から所望のモノクローナル抗体を得る。

記載したモノクローナル抗体は、本発明のレセプターとして使用できる。これと は別に、いわゆる抗体のＦｃ又はＦｃ’部分は、酵素分解によって除去でき、Ｆ ａｂ　、　Ｆ（ａｂ　’　）＊又はＩａｂ’抗体部分のような抗体結合部位含有 レセプター分子をそれぞれ得る。

Ｂ、触媒抗体／ 酵素比較 抗体及び酵素はいずれもその機能が特定のターゲット分子に結合する能力に依存 するタンパク質である。酵素反応は、酵素反応においてその基質に対する酵素の 結合が典型的に化学触媒に導く免疫的反応とは異なり、一方非触媒複合体は、抗 体−抗原結合の通常の結果である。

酵素はタンパク質の加水分解のような触媒反応をタンパク質と結合して加水分解 反応の遷移状態を安定化すると考えられている。

酵素反応の速度は、反応の遷移状態を安定化する、即ち、反応の遷移状態の自由 エネルギー、及び従って活性化自由エネルギーを減少させる酵素の能力のため、 非酵素反応速度に相関して増加する〔ジエンシス（Ｊｅｎｃｋｓ）、　Ｗ、　Ｐ 、　Ａｄｖ、エンチモロジ−（Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）。

この理論の支持は、仮定された遷移状態をモデルすると考えられる基質はしばし ば競争阻害剤として酵素と強力に結合することの観察から来る。レーンハード（ Ｌｅｉｎｈａｒｄ）、　Ｇ、、　サイエンス（Ｓｃｉｅｎ一応する基質（類）又 は生成物（類）と結合するよりより強力に反応体の遷移状態結合構造を結合する ことにより反応自由エネルギーの低下を達成すると、さらに考えられる。

このことは、酵素の固在の結合エネルギーは基質類又は生成物類の結合から測定 できるよりはるかに大きいことを意味する。本質的に酵素の結合エネルギーは、 化学反応を行うために用いられる〔ジエンシス（Ｊｅｎｃｋｓ）　、　Ｗ、　Ｒ ，ＸＶＩＩインターナショナル　ツルベイ　コンフエレンズ（Ｉｎｔｅｒｎａｔ ｉｏｎａｌ　５ｏｌｖａｙ　Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ　）（１１月、＋９８３）） 。

逆の提案は、遷移状態の適当なアナログを最適に結合するために調製された抗体 は触媒として機能するであろうということである。前述及び後述の報告中のレー ナー（Ｌｅｒｎｅｒ）と共同研究者及びシュルツ（Ｓｃｈｕｌｔｚ　）と共同研 究者によるこの結果の証明は、酵素機能と抗体構成の相関を完成させ、人工酵素 の発明に有用な道を与える。

従って、前記のように、モノクローナル抗体は、エステル加水分解〔トラモンタ ノ（Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ　）−ト加水分解 〔ボーラック（Ｐｏｌｌａｃｋ　）ら、サイエンス特異的ラクトン化反応（ナラ パー（Ｎａｐｐｅｒ）ら、サイエンス成〔ペンコピツク（Ｂｅｎｋｏｖ　ｉｃ） とヤング（Ｊａｎｄａ　）ら、Ｊ、　Ａｍ。

Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、、１１０：４８３５　（１９８８））、クライゼン転位〔ジ ャクマン（Ｊａｃｋｓｏｎ　）ら、Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、、１１ ０　：４８４１　（１９８８）とヒルバート（Ｈｉｒｖａｒｔ　）ら、Ｐｒｏｃ 、　Ｎａｔ。

Ａｃａｄ、　Ｓｏｃ、ＵＳＡ、８５：４９５３　（１９８８））、Ｉ）−ニトロ アニリドアミンの加水分解〔ヤング（Ｊａｎｄａ　）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅ ｎｃｅ）＋１０ニア８８８　（１９８８））及びチミン２量体の光化学分解〔コ ク−ラン（Ｃｏｃｈｒａｎ　）ら、Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、。

１１０ニア８８８　（１，９８８）〕を含む多数の化学反応を触媒する可能性を 引き出した。最近、余図子部分が抗体結合部位に共育結合的に攻撃する系が報告 された〔ボーラック（Ｐｏ１１．ａｃｋ　）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ） ２４２：１０３８　（１９８８）］。

上記触媒抗体のほとんどは、形状と電荷寄与が類似して反応過程で高エネルギー 構造が生じると考えられる″遷移状態アナログで動物を免疫することにより製造 された。得られた抗体は、次いで高エネルギー構造のエネルギーを低下させる、 従って全反応障壁を低下する結合エネルギーを用ることによっておそらく、所望 の反応を触媒する。いくつかの例では、抗体結合部位中の化学的に反応性のアミ ノ酸残基側鎖は触媒反応中で巻き込まれた〔ヤング（Ｊａｎｄａ　）ら、サイエ ンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ　）　２４１　：　Ｉ　Ｉ　８８（１９８８）：コクーラ ン（Ｃｏｃｈｒａｎ　）ら、Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、。

抗体が上記結合基質リガンドのエステル又はアミド結合を加水分解する機構は、 “誘導結合（ｉｎｄｕｃｅｄ　ｆｉｔ　）”モデルによって考えられる。

ゆるく結合した基質がゆがむか転位して抗体の結合構造に従うとき、力は単一の 予め決まったアミド又はエステル結合の化学的再構成により和らげられ、この再 構成は結合の加水分解に導く。

アミド結合加水分解中の金属イオン関係は、酵素的〔リブスコブ（Ｌｉｐｓｃｏ ｍｂ）　、Ａｃｃ、Ｃｈｅｍ、Ｒｅｓ、、　１５　：　２３２　（１９８２）　 ）及びモデル系〔コルマン（Ｃｏｌｌｍａｎ　）ら、Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｍ、 　Ｓｏｃ、。

（Ｓｃｈｅｐａｔｚ）　ら、Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、、±０９　：　１８ １４　（１９８７）及びグローブス（Ｇｒｏｖｅｓ）ら、Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅ ｍ、　Ｓｏｃ、、１０６　：　６３０（＋９８４））の両者で観察された。金属 とアミド間の少なくとも２つのタイプの相互作用が同定された。

第１のタイプでは、金属原子はアミドカルボニル酸素に直接配位する。カルボニ ル基の得られる分極は、カルボニル炭素原子における水酸基又は水の親核攻撃を 促進する。触媒のもう１つのモデルは、アミドのカルボニル炭素原子に親核的な 金属結合水酸基又は水の放出からなる。

ｐＨ値９〜１４の水溶液中ての化学量論的Ｃｏ（Ｉ［）−促進アミド加水分解の 場合、いずれのタイプの相互作用もアミド加水分解の速度を著しく増加させるこ とか見い出された。しかし、金属結合水酸基親核性に関する第２のタイプの相互 作用は、より効果的であることが見出されたＣＤ、　Ａ、ブッキンハム（Ｂｕｃ ｋｉｎｇｈａｍ）ら、Ｊ、４八ｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、、９２：６１５１　（１ ９７０））　。　Ｚｎ（ｎ）　含有ブロテアーセ酵素テルモリジン及びカルボキ シペプチダーゼについては、アミド加水分解の速度を増加させるように２つのタ イプの相互作用を操作することは可能である〔マチウス（Ｍａｔｈｅｗｓ）ら、 Ａｃｃ、　Ｃｈｅｍ、　Ｐｅｓ、、２１　：　３３３　（１９８８）及びクリス テインマン（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｏｎ）ら、Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏ ｃ、、　１０８　：　４９９８（１９８８））。

多価イオン金属複合体（共同因子）と反応性配位リガンド（基質）とを含む免疫 リガンドが、抗体結合部位で化学的に反応性を提供するように抗体（レセプター ）によって非共有結合的に結合される新しいアプローチを開示する。

種々の金属イオンを含有する余因子を用いてｐＨ６，５でグリシン−フェニルア ラニン（Ｇｌｙ　−Ｐｈｅ　）ペプチド結合の部位特異的加水分解を触媒し得る 典型的な触媒モノクローナル抗体（レセプター分子）の生成及び初期特性決定を 以下に開示する。用語“アブシン（ａｂｓｉｎ　）”はタンパク分解触媒抗体の この新しいクラスを示すのに用いる。

その新しいアプローチを用い、ペプチド加水分解のようにエネルギー要求性の反 応であっても、反応を抗体を用いて企てることかできることが予想され見出され た。さらに、抗体−抗原相互作用のそのような特性の結合の特異性は選択的な十 分な配列特異性の予めプログラム可能な組を有するアブシン（ａｂｓｉｎ）を与 えた。

ペプチド加水分解は、不安定な金属イオン含有複合体をレセプター分子の抗体結 合部位に包含させることから利益を得ることができた多数の反応の１つの例であ る。これらの系を用いて可能な構造的強制は、アルドール縮合やキラルエボキシ 化のような別の反応の立体特異性のコントロールを強いるのに用いることができ る。

■、レセプター分子 本発明のレセプター分子は触媒作用を持ち、それぞれが多価金属イオン配位複合 体を含む複数の免疫リガンドと免疫学的に結合する、すなわち抗体−抗原間のバ ラトープにより結合する抗体結合部位を含む。第一免疫化作用性免疫リガントの 配位複合体が動力学上不活性である一方、第二抗原性免疫リガンドの配位結合は 動力学上不安定である。本発明のレセプター分子は多価金属イオン（基質）が存 在しない時に第二独立配位リガンドに結合するのと同様に、多価金属イオン及び 第一独立配位リガント（共同因子）から形成される金属イオン複合体のような、 動力学上不安定な免疫リガンド部分にも免疫学的結合を示す。

レセプター分子はその他の多価金属イオン含有性配位複合体く免疫リガンド）に 結合することもでき、それらは動力学的不活性であっても、不安定であってもよ い。その触媒性反応はルイス酸によって触媒される反応であり、水性媒体中で行 なうことができるルイス酸に触媒される反応はいずれも事実上適当な金属イオン 含有性共同因子を伴なうここで述べるレセプター分子が触媒することができる。

レセプター分子はさらに第二免疫リガンドの化学反応を触媒するが、第一免疫リ ガント中の化学反応は触媒しない。

免疫化作用性の第一免疫リガントはそれ自体、２個以上の独立金属イオン配位リ ガンドに配位結合している第一多価金属イオンを含有する、動力学上不活性な金 属イオン配位複合体を含む。

多価金属イオンはしばしば複数の三次元形状の配位複合体を示すことができる。

該複合体の形状はとりわけ、元素、その酸化状態、その配位数及び金属イオンに 配位結合しているリガンドに依存する。宵月な動力学上不活性な配位複合体の例 としてＣｏ（ＩＩＩ）及びｐｔ（ＩＩ）から形成されるものがあり、それらは通 常、飽和アミン含有性リガンドとともに、それぞれ八面体及び正方形二次元複合 体を形成する。

これらの２個以上の独立金属イオン配位子の最初のものは単塵配位子若しくは多 座配位子であってもよく、それゆえに金属イオンに対して１個若しくは複数の配 位結合を形成することかできる。

単座配位リガンドの例としては、水；アンモニア：水酸イオン：フッ素イオン、 塩素イオン、臭素イオン若しくはヨウ素イオン等のハロゲンイオン；１個ないし 約８個の炭素原子を含有するモノカルボン酸イオン：ンアニドイオン等がある。

それらのリガンドは通常それぞれ、アクア、アミン、ヒドロキシド、フルオロ、 クロロ、ブロモ、イオド、モノカルボキシレート及びシアネートと呼ばれる。

多座配位リガンドの例としては、二、三、凹座配位リガンドがあり、炭酸イオン 、蓚酸イオン、２，２′−ビピリジン、エチレンジアミン、アセチルアセトン酸 イオン、１．ＩＯ−フェナンスロリン、２．２’、２“−トリアミノトリエチル アミン、トリエチレンテトラアミン及びエチレンジアミン四酢酸イオン等の例が 挙げられる。それらのりガントは通常それぞれ、カルボネート、オキサル−１□ 　（ｏｘ）　、２．　２’−ビスピリジン（ｂｉｐｙ）　、エチレンジアミン（ ｅｎ）　、アセチルアセトネート（ａｃａｃ）、１．１０−フェナンスロリン（ ｐｈｅｎ）、２．２’、２’−トリアミノＩ・リエチルアミン（ｔｒｅｎ）、ト リエチレンテトラアミン（ｔｒｉｅｎ　）及びエチレンジアミンテトラアセテー ト（ＥＤＴＡ）と呼ばれる（括弧内に通常使用される略号を示す）。五座及び大 塵配位リガンドも知られている。

第一独立配位リガントは多座配位をとり、利用できる配位部位の最低半数と配位 結合を形成できることか好ましい。よって、第一免疫化作用性免疫リガントの第 一独立配位リガントは、飽和アミンとのＣｏ（ｎ［）複合体の場合のように多価 金属イオンの配位数が６であるならば、最低王座配位であることか好ましい。凹 座配位であるトリエンリガンドはＣｏ（Ｉ［Ｉ）との使用に特に好ましい。

ｅｎ等の二室配位リガンドは、飽和アミンリガンドと正方形二次元複合体を形成 するＰｉ（Ｉ［）等の金属イオンに使用するのか好ましい。

第一複合体の第二独立配位リガンドは単座配位若しくは二座配位をとることがで き、さらに少なくとも１０個の炭素原子の鎖式、環式若しくは鎖式置換基で置換 された環式の第一非反応性有機構造体を含む。この配位リガントのリガンド配位 ファンクショナリティーには、好ましくはカルボキシレート基等のリガンドが使 用される際のｐｌ値で陰イオン性になる官能基を含むことが好ましい。

陰イオン性のリガンド機能をもたらすことができる他の官能基にはホスホネート イオン及びヒドロキシメートイオンが含まれる。

第二配位リガンドが結合及び反応の特異性を触媒に持たせる主因であるため、選 択される配位リガンドは本反応が触媒される場合の配位リガンド若しくは基質と 実質的な原子配置の類似性を持つ部分を含む（後述）。従って、第一免疫リガン トの第二非反応性配位リガンドは、リガンド配位ファンクショナリティーに加え てこの配位リガンドを抗原結合部位に導入し結合させられるように、少なくとも １０個の炭素原子の鎖式、環式、若しくは鎖式置換基で置換された環式構造体を 含む。

抗原結合部位は一般に、約５ないし約７個のアミノ酸残基に適応できるものと考 えられる。各残基は３原子からなる炭素鎖を与えるため、この配位リガンドは、 ペプチドに関して測定すると最低約３個のアミノ酸残基の長さを持つ。結合部位 の残りの部分は、多価金属イオン及びその第一、あるいは他の、独立配位リガン ドで占められている。

この非反応性の第二独立配位リガンドは、少なくとも１０個の炭素原子の鎖式、 環式、若しくは鎖式置換基で置換された環式構造体よりも大きくてもよく、その 溶解性は免疫化された動物の血中に許容される免疫化作用性免疫リガンドの溶解 性と同等まで大きくてもよい。もっとも、このリガンドの鎖式、環式、若しくは 鎖式置換基で置換された環式の構造体中に約３０以上の原子を使用する場合、そ れらの原子は役にたたない抗体分子を誘導するか若しくは抗体を誘導しないとい う意味において“浪費され”でもよい。

この第二配位リガンドは既に述べたように、抗体の存在下でその抗体によって誘 導された場合、おそらく１個かそれ以上のプロトンがイオン化される以外は化学 反応を受けないという意味において非反応性である。もっとも、この配位リガン ドが触媒の結合及び反応特異性の主因であるために、この配位リガンドは反応性 配位リガンドに構造的に類似するのみならず、反応性配位結合中のめる反応が触 媒される部位に構造的に類似する部位から約２ないし約７原子、より好ましくは 約２ないし約５原子の位置に金属にリガンドする官能基への結合を含む。

従って、例えば、触媒しようとする反応において特定のカルボニル基への結合を 切ろうとする場合、切れ易いカルボニル基が反応部位と考えられ、第一免疫リガ ントの第二配位リガンドは金属にリガンドする官能基から約２ないし約７原子の 位置にカルボニル基を含む。そのカルボニル基は同時に反応が起こるカルボニル 基と実質的に同等の構造的配置をとる。この近接性は触媒されるべき反応部位が 多価金属イオンに近接するということの確認を助けるものである。

この第二非反応性配位リガンドの残りの構造はスクアレン若しくはペプチドにお いてそれぞれ見られるように炭化水素鎖若しくは置換された炭化水素鎖でもよい 。ベンゼン、ナフタレン若しくはピリジン等の芳香族化合物の環式構造体のよう な環式構造体も、デカリン誘導体並びに、エストラジオール及びテストステロン の誘導体等のステロイド誘導体のようなより小さな環状化合物若しくは炭素鎖で 置換された環状化合物と同様に含められる。

好ましい態様において、該非反応性有機構造体はペプチドである。このようなペ プチドは天然に存在するし配置を取ってもよく、Ｄ配置のものはβ−アラニン等 の残基を含んでもよく、またそのようなアミノ酸残基の２個以上の混合物でもよ い。

第二非反応性配位リガンドは、この配位リガンドが当レセプター分子の結合及び 反応の特異性の主因であるとしても、触媒されるべき反応の遷移状態のアナログ ではないことが示されている。

従って、さらに、抗体結合部位を誘導するためにここで計画的に用いるアプロー チは、それまでに用いられてきたアプローチとは全く異なっており、得られるレ セプター及び結果も同様に異なる。

最初の２個の配位リガンドが決定されれば、残りの配位結合位置は、たとえある としても、先に論じたような単座配位若しくは二座配位リガンドを用いて通常溝 たされる。水、すなわちアクアリガンドは、第−及び第二免疫リガンドが多価金 属イオンの配位球面を満たしていない場合、当配位複合体を完成させるために使 用される特に好ましい配位リガンドである。

レセプター分子は通常、第一免疫リガントと形成される免疫複合体に対して最低 １０−８の解離定数、Ｋ６、を示す。より好ましくは、該解離定数はＩＱ−１２ 若しくはそれ以下である。

抗原性の第二免疫リガンドは、第一免疫リガント（配位複合体）の金属イオンと は異なるか若しくは第一の金属イオンと同じ金属イオンの低酸化状態である第二 の多価金属イオンを含む動力学的に不安定な金属イオン配位複合体を含む。従っ て、第一の多価金属イオンがＣｏ（Ｉ［Ｉ）である場合、第二の金属イオンはＣ ｏ（ＩＩ）であるか、若しくはＺｎ　（ＩＩ）　、Ｇａ　（ＩＩＩ）　、Ｉｎ　 （ＩＩＩ）　、Ｐｅ　（ＩＩＩ）、Ｃｕ　（Ｉｔ）　、Ｎｉ　（Ｉｆ）　、Ｌｕ 　（Ｉ［）　、Ｍｎ　（ＩＩ）　、Ａｌ２　（Ｉ［Ｉ）あるいはＭｇ（ＩＩ）等 のイオンでもよい。Ｃｏ（Ｉ［）を動力学的に不活性な複合体の金属イオンとし て使用する場合、Ｚｎ（Ｕ）が特に好ましい。

動力学的に不活性な複合体が二次元正方形複合体を形成するＰｔ（Ｉｆ）のよう な金属イオンを含む場合、第二免疫リガンドの動力学的に不安定な配位複合体の 好ましい金属イオンはＣｕ（ＩＩ）である。

レセプター分子及び第一免疫り゛ガントの間に形成される免疫複合体は解離定数 を正確に表現することができる通常の抗体−抗原相互作用として見ることができ るが、該レセプターと第二免疫リガンドの間に形成される免疫複合体については 同様のことはあてはまらない。この見かけ上の変則性の原因は、第二免疫リガン ドは動力学的に不安定な配位複合体を含み、第二反応性独立配位リガンドは通常 の配位リガンド官能基を持たないらしく、いずれも実質的に該レセプター分子の 存在下でのみ金属イオン及び第一配位リガントと配位結合するという事実にある 。

従って、当第二免疫リガンドは、レセプターが酵素の類似物であり、第二反応性 配位リガンドが基質の類似物であり、金属イオン及びその第一配位リガント（及 び他の配位リガンドもありうる）が共同でＮＡＤ若しくはＦＡＤのような共同因 子の類似物である、酵素、基質、共同因子系と同様の様式で挙動する傾向にある 。ではあるが、以下の考察は、第二免疫リガンド若しくはその一部をレセプター 、基質及び共同因子と呼ぶことによってより明瞭な記述若しくは説明が得られる 場合以外は、第二免疫リガンドを単一の存在と通常考えることにする。

動力学的に不安定な配位複合体を形成するイオンに加えて、第二免疫リガンドの 多価金属イオンを選ぶための基準の全ては、完全にはわかっていない。もっとも 、通常の触媒を比較的容易に製造するには十分なものが知られている。

まず、動力学的に不安定な複合体の金属イオンは、動力学的に不活性な複合体の 金属イオンが形成するのと同様の形状（外形）の配位複合体を形成することがで きるにちがいない。従って、飽和アミンと八面体複合体を形成するＣｏ（ＩＩＩ ）を動力学的に不活性な複合体に使用する場合、そのようなアミンと二次元的八 面体複合体を形成する金属イオンを、動力学的に不安定な複合体の金属イオンと して使用することができる。

配位複合体の形状若しくは外形を考察する場合、該複合体が単離できてその構造 をＸ線若しくは同様の方法で決定する必要はない。むしろ、そのような構造決定 に通常用いられる推論的方法が適当である。

第二金属イオンによって示される配位数は第一多価金属イオンのそれと同等か、 若しくは第一多価金属イオンよりも少ない１よりも少ないということはない。従 って、第一多価金属イオンが配位数が６のＣｏ（Ｉｆｆ）である場合、第二多価 金属イオンは好ましくは６である配位数を示すが、５でもよい。

金属イオンの寸法も役割を持つように見える。例えば、Ｃｏ（ＩＩＩ）は結晶学 的測定から０．６３オングストロームのイオン半径を持つ。

その配位複合体かここで述へるペプチド開裂反応を触媒しなかった４個の金属イ オン、Ｃｄ　（１１）　、Ｔｂ　（ＩＩ［）　、Ｈｇ　（Ｉ［）及びＬａ（ＩＩ ［）は、同様に測定すると、それぞれ０．９７．０．９２３．１．　Ｉ　Ｏ及び １．０２オングストロームのイオン半径を持つ。一方、先に述べた有用な第二多 価金属イオンはそれぞれ０．５１オングストロームＣＡＩ！　（Ｉ［）　）ない し０．８５オングストローム［Ｌｕ　（ｎ［）　）の間のイオン半径を持つ。従 って、有用な第二金属イオンのイオン半径は動力学的に不活性な複合体の金属イ オンのイオン半径上約３分の１であり、二方育用でない金属イオンのイオン半径 は動力学的に不活性な複合体の多価金属イオンのイオン半径の約１倍半若しくは それ以上であった。〔化学・物理ハンドブック、ライ−スト（Ｗｅａｓｔ　）纒 、第５４改訂、ＣＲＣ出版、クリーブランド、１９７３年、第Ｆ１９４−１９５ 頁、の結晶イオン半径による。〕上記の４個の基準、すなわち（！）免疫化作用 性免疫リガンドの金属イオンの寸法のおよそ±３分の１の寸法（イオン半径）： さらに同じ第一独立配位リガントを用いた場合、（２）動力学的に不安定な複合 体を形成し：（３）その複合体の外形が動力学的に不活性な複合体と同じであり 、（４）配位数も同じであること、は機能的に作用する金属イオンを選択する上 で有用と思われる。従って、いくつかの有用な金属イオンはあてはまらないかも しれないが、有用な金属イオンは通常、それらの基準を満たしている。

それらの基準は大多数を定義するにはそれゆえに十分であるが、「用な金属イオ ン全てについてではない。例えば、Ｙｂ（ＩＩＩ）イオンは０．８６オングスト ロームのイオン半径を持ち、他の３個の基準にもかなっているか、触媒作用を示 さなかった。ではあるが、当業者は上記の基準を用いて容易に触媒を得ることが できる。

動力学的に不安定な金属イオン複合体の第一独立配位リガントは、単座配位子若 しくは多座配位子、好ましくは多座配位子であるが、より好ましくは動力学的に 不活性の金属イオン複合体の第一独立配位リガントと同じ数の配位リガンド官能 基を持つ。さらに、この第一配位リガントは動力学的に不活性な金属イオン複合 体の第一独立配位リガントと実質的に同等の寸法及び構造、並びに同じ型のりガ ント配位ファンクショナリティーを示した。

従ってより好ましくは、動力学的に不活性の複合体の第一配位リガントが、単座 、二重、三座若しくは凹座配位子である場合、動力学的に不安定な複合体の対応 する第一配位リガントはそれぞれ、単座、二重、三座若しくは凹座配位子である 。同様に、免疫化作用性の動力学的に不活性の複合体の第一配位リガントの配位 結合形成官能基、例えば飽和アミン、不飽和アミン、カルボキシレート、エルレ ート、ホスフィン等は、抗原性の第二の動力学的に不安定な複合体の第一配位リ ガント中にも存在する。

２個の第一配位リガントの寸法及び構造の実質的な類似性は、歯牙状構造及びリ ガンド配位ファンクショナリティーの同一性と共に、２個の（動力学的に不活性 及び不安定な）複合体間の相対的な免疫学的同一性に関連がある。従って、これ らのリガンドが、実質的に異なる寸法で、実質的に異なる構造及び結合型を示す ならば、第一のものに誘導された抗体は第二免疫リガンドに結合しないであろう 。

ポリペプチド配列中の唯一個のアミノ酸残基の変化でさえも、ある配列には結合 し他のものには結合しない所定の抗体間の相違性を意味しうることは周知である 。また、抗体結合要件は通常あまり厳重でなく、類似の寸法及びファンクショナ リティーを存するアミノ酸側基は抗体結合にほとんど影響を与えることなく通常 、互いに置き換えることができることも周知である。

従って、アスパラギン酸若しくはアミドは通常グルタミン酸若しくはアミドにそ れぞれ置き換えることができ、同様にアルギニン及びリジン若しくはアラニン、 ロイシン及びイソロイシンも互いに置き換えられる等がある。さらに、ツーテン （）Ｉｏｕｇｈｔｅｎ）、プロシーディングスオブサナショナルア力デミイオブ サイエンスオブＵＳＡ　（Ｐｒｏ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ Ａ）　、８２巻、第５１３１頁、１９８５年は、特定のポリペプチドの１３残基 のうちの１２個をそれぞれ、その他の残基を一定に保ちながら他の１９個の天然 アミノ酸のいずれかと独立に交換することができ、その際に変化した構造の１３ 残基ペプチドに結合するモノクローナル抗体の能力は実質的に損われないことを 報告した。

そこで２個の第一配位リガント間にはリガンド配位ファンクショナリティーの数 と型と同様に、寸法と形状の違いに一定の範囲かある。その違いはレセプター分 子及び、多価金属イオンと第一独立配位リガントによって形成される共同因子の 結合複合体の解離定数によって表わすことができる。有用なレセプター分子及び 共同因子の間の解離定数は単独で測定されてはいないが、レセプター分子及び実 験に選択された多価金属イオンによって、同じレセプターと免疫化作用性第一免 疫リガントの解離定数よりも約１ないし３オーダー大きいように見える。

上記の第二多価金属イオン及びその第一独立配位リガントから形成される動力学 的に不安定な配位複合体は、第二免疫リガンドに対してレセプター、共同因子及 び基質という用語を使用するならば、共同因子を構成する。アクア配位リガント 等の１個以上の他の配位リガンドも該共同因子の一部として存在してよい。

動力学的に不安定な第二免疫リガンドの第二の独立配位リガンド（基質）は単座 配位子若しくは二重配位子であり、触媒される反応の部位を含む反応性有機構造 体を含んでいる。もっとも、リガンド配位ファンクショナリティーは動力学的に 不活性な複合体の第二独立配位リガンドのそれと同じである必要はなく、好まし くは異なる。

実際に、リガンド配位フ７ンクショナリティーは通常の配位リガンド結合を形成 する官能基である必要はない。むしろ、できた配位リガンド結合は、レセプター 分子結合部位及び金属イオン含有性共同因子の結合（エントロピー性）作用によ って押されていてもよい。例えば、後で論じる免疫化作用性免疫リガンドの二重 配位性第二配位リガンドペプチドの実例のリガンド配位官能基は二級アミン及び カルボキシレート基であるが、使用される反応性第二配位リガンド（基質）はど ちらの基も持たず、該二級アミンと同じ位置にアミド基を所有する。

第二独立配位リガンド（基質）はさらに、レセプター分子とこの第二配位リガン ド間の免疫複合体の解離定数か、金属イオン含有性第一配位複合体（共同因子） の非存在下で測定すると、最低１０−２以下となるのに十分な、第−非反応性有 機溝造体との原子配置類似性を持つ少なくとも１０個の炭素原子の鎖式、環式、 若しくは鎖式置換基で置換された環式の反応性有機構造体を含む。

レセプター及び基質間のそのような免疫複合体の１個に対する予備的試験の結果 から５Ｘ］０−’オーダーの解離定数が出されている。

現在のところ、第二反応性配位リガンド（基質）の寸法の上限は、その中で反応 か行なわれる予定の媒体、例えば水性媒体中におけるその溶解性とは違って知ら れていない。例えば、本発明のレセプター分子は蛋白分子末端間のあらかじめ決 められたペプチド結合を開裂させるペプチダーゼとして使用することができる。

この場合、該蛋白分子全体若しくはその小部分を第二反応性配位リガンドとして 使用することができる。

従って、動力学的に不安定な複合体の第二独立配位リガンドを含む第二反応性有 機構造体（基質）は、触媒か結合する動力学的に不活性な複合体の第二非反応性 有機構造体と十分に類似した構造を持つ。最も好ましくは、２個の第二独立配位 リガンドは、触媒反応か起こる部位に近接した約１０個の炭素原子からなる鎖状 触媒反応が起こる部位は通常、アミド若しくはエステル開裂反応ではカルボニル 基、あるいはアルドール縮合てはケトン若しくはアルデヒド基である。エチレン 性二重結合の炭素原子も該触媒反応が起こる部位となりつる。

レセプター分子により触媒される反応は水性媒体中で行なわれ、そこでは水分子 若しくは水酸イオンが反応に参加して多価金属イオンに対する別の配位リガンド として働く。従って、レセプター−第二免疫リガンド免疫複合体に対して水若し くは水酸イオンか接触することか重要でなりうる。

この接触は、必要ならば、免疫化作用性第一免疫リガントに相対的に疎水性の領 域と親水性の領域を持たせることによって促進することができる。八面体型、三 角二錐体型及び四面体型複合体等の金属イオン複合体は三次元構造体若しくはポ リドロンとして見ることかできるので、相対的に疎水性若しくは親水性の領域を ポリドロンの表面として描き、配位結合リガンド結合性官能基を頂点とすると都 合がよい。

例えば、トリエン分子の３個のエチレン基は、後で述べる免疫化作用性の第二免 疫リガンドのペプチド及びフェニル環部分と共にそれらの複合体の相対的に疎水 性の表面を提供する。それらのリガンドの一級及び二級アミン部分は相対的に親 水性の頂点を提供する。もっとも、第一免疫リガントの第二配位リガンドの陰イ オン性電荷のカルボキシレート官能基はそれらのアミンよりも親水性であり、ま たそれはリガンドの先端にあるために第一免疫リガントに対して相対的に親水性 の頂点及び隣接表面若しくは表面類を提供する。その相対的に親水性の表面は、 でき上がったレセプター含有性免疫複合体の外側若しくは水の側を向くと予想さ れ、相対的により疎水性の部分（表面）は当免疫複合体の抗体結合部位の内部表 面を向くと予想された。

従って、ここで用いたレセプター分子の例は、免疫複合体が水若しくは水酸イオ ンに比較的容易に接触するように設計された。

その比較的容易な接触は、第二免疫リガンドが免疫化作用性免疫リガンド中に存 在するよりも少ない配位リガンド結合性官能基を含むように設計することにより さらに促進された。それゆえに、第一金属イオンとほぼ同じ寸法と同じ配位数を 持つ第二金属イオンを用いて、利用できる配位リガンド可能な官能基を少なくす ると、水性反応媒体からの水分子若しくは水酸イオンが容易にアクア若しくはヒ ドロキシドリガンドを供給して動力学的に不安定な金属イオン複合体の配位球面 を完全に満たすことができた。

２個以上の相対的に疎水性の表面と１個以上の相対的に親水性の表面を持つ金属 イオン複合体を利用して最低１個のより少ないリガント結合形成官能基を持つ第 二免疫リガンドを利用する上記の戦略は、レセプター及び第二免疫リガンドによ って形成される免疫複合体に水性媒体中でアクア若しくはヒドロキシドリガンド を供給する目的には一般的である。

反応性抗原性第二免疫リガンド中には存在しない陰イオン性電荷の配位リガンド 官能基を第一免疫化作用性免疫リガント中に使用すると育利なことがある。従っ て、その使用により、結合部位にアルギニン、リジン若しくはヒスチジン等の陽 電荷残基を誘導し、それが次に、配位リガンド中に陰イオン性電荷の官能基が存 在しない場合に、電荷バランスをとろ水酸イオンを誘導することによって、第二 免疫リガンドに親水性の頂点及び隣接表面を提供するのを助けることができる。

■、方法 本発明の方法としての局面は、あらかじめ定めた化学反応をここで述べるような レセプター分子を用いて触媒することを企図する。このようなレセプター分子に より触媒される反応は水中で最適ｐＨ値及び１気圧で、レセプター及び共同因子 分子を欠く以外は温度、圧力、ｐＨ値及び基質濃度について同じ条件下で該反応 を行なう場合に比べると通常最低１０’倍速い速度で行なわれる。好ましくは、 該速度は最低１０’の倍率で異なる。

例えば、カーノ（Ｋａｈｎｅ　）　、ジャーナル　オブ　ジ　アメリカン　ケミ カル　ソサイエティ（Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、　）、１１０巻、第 ７５２９頁、１９８８年は、中性の水中におけるペプチド結合の自然加水分解の 半減期は約３ＸＩＯ−’／秒若しくは約７年であることを報告した。一方、ペプ チド２（後述）を基質とした場合、本発明のレセプター及び金属イオン含有性共 同因子を用いてｐＨ６，５，３７°Ｃでは８日後に完全に加水分解された。

本発明の方法により、上記のレセプター分子の有効量を水性媒体中で抗原性第２ 免疫リガンド（上記）と混合して混合液を作る。

該混合液を望ましいあらかじめ定めた反応が行なわれるに十分な時間保存する。

該反応の生成物は必要ならばレセプター分子と同様にその後単離することができ る。

本発明の方法は反応混合液の一部として水性媒体を利用する。

該媒体は通常水及び緩衝塩類を含有する。さらに、該媒体は蛋白含有性媒体中に 多く見られるような水溶性カルシウム及びマグネシウム塩と同様に塩化ナトリウ ム等の他の塩を含有してもよい。

メタノール、エタノール、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、ジオキサン 、ヘキサメチルリン酸アミド及びＮ、　Ｎ−ジメチルホルムアミド等の有機溶媒 も存在してよい。反応体リガンド及びレセプター分子を乳化する界面活性剤も存 在してよい。該水性媒体中に存在する成分の決定的な特徴としてはそれらの成分 が、レセプター分子を変性させること等によって触媒反応を妨害若しくは阻害す ることが実質上ないということが挙げられる。さらに、該水性媒体は、該レセプ ター分子により触媒される反応を阻害するような塩、蛋白を通常、またそのよう な酵素を特に、実質上台まない。

該水性媒体は通常的５ないし約９、好ましくは約６．０ないし約８．０ＯｐＨ値 を持つ。該触媒反応が前記同様に実質的に妨害若しくは阻害されない限り、上記 の値よりはずれたｐＨ値を利用することもてきる。

該触媒反応は通常、室温すなわち約２０°Ｃないし約２５°Ｃ１若しくは３７° Ｃ１及び大気圧中すなわち約１気圧で行なわれる。もっとも、大気圧における該 水性媒体の凝固点付近の低温及びその沸点付近の高温までの温度も使用すること ができる。周知のように、該レセプター分子のような蛋白は水性媒体が沸騰する ような高温、たとえば約１００″Ｃては、変性する傾向があり、そのため約４０ °Ｃ以下の温度が好ましい。同様に周知なように、多分子動力学式に従う反応は 温度が下がるにつれて反応速度も下がる。従って、最低温度としては約１５°Ｃ が好ましい。

該レセプター、共同因子及び基質から成る混合液を上記のように、望ましいあら かじめ定めた反応か行なわれるに十分な時間保存する。この保存時間はおよそ数 秒ないし数日若しくは数週間でもよく、生成物を捜す目的であるのかあるいは反 応動力学を調べる目的であるのかと同様に、とりわけ個々のレセプター分子、共 同因子及び基質分子、並びに反応温度、ｐＨ値に依存する。後で述べる反応例で は、生成物を示すことがめられた場合及び単離がめられた場合では、それぞれ５ 日及び８日の保存時間か用いられたが、動力学的測定には数分及び数時間が用い られる。

基質（第２免疫リガンドの第２配位リガンド）は反応混液中に該水性媒体中のそ の溶解度までの量で存在する。不溶性基質を含む二相系も使用してよいが、通常 は用いられない。該基質の通常使用濃度は約０．１マイクロモル（μＭ）ないし 約ｌＯミリモル（ｍＭ）である。本質的に生成物がめられている場合には、反応 メカニズム若しくは反応動力学を研究する場合に低温度が用いられるのに比較す ると、相対的に高濃度が用いられる。

有効量のレセプター分子も同時に存在する。該有効量は通常触媒量であり、すな わち、該レセプターは約ｌ：２ないし約ｌ：ｉｏ、ｏｏｏの対基質モル比で用い られ、約ｌ：１０ないし１：１０００のモル比が好ましい。

レセプター分子対基質の比率は通常、基質に対するレセプター分子の特異的活性 及び、該反応を行なう際のユーザーの目的に依存する。従って、生成物かめられ ている場合には、相対的に高濃度のレセプター及びレセプター対基質の高い比率 が用いられる。

反応メカニズム若しくは反応動力学か研究されている場合には、低い濃度及び比 率が通常用いられる。計算量若しくはそれ以上のレセプターを用いることもでき るが、該レセプターは触媒分子であるために、計算量であってもその使用は無駄 と言えよう。従って、少なくとも触媒量のレセプターを使用する。

第２免疫リガンドの共同因子部分（多価金属イオン及び第１配位リガンド）はレ セプター分子と同量ないし基質の約１０倍の量で存在してもよい。個々の反応に 使用する量はめる反応速度及び該レセプター−共同因子免疫複合体の解離定数に より変化させることかできる。

抗体結合部位に対して、基質は拡散して入って反応し、反応生成物が拡散して出 るのに対し、共役因子は結合し続けるのが一般に望ましい。ここで述べるような レセプター分子、共同因子及び基質を用いる場合、該共同因子は通常基質の約０ ．１ないし約１０倍の濃度、より好ましくは約ｌ：１ないし約５＝１の対基質比 で供給される。

■、結果 以下の考察はベブチダーセ活性を示すレセプター分子の製造と使用に関する。先 に述べたように、それらのレセプター分子はアブシン分子若しくはアブシンと呼 ばれる。

ここで実例として用いるアブシンを誘導するために、免疫化に用いるハブテンｌ は、４個の残基のペプチドの第２のアミノ酸部位に結合した比較的動力学的に不 活性なＣｏ（Ｉ［）　（トリエン）部分から成っていた。動力学的に不活性な金 属は理想的な加水分解共同因子たるに十分な程度すばやくリガンドに置換するよ うなことはおそらくないため［Ｃｏ（ＩＩＩ）複合体はアミド結合を開裂させる ことができるが、該複合体の動力学的に不活性な性質は触媒的というよりもむし ろ計算量的な開裂をもたらす。例として、コルマンら（Ｃｏｌｌｍａｎ　ｅｔ　 ａｌ、）　、ジャーナルオブジアメリカンケミカルソサイエティ（Ｊ、　Ａｍ、 　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、　）、８５巻、第３０３９頁、１９６３年、を参照のこ と。〕、上に対するモノクローナル抗体は、Ｃｏ（ＩＩＩ）だけでなくＺｎ（Ｉ ［）若しくはＦｅ（ＤＩ）等の加水分解において活性な共同因子と思われる動力 学的に不安定な金属のトリエン複合体に適応することかできるかなり無差別的な 結合部位を持つものと考えられた。従って、先に述べたように、メアーズら（Ｍ ｅａｒｅｓ　ｅｔ　ａｌ、　）の米国特許第４．７２２．８９２号及びリアトン ら（Ｒｅａｒｄｏｎ　ｅｔ　ａｌ、）　、ネイチャー　（Ｎａｔｕｒｅ）、３１ ８巻、第２６５−２６８頁、１９８５年、の開示は、Ｉｎ　（ＩＩ）　ＥＤＴＡ 複合体により誘導された抗体がいくつかの異なるＥＤＴＡ−金属複合体に結合し たことを教示している。

ハブテンｌに誘導されたアブシンの抗体結合部位は、金属複合体及びペプチドを 共に適当な配置を取らせて、金属触媒性ペプチド加水分解反応ができるようにし 、かつ促進して、最終的に生産物を放出させるように意図された。この事に関し て、ハブテンｌは、反応遷移状態の推定される金属結合型四面体原子を正確に模 倣するハブテン分子部分かないという点において実際の遷移状態アナログとは異 なる。該分子はむしろ、免疫リガンドとして八面体金属共同因子複合体及び基質 ペプチドを共に同時に結合することができる相補的アブシン結合部位をその周囲 に作るような鋳型として設計された。

免疫源（ペプチド含存性ハプテン１）の配座に応じて、アブシン結合部位は抗原 性免疫リガンドのペプチド部分の切れ易い結合を、カルボニル基か同時に結合し ている金属トリエン複合体の金属原子に近い位置にさせるような配向に合わせる であろうと予想された。

該金属複合体はその後、（ａ）該カルボニル酸素原子の結合、それによるカルボ ニル基の分極化、（ｂ）金属結合型水酸基種（水若しくは水酸イオン）の核性攻 撃の促進、若しくは（Ｃ）その両者の協同作用によって、アミド結合の加水分解 を容易にすることができた。

どちらの経路によっても、あるいは両方の組み合わせによっても、金属結合型四 面体中間体を形成させた。アミン脱離基のプロトン化に伴なうこの金属結合型四 面体中間体の分解及び生成物の放出により該加水分解反応が完成する。

ハブテンｌをキーホールリムベットヘモシアニンＣＫＬＨ）に共有結合させ、で きた共役体により１２９ＧＩＸ”マウスを、後述の標準的免疫化処置を用いて免 疫化した。最も高い反応を示したマウスの肺臓の２分の１を採取し、Ｓ　Ｐ　２ １０骨髄腫細胞と融合させるのに用いた。やはり後述のＥＬ　ＩＳＡによって測 定されるようにハブテン１を特異的に結合するモノクローナル抗体を分泌する、 全部で１３個のハイブリドーマが単離及び保存された。

競合ＥＬＴＳＡ試験から１３個の抗体は多様なトリエン金属複合体をその結合部 位に適応させることができることが示され、種々の抗体間には金属結合特異性に 微妙な違いが観察された。

Ｃｏ（］ＩＩ　０リエン）、Ｇａ（１）（トリエン）、５ｃ（ＩＩ［）（）リエ ン）、Ｉｎ（ＩＩＩ）　（）リエン）、Ｌａ（１）（トリエン）、Ｔｂ（ＩＩＩ ）ぐトリエン）、Ｙｂ（ＩＩＩ）　（１−リエン）、Ｍｇ（］ＩＩ０リエン）、 Ｍｎ（ＩＩ）ＩＪリエン）及びＬｕ（Ｉ［Ｉ）（）リエン）等の金属複合体の結 合も該抗体のうちのいくつかによって検出することができたか、一般にＣｄ（Ｉ Ｉ）（）リエン）、Ｃｏ（Ｉ［）（）リエン）、Ｃｕ（ＩＩ）　（’）リエン） 、Ｆｅ（ＩＩＩ）（トリエン）、Ｎｊ（ＩＩ）（）リエン）、Ｐｄ（■）　（ト リエン）、及びＺｎ（ＩＩ）（トリエン）が最も高い親和力を持って結合した。

金属塩のみを加えた（トリエンリガンドを加えなかった）場合、ごくわずかな量 の競合しか観察されなかった。

１３個の各モノクローナル抗体を、６個の基質ペプチド２−７（以下参照）に対 するペプチド結合開裂（アミド加水分解）活性について、数種類の異なるトリエ ン金属複合体を、形成される免疫リガンドへの共同因子になりえるものとして用 いてスクリーニングした。該基質類のいかなるペプチド結合（アミド）加水分解 中にも現われる遊離のアミン基を検出する、高速かつ高感度のペプチド開裂アッ セイか開発された。

当アッセイは、反応混液をシリカ（薄層クロマトグラフィー）（ＴＬＣ）プレー ト上にスポットした後、Ｉ：４水：メタノール（Ｖ　：　Ｖ）溶媒混液で溶離す ることを含んだ。加水分解されたペプチド生成物はいずれも溶媒先端付近に溶離 したが一方、アブシン及び金属トリエン共同因子は原点にとどまった。溶離後、 プレートにフルオレサミンのアセトン溶液を噴霧し、溶媒先端付近の蛍光緑色物 質（長波ＵＶ）はいずれも基質の加水分解を示すものであった。２マイクロモル （μＭ）程度の少量の生成物アミンがこの方法で検出できた。当アッセイのルー チン性が各アブシンについての大量の反応パラメーターの調査を容易にした。

該抗体類のうちいくつかは、数種類の金属イオン複合体共同因子を用いてペプチ ド基質２及び３の実質的な開裂を示した。

Ｚｎ　（ＩＩ）　、　Ｆｅ　（ＩＩ［）　、Ｇａ　（ｎ［）　、　Ｃｕ　（ＩＩ ）及びＮ１（Ｉ［）のトリエン複合体は特に有効な共同因子であった。ペプチド ４−７は該抗体類のいずれについても基質とならなかった。１個のアブシン、２ ８Ｆ！１を直後試験用に選択し、このアブシンのペプチド加水分解活性をペプチ ド２を用いて詳細に分析した。

典型的な反応としては、１０μＭ２８Ｆ１１を７５ｍＭリン酸緩衝液中の１．２ ｍＭ基質ペプチドと共に３ｍＭ）リエン金属イオン複合体と混合し、できた混合 液を数日間保存して触媒を行なわせた。当反応はアブシン及び抗原性免疫リガン ド〔金属（トリエン）及び基質〕の完全な相補系を厳密に必要とした。最適開裂 はほとんどの金属について６．０−７．５のｐＨ値範囲で観察されたが、もっと も種々の金属により種々のｐＨ値適性が示された。

図２に見ることができるように、３７℃、ｐＨ６，５で５日装置いた後に、ペプ チド又の開裂はぐ活性が大きい順に）Ｚｎ（ＩＩ）、Ｇａ（ＩＩＩ）　、Ｉｎ（ ＩＩＩ）　、Ｆｅ（Ｉ［［）　、Ｃｕ（Ｉｆ）　、Ｎｉ　（ＩＩ）　、Ｌｕ（Ｉ ＩＩ）、Ｍｎ（ＩＩ）及びＭｇ（ＩＩ）のｌ・リエン金属イオン複合体により観 察された。少量ではあるが再現性のある量の開裂が、Ａｊ７　（Ｉ［）及びＣｏ （Ｉｆ）のトリエン金属イオン複合体並びにペプチド２を含む抗原性免疫リガン ドにより観察された。レセプター２８Ｆｌｌによるペプチド且の開裂は、共同因 子なしでトリエンのみを使用した場合、若しくは２８Ｆ１１プラスＣｄ　（ＩＩ ）　、Ｐｄ　（ＩＩ）　、Ｓｃ　（ＩＩＩ）、Ｔｂ（Ｉ［）及びＹｂ（ＩＩＩ） のトリエン複合体を加えた場合には観察されなかった。基質ユは基質主の開裂反 応と同様の金属依存性を示した。

Ｚｎ（ＩＩ）（トリエン）は最も有効な金属−共同因子複合体であることが観察 さね、１．５ｍＭの濃度で最適効力を示した。Ｚｎ（Ｉ［）（トリエン）共同因 子による基質又の触媒性加水分解はｐＨ６，０ないしｐＨ８，０の間、及び８０ ０ｍＭ以下のＮａＣ１濃度が最適であった。

いくつかの証拠から、レセプター２８Ｆ１］を用いて観察される蛋白分解活性（ ペプチド結合開裂）はアブシン結合部位によるものであることが確認される。第 一に基質特異性は、抗原性免疫リガンドに使用されるハブテン１の構造に調和し ている。第二に、レセプター２８Ｆ１１の限定的ペプシン蛋白分解によって製造 された精製Ｆａｂ’断片は触媒活性を完全に保持していた。第三に、Ｚｎ（Ｉ［ ）だけではごく低い活性しか示さなかったため、トリエンリガンドが該加水分解 反応に必要であることか示された。〔トリエンなしでいずれの開裂も観察された という事実はおそらくアブシン結合部位の水中Ｚｎ（ＩＩ：）？）［合体を適応 させる限定的能力を反映している）。第四に、該反応はハブテンｌによって有効 に阻害されたが、ハブテンによる阻害は触媒性抗体の特徴である。全てのデータ は、非共有結合共同因子としてＺｎ（ＩＩ）０リエン）を含むアブシン抗体結合 部位で触媒性加水分解反応が起きているということに矛盾しない。

ペプチド２及び３を用いたより大きなスケールの反応生成物を単離し、それらが それぞれのｇｌｙ　−ｐｈｅ結合間の特異的開裂の結果生じたものであることが 示された。４ｍｇのペプチド基質を用いると３　ｍＭ　Ｚｎ（Ｉ［）（トリエン ）及び１０μＭレセプター２８Ｆ１１を用いた反応は８日間で完了させることが できた。これは抗体結合部位あたり４００ターンオーバーに相当し、それゆえに ターンオーバー回数は６ＸｌＯ−’Ｓ−’である。該反応からは２種類の断片の みが観察され、これらを単離しＮＭＲで特性を調べた（ペプチド至については図 ３参照）。該断片の構造は各基質のグリシン及びフェニルアラニンの間の単一の 開裂の結果としてのみ起こりえるものであった。

このアブシン触媒によるペプチド加水分解反応の詳しいメカニカル解釈はハブテ ン上及び／又はペプチド基質の配座解析におそらく左右される。金属トリエン複 合体が抗原性免疫リガンドの必要な共同因子であることが示されたので、ペプチ ド基質の切断され易い結合が反応のある時点て金属に直接配位結合するという仮 定は理にかなっている。

一見すると、ペプチド基質２７１び主のｇｌｙ−ｐｈｅ結合はきまって金属結合 部位から多少離れているように見える。予備的な構造モデルからは、ハブテンｌ 中の両方のフェニル環を互いに近接するような位置にすると実際に、切断され易 いアミド結合（ＧＩＹ−Ｐ　ｈｅ）を金属結合部位に近接するような位置にさせ る配置でのペプチド２及び３の結合を必要とするアブシン結合部位が作られるに ちがいないことが示されている。

観察されたペプチダーゼ特異性は、ペプチド４−７が同様の配置を取ることはあ りそうにないので、このモデルに一致している。

化合物１−７の配座解析が、このペプチド加水分解反応の詳細をより多く理解す る助けとなるように現在進行中である。

■、特異的レセプターの製造 本発明において存用なレセプターは好ましくはモノクローナル抗体であるが、ポ リクローナル抗体若しくはその結合部位部分を使用してもよい。“モノクローナ ル抗体”とは一種類のみのレセプター分子を分泌するハ、イブリドーマと呼ばれ る単一細胞のクローンによって製造されたレセプターのことである。ハイブリド ーマ細胞は抗体産生細胞及び骨髄腫細胞若しくは他の無限継続性細胞株から融合 される。

本発明のモノクローナル抗体を製造する技術は周知のものである。このようなレ セプターはここに参考文献として組み込んである、ケーラー及びミルシュティン （Ｋｏｈｌｅｒ　ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）、ネイチャー（Ｎａ、ｔｕｒｅ） 、２５６巻、第４９５頁、１９７５年に最初に述べられた。モノクローナル抗体 は通常、ハイブリドーマ組織培養、若しくはハイブリドーマ組織を導入した哺乳 動物から得られた腹水から得られる。両方法をここで述べる。

モノクローナル　レセプターは、ポリクローナル抗体に比較すると相対的に高い 特異的触媒活性を持つことと同時に、このような特定の免疫化アナログ−リガン ド及び反応体リガンドを特定のエピトープに結合させる際に無類の特異性を示す ことにより、ここでは好ましい。ポリクローナル抗体の製造をここで用いてもよ いが、免疫化アナログ−リガンドに結合する分画と抗原性キャリアーのエピトー プ等の無関係のエピトープに結合する分画に一般に分離しなければならない。

免疫源性免疫リガンドに結合するポリクローナル抗体は、アフィニティ（親和力 ）吸着剤として免疫リガンドを用いるアフィニティ分離によって分離することが できる。抗体標本をアフィニティ吸着剤と混合し適当な免疫反応が起きるに十分 な時間保存した後、該アフィニティ吸着剤を抗体標本の残存部分から分離する。

分離した該アフィニチイ吸着剤に結合している抗体部分は免疫源性免疫リガンド に結合する抗体を含有しているが、一方該抗体標本の分離した残存部分中の抗体 は無関係のエピトープに結合する。

それらのアフィニティ結合した抗体をその後、吸着剤をＩ）Ｈ２で塩酸グリシン で洗浄する等の、アフィニティ吸着剤から結合物を分離する一般的手法により単 離してもよい。

抗体の遺伝子型含有ポリアミド部分（抗体結合部位）とは、抗体分子のうち、遺 伝子盟を含みリガンド若しくはアナログ−リガンドに結合するポリアミド部分の ことである。このような部分には、周知の酵素的開裂方法により抗体から製造さ れるＦａｂ、　Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）ｚか含まれる。例えば、一般的なもの としては、チオフィロブーロス及びディクソン（Ｔｈｅｏｆｉｌｏｐｏｕｌｏｓ 　ａｎｄ　Ｄｉｘｏｎ）の米国特許第４．３４２．５６６号、及び特殊なものと しては、Ｆａｂ断片に対する加速された加水分解速度が天然のＩｇのものと同等 であることを報告したボラック（Ｐｏｌｌａｃｋ　ｅｔ　ａｔ、）　、サイエン ス（Ｓｃｉｅｎ−ｃｅ）、　２３４巻、第１５７０頁、１９８７年、を参照のこ と。遺伝子型含有ポリアミドがそれから得られる抗体は、免疫源に対して出現す る、若しくは免疫源によって誘導されるものとして述べられるので、遺伝子型含 有ポリアミド（抗体結合部位含有）レセプターは、抗体から遺伝子型含有ポリア ミドを得るには開裂処置が通常必要であるという条件の下で“出現する”若しく は“誘導される”ものとして論じられる。無傷の抗体が好ましい。

ここで実施例として用いるレセプター分子を製造するには、６−８週齢の１２９ ０ＩＸ”マウスを、ピアス化学会社カタログ中の説明書に従って１−エチル−３ −（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドを用いて、２５０μ！！ＤＭ Ｆ中の２．５＋ｎＭの非反応性ペプチド１含有免疫リガンドを７５０μｌの０． ０１ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７，２、中の２ｍｇＫＬＨと４°Ｃで１時 間攪拌しながらカップリングさせて共役体を形成させることにより製造した免疫 源で免疫化した。６００μｌの共役体溶液、９００μβのＰＢＳ緩衝液及び１５ ００μｌの完全フロインドアジュバントを含むように製造した接種液（３０００ μｌ）をマウス１匹あたりに１００μｇの兵役体が与えられるようにマウス１匹 あたり５００μβずつ投与した。投与は腹腔内注射によって行なった。

マウスは最初の免疫化の後２週間にわたってブースター腹腔内注射を受けた。該 ブース−ター接種液は３００μｌの該共役体溶液、１２００μｌのＰＢＳ緩衝液 及び１５００μｌのみょうばんアジュバント分散液を含むように製造した（３０ ００μＩ！＞。各マウスに１匹あたり５０μｇの共役体が与えられるように５０ ０μβずつ投与した。

その後、さらに４週間マウスにブースターを与えた。この回は、接種液は１００ μ！の共役体溶液及び３００μｌのＰＢＳ緩衝液を含有した。各マウスに１００ μｇの共役体を含む２００μｌの接種液を腹腔内投与した。

免疫化されたマウスによって産生されたポリクローナル抗体をスクリーニングす るためにＥＬＩＳＡを使用した。使用した抗原は、ＫＬＨ共役体の製造で述べた のと同様の方法に従ってハブテンペプチド１をウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に 結合させることにより製造した共役体であった。該ポリクローナル抗体をさらに 、特異的結合が観察されることを確認するために阻害剤として第一の免疫リガン ドを用いてスクリーニングした。結合が陽性であることはパーオキシダーゼでラ ベルされたヤギ抗マウスＩｇＣ；＋ＴｇＭを用いてアッセイした。観察された結 合が特異的であることを確認する助けとして結合アッセイをさらに阻害剤として 遊離のハブテンペプチドｌの存在下で行なった。

抗体かＥＬＩＳＡにおいて最も高い力価を示したマウスの膵臓の２分の１から取 った細胞を、ＩＯパーセント牛脂児血清中の骨髄ＩＩ！１Ｐ３Ｘ６３ＡＧ、９． ６５３　（ＡＴＣＣＣＲＬ２５８０）細胞と融合させた。残りの２分の１の膵臓 から取った細胞は１バーセントヌートリドーマ及び２パーセントＢＳＡ中のＳＰ ２１０−Ａｇ　１４　（ＡＴＣＣＣＲＬ１５８１）骨髄腫細胞と融合させた。

標準的融合技法を用いた。

各融合による細胞を１０枚の９６ウエルプレートに接種した。

Ｐ３Ｘ６３融合のウェルのうち約１０パーセントはＨＡＴ−ＤＭＥＭ培地中で成 育を示し、ウェルの上溝のうち上記のＥＬＩＳＡで陽性の結合を示したものはな かった。５Ｐ２１０融合のウェルのうち約３０パーセントはＨＡＴ−ＤＭＥＭ培 地中で成育を示した。成育した３００ウエルのうち、３５ウエルの上清がＥ、Ｌ Ｉ　Ｓ　Ａで陽性であった。それらの３５の最初に陽性だったもののうち、１５ かサブクローニングを経てもその活性を保ち、腹水を作らせるためにマウスに導 入された。

それらの１５個のハイブリドーマをその軽鎖及び重鎮の構成について分析した。

１２個についてはカッパ、ガンマ１．２個はラムダ、ガンマ１；及び１個はカッ パ、ミューであることがわかった。１５個のうち１３個を触媒活性があるかどう かをアッセイし、そのよう活性を示すことが見出され、２個のハイブリドーマは マウス中で依然成育していた。現在、その１３個のハイブリドーマには最低２個 の異なるハイブリドーマが含まれることが知られており、残りの１１個のハイブ リドーマがその２個の同定済み細胞系と等しいのか異なるのかを決定するために 研究が行なわれている。

上記の１３個のハイブリドーマをブリスタンを前もって与えておいたＢＡＬＢ／ ｃＸＩ　２９Ｇ　ＩＸ”マウスに注射し、腹水を作らせた。モノクローナル抗体 を該腹水を飽和硫酸アンモニウムで沈殿させた後、ＤＥＡＥ−セファデックスに よるイオン交換クロマトグラフィー、さらにプロット−Ｇセファロースによるア フィニティクロマトグラフィーにより精製した。蛋白濃度はローリ−法〔ジャー ナル　オブ　バイオロジカル　ケミストリイ（Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、）、　１９３巻、第２６５頁、１９５１年〕により測定した。

できたレセプター含有水性溶液をアミコン限外濾過によって濃縮し、２０　ｍＭ 　ＮａＣｌ！及び２０　ｍＭ　ＥＤＴＡを含む５　ｍＭリン酸緩衝液中でｐＨ７ で透析して金属イオンを除去した。その後、ＥＤＴＡを含有する該溶液を５　ｍ Ｍリン酸及び２０　ｍＭ　ＮａＣｊ！を含む緩衝液中でｐＨ７で透析して、使用 にあてた。レセプター２８Ｆ１１の貯蔵用溶液は上で製造した溶液をアミコンフ ィルターで約４ないし約２０ｍｇ／ｍｆｆ１の濃度に濃縮して製造した。

Ｆａｂ’断片部分は以下のように製造した。精製したモノクローナルレセプター ２８Ｆ１１（２８ｍｇ）を蛋白濃度がＩｍｇ／ｍＡ’になるように０．１Ｍクエ ン酸緩衝液にｐＨ３，７で溶解した。少量の１．０Ｍクエン酸緩衝液をレセプタ ー溶液に加えて、ｐＨ値を３．７に調整した。

その後、ｐＨを調整したレセプター溶液に１．４ｍｇのペプシンを加え、できた 混合液を３７°Ｃに２時間２０分維持し、Ｆ（ａｂ’）２断片を形成させた。ｐ Ｈ値が８．０の３Ｍ　ＴｒｉＳ−Ｈ（Ｊ’緩衝液を２ｍ１７加えて反応を停止し 、それにより溶液のｐＨ値は７．５に上がった。

システィン（３６，４ｍｇ）を上記のＦ（ａｂ’）ｚ含有溶液に加え、できた混 合液を２２℃に３時間維持した。ヨードアセトアミドの最終濃度が３０ｍＭにな るように十分量の一ドアセトアミドを加えた。このヨードアセトアミド含存溶液 を暗室内で４℃に４時間維持した。該反応混液をその後、レセプター蛋白濃度を １ｍｇ／ｍβに維持して、１０ｍＭリン酸緩衝液中に２００ｍｇの酢酸ナトリウ ムを含有する緩衝液中でｐＨ６，８で透析した。

できたＦａｂ’抗体断片部分をＴＳＫＧ−３００カラム及び最後に挙げた緩衝液 を用いたシリカＨＰＬＣによる分子ふるいクロマトグラフィーにより精製した。

溶離分画を適当なサイズの望ましいＦａｂ’断片をめて５ＤＳ−ＰＡＧＥにより アッセイした。

Ｆａｂ’断片含有分画を２０　ｍＭ　ＮａＣ１，５ｍＭ　ＥＤＴＡ及び５ｍＭ’ Ｊン酸を含有する緩衝液中でｐＨ７で透析し、多価金属イオンを除去した。その 後、２０　ｍＭ　ＮａＣＡ及び５　ｍＭリン酸を含有する緩衝液中でｐＨ７で透 析してＥＤＴＡを除去した。Ｆａｂ’抗体部分の貯蔵用溶液はアミコン限外濾過 装置により蛋白濃度が約４ないし約１０ｍｇ／ｎｕになるように濃縮した。

それらのハイブリドーマのうち１個をこのクラスの例として、アメリカンタイプ カルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）　、！２３０１バークローンドライブ、ロ ックビル、メリーランド州、に供託した。そのハイブリトーマは１９８９年１月 １３日に供託され、２８Ｆ＋　１と命名され、ＡＴＣＣの受託番号はＨＢ９９７ １であった。

上記の供託は、供託期間が供託臼から３０年間あるいは供託所における該供託物 に対する最終請求から５年間、若しくは本出願から発生する米国特許の施行期限 のうちの長い方を取るというブダペスト条約に従ってなされた。該ハイブリドー マは供託所において生育不能となった場合は補充されるであろう。

本レセプター分子を別の方法で製造するには、抗体結合部位形成断片をコード化 している遺伝子を、ここで考察したような免疫反応を示す抗体分子を産生ずるい ずれか細胞から得てもよい。好ましい細胞はハイブリドーマ細胞である。

一般的な組換えＤＮＡクローニング法の例としては、モリキュシー　クローニン グ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）、　７＝アテイスら（Ｍａｎ−ｉａ ｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、）、コールド　スプリング　ハーバ−研究所、ニューヨー ク、１９８２年；ＤＮＡクローニング（ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）、グローバー （Ｇｌｏｖｅｒ）纒、ＩＲＬ出版、マクレーン、バージニア州、１９８５年を参 照のこと。ゲノムクローニング及びリンパ細胞における免疫グロブリン遺伝子の 発現については、ニューバーガーら（Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、）、　 ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、３１２巻、第６０４−８頁、１９８４年；オチら （Ｏｃｈｉ　ｅｔ　ａｌ、）、ブローシーディンゲス　オブ　ザ　ナショナル　 ア力デミイ　オブ　サイエンスオブＵＳＡ　（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａ ｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ）、　８０巻、第６３５１−５５頁、１９８７年：及び オイら（Ｏｉ　ｅｔ　ａｌ、）、プロシーディンゲス　オブ　ザ　ナショナル　 ア力デミイ　オプ　サイエンスオブＵＳＡ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ 、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ）、８０巻、第８２５−２９頁、１９８３年を参照のこと 。ハイブリドーマ細胞からの免細胞における形質発現については、ロバーツら（ Ｒｏｂｅｒｔｓ　ｅｔ　ａｌ、）。

プロティン　エンジニアリング（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）、 １巻、第５９−６５頁、１９８６年を参照のこと。また、酵母における形質発現 についてはウッドら（Ｗｏｏｄ　ａｔ　ａｌ、）、ネイチ−１−−（Ｎａｔｕｒ ｅ）。

３１４巻、第４４６−９頁、１９８５年を参照のこと。

特定の態様及び実施例を含む上記の明細書は、本発明を具体的に説明することを 意図しており、限定するもの解釈すべきではない。本発明の真の意図及び範囲か らそれることなく数多くの他の変更及び修正を行なうことができる。

浄書１内容に変更なし） 平成　年　月　日

Claims (30)

【特許請求の範囲】
1. １．それぞれが多価金属イオン配位複合体を含む複数の免疫リガンドと免疫的に 結合する抗体結合部位を含むレセプター分子を含む触媒分子であって、第一免疫 リガンドである該配位複合体が動力学的に不活性であり、第二免疫リガンドであ る該配位複合体が動力学的に不安定であり、該レセプター分子がさらに該第二免 疫リガンドの化学反応を触媒し、かつ該第二免疫リガンドにおいて触媒される反 応と同一の反応を該第一免疫リガンドにおいて触媒することはない触媒分子。
2. ２．モノクローナルレセプター分子である請求の範囲１記載の触媒分子。
3. ３．触媒される化学反応が予め決定されたべプチド結合の開裂である、請求の範 囲２記載の触媒分子。
4. ４．解離定数が約１０−８以下である免疫複合体を形成する第一免疫リガンド、 及び第二リガンドに結合し、該第二免疫リガンドの化学反応を触媒する抗体結合 部位を含むレセプター分子を含むモノクローナル触媒分子組成物であって、該第 一免疫リガンドが２以上の独立した金属イオン配位リガンドに配位された第一多 価金属イオンを含む動力学的に不活性の金属イオン配位複合体を含み、該第一独 立配位リガンドが単座配位若しくは多価配位子であり、該第二独立配位リガンド が単座配位子若しくは二座配位子であり、該第二独立配位リガンドがさらに少な くとも１０個の炭素原子の鎖式、環式、若しくは鎖式置換基で置換された環式構 造を含む第一非反応性有機構造体を含んでおり、 第二免疫リガンドが、上記の第一配位複合体の金属イオンとは異なるか、又は２ 以上の独立金属イオン配位リガンドに配位されている上記の第一独立配位複合体 と同一の金属で低酸化状態にある第二多価金属イオンを含む動力学的に不安定の 金属イオン配位複合体を含み、上記の第一独立配位リガンドが単座配位若しくは 多価配位子であって上記の動力学的に不活性の配位複合体の上記第一配位リガン ドと実質的に類似の寸法、リガンド配位ファンクショナリティー、及び実質的に 類似の構造を有するものであり、上記の第二独立リガンドが単座配位子若しくは 二座配位子であり、上記第二配位リガンドが分子的立体構造において上記の非反 応性有機構造体に十分に類似した少なくとも１０個の炭素原子の鎖式、環式、若 しくは鎖式置換基で置換された環式の反応性有機構造体をさらに含んでおり、上 記触媒分子と上記の第二配位リガンドとの間に形成される免疫複合体の解離定数 が最大１０−２であるモノクローナル触媒分子組成物。
5. ５．上記の第二免疫リガンドの該金属イオンの配位数が上記の第一免疫リガンド の金属イオンの配位数と同じか若しくは１以上少ない、請求の範囲４記載の触媒 分子組成物。
6. ６．上記の動力学的に不活性及び動力学的に不安定な金属イオン配位複合体のそ れぞれが、比較的疎水性の２以上の面と１若しくは２の比較的親水性の面とを有 する請求の範囲５記載の触媒分子組成物。
7. ７．上記の比較的疎水性の面が上記の第一配位リガンドに少なくとも部分的に設 けられている請求の範囲６記載の触媒分子組成物。
8. ８．上記の比較的親水性の１又は２の面が上記の単座若しくは二座の第二配位子 の陰イオン的に荷電した部分により設けられている請求の範囲６記載の触媒分子 組成物。
9. ９．触媒される上記化学反応が少なくとも３個のアミノ酸残基を含むペプチドの 予め選択されたペプチド結合の開裂であって、上記の動力学的に不安定な配位複 合体の該反応性有機構造体がその残基のペプチド結合が開裂される残基を含むす くなくとも３個の残基を含むペプチドを含んでおり、上記の動力学的に不活性な 配位複合体の上記の非反応性有機構造体が、加水分解されるペプチド結合の開裂 され易いカルボニル炭素と類似の位置にあり２ないし約７個の炭素鎖で配位官能 基に結合されているアミドカルボニル炭素を有する３ないし約１０個のアミノ酸 残基を有するペプチドを含む、請求の範囲４記載の触媒分子組成物。
10. １０．水若しくは水酸イオンが上記の動力学的に不安定な第二配位複合体の配位 リガンドである請求の範囲４記載の触媒分子組成物。
11. １１．解離定数が約１０−８以下である免疫複合体を形成する第一ペプチド含有 免疫リガンドと第二ペプチド含有免疫リガンドに免疫的に結合し、該第二免疫リ ガンドの予め決定されたペプチド結合に対して触媒的加水分解活性を示す抗体結 合部位を含むレセプター分子を含むモノクローナルアプシン分子組成物であって 、 該第一免疫リガンドが２以上の独立した金属イオン配位リガンドに配位された第 一金属イオンを含む動力学的に不活性の金属イオン配位複合体を含み、該第一独 立配位リガンドが単座配位若しくは多価配位子であり、該第二独立配位リガンド か単座配位子若しくは二座配位子であり２ないし約７個の炭素鎖で金属イオン− 配位官能基に結合されたアミドカルボニル炭素を有する３ないし約１０個のアミ ノ酸残基を含む不活性なペプチドを含み、上記の結合されたアミノカルボニル炭 素が加水分解されるペプチド結合の開裂され易いカルボニル炭素と類似の位置に あり、 該第二独立配位リガンドが上記の第一配位複合体の金属イオンとは異なるか、又 は２以上の独立金属イオン配位リガンドに配位されている上記の第一独立配位複 合体と同一の金属であって低酸化状態にある第二多価金属イオンを含む動力学的 に不安定な金属イオン配位複合体を含み、上記の第一配位リガンドが単座配位若 しくは多価配位子であって上記の動力学的に不活性の配位複合体の上記第一配位 リガンドと実質的に類似の寸法、リガンド配位ファンクショナリティー、及び実 質的に類似の構造を有するものであり、上記の第二独立リガンドが単座配位子若 しくは二座配位子であり、分子的立体構造において上記の非反応性ペプチドに十 分に類似した少なくとも３個のアミノ酸残基を含む活性ペプチドをさらに含んで おり、上記アプシンと上記反応性ペプチドとの間に形成される免疫複合体の解離 定数が最大１０−２であるモノクローナルアプシン分子組成物。
12. １２．上記の動力学的に不活性な第一免疫リガンドの金属イオンがＣｏ（ＩＩＩ ）であり、動力学的に不安定な第二免疫リガンドの該金属イオンがＺｎ（ＩＩ） 、Ｆｅ（ＩＩＩ）、Ｃｏ（ＩＩ）、Ｃｕ（ＩＩ）、Ｇａ（ＩＩＩ）、Ｌｕ（ＩＩ Ｉ）、Ｉｎ（ＩＩＩ）、Ａｌ（ＩＩＩ）、Ｍｎ（ＩＩ）、Ｎｉ（ＩＩ）、及びＭ ｇ（ＩＩ）からなる群から選ばれる請求の範囲１１記載のププシン分子組成物。
13. １３．上記の動力学的に不活性な第一リガンド及び動力学的に不安定な第二リガ ンドのいずれの該第一独立配位リガンドがトリエチレンテトラミンである請求の 範囲１２記載のアプシン分子組成物。
14. １４．動力学的に不活性な配位複合体の第二独立配位リガンドの上記非反応性ペ プチドが下記の式で示される構造：▲数式、化学式、表等があります▼ を有しており、かつ動力学的に不安定な上記配位複合体の反応性ペプチド含有第 二独立配位リガンドが下記の式：▲数式、化学式、表等があります▼ 若しくは ▲数式、化学式、表等があります▼ で示される請求の範囲１３記載のアプシン分子組成物。
15. １５．予め決定された化学反応を行う方法であって、以下の工程：（ａ）水性媒 体中に触媒的に有効量のレセプター分子、共同因子分子、及び基質分子を混合物 を製造するために混合する工程であって、該レセプター分子がそれぞれが多価金 属イオン配位複合体を含む複数の免疫リガンドと免疫的に結合する抗体結合部位 を含み、第一免疫リガンドが動力学的に不活性であり、第二免疫リガンドが動力 学的に不安定であり、上記共同因子分子及び基質が上記の第二免疫リガンドを含 み、該レセプター分子が該基質中において予め決定された反応を触媒し、該第一 免疫リガンド中のいかなる化学反応も触媒しないものである工程；及び （ｂ）該混合物を予め決定された反応が進行するのに十分な時間にわたって維持 する工程、 を含む方法。
16. １６．該レセプター分子がモノクローナルである請求の範囲１５記載の方法。
17. １７．上記の予め決定された反応が予め決定されたペプチド結合の開裂である請 求の範囲１５記載の方法。
18. １８．予め決定された化学反応を促進する方法であって、以下の工程： （ａ）水性媒体中に触媒的に有効量のモノクローナルレセプター分子、共同因子 分子共同因子分子、及び基質分子を、該レセプター分子が第一免疫リガンド及び 第二免疫リガンドに免疫的に結合する抗体結合部位を含み、該第二免疫リガンド 中において予め決定された反応を触媒する混合物を製造するために混合する工程 において、 該第一免疫リガンドが２以上の独立した金属イオン配位リガンドに配位された第 一多価金属イオンを含む動力学的に不活性の金属イオン配位複合体を含み、該独 立配位リガンドの１個が単座配位若しくは多価配位子であり、他の独立配位リガ ンドが単座配位子若しくは二座配位子であって、さらに少なくとも１０個の炭素 原子の鎖式、環式、若しくは鎖式置換基で置換された環式構造を含む第一非反応 性有機構造体を含んでおり、該レセプター分子と第一免疫リガンドとの間の免疫 複合体の解離定数が約１０−８以下であり、かつ第二免疫リガンドが上記の第一 配位複合体の金属イオンとは異なる第二多価金属イオンを含み２以上の独立金属 イオン配位リガンドに配位している動力学的に不安定の金属イオン配位複合体を 含み、上記の第一独立配位リガンドが単座配位若しくは多価配位子であって上記 の動力学的に不活性の配位複合体の一個の独立配位リガンドと実質的に類似する 寸法、リガンド配位ファンクショナリティー、及び実質的に類似の構造を有する ものであり、上記の第二独立リガンドが単座配位子若しくは二座配位子であり、 上記第二配位リガンドが分子的立体構造において上記の非反応性有機構造体に十 分に類似した少なくとも１０個の炭素原子の鎖式、環式、若しくは鎖式置換基で 置換された環式構造を含む反応性有機構造体をさらに含んでおり、上記触媒分子 と上記の第二配位リガンドとの間に形成される免疫複合体の解離定数が最大１０ −２であり、該第二金属イオン及び該第一独立配位リガンドが上記共同因子分子 を含み、かつ上記第二独立配位リガンドが該基質分子を構成している工程、及び （ｂ）上記の予め決定された化学反応が進行するのに十分な時間にわたって上記 混合物を維持する工程 とを含む方法。
19. １９．該第二免疫リガンドの金属イオンの配位数が上記第一免疫リガンドの配位 数と同じか１以上小さい配位数である請求の範囲１８記載の方法。
20. ２０．動力学的に不活性及び動力学的に不安定な金属イオン配位複合体のそれぞ れが２以上の比較的疎水性の面と１または２の比較的親水性の面を有している請 求の範囲１９記載の方法。
21. ２１．触媒される化学反応が少なくとも３個のアミノ酸残基を含むペプチドの予 め選択されたペプチド結合の開裂であり、上記の動力学的に不安定な配位複合体 の該反応性有機構造体がその残基のペプチド結合が開裂される残基を含むすくな くとも３個の残基を含むペプチドを含んでおり、上記の動力学的に不活性な配位 複合体である上記の非反応性有機構造体が、加水分解されるペプチド結合の開裂 され易いカルボニル炭素と類似の位置にあり２ないし約７個の炭素鎖で配位官能 基に結合されているアミドカルボニル炭素を有する３ないし約１０個のアミノ酸 残基を有するペプチドを含む構造体である請求の範囲１８記載の方法。
22. ２２．該混合物中に該共同因子分子が上記基質の濃度の約０．１乃至約１０倍で 存在する請求の範囲１８記載の方法。
23. ２３．予め選択されたペプチド結合を加水分解する方法であって、以下の工程： （ａ）水性媒体中に、第一ペプチド含有免疫リガンド及び第二ペプチド含有免疫 リガンドに免疫的に結合する抗体結合部位を含み該第二免疫リガンド中において 予め決定されたペプチド結合に対して触媒的加水分解活性を示す触媒的に有効量 のアプシン分子を混合する工程において、 該第一免疫リガンドが、２以上の独立した金属イオン配位リガンドに配位された 第一金属イオンを含む動力学的に不活性の金属イオン配位複合体を含み、該第一 独立配位リガンドが単座配位若しくは多価配位子であり、第二独立配位リガンド が単座配位子若しくは二座配位子であって、２ないし約７個の炭素鎖で金属イオ ン配位官能基に結合されているアミドカルボニル炭素を有する３ないし約１０個 のアミノ酸残基を有する非活性ペプチドを含み、上記の結合されたアミドカルボ ニル炭素が加水分解されるペプチド結合の開裂され易いカルボニル炭素と類似の 位置にあり、該レセプター分子と第一免疫リガンドとの間の免疫複合体の解離定 数が約１０−８以下であり、かつ 該第二独立配位リガンドが上記の第一配位複合体の金属イオンとは異なるか、又 は上記の第一独立配位複合体と同一の金属であって低酸化状態にある第二多価金 属イオンを含み２以上の独立金属イオン配位リガンドに配位された動力学的に不 安定な金属イオン配位複合体を含み、上記の第一配位リガンドが単座配位若しく は多価配位子であって上記の動力学的に不活性の配位複合体の上記独立第一配位 リガンドと実質的に類似の寸法、リガンド配位ファンクショナリティー、及び実 質的に類似の構造を有するものであり、上記の第二独立リガンドが単座配位子若 しくは二座配位子であり、分子的立体構造において上記の非反応性ペプチドに十 分に類似した少なくとも３個のアミノ酸残基を含む活性ペプチドをさらに含んで おり、上記アプシンと上記反応性ペプチドとの間に形成される免疫複合体の解離 定数か最大１０−２であり、上記第二金属イオン及びその該第一独立配位リガン ドが上記共同因子分子を含み、かつ上記第二独立配位リガンドの反応性ペプチド が該基質分子を構成している工程、及び（ｂ）上記の反応が進行するのに十分な 時間にわたって上記混合物を維持する工程 とを含む方法。
24. ２４．上記の動力学的に不活性な第一免疫リガンドの金属イオンがＣｏ（ＩＩＩ ）であり、動力学的に不安定な第二免疫リガンドの該金属イオンがＺｎ（ＩＩ） 、Ｆｅ（ＩＩＩ）、Ｃｏ（ＩＩ）、Ｃｕ（ＩＩ）、Ｇａ（ＩＩＩ）、Ｌｕ（ＩＩ Ｉ）、Ｉｎ（ＩＩＩ）、Ａｌ（ＩＩＩ）、Ｍｎ（ＩＩ）、Ｎｉ（ＩＩ）、及びＭ ｇ（ＩＩ）からなる群から選ばれる請求の範囲２３記載の方法。
25. ２５．上記の動力学的に不活性な第一リガンド及び動力学的に不安定な第二リガ ンドの両者の上記第一独立配位リガンドがトリエチレンテトラミンである請求の 範囲２４記載の方法。
26. ２６．動力学的に不活性な配位複合体の第二独立配位リガンドの上記非反応性ペ プチドが下記の式で示される構造：▲数式、化学式、表等があります▼ を有しており、かつ動力学的に不安定な上記配位複合体の反応性ペプチド含有第 二独立配位リガンドが下記の式：▲数式、化学式、表等があります▼ 若しくは ▲数式、化学式、表等があります▼ で示される請求の範囲２４記載の方法。
27. ２７．その抗体結合部位が予め決定された化学反応を触媒し、該抗体結合部位が それぞれが多価金属イオン配位複合体を含む複数の免疫リガンドと結合し、第一 免疫リガンドが動力学的に不活性てあり、第二免疫リガンドが動力学的に不安定 であり、該レセプター分子が上記化学反応を上記第二免疫リガンド中で触媒し、 かつ第一免疫リガンド中ではいかなる化学反応も触媒することはないモノクロー ナルレセプターを分泌するハイプリドーマ。
28. ２８．該化学反応が予め決定されたペプチド結合の開裂である請求の範囲２６記 載のハイプリドーマ。
29. ２９．該レセプターの該抗体結合部位と該第一免疫リガンドが１０−８以下の解 離定数を有する免疫複合体を形成する請求の範囲２６記載のハイプリドーマ。
30. ３０．２８Ｆ１１と命名されＡＴＣＣの受託番号がＨＢ９９７１である請求の範 囲２７記載のハイプリドーマ。