JPH04502708A - 立体特異的触媒作用を示す抗体結合部位を有する分子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 立体特異的触媒作用を示す抗体結合部位を有する分子゛　への 本発明は１９８７年５月２８日に出願された共に係属中の出願番号０５５１７７ の一部継続出願である１９８７年８月７日に出願された共に係属中の出願番号０ ８３６８１の一部継続出願である。これらの出願の開示内容をここに参考に加入 する。

且王立丘 本発明は抗体、抗原、及び免疫原に関し、さらに特定的にはアミドもしくはエス テルの加水分解の遷移状態の四面体炭素原子に立体特異的に結合し、これを安定 化する抗体結合部位であって、かかる結合の加水分解を立体選択的にひきおこす 抗体結合部位を含有する分子に関する。

１貝生！且 配位子と受容体の間の結合現象は生物系において多くの非常に重要な役割を演じ る。かかる現象の例はデオキシヘモグロビンへの酸素分子の結合によるオキシヘ モグロビンの形成、及び基質のそれに作用する酵素への結合、例えばタンパク質 とトリプシン等のプロテアーゼの間の結合を包含する。生物学的結合現象のより さらなる例は抗原の抗体への結合、及び補体成分Ｃ３のいわゆるＣＲＩ受容体へ の結合を包含する。

多くの薬物や他の治療剤も結合現象に依存すると考えられている０例えば、モル フイネ等のアヘン剤は脳中の特異的受容体に結合することが報告されている。ア ヘン剤作動物質及び拮抗物質はモルフイネ等の薬物とそれらの結合部位で競合す ることが報告されている。

モルフイネやその誘導体等の人間が作り上げた薬物等の配位子、及びエンドルフ ィンやホルモン等の生物系に本来的に存在する配位子は生物系に本来的に存在す る受容体に結合するので、ここでは−緒に取り扱う。かかる結合は、特にアミド やエステル結合の加水分解、例えばタンパク質をトリプシンやパパイン等の酵素 によって構成ポリペプチドに加水分解する場合や脂肪をグリセリンと３つのカル ボン酸に切断する場合をはじめとするいくつかの生物学的現象を引き起こす。

スロビン（Ｓｌｏｂｉｎ）　、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ　＋　Ｊ−：　２８３ ６−２８４４（１９６６）はウシ血清アルブミンのｐ−ニトロカルボベンゾキシ 複合体に対する抗体の調製を報告した。これらの抗体はついで酢酸ｐ−ニトロフ ェニル及びε−アミノカプロン酸エステルの加水分解に用いられた。酢酸エステ ルの反応は二次速度定数によって表わされ、非特異的らしいと記述されている。

正常Ｔ−グロブリンを用いて得られた二次速度定数は特別に調製された抗体のそ れとほぼ等しいとされた。特別に調製された抗体の存在はアミノカプロン酸エス テルの加水分解を阻害することが記述されている。

コーエン（Ｋｏｈｎｅｎ）及び共同研究者もエステル分解を引き起こすのに抗体 を用いる試みを報告した。このグループによって用いられた抗体はいずれも、最 終的に利用された基質分子の加水分解される結合を含まない部分に集合した（ｂ ｅ　ｒａｉｓｅｄ　ｔｏ）　＠彼らの初期の研究（ＰＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、 土、ＬＬ：１３７−１４０（１９７９）及びＢｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ 、　Ａｃｔａ＋ｉｉｉ：　３２８−３３７　（１９８０））ではステロイドのカ ルボキシエチルチオエーテルの７−ウンベリフェロン（７−ヒトロキシクメリン （ｃｏｕｓｅｒｉｎ））エステルを加水分解するのに抗ステロイド抗体を用いた 。各抗体の場合において、バックグランドや正常１ｇＧについて得られた加水分 解速度に比べ加水分解速度の上昇が認められた０両方の場合において代謝回転数 は低く　（１分間に抗体１モルあたり基質約１モル以下）、抗体の飽和により平 坦域（ｐｌａｔｅａｕ）に達する。この速度の低下はステロイド性酸産物の抗体 への不可逆的結合に帰せられる。

コーエン（Ｋｏｈｅｎ）らはまた基質分子のジニトロフェニル部分に集合したモ ノクローナル抗体を用いる７−（Ｎ−（２，４−ジニトロフェニル）−６−アミ ノヘキサノイル〕−クメリンの加水分解を報告した（ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ 、上工土：　４２７−４３１（１９８０））　。

ここではバンクグランドに対する速度の増加も報告されたが、その反応は触媒的 というより化学量論的であるとされた。抗体の飽和に達するにつれての零に接近 する速度の減少が報告された。この減少は、再び、抗体への生産物酸の結合によ る生産物阻害に帰せられた。その理由は初期加水分解活性のいくつかが抗体−基 質一生産物混合物のクロマトグラフィーによりて再生できたことによる。

強力な抗体結合を基質分子の安定な状態に指向させる場合には、複合体の解離の 遅い速度は接触反応を妨害することになる。

コーネン及び共同研究者によって報告された結果についての場合はそのような場 合であると考えられる。

上記構成物は興味を引くが、酵素にとって本質的である結合エネルギーの利用の 機構を扱っていないので著しく制限される（Ｗ、Ｐ、　ジエンクス（Ｊａｎｃｋ ｓ）　、　Ａｄｖ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、、ｌ１．２１９（１９７５））。

かかる欠点は目的とする抗体を顕現させるハプテン等の遷移状態類縁体を用いる ことによって是正することができる。このハブテン（ここでは「１！緑体配位子 」ともいう）は接触反応系で阻害荊の役割を担うものと考えることができる。

このように接触反応プロセスに対する結合相互作用を実験的にそらすのに免疫学 的結合を用いることができる０例えば、与えられた反応の遷移状態に似せたハブ テン基に対する抗体の使用により、基質を遷移状態に類似させることによって基 質反応が加速されることが示唆された。ジエンクス、Ｗ、　Ｐ、　、　Ｃａｔａ ｌｙｓｉｓ　ｉｎＣｈｅｍｉｓｔｒｙ’ａｎｄ　Ｅｎｚｙ＋ｇｏｌｏｇｙ　（化 学及び酵素学における接触反応）、２８８頁（マクグロウヒル（ＭｃＧｒａｗ− Ｂｉｌｌ）、　二ｚ−ヨーク１９６９）　。

その広範囲に亘る示唆にもかかわらず、特定の遷移状態ハブテンは示唆されてお らず、またその概念をテストすることができる特定の反応も示唆されていない。

現在受は入られている化学的理論によると、アミド及びエステル結合の加水分解 は（ａ）アミドもしくはエステルの酸部分の炭素原子、（ｂ）２つの酸素分子、 すなわちカルボニル基からの酸素分子を媒体のヒドロキシルイオンもしくは水分 子からの酸素分子、及び（ｃ）エステルのアルコール部分の酸素原子もしくはア ミドのアミン部分の窒素原子に結合した四面体炭素原子を含有する遷移状態を形 成するカルボニル炭素原子の位置での反応によって水性媒体中で進行すると考え られている。かかる反応の遷移状態は定義によると単離できる中間体と比較して 単離できない有用な心的構成物である。

上記加水分解遷移状態は単離できないけれども、多くの科学文献がこの主題に没 頭してきた。それらの文献のいくつかを以下に論じる。

アミドやエステルの加水分解についての上述の遷移状態はよく理解されていると 考えられるが、特定のタンパク質等のアミドまたは脂肪等のエステルが遷移状態 を介して反応する受容体結合部位の位相（ｔｏｐｏｌｏｇｙ）パラメーター、例 えば大きさ、形及び電荷はよ（分っていない、従って、複数の結合部位の位相が 分かり、これらの部位で結合する配位子の相互作用を研究できると都合がよい。

残念ながら、Ｘｉ結晶構造を測定できた比較的少数の酵素を除き、一般に生物学 的加水分解における受容体結合部位の位相は未知である。

結合部位位相の知識の欠如の幾分かは細胞中での多くの受容体結合部位の位置の 知識すら欠如していることに由来する。加えてその位置が既知の受容体結合部位 についてもその化学的正体、すなわち結合部位のタンパク質及び炭水化物組成は 一般に未知である。かくして、受容体結合部位の位相的必要条件を理解しようと する研究及び従ってこれらの必要条件を満たすことができる治療剤を構築しよう とする研究は一般に挫折させられる。

従って研究者は潜在的治療剤が有用であるかどうかを確かめるため動物もしくは 細胞培養研究でそれらをスクリーニングすることを余儀なくされる。かかる系は 有用であるが、高価でかつ時間がかかる。

酵素の如き加水分解受容体の位相及び化学的反応性が既知である場合でも、加水 分解プロテアーゼ等の酵素は典形的にはそれらの基質、ポリペプチド鎖、をタン パク質のポリペプチド鎖中に数回存在する特定のアミノ酸残基の隣りで切断する 。かかる比較的ランダムな切断はタンパク質のポリペプチド地図を得るにはを用 であり得るが、かかる比較的ランダムな切断は特定のアミノ酸残基配列を生産物 しようとする場合には有用でない。

例えば、近年の遺伝子工学技術はｌａｃ　ｚ遺伝子等のベクター遺伝子の転写産 物に融合した目的タンパク質もしくはポリペプチドを含有する融合タンパク質を 調製するのには有用であった。しかしながら、かかるタンパク質の使用はベクタ ー遺伝子産物の断片の存在によって妨げられる。従って望まれる及び望まれない 融合ポリペプチドもしくはタンパク質部分間の融合産物を切断するタンパク分解 酵素様分子を開発できれば有用である。

近年、レルネル、トラモンタノ及びヤング（Ｌｅｒｎｅｒ、　Ｔｒａ■ｏｎ　ｔ −ａｎｏ　ａｎｄ　Ｊａｎｄａ）　（Ｓｃｉｅｎｃｅ＋　２３１．１５６６　（ １９８６））はエステルを触媒的に加水分解するモノクローナル抗体を報告した 。

トラモンタノ及びレルネルも米国特許４６５６５６７でモノクローナル抗体を用 いてエステルを加水分解することを記述している。ボラック、ヤコブス及びシュ ルツ（Ｐｏｌｌａｃｋ　、Ｊａｃｏｂｓ　ａｎｄ　５ｃｈｕｌｔｚ）（Ｓｃｉｅ ｎｃｅ、２３４．１５７０　（１９８６））はＭＯＰＣ１６７〔レオンら、Ｂｉ ｏｃｈｅｍ、、１０．１４２４　（１９７１））と名づけたミリローマタンパク 質がカーボネートの加水分解を引き起こすことを報告した。

２つのレルネル及びトラモンタノによる開示によると、抗体はカルボン酸エステ ルもしくは炭酸エステルの四面体加水分解遷移状態の安定な類縁体を表わすため に合成したホスホネートの方に集まった（ｂｅ　ｒａｉｓｅｄ　ｔｏ）　ａ主と して論じられたボラックらの抗体は加水分解されたカーポネー）ＩＩ縁体に構造 的に類似したホスホネートにたまたま結合したミエローマタンパク質であった。

このように、レルネル及びトラモンタノらの研究では加水分解する基質は、目的 とする生産物に従って合成された免疫化類縁体及び加水分解抗体を用いて予め選 択されていた。ボラックらはミエローマタンパク質の特異性をひとたび知った場 合に加水分解される基質をデザインした。ボラックらはまたレルネルらの系に概 念的に類似した、カーボネートの加水分解のための触媒的抗体、基質及び基質類 縁体の系の存在を報告した（上記文献）、この系に関する研究はヤコブスら、Ｊ 、　Ａｍ、　Ｃｈｅｗ、　５ｏｃ−、１０９，２ｔ　７４（１９８７）に報告さ れている。

公開特許出１１ＷＯ８５１０２４１４は抗体の触媒としての可能な使用を論じて おり、０−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシドの加水分解におけるポリクロ ーナル血清の使用に関するデータを提出している。この出願においては有用な抗 体は反応体、反応中間体、または反応体、生産物もしくは反応中間体の類縁体に よって誘導し得るとされている。そこにおいて「類縁体」は化学構造に関して反 応体と十分に類似している異性体、同族体または他の化合物を包含するものとし て定義されており、類縁体のところに集合した抗体は反応体との免疫反応に参加 できるが類縁体の反応を必ずしも触媒しない。

この明細書に示されたデータは基質（反応体）ガラクトシドのある切断が比較的 に濃い抗体調製物（１：１０及び１：２０希釈液）を用いて１８時間に亘って起 こったことを示しているにすぎない、触媒作用は述べられているが、述べられた 触媒抗体の代謝回転は示されておらず、切断された基質ガラクトシドのパーセン テージも示されていないので触媒活性は示されていない、該出願は研究した基質 の不特定の濃度での吸光度の直線性を仮定して、β−ガラクトシダーゼがポリク ローナル抗体より約１０倍多い基質を切断したことを示している。

該出願において提示されたデータから、用いられた抗体調製物のりジン残基の末 端アミノ基による０−ニトロフェニル基の親核置換が起こったことが考えられる 。このように、観察された吸光度はε−アミノリジニル０−二トロフェニルアニ リンの形成もしくはε−アミノーリジニルガラクトシドと０−ニトロフェノール の形成に帰することができるが、それらの出来事のいずれも触媒的ではない。理 由は抗体が代謝回転というより消費されたからである。

より最近の研究においては、抗体分子によって触媒された２分子アミドの形成が 開示され〔ペンコピツク（Ｂｅｎｋｏｖｉｃ）ら、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ　Ｓ　Ａ、工５：５３５５　（１９８Ｂ） ）、また抗体によって触媒されたクライゼン転位が開示された〔ジャクリンＵａ ｃｋｓｏｎ）ら、Ｊ　、　Ａｍ、　Ｃｈｅｗ、　Ｓｏｃ、＋　１１０　：　４８ ４１（１９８８））、上記研究のいずれも、またさらに前に論じた研究もいずれ かの反応を立体特異的に触媒する抗体の使用を想定していない。

立体特異性は抗体によって触媒されたラクトン生成反応〔ネイバー　（Ｎａｐｐ ｅｒ）　ら、５ｃｉｅｎｃｅ　、　ＬＬＬ：　１０４１（１９Ｂ　？　））及び 抗体によって触媒されたクライゼン転位（ヒルバート（旧１ｖｅｒｔ）ら、Ｐｒ ｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８　Ｓ　：　４９５５（１ ９８８））において示された。しかしながら、以下に記述する、加水分解反応を 立体特異的に触媒する抗体結合部位含有分子の使用は上記刊行物のいずれにおい ても想定されていない。

の　゛　な 本発明は反応配位子（反応体リガンド）の一方の立体異性体の予め選択された切 れやすいカルボン酸アミドもしくはエステル結合を触媒的に加水分解することが できるが、他方の立体異性体については加水分解できない、抗体結合部位を含有 する受容体分子または遺伝子（イディオタイプ）型含存ポリアミドに関する。こ の抗体結合部位は（ａ）該予め選ばれた切れやすいアミドもしくはエステル結合 を含有する反応体配位子の一方の立体異性体、及び（ｂ）反応体配位子に立体化 学的に類似し反応体配位子の予め選ばれたカルボン酸アミドもしくはエステル結 合の切れやすいカルボニル炭素原子の位置に類似した位置に四面体的に結合した リン原子を含有する類縁体配位子（アナログリガンド）の一方の立体異性体に結 合する（と免疫反応する）、そのように結合した反応体配位子の加水分解遷移状 態は（ｉ）炭素原子、すなわちエステルもしくはアミドの酸部分のα炭素、（ｉ ｔ）　２つの酸素原子及び（ｉｉｉ）エステルの酸素原子もしくはアミドの窒素 原子に結合した四面体炭素原子を含有する。

反応体配位子の加水分解状態のところに集合した抗体結合部位含有分子は、配位 子の加水分解遷移状態の類縁体を含有する（好ましくはタンパク質担体に結合し て複合体を形成した）類縁体配位子分子の一方の立体異性体で免疫化することに よって高揚されるか（ｂｅ　ｒａｉｓｅｄ）誘導される（ｂｅ　１ｎｄｕｃｅｄ ）　＊　Ｉ！緑棒体配位子加水分解遷移状態分子免疫化立体異性体は（ｉ）Ｉ！ 似した配位子アミドもしくはエステルの酸部の炭素原子（酸部分のα炭素）　、 （ｉｔ）２つの酸素原子及び（ｉｉｉ）第３の酸素原子または窒素原子、すなわ ち配位子の類縁体エステルもしくはアミドのα炭素原子に結合している第３の酸 素原子または窒素原子に直接結合した四面体的に結合したリン原子を含有する。

上述（＋）の類縁体分子の中心となる四面体リン原子に直接結合した酸部分のα 炭素原子は少なくとも５原子より好ましくは少なくとも１５原子を含有する鎖、 好ましくは少なくとも１５原子と置換フェニル基を含有する鎖中に包含される。

このことは上記（ｉｉｉ）の第３の酸素原子または窒素原子についても同様であ る。

中心原子に直接結合した上述（ｉｔ）の２つの酸素原子のうち１つの酸素原子は （ａ）中心原子に対する１つのオキソ基として２回結合する（二重結合する）か 、（ｂ）ヒドロキシル基の一部となるかまたは（ｃ）Ｃ＋　−Ｃａ低級アルキル 基を含有するアルコキシ基の酸素原子である。中心原子に結合した酸素原子のう ち第２のものは中心原子に単結合した一ＯＲ，基（式中Ｒ２は水素（Ｈ）及びＣ ＩＣａ低級アルキルよりなる群から選ばれる）である。

類縁体配位子分子の中心原子に結合した上述（ｉｆｆ）の第４の原子は配位子の 類似したエステルもしくはアミド部分のエステルのアルコール酸素原子もしくは アミドのアミン（イミノ）窒素原子である。この第４の原子は少なくとも５原子 、より好ましくは少なくとも１５原子を含有する鎖の一部であり、鎖の残部と共 にＲ３を構成する。

反応体配位子と類縁体配位子は共に２つの立体異性体形態で存在することができ 従って立体異性体中心を提供する少なくとも１つの炭素原子を含有する。立体異 性体中心は配位子及び類縁体配位子分子の各々において各分子において同じ相対 的位置に位置している。立体異性体中心はまたそれが触媒抗体結合部位含有分子 によって結合されることを可能にするために加水分解される結合の十分近くに位 置している。

四面体的に結合した中心原子はリンであり、その結果類縁体配位子は四面体炭素 遷移状態に相当するリンに関しての置換基の配置を有する有機リン化合物である 。イオン化された形態でのホスホネートもしくはホスホノアミデートモノアシ７ ドもカルボニル中心での親核的攻撃における発達中の電荷（ｄｅｖｅｌｏｐｉｎ ｇ　ｃｈａｒｇｅ）を装う（ｓｉｍｕｌａｔｅ）　＊ さらに酵素によるペプチドの加水分解のホスホノアミデート及びホスホルアミデ ート阻害剤が遷移状態の模倣物として記述されてきた。ガラ−ディ（Ｇａｌａｒ ｄｙ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　−２−２−、１９９０（１９８３）　 ｉバートレフト（Ｂａｒｔｌｅｔｔ）　ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　１１ ゜４６１８　（１９８３）；　トルセット　（Ｔｈｏｒｓｅｔｔ）　ら、Ｐｒｏ ｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、、：ＬＬ、２１７６　（１９８２）ｉジャコブセン （Ｊａｃｏｂｓｅｎ）　ら、　Ｊ、　＾ｓ、Ｃｈｅｗ、Ｓｏｃ、＋　−１−」Σ −ｌ、６　５　４　（１９８１）；カム（Ｋａｍ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｓｉｓｔｒ ｙ＋土ＪＪ−，３０３２（１９７９）及びライ−バーら、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉ ｏｌ、、土土工、１１９　（１９７７）。

ここに記述する研究においてホスホン酸エステル及びホスホノアミデートアミド は、モノクローナルであって立体特異的カルボン酸（ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ）エ ステラーゼ及びアミダーゼである抗体を生成させる遷移状ＩＩＩ縁体として機能 する。実際において、これらの抗体は真の酵素と同様に、それらの固有の結合エ ネルギーを機能的に表してエステル及びアミドを触媒的に加水分解し、典型的に 抗体として抗原に結合する。

加水分解遷移状態の類縁体を含有する例示的な免疫化類縁体配位子分子は式 （式中　Ｘ＝ＯまたはＮＨ； 式中　Ｒａ　”’　（ＣＨｚ　）−Ｃｏｗ　ＲｓＲｚ＝Ｈまたは　Ｃ，−Ｃ，低 級アルキル、及び式中波線は立体化学異性体の両方を示し、ｎは１〜８の整数で ある） によって表される。

類縁体配位子加水分解遷移状態分子はそれ自身配位子、たとえ反応性がなくても 配位子であり、本発明において考慮されているものである。これらの配位子分子 は比較的小さな分子サイズを有し、従って典型的には、受容体分子の生産を誘導 する免疫原として用いるとき、より大なる担体分子に結合させるが、阻害剤分子 として単独に用いる場合もある。かかる比較的小さな分子は通常ハプテンと称せ られる。

これらの類縁体配位子分子はまた免疫原として使用するために担体にハブテン類 縁体配位子分子を結合させる手段を与える反応性メルカプタン、サクシンイミド 、他の基等の結合原子または基を典型的には含有する。

上記類縁体配位子分子に構造的に相当する例示的反応体配位子分子は式 （式中、Ｘ、Ｒ，及びＲ１は前記と同義である）によって表される。

本発明の抗体結合部位含有分子はそれ自身受容体（レセプター）であり、抗体結 合部位含有分子（受容体）と同様のもしくは等しいエピトープＨＭを含有する異 なる構造の配位子の間で形成される受容体−配位子複合体の分子内反応性パター ンの研究を通して抗体−ハブテン相互作用のコンフォーメーション優先の情報を 与える。

特定のアミドもしくはエステルの加水分解遷移状態に結合するモノクローナル受 容体分子を製造する方法も意図される。ここで、加水分解遷移状態類縁体を含有 する前述のハブテン類縁体配位子分子は担体に結合した免疫原複合体として提供 される。このように提供された複合体を生理的に許容し得る希釈液に溶解もしく は分散して接種物を形成させる。接種物を注射によってハプテン類縁体配位子に 対する抗体を誘導するのに十分な量はど適当な非ヒト哺乳動物宿主に導入する。

誘導された抗体を回収する。回収された抗体を該免疫化するハプテン配位子類縁 体に結合する（と免疫反応する）能力についてアッセイする。その抗体が免疫化 ハプテン類縁体配位子に結合する動物の肺臓からのものの如き免疫グロブリン生 産細胞を集め、ミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマ細胞を形成する。ハ イブリドーマ細胞を培養培地で増殖し、増殖させたハイブリドーマ細胞からの上 清培地を免疫化するハプテン類縁体配位子に結合する抗体の存在についてアッセ イする。

その上清がかかる結合性抗体を含有するハイブリドーマ細胞をついでそれらの細 胞のどれが基質配位子を立体特異的に加水分解する抗体を分泌したかを決定する ためにスクリーニングする。その分泌抗体が免疫原に結合し、反応体配位子に結 合し、反応体配位子を加水分解するハイブリドーマ細胞を、培養培地上清からま たはハイブリドーマを導入した宿主哺乳動物の腹水から目的とするモノクローナ ル抗体を得るために、クローン化する。

上記モノクローナル抗体は本発明の受容体として用いることができる。別法とし ていわゆる抗体のＦｃもしくはＦｃ’部分を酵素切断によって除去してそれぞれ ＦａｂもしくはＦ（ａｂ’）ｚ抗体部分等の免疫化ハプテン類縁体配位子に結合 する抗体結合部位（遺伝子型含有ポリアミド）を提供することができる。

本発明はいくつかの利益及び有利さを提供する。１つの利点はその結合部位位相 の必要条件が研究対象の特定の反応抗体配位子向けに仕立てられ、かつその配位 子の唯１つの異性体における予め選ばれた結合を加水分解する受容体の製造であ る。

本発明の別の利点はアミドもしくはエステル配位子を配位子の唯１つの立体異性 体の予め決められた部位で加水分解し、また触媒作用を示す受容体の製造である 。

本発明の利点は、生産し得る受容体が立体特異性を有するので、複数の異なる加 水分解性結合を含有する配位子、例えばＤ及びＬアミノ酸残基の両方を含有する ポリペプチドもしくはタンパク質を予め選ばれた特定の加水分解性結合のところ で加水分解できることである。

本発明のさらなる別の利点は合成中もしくは合成後の異性体混合物中の唯１つの 立体異性体からブロッキング基を選択的に除去し、それによって目的とする立体 異性体のそれぞれ回収もしくは使用を容易にする受容体の提供である。

本発明のさらに別の利益及び利点は以下の議論から当業者に明白となるであろう 。

の−　な蕾′木 １１入 本発明は反応体配位子エステルもしくはアミドの加水分解のための反応配列にお ける遷移状態の立体化学及びコンフォーメーションを模倣する反応体配位子カル ボン酸アミドもしくはエステルの類縁体によって誘導された抗体及び遺伝子型含 有ポリアミド（抗体結合部位もしくはバラトープ）部分である、集合的に受容体 と称せられる分子に関する。この受容体分子（抗体及び抗体結合部位）は類縁体 配位子０１つの立体異性体及び反応体配位子０１つの立体異性体に結合し、反応 体配位子の予め選ばれた部分の加水分解遷移状態を安定化すると考えられ、それ によって反応体配位子の唯１つの立体異性体に対し触媒活性を示す。

抗体及び酵素は共にその機能が特定の目標分子に結合する能力によっているタン パク質である。

酵素反応においては酵素の基質への結合が典型的には化学的触媒作用をもたらす のに対し、非触媒的複合体が抗体−抗原結合の通常の結果である点において、酵 素反応は免疫反応と異なる。

酵素はタンパク質と結合して加水分解反応の遷移状態を安定化することによって タンパク質の加水分解を触媒すると考えられている。酵素反応の速度は、反応の 遷移状態を安定化する、すなわち遷移状態の自由エネルギー、従って反応の自由 活性化エネルギーを減少する酵素の能力によって、非酵素反応の速度に比例して 増加すると考えられている〔ジエンクス、Ｈ，Ｐ、＋　Ａｄｖ、　Ｅｎｚｙｓｉ ｏｌ−ＯｇＶ　＋土３，２１９　（１９７５）及びポーリング（Ｐａｕｌｉｎｇ ）、Ｌ、。

Ａｓｅｒ、　５ｃｉｅｎｔｉｓｔ、３６．　５８　（１９４８）　）　、この理 論の支持は仮定された遷移状態を表出するものと考えられる物質が競合阻害剤と しての酵素にしばしば強く結合するという観察から得られる。

ラインハード（１，ｅｊｎｈａｒｄ）　、　Ｇ、、　５ｃｉｅｎｃｅ＋１８０． 　１４９　（１９７３）及びウォルフユンデン（Ｗｏｌｆｅｎｄｅｎ）、　Ｒ， 、Ａｃｅ、　Ｃｈｅｗ、　Ｒｅｓ、、　５　。

１０（１９７２）。さらに酵素は対応する基質や生産物に結合するよりもより強 く反応体の遷移状態形体（ｇｅｏｍｅｔｒｙ）に結合することによって反応自由 エネルギーの低下を成し遂げていると考えられる。

このことは酵素の固有結合エネルギーが基質や生産物の結合から測定できるより はるかに大きいことを意味する９本質的には、酵素の結合エネルギーは化学反応 を行うのに利用される〔ジエンシス、Ｗ、　Ｐ、、χＶＩＩ　Ｉｎｔｅｒｎａｔ ｉｏｎａｌ　５ｏｌｖａｙ　Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ　（第１７回国際ソルベー会 ＩＩ）（１９８３年１１月）〕。

談話による提案は遷移状態の適当な類縁体に最適に結合するよう調えられた抗体 は触媒として機能するであろうということである。前述した論文におけるレルネ ル及び共同研究者及びシュルツ及び共同研究者によるこの結果の実証は酵素機能 と抗体構造の相間々係を樹立し、人工酵素を考え出す有用なアプローチを提供す る。

ここに記述した免疫学的加水分解の背後にある基本的概念は、特定の反応体配位 子への結合において、アミドもしくはエステル結合の加水分解の遷移状態に優先 的に結合してそれによってそれを安定化する、予め定められた特異性を有する抗 体を調製するのに、類縁体配位子を用いることを企画していることである。類縁 体配位子は加水分解における高エネルギー遷移状態のコンフォーメーションに似 た形を取り（ｓｔｓ＋ｕｌａｔｅ）　、関連基質に結合し、それらの加水分解を 安定化する能力を有する抗体の産生を誘導する。

かかる優先的結合及び安定化は加水分解反応のための活性化エネルギーを減少さ せ触媒作用のための基準に適合させる。この性質を示す抗体は、結合の加水分解 を受ける基質反応体配位子の結合特性に似るように化学的に修飾した合成類縁体 で免疫化することによって、すなわち特定の反応の遷移状態類縁体で免疫化する ことによって得ることができる。

加えて、本発明の受容体分子はまた他の点では等しい反応体配位子分子の立体異 性体対の一方に結合し、これのみを加水分解する。かくして、反応体配位子が鏡 像体である場合には、鏡像体の一方のみが加水分解される。同様に、反応体配位 子がシス及びトランス形の両方で存在する場合には、それらの異性体の一方のみ が加水分解される。

本発明の受容体分子は立体特異性を示すので、類縁体配位子及び反応体配位子は 共に２つの立体異性体形態で存在できる少なくとも１つの炭素原子、すなわち立 体異性体中心を含有する。立体異性体中心は、類縁体配位子及び反応体配位子分 子の各々において、類似の分子中の他の原子に関して同じ位置に位置している。

このように、立体異性体中心が、鎖中で、類縁体配位子の酸部分におけるリン原 子から４原子離れて存在する場合には、立体異性体中心が、鎖中で、反応体配位 子の切れやすいカルボニル炭素から４原子離れて存在している。

類縁体配位子分子及び／または反応体配位子分子は１つより多い立体異性体中心 を含有することができることが注記される。かかる第２、第３等の中心が受容体 分子によって結合されないほどの、切れやすいカルボニル炭素（もしくはリン原 子）からの距離に位置している場合にはここでは問題外となる（ｉｓ　ｏｆ　ｎ ｏ　ｍａｔｔ−ｅｒ）。しかしながら、受容体分子によって結合されるほど十分 近くに存在する場合には、他の立体異性体中心のいずれも別の立体異性体を生産 する。かかる異性体の数は成敗−２”　（ここでｎは立体異性体中心の数である ）によって決定される。

その少なくとも１つの立体異性体中心はエステルもしくはアミド反応体配位子及 び類縁体配位子のカルボン酸、アルコールもしくはアミン部分にあることができ る。反応体配位子及び類縁体配位子分子中に１より多い中心が存在する場合には これらの複数の立体異性体中心は切りやすいカルボニル炭素原子（または中心リ ン原子）のあたりに望まれるようにして分布することができる。

中心の四面体リン原子によって提供される立体異性はここでは考慮されない。

本発明の受容体分子は立体異性体対の混合物中に、もしくは反応体配位子分子の 別の対として存在する一対の立体異性体反応体配位子分子の少なくとも１つの加 水分解を区別し、立体選択的に触媒する。より好ましくは、受容体分子は反応体 配位子分子の立体異性体の一方のみを区別し、その加水分解を触媒する。

接触加水分解の上記立体選択性は、立体異性の位置、すなわち立体異性体中心が 反応体配位子中で加水分解される結合（切れやすいカルボニル炭素）の十分近く に存在し、その結果、立体異性体中心が触媒抗体結合部位含有分子によって結合 され、かくして受容体分子が唯１つの立体異性体及び反応体配位子及び類縁体配 位子の両方の同じ立体異性体（ＲもしくはＳ）に結合することを想定している。

加水分解される結合の位置は類縁体配位子のリン原子（及び反応体配位子の類似 の切れやすいカルボニル炭素）の位置及び抗体結合部位の大きさによって決定さ れる。抗体結合部位は通常約５〜約７のアミノ酸残基を収容することができると 考えられている。

立体異性体中心は類縁体配位子のリン原子（反応体配位子の切れやすいカルボニ ル炭素）の各側で１〜約４のアミノ酸残基（約１２原子の鎖長）及びより好まし くは１〜約２のアミノ酸残基（約６原子の鎖長）によって占められた容量内にあ る。このように、立体異性体中心はカルボン酸アミドもしくはエステル反応体配 位子の切れやすいカルボニル炭素のカルボン酸部分にまたはアミンもしくはアル コール部分に存在することができる。ここで用いられた例示的立体異性体エステ ルにおいては、立体異性体中心は分子のアルコール部分に存在する。

この距離は空間充填モデル（ｓｐａｃｅ−ｆｉｌｌｉｎｇ　ｍｏｄｅｌｓ）の使 用によって容易に決定できるが、疑義がある場合には触媒受容体が類縁体配位子 の立体異性体を分割するか分離することができるかどうかを単に決定することに よって決定できる。もちろん、究極的なアッセイは触媒受容体分子が１つの異性 体を加水分解するが他方の異性体を加水分解しないかどうかである。

幾何異性体が関与する場合は、立体異性体中心は鏡像体の場合と異なり単一の原 子ではないことが理解されるべきである。むしろ、その中心はその数がシス／ト ランス異性体を定義するのに必要とされる原子の数によって支配される一群の原 子に亘って存在する。しかしながら、ここでは表現上は異性体中心はそれが鏡像 体が含まれるキラル原子のような単一の原子であるかの如くここでは述べる。

すでに注記した如く、類縁体配位子及び反応体配位子は１対の立体異性体の１つ である。これらの立体異性体は幾何異性体か光学異性体、すなわち鏡像体である 。幾何異性体は環状分子中にもしくは二重結合が存在する場合に見い出されるシ ス／トランス異性体である。光学異性体は立体異性中心がその炭素原子がキ°ラ ル炭素原子であるゆえにキラル中心と称せられる鏡像体のｄ、ｊｌまたはＲ，Ｓ 対である。

後で論する例示的触媒反応においては、反応体配位子立体異性体は鏡像体Ｒ，Ｓ 対である。この例示的研究で用いられた類縁体配位子は２つの鏡像体を含み、反 応体配位子のＲもしくはＳ形を立体選択的に加水分解する受容体分子の生産を誘 導したが、鏡像体配位子の１つのみが鏡像体反応体配位子の唯１つの生産を誘導 するのに利用されたことが理解されるべきである。

抗体が結合した反応体配位子のエステルもしくはアミド結合を加水分解する機構 は「誘導適合」モデルによって考えることができる。

ゆるく結合した基質がゆがみもしくは再配列して抗体の結合構造（ｂｉｎｄｉ’ ｎｇ　ｇｅｏｓ＋ｅｔｒｙ）に適合するにつれて、予め決められたアミドもしく はエステルの単結合の化学的再編成（ｒｅｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）によって 応力が軽減されるが、この再編成によって結合の加水分解が起こる。

ここにおいて「受容体」は反応体配位子、阻害剤配位子もしくは類縁体配位子に 結合する生物活性分子を意味するものとして用いられる０本発明の受容体分子は 抗体、実質上完全な（ｉｎｔａｃｔ）抗体または抗体の遺伝子型含有ポリアミド 部分である。

受容体分子の生物活性はその抗原反応体配位子、阻害剤配位子よって実証される 。好ましくは受容体は約５〜約９のｐＨ範囲及び蒸留水から１モル塩化ナトリウ ムまでのイオン強度でも抗原配位子に結合する。

抗体の遺伝子型含有ポリアミド部分（抗体結合部位）は遺伝子型を含有する抗体 分子の部分であり、配位子または類縁体配位子に結合する。かかる部分は周知の 酵素的切断技術によって抗体から調製したＦａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）ｚ 断片を包含する。

例えば一般的にはチオフィロボウロス（Ｔｈｅｏｆｉｌｏｐｏｕｌｏｓ）及びデ ィクソン（Ｄｉｘｏｎ）、米国特許４３４２５６６及び具体的にはポラツクら（ Ｓｃｉｅｎｃｅ、、２Ｕｉ、１５７０　（１９８７）３　ｍボラフクらばＦａｂ 断片についての加速された加水分解速度はもとの（ｎａｔｉｖｅ）　Ｉ　ｇのそ れと同じであったと報告している。遺伝子型含有ポリアミドが得られる抗体が免 疫原に対して高められ（ｂｅ　ｒａｉｓｅｄ）もしくは誘導されたように記述さ れている限り、切断工程が抗体から遺伝子型含有ポリアミドを得るのに典型的に 必要とされるという理解で、遺伝子型含有ポリアミド（抗体結合部位含有）受容 体は「高められた」もしくは「誘導された」ものとして論ぜられる。

しかしながら完全な抗体が好ましく、本発明の受容体分子の例示に用いられる。

本発明において有用な受容体はモノクローナル抗体である。

「モノクローナル抗体」はただ１種の受容体分子を分泌するハイブリドーマと呼 ばれる単一細胞のクローンによって生産される受容体である。ハイブリドーマ細 胞は抗体産生細胞とミエローマ細胞もしくは他の自己永存性細胞系から融合され る。

本発明のモノクローナル抗体を製造する技術は周知である。このような受容体は コーラ−（Ｋｏｈｌｅｒ）及びミルシュタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）、　Ｎａｔ ｕｒｅ、２５工、４９５　（１９７５）にはじめて記述された。この文献をここ に参考に加入する。モノクローナル抗体は典型的にはハイブリドーマ組織培養物 からまたはハイブリドーマ組織を導入した動物から得られる腹水から得られる。

両方の方法をここに記述する。

「配位子」はここでは受容体分子の抗体結合部位と免疫反応するかそれに結合す る分子として定義される。２つの型の配位子がここでは意図される。１つは類似 体配位子と称せられ、受容体分子の製造を誘導する免疫原として及び受容体分子 が触媒する反応の阻害剤として用いられる。類似体配位子は実質上触媒反応を受 けるのに不活性である。もう１つは反応体配位子または反応体配位子物質と称せ られ、触媒反応を受ける分子である。

ここに記述される如く、アミドもしくはエステル結合の加水分解における遷移状 態のコンフォーメーションをまねるように特定の予め決められた部位でホスホン アミデートもしくはホスホネート部分を導入した。アミドもしくはエステル配位 子の化学的類縁体を合成する。かかる類縁体はこの研究のための適当な候補者で ある。その理由はホスホンアミデートはタンパク分解酵素の阻害における遷移状 態類縁体として用いられてきたものであるからである〔バートレットら、Ｂｉｏ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２２．４６１８（１９８３））。

短いポリペプチド鎖は、相同タンパク質を認識し、これに予め決められた特定の 部位で結合する抗体の産生を誘導する。本発明はポリペプチドに関する以前の研 究を進めるものである。抗体（受容体）は免疫化するハブテンとしての第１の分 子（類縁体配位子）の１つの立体異性体によって誘導され、第１の分子のみなら ず第２の関連分子（反応体配位子）の１つの立体異性体にも結合する。第２の分 子の結合に際して、受容体は免疫化ハブテン第１分子の位相に位相において相当 する予め選ばれたエステルもしくはアミド結合の加水分解（ここで実証されるご とく触媒的である）を引き起こす。位相、すなわちサイズ、形、立体化学及び電 荷における対応は配位子の加水分解が起こる部位を予め選択する手段を提供する 。類縁体配位子または反応体配位子の構造に類似した阻害剤配位子も受容体分子 に結合する。

従って、比較的小さな免疫化ハプテン類縁体配位子の合成によって、複数のアミ ドもしくはエステル結合を含有していてもよい別の分子中のエステルもしくはア ミド結合を認識し、それに結合し、触媒的に切断する受容体分子の産生を誘導す ることができる。

かくして、前記したような遺伝子工学的手法により作られた融合タンパク質等の タンパク質もしくはポリペプチドの選ばれた予め決められたアミド結合の加水分 解を立体選択的に引き起こす受容体を製造できる。同様にモデル化合物もしくは 脂肪分子の選ばれた予め決められたエステル結合を立体特異的に及び触媒的に加 水分解する受容体を製造することができる。

この結果の意味するところは、これまで知られていなかったプロテアーゼやリパ ーゼの免疫グロブリンに対すや活竺を与えることができるということである。さ らに、アミどもしく眸エステル結合が免疫化のために用いられたハプテン類縁体 配位子におけるホスホンアミデートもしくはホンホネート立体配置で切断される ように指定する（ｄｅｓ　ｉｇｎａ　ｔｅ）ことによって、抗体の活性を意図的 に任意の予め決められた部位に指向させることができる。

このように、抗体及び抗体の遺伝子型含有ポリアミド部分をハブテンエステルも しくはアミド類縁体配位子加水分解遷移状態分子によって誘導する。ハブテン分 子は（ａ）１１似のエステルもしくはアミドのカルボン酸部分の炭素原子、（ｂ ）２つの酸素原子及び（Ｃ）第３の酸素原子または窒素原子に直接結合した四面 体的に結合した中心リンもしくはケイ素原子を含有する。ここで第３の酸素原子 または窒素原子は配位子の類似したエステルもしくはアミドのアルコールもしく はアミン部分の炭素原子（α炭素）に結合している。

■　エスール　”の゛　ヒ　びハブーン（、ｆＬｇ類縁体配位子の設計は模倣さ れる結合形成のための遷移状態を通して生成する生産物の構造から出発して類縁 体配位子へと進行する。アミドもしくはエステルの加水分解を含む反応は一般的 概念の説明的例を与え、エステルもしくはアミドの加水分解反応についての例と してここに用いる。

て特徴づけられる。従って、アシル基はこの遷移状態で変化する程度の四面体的 性格を存する可能性がある。Ｗ、Ｐ、ジエンクス。

Ｃａｔａｌｙｓｉｓ　ｉｎ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｅｎｚｙａ＋ｏｌｏ ｇｙ　＋　ｃｂ、１　（Ｌ　（マクグロウヒル、ニューヨーク、１９６９）、） ランスアシル化反応を触媒する酵素はアシル中心のあたりに四面体立体配置を有 する反応体配位子の類縁体とよく結合すると考えられる。このことはアミドもし くはエステルの直接的水和を触媒する酵素のみならず、配位子（基質）と酵素の 間の共有結合が一時的に形成されるセリンプロテアーゼについてもあてはまる〔 ウェステリツク（ｆｌｅｓｔｅｒｉｋ）ら、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｗ、、　２ 　４二し、　８１９５（１９７２）ｉＲ，Ｃ，）ンブソン（Ｔｈｏｓｐｓｏｎ） 、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＋−１−？−，４７（１９７３）及びインペラリ 　（Ｉｓｐｅｒａｌｉ）　ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＋　２５　＋　３７６ ０（１９８６））、前者の部類は切れやすいアミド単位の代りにホスフェート、 ホスホネートもしくはホスホンアミデート基を含有する四面体立体配置を有する 化合物によって阻害される〔ウェーバ−ら、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、、上土 工、１１９　（１９７７）及びジャコブセン、Ａｃｃ、　Ｃｈｅｗ、　Ｒｅｓ、 、上５，２３２（１９Ｂ２））。

遷移状態類縁体の完全な像（ρ１ｃｔｕｒｅ）は金属イオンもしくはある他の極 性化する部位に対する配位子として阻害剤のホスホノ基を有しているかもしれな い〔ライ−バーら、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、＋上上土。

１１９　（１９７７）及びクリスティアンソン（Ｃｈｒｉｓｔｔａｎｓｏｎ）　 ら、Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｗ、　Ｓｏｃ、　、１０８．　５４５　（１９８６） 　）、しかしながら、金属ペプチダーゼ中の金属イオンの役割はよく分っていな い、それは四面体中間体の間でのプロトン移動工程が速度制限的となる可能性が あるアミド加水分解において多様な機能を有しているかも知れない（Ｌ、　Ｍ、 セイル（Ｓａｙｒｅ）、Ｊ、＾ａｈ、　Ｃｈｅ＋ｓ、　Ｓｏｃ、。

カルボン酸エステルの加水分解は遷移状態のホスホネート含有類縁体によって近 づけられる（ｂｅ　ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｄ）べきトランスアシル化のより簡 単な例である。荷電したホスホネート基の結合は触媒作用につながる遷移状態の 安定化相互作用を説明するがも知れない、エステル加水分解反応は一般に抗体に 適した周囲条件で都合のよい自然な速度で進行する。従って何らかの小さな速度 の加速も容易に検出し得る。

この研究のための類縁体配位子及び反応体配位子の構造はある基準に従って選ん だ、これらは有機リン前駆体及び対応するカルボン酸基質の入手可能性及び安定 性、その製造のための化学合成の便宜性、及び免疫学的提示（ｐｒｅｓｅｎｔａ ｔｉｏｎ）のための種々の機構への適合を包含した。

立体選択的接触加水分解のために必要な特徴を備えた基本分子構造は下記式！で 表される置換フェニル酢酸エステル類縁体−（化合物Ｆ）である。

ためにここで用いられる！！縁体配位子である。化合物Ｆは免疫化のための抗原 担体への結合（ｃｏｕｐｌｉｎｇ）前の形態で示されている。

化合物Ｆは２つの立体異性構造（Ｒ及びＳ）が可能であることを示すメチン炭素 上に星印（★）を付した立体異性中心によりラセミ形Ｌｉ　（ｒａｃｅｍｉｃ　 ｓ＋ｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）として存在することが注意されるべきである。

化合物Ｆの酸部分における如＜、類縁体配位子の酸またはアミンもしくはアルコ ール部分にアミノ置換基を含ませることによって、類縁体配位子に抗原（免疫原 ）担体タンパク譬にカップリングさせるための官能付加体（ａ　ｆｕｎｃｔｉｏ ｎａｌ　ａｐｐｅｎｄａｇｅ）を備えさせることができる。かかる加えられた付 加体は類縁体配位子がハブテンである場合に有用である。付加体及び付随したリ ンカ−原子は反応体配位子に存在していてもよ（、特に反応体配位子が比較的小 さくて抗体結合部位が配位子によって比較的にふさがれ得る場合には存在してい てもよい。

かくして本発明は一般に反応体配位子の１つの立体異性体の予め選ばれたアミド もしくはエステル結合を触媒的に加水分解できるモノクローナル受容体に関する 。受容体は、（ａ）反応体の予め選ばれたエステルまたはアミド結合の四面体加 水分解遷移状態を形成することができる反応体配位子（すなわち予め選ばれたカ ルボン酸アミドもしくはエステル結合を含有する）の１つの立体異性体、及び（ ｂ）反応体配位子に立体化学的にＮ４Ｑし、反応体配位子の予め選ばれたエステ ルまたはアミド結合の切れやすいカルボニル基炭素原子によって占められる位置 に位置した四面体結合したリン原子を有する類縁体配位子の１つの立体異性体に 結合する抗体結合部位を含有する。四面体的に結合したリン原子は（＋）　少な くとも５原子、より好ましくは少なくとも１５原子、もっとも好ましくは少なく とも１５原子と置換したフェニル基を含有する鎖に包含される類似の反応体配位 子エステルまたはアミドの酸部の炭素原子（α炭素）、 （ｉｉ）　２つの酸素原子であって、その一方は酸素がオキソ基である二重結合 によってリン原子に結合し、他方がリン原子に単結合し、及び水素及びＣＩ　Ｃ ｄ低級アルキルよりなる群から選ばれた基に単結合した２つの酸素原子、（ｉｉ ｉ）　’ＩＩ似したエステルまたはアミドの炭素原子、すなわち少な（とも５原 子、より好ましくは少なくとも１５原子、及びもっとも好ましくは少なくとも１ ５原子及び置換したフェニル基を含有する鎖の部分である、エステルまたはアミ ドのアルコールまたはアミン部分の炭素に結合した第３の酸素原子または窒素原 子 に直接結合している。

環状アミドまたはエステルが反応体配位子である場合には、明確な分子の酸及び アミンもしくはアルコール部分はない、しかしながら、有機化学における熟練者 はアミドやエステルが定義上酸及びアミンもしくはアルコール部分を含有しなけ ればならないことを理解するであろう、かくして、その分子の酸部分において少 なくともカルボニル炭素及びそれが直接結合したα炭素を含み、その分子のアミ ンまたはヒドロキシル部分においてアミノもしくはヒドロキシ基及びそれが直接 結合したα炭素を含む想像上の境界線をそのような分子について引くことができ る。もちろん、このような環状化合物も触媒受容体分子によって結合される反応 体配位子部分に含まれる立体異性体中心を包含する。

別の態様において、本発明は反応体配位子分子中の予め選ばれたエステルまたは アミドを接触的に加水分解する立体選択的方法に関する。この方法は（ａ）水性 媒体中で触媒的に有効な量の上記受容体の１つと立体異性体中心を含有する反応 体配位子分子とを混合し、ついで（ｂ）混合物を配位子分子が受容体に結合し、 受容体分子が反応体配位子の可能な立体異性体の１つの予め選ばれた結合を加水 分解するに十分な時間維持する工程よりなる。この加水分解の生産物はついで必 要に応じ回収することができる。

受容体分子を誘導するのに用いる類似体配位子と同じ立体配置を有する反応体配 位子が用いられることが理解されるべきである。

１つの立体異性体が反応するが、反応体配位子の立体異性体対を用いることがで きる。

本発明の加水分解方法は反応混合物の一部として水性媒体を用いる。この媒体は 典型的には水及び緩衝剤塩を含有する。加えて、媒体はタンパク質含有媒体中に しばしば見い出される水溶性カルシウム及びマグネシウム塩のみならず、塩化ナ トリウム等の他の塩を含有することができる。メタノール、エタノール、アセト ニトリル、ジメチルスルホキシド、ジオキサン、ヘキサメチルホスホルアミド及 びＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド等の有機溶媒も存在させることができる０反応 体配位子及び受容体分子を乳化させる界面活性剤も存在させることもできる。水 性媒体中に存在する成分の臨界的特徴はこれらの成分が受容体分子の変性によっ て接触反応に実質上干渉せずまたはそれを阻害しないことである。さらに、水性 媒体は受容体分子によって触媒される結合切断反応を阻害する塩、−ＩＩ的にタ ンパク質及び具体的には酵素を実質上台まない。

水性媒体は典型的には約５−約９のｐＨ値及び好ましくは約ｐＨ６、〇−約ｐＨ ８，０を有する。再び触媒反応が実質上干渉されずまたは阻害されない限り上述 より大きな及び小さなｐＨ値を用いることができる。

接触反応は典型的には周囲室温で、すなわち約２０−約２５℃でまたは３７℃で 及び周囲大気圧、すなわち約１気圧で行う、しかしながら、大気圧で水性媒体の 凝固点あたりまで下がった温度や媒体の沸点あたりの温度も用いることができる 。既知のごとく、受容体分子等のタンパク質は水性媒体が沸騰する温度、例えば 約１００℃等の高い温度では変性する傾向があるので、約４０℃より低い温度が 好ましい９周知の如く、多分子運動式（ｍｕｌｔｉｍｏｌｅ−ｃｕｌａｒ　ｋｉ ｎｅｔｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ）に従う反応は温度が減少すると速度が減 少する。従って、最低温度は約１５℃であることが好ましい。

反応体配位子は水性媒体中でその溶解度までの量で反応混合物中に存在させる。

不溶性反応体配位子を含有する２相系も用い得るが、通常はそう用いない０反応 体配位子の通常用いられる濃度は約０．１μＭから約１０ｍＭであるが、この量 は溶媒媒体中における反応体配位子の溶解度の関数でもある。生産物自体が望ま れる場合には、反応機構または反応動力学を研究する場合のより低い濃度に比べ 、比較的高い濃度を用いる。

有効量の受容体分子も存在させる。その有効量は典型的には触媒量である。すな わち、受容体は反応体配位子に対するモル比として約１：２〜約１：１００００ で用いられ、約１：１０〜約１：１００のモル比が好ましい０反応体配位子に対 する受容体分子の比は典型的には反応体配位子に対する受容体分子の比活性及び 反応を行う使用者の目的による。従って、生産物を目的とする場合は受容体の比 較的より高い濃度及び反応体配位子に対するより高い受容体比が用いられる０反 応の反応機構または動力学を研究する場合には、より低い濃度及び比を典型的に は用いる。化学量論量以下の受容体も用いることができるが、受容体は触媒分子 なので、化学量論量の使用さえ無駄である。従って、少なくとも触媒量の受容体 を用いる。

受容体分子と反応体配位子を水性媒体中で混合することにより形成された混合物 は立体特異的結合及び反応が起こるに十分な時間保持する。保持時間の持続は反 応からめられるもののみならず、選ばれた受容体及び反応体配位子、それらの濃 度、ｐＨ値及び温度をはじめとするいくつかのパラメーターの関数である。

かくして、動力学的研究を行う場合には数分から数時間の保持時間がしばしば用 いられる。反応生産物を目的とする場合、数時間〜数日の保持時間がより多く用 いられる。

■、結果 ＫＬＨに共有結合したエナンチオマー化合物Ｆを免疫原性コンジュゲートとして 使用し、マウスを免疫化した。ハイブリドーマは、免疫化した動物からの肺臓細 胞を使用して調製した。

Ｉ２のハイブリドーマを調製し、それらが分泌する化合物Ｆに結合したモノクロ ーナル抗体（レセプター）は、ＥＬＩＳＡアッセイにおいてＢＳＡに結合した。

これらの結合相互作用のそれぞれは、該レセプターを溶液中の遊離の化合物Ｆと 予めインキュベートすることにより阻害され、これにより観察されたＥＬＩＳＡ 結合は、結合したハプテン性アナログリガンドに特異的なものであることが示さ れた。

これらの１２のモノクローナルのうち、以下に挙げる８つのモノクローナルレセ プターが例としてのエナンチオマーエステル反応体リガンド化合物Ｈ（Ｒ，Ｓ） を触媒的に加水分解することができた。これらの８つの触媒的レセプターのうち 、２つは５（−）反応体リガンド、化合物Ｈ［Ｓ　（−）　）のみの加水分解を 触媒し、その他の６つはＲ（＋）反応体リガンド化合物Ｈ［Ｒ（＋）　）の加水 分解のみを触媒した。これらの立体選択的加水分解に使用した特異的条件は以下 に記載する。

ひとつのエナンチオマーを加水分解するレセプター分子は他のエナンチオマーの 加水分解を触媒しないということが強調されるべきである。また、化合物ＨのＲ （＋）とＳ　（−）との両方のエナンチオマーの加水分解を触媒するレセプター は見られなかったということも強調されるべきである。

化合物Ｆ及びＨｌならびにそれらの合成における中間体の構造を、本明細書中に 含まれる種々の合成についての記載とともに以下に示す。

上記のような立体選択的触媒的加水分解は、今までに最初に報告されたこのよう な加水分解であると考えられる。また、立体異性体対、ここではエナンチオマ一 対を構成する個々のもののそれぞれの反応を立体選択的に触媒することができる 別々の抗体結合部位を有するレセプター分子の調製についてもこれが初めての報 告であると考えられる。即ち、前に指摘した文献、Ｎａｐｐｅｒ　ａｔａｌ、、 　５ｃｉｅｎｃｅ、　１ユ１：　１０４１　（１９８７）及びＨｉｌｖｅｒｔ　 ｅｔａｌ、、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳ　Ａ、　ＪＬ Ｌ：　４９５３　（１９８８）は両方とも２つの立体異性体基質分子の一方のみ の反応を触媒するレセプター分子の調製を報告するものである。

本明細書中で報告する結果は、従って、２つの先行特許出願及び上記のＮａｐｐ ｅｒ　ｅｔ　ａｌ、の文献を補完するものである。その補足性は、以前に報告さ れた加水分解と比較して、立体選択的加水分解において見られ、また反応体リガ ンドの立体異性体のそれぞれの反応を触媒することができる個々のレセプター分 子の獲得においても見られる。

加水分解反応の動力学の研究を開始した。最初に得られた結果によると、この加 水分解は比較的速く、この反応体リガンド分子の生成物酸による生成物阻害があ る程度みられる。

■、口′ｊガン−゛１ガン′のｔ 以下、本明細書に記載する合成は、ただ一つの反応体リガンドとしてのカルボン 酸エステルと、アナログリガンドとしての一つのホスホネートに関するものであ る。しかし、これらの合成は単に反応体を置換することによって容易に異なるエ ステル及びホスホネート化合物に適用することができる。カルボン酸アミド反応 体リガンド及びホスホンアミドアナログリガンドも、本明細書で使用したものに 換えて適当な反応体を使用することによって記載されたものに１Ｍ４ＱＩの手順 により容易に調製することができる。

止血を人 攪拌した５−のメチレンクロリド（水素化カルシウム上で新たに蒸留したもの） 中のジエチル４−アミノベンジルホスホネート（０，７４ｇ＋　３．０４ｍＭ） の溶液に、ピリジン（０，３２ｍ、４ｍＭ）を加えた。混合物を４℃に冷却し、 トリフルオロ酢酸無水物（０，５ｄ、　３．５４ｍＭ）を５分間で撹拌した溶液 に滴下して加えた。

攪拌を１５分間継続し、この間に溶液は室温（約２３℃）となるままにした０反 応の終了は、メチレンクロリド（ＣＨ，Ｃ１Ｚ　）と酢酸エチル（ＥＴＯＡＣ） との１：ｌの混合物を溶出液とした薄層クロマトグラフィーにより示された（Ｒ ｆｏ、２）。

溶液をその後５０−の酢酸エチルで希釈した。有機溶液を０．５ＭのＨＣｌの２ ５−で連続的に２回洗浄し、その後無水硫酸マグネシウム上で乾燥した。蒸発に より黄色油状物が得られ、これをメチレンクロリドと酢酸エチルとの１＝１の混 合物を溶出液としたシリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィーにより精製し た。

ホスホネート（化合物Ａ）を無色結晶物質として得た（０．８７７ｇ、８５％収 率）。

ＣＤ（１！！中１００ＭＨｚ（内部標準としてのＴＭＳに対して）でのプロトン ＮＭＲ：δ１０．６１（広い一重線、ＩＨ）、７．５３（二重線、Ｊ＝８．２２ Ｈｚ、２Ｈ）、７．１７　（二重の二重線。

Ｊ＝８．６７Ｈｚ及び２．５Ｈｚ、２Ｈ）　、　４．０２　（Ｐ、Ｊ＝７．１８ Ｈ２，２（２Ｈ）　）　、３．１０　（二重線、Ｊ＝２１．６２．Ｈｚ。

２Ｈ）及び１．２６（三重線、Ｊ−７，０５Ｈｚ、２　（３Ｈ）。

進イ１１乱 ２−の乾燥した、新たに蒸留したジクロロメタン（ＣＨ２Ｃｌ２）中の０．２　 ｇ　（５，８８ｘ　１０−’モル）の化合物Ａを含む丸底フラスコに０．８−の トリメチルシリルプロミド（ＴＭＳＢｒ：５．９ＸＩＯ−’モル）を加えた。得 られた混合物を４０℃で３時間攪拌した。

その後溶媒を除去し、白色の固体を得た。この固体をジエチルエーテル中の５バ ーセン）　（Ｖ／Ｖ）の水で処理し、固体を溶解した。放置すると、ホスホン酸 と認められる白色の固体がさらに生成し、これを回収し、乾燥して重量を測定す ると０．１２７４　ｇであった。ＣＨｚ　Ｃｊ！ｚ　／ＥＴＯＡｃ　（１：　１ ．ｖ／Ｖ）を使用したシリカゲル上での薄層クロマトグラフィー（ｔ　１　ｃ） で分析するとホスホン酸は純粋であることが示された。

前記ホスホン酸（０，１２２１ｇ）をメタノール中に溶解し、これにジアゾメタ ンを加えた０反応が起きるのを待った後、溶液の黄色が消えるまで少量のカチオ ン交換樹脂（プロトン型）を加えた。溶媒を除去し、ｃｉ−ｒｘ　（１！を加え て化合物Ｂを溶解し、得られた溶液を濾過して樹脂ビーズを除去した。その後溶 媒を除去し０．１２８７　ｇの化合物Ｂを得た（９５％収率）。

上記のような薄層クロマトグラフィーにより単一生成物であることが示された。

ＣＤＣｌ１Ｓ中１００ＭＨｚ（内部標準としてのＴＭＳに対して）でのプロトン ＮＭＲ：δ８．７８（広い一重線、ＩＨ）、７．４２（多重線、４Ｈ）　、３． ７　（二重線、Ｊ＝１１Ｈｚ、６Ｈ）。

３．１７（二重線、Ｊ＝２０Ｈｚ、２Ｈ）上豆立旦 化合物Ｂ　（０，５０ｇ、１．６　ｘ　１０−’モル）を乾燥クロロホルム４ｄ とともに丸底フラスコに入れ、これに１当量のＰ（ｕｓ（０，０３４ｇ）を加え た。得られた溶液を攪拌しながら４５℃に加熱した。１時間後ｔｌｃ（前述の通 り）により反応が約９５％完了していることが示された。さらに２分の１当量の ＰＣｆ、を加え、反応をさらに１時間維持しこの間に反応が完了したことがｔｌ ｃにより示された。

その後、溶液中に二酸化イオウを吹き込んだ。そして溶媒、揮発物を除去し、残 渣をジエチルエーテルで洗浄し、減圧下に乾燥させた。０．０２５５ｇの化合物 Ｃを回収した。

ＣＤ（１！、中１００ＭＨｚ（内部標準としてのＴＭＳに対して）でのプロトン ＮＭＲ：δ８．５（広い一重線、ＬＨ）、７．４２　（多重線、４Ｈ）、３．８ ６　（二重線、Ｊ＝１４Ｈｚ、３Ｈ）、３．５５（二重線、Ｊ＝２０Ｈｚ、２Ｈ ）。

北イｌ穎叫 ５ｅｃ−フェネチルアルコール（α−メチルベンジルアルコール）のラセミ体（ ｒａｃｅｍｉｃ　ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ　）　（０，１５２ｍ。

１２．６６Ｘ１０−’モル）を乾燥テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中に溶解した 。水素化ナトリウム（０，０３８ｇ、１５．８３ｘｌＯ−’モル）を溶液に加え 、得られた混合物を還流下２時間加熱した。

混合物を室温に冷却した後、０．１０ｇ　（３，１６５ｘｌＯ−’モルの化合物 Ｃを冷却混合物に加え、得られた混合物を５分間攪拌した。

ＴＨＦを除去し、残渣をＥＴＯＡｃ中に希釈した。溶液を０．５Ｍ水性ＨＣｌ及 び飽和塩化ナトリウムで洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。ＥＴＯＡｃを 除去して黄色油状物を得た。この油状物を、ＣＨｔ　Ｃ１ｔ　／　Ｅ　Ｔ　ＯＡ 　Ｃの１０／ｌ、５／１及び３／Ｉ　（Ｖ／Ｖ）のものを溶媒として使用したフ ラッシュカラムクロマトグラフィーで精製して０．０８３　ｇの化合物りを得た く６５％収率）。

ＣＤＣＪｆｆ中１００ＭＨｚ（内部標準としてのＴＭＳに対して）でのプロトン ＮＭＲ：δ９．７２（広い二重線、Ｊ＝１０Ｈ２）。

７．２８（多重線、９Ｈ）、５．４５　（多重線、ＩＨ）、ジアステレオマ一対 ：（３，６５（二重線、Ｊ−１１Ｈｚ＞　、　３．３２　（二重線。

Ｊ＝１１Ｈｚ）、３Ｈ）、ジアステレオマ一対：３．１（２重線。

Ｊ＝２１Ｈｚ）、２．９５　（二重の二重線、Ｊ＝２１Ｈｚ）２Ｈ）。

ジアステレオマ一対：（１，６（二重線、Ｊ＝７Ｈｚ＞、１．４５（二重線、Ｊ ＝７Ｈｚ）３Ｈ）。

止含惣旦 化合物Ｄ　（０，０２５０ｇ、６．２２Ｘ１０−’モル）を撹拌したエタノール 溶液中に溶解した。ナトリウムボロハイドライド（０，０１６１ｇ、７当量）を エタノール溶液に加え、得られた溶液を１時間室温で撹拌した。

次に水酸化アンモニウムの１０％水溶液を上記溶液に加えた。

得られた溶液をＥＴＯＡｃで抽出し、得られたＥＴＯＡｃ抽出物を硫酸ナトリウ ム上で乾燥させた。溶液を除去して０．０１５　ｇの化合物Ｅを得た（約８０％ 収率）。

ＣＤＣ１，中１００ＭＨｚ（内部標準としてのＴＭＳに対して）でのプロトンＮ ＭＲ：δ６．９５（多重線　９Ｈ）、５．４８（多重線、ＩＨ）ジアステレオマ 一対：［３，６２（二重線、Ｊ＝ｌＩＨｚ）、３．３（二重線　Ｊ＝１１Ｈｚ） ３Ｈ：ｌ　ジアステレオマ一対：ｌ：３．０８（二重線、　Ｊ＝２１Ｈｚ）　、 　２．８８　（二重線。

Ｊ＝２１Ｈ２）、２Ｈ］　シアテレオマ一対：［１，５８（二重線。

Ｊ＝７Ｈｚ）、１．４５　（二重線、Ｊ＝７Ｈｚ）、３Ｈ）。

化合物Ｆ（アナログリガンド） 化合Ｉｌ！ｌＥ　（０，０３２ｇ、１．０４６　ｘ　１０−’モル）を３−の乾 燥ＣＨｚ　Ｃ１，を中に溶解し、これにトリエチルアミン（０，０１４５−１１ 当量）を加え、得られた溶液を室温で１０分間攪拌した。

その後グルタル酸無水物（０，０１１０ｇ、１当量）を攪拌を継続しながら加え た０反応の後、ＣＨｚＣＡｚ／メタノール（５／１゜ｖ　／　ｖ　）を溶媒とし て使用したシリカゲル上でのｔｉｅを行った。

反応混合物をＥＴＯＡｃで希釈し、０．５水性Ｈ（ｌを加えた。

その後４モルの水性ＨＣＪを水性部分が酸性になるまで加えた。

有機溶媒層を分離し硫酸ナトリウム上で乾燥し、その後溶媒を減圧下に除去した 。上記の溶媒を溶出液として使用して、シリカゲル上の調製的ｔｉｃにより得ら れた化合物を取得した。

化合物Ｆは、上記で調製した化合物（３２＋＊ｇ）と２−のｔ−ブチルアミンを ６０℃で１０日間、密閉した試験管内で反応させて調製した。溶媒を除去し、生 成物を高速プロティン液体クロマトグラフィーで精製し、ラセミ化合物Ｆを凍結 乾燥により得た６合計２６．３　ｍｇの化合物Ｆが得られた（８５％収率）。

ＤＭＳＯ−ｄ＆中１００ＭＨｚ（内部標準としてのＤＭＳＯに対して）でのプロ トンＮＭＲ：δ９．８（−重線、ＩＨ）、７．３（多重線、９Ｈ）、５．９３　 （多重線、ＬＨ）、２．９８　（二重線。

Ｊ＝２１Ｈｚ）、２．３０　（多重線、４Ｈ）、１．８２　（多重線゛、２Ｈ） 、１．４５（二重線、Ｊ　−７Ｈｚ、３　Ｈ）。

止立笠旦 トリフルオロ酢酸無水物（２，８ｄ）を、１０％水性アセトニトリル中の４−ア ミノフェニル酢酸（１，５ｇ）と炭酸ナトリウム（１，５ｇ）に−１０℃で加え た。溶液を６Ｎ　Ｈ（１（０，２ｄ）で酸性化し、減圧下に濃縮した。ジクロロ メタンとメタノールの９：１の混合物とともにシリカを通して濾過し、１．４ｇ のｐ−トリフルオロアセタミドフェニル酢酸を得た（５７重量％収率）。

クロロホルムとメタノールの５／１混合物（Ｖ／Ｖ）を溶出液として使用してシ リカゲル上で薄層クロマトグラフィーを行い、０６３５のＲｆ（ｉｉを得た。

ＤＭＳＯ−ｄ、中１００ＭＨｚ（内部標準としてのＴＭＳに対して）でのプロト ンＮＭＲニア、３７（二重線、Ｊ＝８．７Ｈｚ、２Ｈ）、７．０２（二重線、Ｊ −８，７Ｈｚ、２Ｈ）、３．３　（−重線。

２Ｈ）。

前記の酸（０，６ｇ）を塩化チオニル中に溶解し溶液を４０℃で２時間加熱した 。塩化チオニルを減圧下に除去して対応する酸塩化物を得た。

ＣＨｚＣ１ｚ中に溶解した０、０４６１ｇ　（３，７７３ｘｌＯ−’モル）の３ （−）ｓｅｃ−フェニルアルコールと０．０５２５−のトリエチルアミン（１当 量）を含む溶液を調製した。この溶液を室温で０．５時間攪拌した。上記で調製 した酸塩化物（０，１０ｇ。

３．７７４Ｘ１０−’モル）を次に加え、さらに１当量のトリエチルアミンを加 えた。酸塩化物の添加により溶液は褐色になり、アミンの添加により固体の沈澱 が始まった０反応混合物を０．５時間攪拌した。

反応混合物をその後ＥＴＯＡｃで希釈し、０．５Ｍ水性ＨＣＺで洗浄し、有機溶 媒を硫酸ナトリウムで乾燥し、有機溶媒を除去した。ＣＨｚ　Ｃ１１ｔ　／ＥＴ ＯＡｃ　（５／１．ｖ／ｖ）を溶出液として使用してシリカゲルカラム上で生成 物を精製した。乾燥後、０．０１５８ｇの化合物Ｇ　（Ｓ　（−）　）を回収し た。

Ｒ（＋）異性体はほぼ同様の方法により４８％の収率で調製された。

等量のＲ（＋）及び５（−）エナンチオマー異性体を含むラセミ体も調製した。

この物質は化合物Ｇ　（Ｒ，Ｓ）と指称する。

ＣＤ　Ｃ１３中１００ＭＨｚ（内部標準としてのＴＭＳに対して）でのプロトン ＮＭＲ：６８．ｌ（広い一重線、ＩＨ）　、７．３　（多重線、９Ｈ）　、５． ９　（多重線、ＬＨ）、３．６２　（−重線、２Ｈ）。

１．５５（二重線、Ｊ＝６Ｈｚ、３Ｈ）。

血含隻且 化合物Ｇ　（Ｒ（＋））（０，６６４７ｇ：１．８４ｘｌＯ−”モル）を丸底フ ラスコ中の５ｄのエタノールに溶解し、５当量のナトリウムポロハイドライドを 加えた。得られた混合物を２．５時間攪拌し、１０容量％水性水酸化アンモニウ ムの２０−中に注いだ。水性溶液をＥＴＯＡｃで抽出し、ＥＴＯＡｃ溶液を硫酸 ナトリウム上で乾燥した。溶媒を減圧下に除去し、残渣を５−の新たに蒸留した Ｃ　Ｈｚ　Ｃｊ！　ｚ中に熔解した。

２当量のトリエチルアミン（０，５１ｍ）を上記のＣＨＩ　ＣＩｔ！溶液に加え 、得られた溶液を短時間攪拌した０次にグルタル酸無水物の１当量（０，２０９ ５ｇ）を加え、得られた反応混合物を室温で１８時間攪拌した。

減圧下で揮発物を除去し、残渣をＥＴＯＡｃに再溶解した。この溶液を水性０． ５ＭＨＣｊ！、炭酸水素ナトリウム（１０重量％）、その次に飽和水性塩化ナト リウムで洗浄した。有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥し、その後減圧下で除去し た。残渣を最少量のメタノールに溶解し、混合ヘキサンを加えて生成物を沈澱さ せた。

生成物を追加量の混合ヘキサンで洗浄し、乾燥して０．３００　ｇを得た（約４ ３％収率）。

生成物の゛化合物Ｈ（Ｒ（＋）　）は、ナトリウム重線により偏光計において＋ ３０．６°の光学回転角を示した。

もう一方のエナンチオマー、化合物Ｈ（Ｓ　（−）　）はほぼ同様な方法により 調製し、上記と同様に−３０，３°の光学回転角を示した。

化合物Ｇ　（Ｒ，Ｓ）を出発物質として使用してラセミ体を同様に調製した。こ の生成物は最初のスクリーニングに使用したもの′であり、化合物Ｈ（Ｒ，Ｓ） と指称する。

ＤＭＳＯ−ｄ、中１００ＭＨｚ（内部標準としてのＤＭＳＯに対して）でのプロ トンＮＭＲ：δ９．９（−重線、ＩＨ）、７．５３（多重線、９Ｈ）、５．７８ 　（多重線、ＩＨ）　、３．６　（−重線、２Ｈ）、２．２５（多重線、４Ｈ） 　、１．７５　（多重線、２Ｈ）、１．４５（二重線、Ｊ＝６Ｈ２，３Ｈ）。

コンシュ゛−ｆ１＋　のス　シン　染ジル　ロ１　゛カー　ｌン久遁勿這製 前記アナログリガンド（化合物Ｆ）はグルタル半アミド基を有し、これは該ハプ テン性アナログリガンドを抗体を誘発するための抗原性（免疫原性）キアリアに 結合されるのに使用される。カルボキシル基の間に合計で１〜８のメチレン＆　 （（、Ｈ，）を含む追加の結合基も有用である。

従って、マロン酸、グルタル酸、アジピン酸からデカンニ酸（ｄｅｃａｎｅｄｉ ｏｉｃ　ａｃｉｄ）のような二塩基酸が有用である。これらの物質は、適当な無 水物、酸塩化物、あるいはその他の適当な酸基に対する活性化結合を使用するこ とによりアナログリガンドに結合することができる。

特に有用なジカルボン酸誘導結合基は、０−スクシンイミジル基を１つのカルボ ン酸末端に有し、他の末端に酸塩化物を有するものである。下記の手順は、スク シンイミジルアジポイルクロリドの特定の調製をその他の同様な結合基の合成に 例として記載したものである。

塩化チオニル（１５−）中のアジピン酸モノメチルエステル（５，４ｇ、３３． ３ｍｍｏｌ）を４０℃で２時間加熱した。混合物を次に減圧下で濃縮し蒸発させ て（２０ｍｍＨＨにおいて沸点１１９℃）３、５８　ｇの酸クロリドメチルエス テルを得た（８５重量％収率）。

これを２０−のジクロロメタンに溶解しＮ−ヒドロキシスクシンイミド（２，７ ５ｇ＋　２４．０ｓ＋ｍｏｌ）を加え、次にトリエチルアミン（４，２ｇ、３０ ｓｎｏｌ）を加えた。混合物を１０分間攪拌し、酢酸エチルで希釈し、０．５Ｍ 　ＨＣＩ及びプラインで洗浄した。溶液を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過 及び濃縮して４．５ｇのメチルスクシンイミジルアジペートを無色油状物として 得た（　８７．５重量％収率）。

ＣＤＣＪ！、中１００ＭＨ！（内部標準としてのＴＭＳに対して）でのプロトン ＮＭＲ：６３．７３（−重線、３Ｈ）、６２．９０（−重線、４Ｈ）、２．７０ 　（多重線、２Ｈ）、２．３７　（多重線、　２　Ｈ）。

及び１．７９（多重線、４Ｈ）。

メチルスクシンイミジルアジペート　（４，５ｇ、１７．５＋ｕ＋ｏｌ）、クロ ロトリメチルシラン（１１，Ｌ　ｄ、８７．５　ｍｓ＋ｏｌ）及びヨウ化ナトリ ウム（１３，１ｇ、８７．５ｍｍｏｌ）の１０−のア七ト二トリル中の溶液を還 流下に１２時間加熱した。混合物をその後室温に冷却し、酢酸エチルで希釈した ０反応混合物を、この有ｍ溶液が無色になるまで５％水性亜硫酸水素ナトリウム で繰り返し洗浄した。

その後これをブラインで洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し濃縮 して３．２ｇのアジピン酸モノスクシンイミジルエステルを白色固体として得た （７１重量％収率）。

ＣＤＣＺｆｆ中１００ＭＨｚ（内部標準としてのＴＭＳに対して）でのプロトン ＮＭＲ：δ３．９０（−重線、４Ｈ）、２．７０　（多重線、２Ｈ）　、　２． ４　（多重線、２Ｈ）、１．８０　（多重線、４Ｈ）。

アジピン酸スクシンイミジルエステル（１，００ｇ、　３．８０ｅ＋５ｏｌ）及 び塩化チオニル（５ｗりの混合物を４０℃に３時間加熱し、室温に冷却して減圧 下に濃縮した。残渣を数回乾燥ヘキサンとともに攪拌し、この油状物を分離して 減圧下で乾燥して０．９７　ｇのスクシンイミジルアジポイルクロリドを得た（ ９０重量％収率）。

これを乾燥テトラヒドロフラン中に溶解して５モル溶液を作成し、これをそのま まタンパク質キアリアに対する結合に適した化合物の調製に使用した。

ｃＤｃ７！、中１００ＭＨｚ（内部標準としてのＴＭＳに対して）でのプロトン ＮＭＲ：３．００（多重線、２Ｈ）、２．９０　（−重線。

４Ｈ）、２．７０（多重線、２Ｈ）、１．８０　（多重線、４Ｈ）。

スクシンイミジル酸クロリドとハブテン性アナログリガイドの反応は、化合物Ｆ の調製について前に記載したのと実質的に同様な方法により行った。この反応に より、スクシンイミジル酸塩化物の酸塩化物含有部分がハブテンのアミンに結合 され、後にキアリアと反応する遊離のスクシンイミジル基を残す。

■、コンシュ゛−のｉ′＋ ハブテン性アナログリガンド分子の、例えばキーホールリンペントヘモシアニン （Ｋ　Ｌ　Ｈ）のような抗原性（免疫原性）タンパク質キアリアとのコンジュゲ ートは、例えば、キアリアを例えばＭＢＳ（ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒ ドロキシスクシンイミドエステル）のようなカンプリング剤で活性化し、アナロ グリガンドのチオール基に結合することによって調製できる０例えば、Ｌｉｕｅ ｔａｌ、、　Ｂｉｏｃｈｅｍ　０．　６９０　（１９７９）を参照されたい。

当業者には周知のように、化合物はそのキアリアに対して中間物、即ち結合基を 介して結合するのが有利であることが多い。

有用なキアリアは当分野でよく知られており、一般的にはタンパク質そのもので ある。このようなキアリアの例には、キーホールリンペントヘモシアニン（ＫＬ Ｈ）、エデスチン、チログロフ゛リン、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）またはヒト 血清アルブミン（ＨＳ　Ａ）のようなアルブミン、ヒツジ赤血球（Ｓ　ＲＢ　Ｃ ）のような赤血球、破傷風毒素、コレラ毒素、並びにポリ（Ｄ−リシン：Ｄ−グ ルタミン酸）のようなポリアミノ酸等がある。

キアリアの選択は、抗原の決定基部分よりも抗原の意図されている最終的な用途 により依存し、特に本発明に包含されるものではない判断基準に基づくものであ る０例えば、コンジュゲートが研究室の動物に使用されるものであるならば、そ の特定の動物に対して都合の悪い反応を生起しないキアリアが選択されなければ ならない。

キアリアーハブテンコンジュゲートは、生理学的に許容され得る希釈剤、例えば 、通常の生理食塩水、ＰＢＳ、あるいは滅菌水等の水性組成物に溶解されるか分 解され、接種物を形成する。完全または不完全フロインドアジュバントのような アジュバントやみょうばん等も接種物に含有させることができる。公知の通り、 接種物は抗体を生成するのに使用される動物に、抗体を誘導する例示的な手順に おいては、２５０μｌのジメチルホルムアミド中の２．５ｍｇのハブテン性アナ ログリガンドとスクシンイミジルアジポイルクロリドまたはスクシンイミジルグ ルタロイルクロリドとの反応生成物を７５０μ！のｐｏが７．２の０．１Ｍリン 酸ナトリウム緩衝液中の２ＨのＫＬＨにゆっくりと加える４℃の温度を使用し、 得られた混合物を約１時間攪拌しハプテン結合ＫＬＨコンジュゲートを形成する 。このようにして形成されたコンジュゲート反応生成物はその後通常の手段によ り精製する。

本実験においては、化合物Ｆ（５ｌｇ）を水（２−）中のＫＬＨ（２ｍｇ）に混 合した。　ｐＨはＨＣｌで４．５に調整し、その後１０当量の１−エチル−３− （３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミドを加えた。混合物は約１２時 間攪拌した。得られた粗生成物をマウスに注射した。

■、モ　ロー　ルレセ　−〇量 上記のＫＬＨコンジュゲート（約１００μｇ）をマウス（１２９ＧＩＸ”株）の 免疫化に使用し、モノクローナル抗体をＮｉｍａｎ　ａｔ　ａｌ、Ｐｒｏｃ、Ｎ ａｔｌ、＾ｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　７　７．　４　５　２　４（１９８０） 及びＮｉｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅ ｓ　ａｎｄＴ−ＣｅｌユＰｒｏｄｕｃｔｓ　ｅｄ、＋　ＫａＬｚ、　ｏ、　Ｈ− ＋　２３　５１　（ＣＲＣＰｒｅｓｓ＋Ｂｏｃａ　Ｒａｔｏｎ、　ＦＬ　１９８ ２）に記載されたようにして得た９９本発明のハイブリドーマを形成するのに使 用するリンパ球は任意の哺乳動物、例えば、霊長目、儒歯目（例えばマウス、ラ ット）、ウサギ、モルモット、牛、犬、羊、豚等に由来するものとすることがで きる。適当には、宿主を免疫原、ここではハプテン性アナログリガンドの注射に より敏悪化し、その後追加免疫注射をし、そして肺臓を摘出する。

ミエローマ細胞系はリンパ球と同じ種からのものであることが好ましい、従うて 、マウス−マウスハイブリッド（Ｓｈｕｌｍａｎ　ｅｔａｌ、＋　Ｎａｔｕｒｅ 　２ユ６，２６９　（１９７８））、あるいはラット−ラットハイブリッド（Ｇ ａｌｆｒｅ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ　２７７．　１３１（１９７９）） 等のような融合ハイブリッドが典型的に使用できる。しかし、ハイブリドーマを 形成するのにうまく使用し得るラット−マウスハイブリッドもある（Ｇｏｄｉｎ ｇ、　”Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆＭｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉ ｅｓ　ｂｙ　Ｃｅ１ｌ　Ｆｕｓｉｏｎ、’　Ａｎｔｉｂｏｄ　ａｓ　ａ　Ｔｏｏ ｌＭａｒｃｈａｌｏｎｉｓ　ｅｔ　ａｌ、　ｅｄｓ、、　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ 　＆　５ｏｎｓ　Ｌｔｄ、＋　ｐ、２７３（１９８２））、本発明に好適に使用 できるミエローマ系には、ＭＰＣ−１１（ＡＴＣＣＣＲＬ１６７）、Ｐ３Ｘ６３ −Ａｇ８．６５３　（ＡＴＣＣＣＲＬ１５８０）、Ｓｐ２１０−Ａｇ１４（ＡＴ ＣＣＣＲＬ１５８１）、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ、１（ＡＴＣＣＣＲＬ１５９７）、 Ｙ３−Ａｇ１．２．３゜（Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　Ｎａｔｉｏｎａｌｅ　ｄｅ　 Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ　ｄｅ　Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ＋Ｐａｒｉｓ、　Ｆｒ ａｎｃｅにＮｏ、ｌ−０７８で寄託）及びＰ３Ｘ６３Ａｇ８（ＡＴＣＣＴ　Ｉ　 Ｂ　９）が含まれる。非分泌ネズミミエローマ系５ｐ２１０あるいはＳｐ２１０ −Ａｇ１４は本発明に好適に使用できるつ 最終的に生成されたハイブリドーマ細胞は、このような細胞用によく知られてい る通常のｉｎ　ｖｉｔｒｏ組織培養法により培養することができる。より好まし くは、このようにして生成された腹水に由来するモノクローナルレセプターにつ いて同様に周知の方法を使用して動物中で培養することができる。腹水を生成す るのに使用された動物は、５ｃｒｉｐｐｓ　Ｃ１１ｎｉｃ　ａｎｄ　Ｒｅ５ｅａ ｒｃｈ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ。

Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａのマウスコロニーで生産された雌１ ２９ＧＩＸ”マウスであったが、マウス以外の動物をハイブリドーマの調製に使 用したときはマウスあるいはそのタイプの動物を腹水の生成に使用することがで きる。

特に、モノクローナルレセプターの１つの例は、Ｋｏｈｌｅｒ　ｅｔａｌ、　、 シリμオニ旨り旦６，４９５　（１９７５）の標準的なハイブリドーマ法により 生産される。詳細には、３００μｌのリン＃Ｒ＄１衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐ Ｈ７，４と完全フロインドアジュバントとの１：１混合物中の１００μｇのコン ジュゲート（例えばＫＬＨに結合した化合物Ｆ）の接種物の腹腔内注射により雌 １２９ＧＩＸ”マウスを免疫化した。２週間後、同様な方法により、３００μｌ のＰＢＳ　（ｐＨ７，４）と１０ｍｇ／ｍｌのみょうばんの１：１混合物中の５ ０μｇのコンジュゲートをマウスに再び注射した。さらに８週間後、２００μＥ のＰＢＳ　（ｐＨ７，４）中の５０μｇのコンジュゲートを静脈内に投与してマ ウスを免疫化した。４日後に肺臓をマウスから摘出し、肺臓細胞をミエローマ細 胞と融合させた。

肺臓細胞をプールして単一の細胞懸濁物を作成した０次に核のある肺臓細胞（１ ，４ＸＩＯ”）を細胞融合促進剤（ポリエチレングリコール２０００）の存在下 で３Ｘ１０’　Ｓｐ２１０−Ａｇ１４非分泌ミエローマ細胞と融合させた。牌ｇ ｅｔ胞を９６ウエルプレートに播き、４５０　（１＋ｇ／　Ｉグルコース（１０ ％）、１０％胎児子牛血清（Ｆｅ２）、ヒボキサンチン、アミノプテリン及びチ ミジン（即ちＨＡＴ培地）を含み非融合細胞を増殖させないダルベツコ改変イー グル培地（ＤＭＥＭ）で増殖させることによって特定のモノクローナル抗体を生 成するハイブリドーマを選択した。２〜３週間後、各ウェルの細胞クローン上の 上清からサンプルを取り、ＥＬ　Ｉ　ＳＡアフセイ（下記に記載する酵素結合免 疫吸着アッセイ）により化合物Ｆに対する抗体の存在について試験した。陽性の ウェルを限界希釈法により２回クローン化した。２回のクローニングの後に化合 物Ｆ特異抗体を産生じ続けるクローンを増殖させてより多くの上溝液体を製造し た。ハイブリドーマ及びそれから生産され本明細書に記載したモノクローナルレ セプターは後記の表に示したように研究室の指称により特定する。

本発明のモノクローナルレセプターは、ハイブリドーマを注射によりマウスのよ うな哺乳動物の腹腔内に導入することによっても生産することができる。既に指 摘したように、米国特許第４、３６１．５４９号（この記載は参考文献として本 明細書の一部とする）に記載されているような同質遺伝子または半同質遺伝子の 哺乳類を使用することが好ましい。ハイブリドーマの導入により、適当な増殖期 間（例えば、２〜３週間）の後、抗体産生ハイブリドーマが形成され、宿主マウ スの血流及び腹膜滲出液（腹水）から回収できるようなレセプターの高い濃度が 得られる。

宿主マウスはその血液内及び腹水に通常のレセプターを有しているが、通常のレ セプターの濃度は典型的にはモノクローナルレセプターの濃度の約５％でしかな い。

モノクローナルレセプターは腹水液体から沈澱され、アニオン交換クロマトグラ フィーにより精製され、３つの異なる緩衝液に対して透析される。

本研究においては、典型的にはＩｇＧフラクションを、マウス腹水から４５％飽 和硫酸アンモニウムで沈澱させ、ＤＥＡＥ−５ｅｐｈａｃｅｌ上で塩化ナトリウ ム溶出させるクロマトグラフィーにより得た。１００ｍＭ塩で溶出されたフラク ションを透析し濃縮した。

タンパク濃度はＬａｗｒｙ法（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　Ｉ　９３　： 　２６５（１９５１））で決定した。単離されたＩｇＧフラクションを含む得ら れた濃縮溶液を、典型的には、５０＋ｎＭ）リス−ＨＣｌまたは０．０１Ｍナト リウムアジドを含むリン酸ナトリウムのような適当な緩衝液を使用して１〜２０ 鋤ｇ　／　ｍ　Ｉのレセプターのストンク溶液に１ｌ１１！する。

ＥＬ　Ｉ　ＳＡにおいて抗原に結合した１２のモノクローナルレセプターのうち 、８つはラセミ体化合物Ｈ（Ｒ，Ｓ）基質の加水分解を触媒した。これらの８つ の触媒分泌ハイブリドーマのうち２つ（それぞれの各立体異性体の反応を触媒し たもの）を本発明の実施例として寄託した。ハイブリドーマは、下記ハイプリド ーマ寄託表に示すようにＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１ １ｅｃｔｉｏｎ＋　１２３０１Ｐａｒｋ】ａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ、　Ｒｏｃｋｖｉ ｌｌｅ、ＭＤに寄託した。

ハイ°Ｉ　′−マ ハイブリドーマ名称 五突呈　■」Ｊ江Ｕ」辺え匹　ＡＴＣＣｉ圧旦２Ｈ６Ｒ（＋）　Ｈ８９９６９１ ９８９年１月１３日２１Ｈ３Ｓ　（−）　１８９９７０　１９８９年１月１３日 ＩＦ５　Ｒ（＋）　ＮＤ”　ＮＤ” ９Ｃ７５（−）　ＮＤ”　ＮＤ” １８Ｅ９　Ｒ（＋）　ＮＤ”　ＮＤ” １１Ｄ９　Ｒ（＋）　ＮＤ”　ＮＤ” ２０Ｃ１ＯＲ（＋）　ＮＤ”　ＮＤ” ２６Ｄ３　Ｅ（＋）　ＮＤ”　ＮＤ“ ＮＤ”　：寄託せず この寄託はブダペスト条約の要件に従ってされたものであり、この条約では寄託 期間は寄託日から３０年、あるいは寄託機関における最後の寄託申請後５年、あ るいはこの出願から発生する米国特許の存続期間のうち最も長いものであること が要求されている。バイブリドーマが寄託機関で成育不能になったような場合は 補充される。

０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液、Ｉ）Ｆｌ値５．５．３７℃中の予備消化された パパインを使用し、ヨードアセタミドと反応させることによってモノクローナル レセプターのＦａｂフラグメントを調製：　することができる、ｌ”ａｂフラグ メントば、典型的には、アニオン交換クロマトグラフィー、透析、及びＤＥＡＥ アニオン交換クロマトグラフィーによりさらに精製され、その均質性はゲル電気 泳動により判断される。

■、　人　ア・セイ　ＥＬ　Ｔ　ＳＡ 誘導されたモノクローナルレセプター分子によるアナログリガンドの結合を、そ の滴定範囲内で固定された濃度の抗体と変化する阻害剤（遊離の化合物Ｆ）濃度 を使用して、ＥＬ　Ｉ　ＳＡによりアッセイした。遊離の化合物Ｆを阻害剤とし て使用することにより、観察される結合相互反応が抗体特異的なものであること を確保する助けとなる。

アッセイは平底ポリビニルマイクロタイタープレート（Ｄｙｎａｔ−ｅｃｈ、　 Ａｌｅｘａｎｄｒｉａ、　ＶＡ）を用いて行った。具体的には、リン酸緩衝生理 食塩水（Ｐ　Ｂ　Ｓ）中に抗原リガンドとしてＢＳＡに結合した化合物Ｆを含む 溶液をウェル当たり５０μｌ使用してこの溶液でウェルをコートした。ＢＳＡを ハブテンが細胞壁に結合するためのキアリアとして使用し、アナログ−リガンド ／ＢＳＡコンジュゲートを免疫化ＫＬＨ含有物の代わりに使用して、存在し得る 抗−ＫＬＨ抗体をスクリーニングした。

結合リガンドは１μｇ／ｓｌでコートした。その後、プレートを３７℃の乾燥オ ーブン中で一晩インキュベートした。乾燥したプレートは使用するまで４℃で保 存した。ＥＬＩＳＡアンセイの前に、乾燥プレートを０．１％ポリアルキレン（ ２０）ソルビタンモノオレエー）　ＣＴｕｅｅｎ　２０）及び０．０２％Ｔｈｉ ｍｅｒｏｓａｌ　（エチルマーキュリチオサリチル酸ナトリウム）（Ｓｉｇｍａ 、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ。

ＭＯ）を含む１０ミリモル（ｓ＋Ｍ）　ＰＢＳ、ｐＨ７，４でそれぞれ２分間２ 回洗浄した再ｆＩＡ潤化した。

非特異的結合を減じるため、ハイブリドーマ上清を０．１％ＢＳＡを含む洗浄緩 衝液を希釈剤として１：２に希釈した。５０μｌの希釈ハイブリドーマ上清をそ の後各ウェルに加え、磁気攪拌機上で４℃で１時間インキュベートし、モノクロ ーナル抗体含有上清を結合化合物Ｆと接触させた。各２分間の２回の洗浄の後、 １　：　１０００に希釈した、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩ　ｇ　Ｇ　 ＋　ｒ　ｇ　Ｍ　（Ｔａｇｏ、　Ｂｕｒｌｉｍｇａｍｅ、　ＣＡ）の５０．ｃｌ を各ウェルに加え、反応混合物を４℃で１時間インキュベートし標識抗体を結合 モノクローナル抗体に結合した。

アッセイに使用したペルオキシダーゼ活性結合基質は使用の直前に調製し、０． １２％ＨｔＯｔを含む８０ａＭクエン酸−リン酸緩衝液、ＰＨ６，０中の４００ μｇ／ｍｌ　ｏ−フェニレンジアミン（Ｓｉｇｍａ、　Ｓｔ、　ＬｏｕｉＳ＋　 ＭＯ）からなる。最後の２回の洗浄の後、５０μｌの基質溶液を各ウェルに加え 、暗所で１５分間発色させた。４モルＨ２Ｓｃ４の２５μりを各ウェルに加える ことによって発色を停止し、４９２ナノメーター（ｎｍ）の光学密度をＭｕｌｔ ｉｓｋａｎ　Ｅ　Ｌ　Ｉ　Ｓ　Ａプレートリーダーで測定した。

レセプター分子の別の調製のために、抗体結合部位形成フラグメントをコードす る遺伝子を、本明細書中で述べたように免疫反応する抗体分子を産生ずる任意の 細胞から得ることができる。好ましい細胞はハイブリドーマ細胞である。

一般的な組み換えＤ　Ｎ　／’、クローニング法の例としては、Ｍｏ１ｅｃ−劃 」Ｌニオ阻り徂、Ｍａｎｉａｔｉｓ　ａｔ　ａｌ、、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　 Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ、＋Ｎ、Ｙ、＋　１９８２　；　ＤＮＡ　Ｃ１ｏｎｉｎ　 Ｇｌｏｖｅｒ、ｅｄ−＋　ｒＲｔ、Ｐｒｅｓｓ。

ＭｃｌｅａｎＶＡ　（１９８５）を参照されたい、ゲノムクローニング及びリン パ細胞内でのイムノグロブリン遺伝子の発現については、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ　 ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ、３１２＝６０４−８（１９８４）ｉｏｃｈｉ　 ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ　Ｎａ刀ユ」旦回工」劇ユニＵＳコ、、ｓｏ：５３ｓ ｔ−５５（１９８７）及びＯｆ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃ ａｄ、　Ｓｃｉ。

旦旦人、８０：８２５−２９　（１９８３）を参照されたい、ハイブリドーマ細 胞からのイムノグロブリン遺伝子のクローニングとＸｅｎｏｐｕｓ卵母細胞中に おける発現については、Ｒｏｂｅｒｔｓ　ｅｔ　ａｌ、＋Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎ ｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、１　：　５９　６５　（１９８６）を、酵母中における発 現についてはＷｏｏｄ　ａｔ　ａｌ、　Ｎａｔｕｒｅ　３１４　：　４４６−９ （１９８５）を参照されたい。

これまでの記載は本発明を例示するためのものであって、制限することを意図す るものではない６本発明の本来の趣旨及び範囲を離れることなく数多くの変更及 び改変を行うことができる。

手続補正書（方式） ３．７０．１６ １、事件の表示　平成２年特許願第５０３０９４号（ＰＣＴ／ＵＳ　９０１００ ２６９） ２、発明の名称　立体特異的触媒作用を示す抗体結合部位を存する分子 ３、補正をする者 事件との関係　出　願　人 名　称　スクリップス　クリニック　アンドリサーチ　ファウンデーション ５、補正命令の日付　自　発

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. １．反応体リガンドの一つの立体異性体の、予め選択された切断されやすいカル ボン酸アミドまたはエステル結合を触媒的に加水分解することができる、抗体結 合部位を含むレセプター分子であって、前記抗体結合部位が、 （ａ）予め選択された切断されやすいカルボン酸アミドまたはエステル結合を含 む反応体リガンドの立体異性体対の一方、及び （ｂ）前記反応体リガンドに立体化学的に類似であり、前記反応体リガンドの予 め選択されたカルボン酸アミドまたはエステル結合の切断されやすいカルボニル 炭素の位置と類似の位置に四面体結合したリン原子を含むアナログリガンドの立 体異性体対の一方と結合する前記レセプター分子。
2. ２．前記リン原子が、 （ｉ）少なくとも５の原子を有する鎖に含まれる、前記アナログ反応体リガンド アミドまたはエステルの酸部分の炭素原子、（ｉｉ）前記リン原子に二重結合し た一つの酸素原子、（ｉｉｉ）前記リン原子に単結合し水素原子またはＣ１−Ｃ ４低級アルキル基に単結合した一つの酵素原子、及び（ｉｖ）類似のエステルま たはアミドのそれぞれのアルコールまたはアミン部分のα−炭素にさらに結合し 、少なくとも５の原子を有する鎖の部分である第三の酸素原子またはイミノ窒素 原子に直接結合している請求項１に記載のレセプター分子。
3. ３．前記抗体結合部位に結合された立体異性体の立体異性中心が前記反応体リガ ンドのアルコールまたはアミン部分に位置する請求項１記載のレセプター分子。
4. ４．前記抗体結合部位に結合された反応体リガンド立体異性体の立体異性中心が 前記切断されやすいカルボン酸アミドまたはエステル結合から１〜約４のアミノ 酸残基により占められた空間の中にある請求項１記載のレセプター分子。
5. ５．前記立体異性体がエナンチオマーである請求項１記載のレセプター分子。
6. ６．反応体リガンドの一つの立体異性体の、予め選択された切断されやすいカル ボン酸アミドまたはエステル結合を触媒的に加水分解することができ、他の立体 異性体にはそうではない、抗体結合部位を含むレセプター分子であって、前記抗 体結合部位が、 （ａ）式、 ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、ＸはＯまたはＮＨであり、Ｒ１は▲数式、化学式、表等があります▼（ Ｒ４は（ＣＨ２）■ＣＯ２Ｒ５である（Ｒ５はＨまた▲数式、化学式、表等があ ります▼であり、ｎは１から８の整数である））であり、Ｒ２はＨまたはＣ１− Ｃ４低級アルキルであり、Ｒ３は▲数式、化学式、表等があります▼である（波 線は両方の立体異性体を表す）〕で表されるアナログリガンド分子の立体異性体 対の一方、及び式、 ▲数式、化学式、表等があります▼〔式中、Ｘ、Ｒ１及びＲ３は前記の通りであ る〕で表される反応体リガンドの一つの立体異性体と結合する前記レセプター分 子。
7. ７．ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ　９９６９を有するハイブリドーマ２Ｈ６から分泌さ れる請求項６記載のレセプター分子。
8. ８．ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ　９９７０を有するハイブリドーマ２１Ｈ３から分泌 される請求項６記載のレセプター分子。
9. ９．反応体リガンドの一つの立体異性体の、予め選択された切断されやすいカル ボン酸アミドまたはエステル結合を触媒的に加水分解することばできる、抗体結 合部位を含むモノクローナルレセプター分子であって、前記抗体結合部位が、（ ａ）予め選択された切断されやすいカルボン酸アミドまたはエステル結合を含む 反応体リガンドの立体異性体対の一方、及び （ｂ）前記反応体リガンドに立体化学的に類似であり、前記反応体リガンドの予 め選択されたカルボン酸アミドまたはエステル結合の切断されやすいカルボニル 炭素の位置と類似の位置に四面体結合したリン原子を含むアナログリガンドの立 体異性体対の一方と結合する前記モノクローナルレセプター分子を分泌するハイ ブリドーマ。
10. １０．前記リン原子が、 （ｉ）少なくとも５の原子を有する鎖に含まれる、前記アナログ反応体リガンド アミドまたはエステルの酸部分の炭素原子、（ｉｉ）前記リン原子に二重結合し た一つの酸素原子、（ｉｉｉ）前記リン原子に単結合し水素原子またはＣ１−Ｃ ４低級アルキル基に単結合した一つの酸素原子、及び（ｉｖ）類似のエステルま たはアミドのそれぞれのアルコールまたはアミン部分のα−炭素さらに結合し、 少なくとも５の原子を有する鎖の部分である第三の酵素原子またはイミノ窒素原 子に直接結合している請求項９に記載のハイブリドーマ。
11. １１．２Ｈ６と指称されＡＴＣＣ受託番号ＨＢ　９９６９を有する請求項９記載 のハイブリドーマ。
12. １２．２１Ｈ３と指称されＡＴＣＣ受託番号ＨＢ　９９７０を有する請求項９記 載のハイブリドーマ。
13. １３．触媒として有効な量のレセプター分子を立体異性体反応体リガンド分子に 水性媒体中で混合して混合物を形成し、ここでレセプター分子は、抗体結合部位 を含み、反応体リガンドの一つの立体異性体の、予め選択された切断されやすい カルボン酸アミドまたはエステル結合を加水分解することができ、他方の立体異 性体に対してはそうではなく、前記抗体結合部位が、予め選択された切断されや すいカルボン酸アミドまたはエステル結合を含む反応体リガンドの立体異性体対 の一方、及び前記反応体リガンドに立体化学的に類似であり、前記反応体リガン ドの予め選択されたカルボン酸アミドまたはエステル結合の切断されやすいカル ボニル炭素の位置と類似の位置に四面体結合したリン原子を含むアナログリガン ドの立体異性体対の一方と結合するものであり、 前記反応体リガンド分子が前記レセプター分子に結合し、レセプター分子が前記 予め選択された切断されやすい結合の加水分解を触媒するのに十分な時間、前記 混合物を維持する段階を含む、立体異性カルボン酸アミドまたはエステル分子対 の一方の加水分解反応を触媒する方法。
14. １４．前記抗体結合部位が、 （ｉ）少なくとも５の原子を有する鎖に含まれる、前記アナログ反応体リガンド アミドまたはエステルの酸部分の炭素原子、（ｉｉ）前記リン原子に二重結合し た一つの酸素原子、（ｉｉｉ）前記リン原子に単結合し水素原子またはＣ１−Ｃ ４低級アルキル基に車結合した一つの酸素原子、及び（ｉｖ）類似のエステルま たはアミドのそれぞれのアルコールまたはアミン部分のα−炭素にさらに結合し 、少なくとも５の原子を有する鎖の部分である第三の酸素原子またはイミノ窒素 原子に結合する請求項１３に記載の方法。
15. １５．反応体リガンドが立体異性体対として存在する請求項１３記載の方法。
16. １６．立体異性体対がエナンチオマーである請求項１５記載の方法。
17. １７．前記抗体結合部位に結合された立体異性体の立体異性中心が前記反応体リ ガンドのアルコールまたはアミン部分に位置する請求項１３記載の方法。
18. １８．前記抗体結合部位に結合された反応体リガンド立体異性体の立体異性中心 が前記切断されやすいカルボン酸アミドまたはエステル結合から１〜約４のアミ ノ酸残基により占められた空間の中にある請求項１３記載の方法。
19. １９．触媒として有効な量のレセプター分子を立体異性体反応体リガンド分子に 水性媒体中で混合して混合物を形成し、ここでレセプター分子は、抗体結合部位 を含み、反応体リガンドの一つの立体異性体の、予め選択された切断されやすい カルボン酸アミドまたはエステル結合を触媒的に加水分解することができ、他方 の立体異性体に対してはそうではなく、前記抗体結合部位が、 （ａ）予め選択された切断されやすいカルボン酸アミドまたはエステル結合を反 応体リガンドの立体異性中心から１〜約４のアミノ酸残基により占められた空間 の中に含む反応リガンドの立体異性体対の一方、及び （ｂ）前記反応体リガンドに立体化学的に類似であり、前記反応体リガンドの予 め選択されたカルボン酸アミドまたはエステル結合の切断されやすいカルボニル 炭素の位置と類似の位置に四面体結合したリン原子を含み、前記リン原子から１ 〜４のアミノ酸残基により占められた空間の中に位置する立体異性中心を含むア ナログリガンドの立体異性体対の一方と結合するものであり、 前記リン原子が、 （ｉ）少なくとも５の原子を有する鎖に含まれる、前記アナログ反応体リガンド アミドまたはエステルの酸部分の炭素原子、 （ｉｉ）前記リン原子に二重結合した一つの酵素原子、（ｉｉｉ）前記リン原子 に単結合し水素原子またはＣ１−Ｃ４低級アルキル基に単結合した一つの酸素原 子、及び（ｉｖ）類似のエステルまたはアミドのそれぞれのアルコールまたはア ミン部分のα−炭素にさらに結合し、少なくとも５の原子を有する鎖の部分であ る第三の酸素原子またはイミノ窒素原子 に直接結合するものであり、 前記反応体リガンド分子が前記レセプター分子に結合し、レセプター分子が前記 予め選択された切断されやすい結合の加水分解を触媒するのに十分な時間、前記 混合物を維持する段階を含む、立体異性カルボン酸アミドまたはエステル分子対 の一方の加水分解反応を触媒する方法。
20. ２０．前記レセプター分子が、２Ｈ６と指称されＡＴＣＣ受託番号ＨＢ　９９６ ９を有するハイブリドーマから分泌されたものである請求項１９記載の方法。
21. ２１．前記レセプター分子が、２１Ｈ３と指称されＡＴＣＣ受託番号ＨＢ　９９ ７０を有するハイブリドーマから分泌されたものである請求項１９記載の方法。