FI108437B - Molekyylit, jotka sisõltõvõt vasta-aineenyhdistõmiskohtaosia, jotka katalysoivat hydrolyysireaktioita - Google Patents
Molekyylit, jotka sisõltõvõt vasta-aineenyhdistõmiskohtaosia, jotka katalysoivat hydrolyysireaktioita Download PDFInfo
- Publication number
- FI108437B FI108437B FI923367A FI923367A FI108437B FI 108437 B FI108437 B FI 108437B FI 923367 A FI923367 A FI 923367A FI 923367 A FI923367 A FI 923367A FI 108437 B FI108437 B FI 108437B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- ligand
- molecules
- antibodies
- antibody
- hapten
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D213/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
- C07D213/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
- C07D213/04—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
- C07D213/24—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom with substituted hydrocarbon radicals attached to ring carbon atoms
- C07D213/28—Radicals substituted by singly-bound oxygen or sulphur atoms
- C07D213/30—Oxygen atoms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C205/00—Compounds containing nitro groups bound to a carbon skeleton
- C07C205/39—Compounds containing nitro groups bound to a carbon skeleton the carbon skeleton being further substituted by esterified hydroxy groups
- C07C205/42—Compounds containing nitro groups bound to a carbon skeleton the carbon skeleton being further substituted by esterified hydroxy groups having nitro groups or esterified hydroxy groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings of the carbon skeleton
- C07C205/43—Compounds containing nitro groups bound to a carbon skeleton the carbon skeleton being further substituted by esterified hydroxy groups having nitro groups or esterified hydroxy groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings of the carbon skeleton to carbon atoms of the same non-condensed six-membered aromatic ring or to carbon atoms of six-membered aromatic rings being part of the same condensed ring system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C205/00—Compounds containing nitro groups bound to a carbon skeleton
- C07C205/44—Compounds containing nitro groups bound to a carbon skeleton the carbon skeleton being further substituted by —CHO groups
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C215/00—Compounds containing amino and hydroxy groups bound to the same carbon skeleton
- C07C215/02—Compounds containing amino and hydroxy groups bound to the same carbon skeleton having hydroxy groups and amino groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton
- C07C215/22—Compounds containing amino and hydroxy groups bound to the same carbon skeleton having hydroxy groups and amino groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being unsaturated
- C07C215/28—Compounds containing amino and hydroxy groups bound to the same carbon skeleton having hydroxy groups and amino groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being unsaturated and containing six-membered aromatic rings
- C07C215/30—Compounds containing amino and hydroxy groups bound to the same carbon skeleton having hydroxy groups and amino groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being unsaturated and containing six-membered aromatic rings containing hydroxy groups and carbon atoms of six-membered aromatic rings bound to the same carbon atom of the carbon skeleton
- C07C215/32—Compounds containing amino and hydroxy groups bound to the same carbon skeleton having hydroxy groups and amino groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being unsaturated and containing six-membered aromatic rings containing hydroxy groups and carbon atoms of six-membered aromatic rings bound to the same carbon atom of the carbon skeleton containing hydroxy groups and carbon atoms of two six-membered aromatic rings bound to the same carbon atom of the carbon skeleton
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C219/00—Compounds containing amino and esterified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton
- C07C219/34—Compounds containing amino and esterified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton having amino groups and esterified hydroxy groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings of the same carbon skeleton
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C223/00—Compounds containing amino and —CHO groups bound to the same carbon skeleton
- C07C223/06—Compounds containing amino and —CHO groups bound to the same carbon skeleton having amino groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings of the carbon skeleton
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C229/00—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton
- C07C229/52—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings of the same carbon skeleton
- C07C229/54—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings of the same carbon skeleton with amino and carboxyl groups bound to carbon atoms of the same non-condensed six-membered aromatic ring
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C233/00—Carboxylic acid amides
- C07C233/01—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
- C07C233/16—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by singly-bound oxygen atoms
- C07C233/24—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by singly-bound oxygen atoms with the substituted hydrocarbon radical bound to the nitrogen atom of the carboxamide group by a carbon atom of a six-membered aromatic ring
- C07C233/25—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by singly-bound oxygen atoms with the substituted hydrocarbon radical bound to the nitrogen atom of the carboxamide group by a carbon atom of a six-membered aromatic ring having the carbon atom of the carboxamide group bound to a hydrogen atom or to a carbon atom of an acyclic saturated carbon skeleton
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D207/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
- C07D207/46—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with hetero atoms directly attached to the ring nitrogen atom
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D213/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
- C07D213/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
- C07D213/04—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
- C07D213/24—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom with substituted hydrocarbon radicals attached to ring carbon atoms
- C07D213/36—Radicals substituted by singly-bound nitrogen atoms
- C07D213/38—Radicals substituted by singly-bound nitrogen atoms having only hydrogen or hydrocarbon radicals attached to the substituent nitrogen atom
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D213/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
- C07D213/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
- C07D213/04—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
- C07D213/24—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom with substituted hydrocarbon radicals attached to ring carbon atoms
- C07D213/54—Radicals substituted by carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals
- C07D213/56—Amides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D317/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having two oxygen atoms as the only ring hetero atoms
- C07D317/08—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having two oxygen atoms as the only ring hetero atoms having the hetero atoms in positions 1 and 3
- C07D317/10—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having two oxygen atoms as the only ring hetero atoms having the hetero atoms in positions 1 and 3 not condensed with other rings
- C07D317/14—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having two oxygen atoms as the only ring hetero atoms having the hetero atoms in positions 1 and 3 not condensed with other rings with substituted hydrocarbon radicals attached to ring carbon atoms
- C07D317/16—Radicals substituted by halogen atoms or nitro radicals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D317/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having two oxygen atoms as the only ring hetero atoms
- C07D317/08—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having two oxygen atoms as the only ring hetero atoms having the hetero atoms in positions 1 and 3
- C07D317/10—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having two oxygen atoms as the only ring hetero atoms having the hetero atoms in positions 1 and 3 not condensed with other rings
- C07D317/14—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having two oxygen atoms as the only ring hetero atoms having the hetero atoms in positions 1 and 3 not condensed with other rings with substituted hydrocarbon radicals attached to ring carbon atoms
- C07D317/28—Radicals substituted by nitrogen atoms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D401/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom
- C07D401/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings
- C07D401/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/44—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0002—Antibodies with enzymatic activity, e.g. abzymes
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Description
108437
Molekyylit, jotka sisältävät vasta-aineenyhdistämiskohtaosia, jotka katalysoivat hydrolyysireaktioita
Kuvaus 5 Ristiviittaus liittyviin hakemuksiin Tämä on jatkohakemus yhdessä haetulle US-patenttihakemukselle 470924, jätetty 26. tammikuuta 1990Jonka esitykset liitetään tähän viitteeksi.
Tekniikan ala Tämä keksintö koskee vasta-aineita, antigeenejä ja immunogeenejä ja erityisemmin 10 molekyylejä, jotka sisältävät vasta-aineenyhdistämiskohtaosan, joka sitoo amidi- tai esterihydrolyysisiirtymätilan tetraedrisen hiiliatomin ja ympäröivät rakenteet ja aikaansaa edelleen kohdan hydrolysoituvan amidi- tai esterisidoksen happo-emäs- tai nukleofnliselle katalyysille.
Keksinnön tausta 15 Ligandien ja reseptorien välisellä sitoutumisilmiöllä on useita ratkaisevia merkityksiä biologisissa järjestelmissä. Esimerkinomaisia tällaisista ilmiöistä ovat happimolekyylien sitoutuminen deoksihemoglobiiniin muodostaen oksihemoglobiinia ja substraatin sitoutuminen siihen vaikuttavaan entsyymiin, kuten proteiinin ja prote-aasin, kuten trypsiinin, välinen. Edelleen muita esimerkkejä biologisista sitoutu-. /20 misilmiöistä ovat mm. antigeenin sitoutuminen vasta-aineeseen ja komplementti-; . komponentin C3 sitoutuminen nk. CRl-reseptoriin.
« · * : *.: Myös useiden lääkkeiden ja muiden terapeuttisten aineiden uskotaan olevan riippu- • · ·*.*·: vaisia sitoutumisilmiöistä. Esimerkiksi opiaattien, kuten morfiinin, kuvataan sitou- tuvan spesifisiin reseptoreihin aivoissa. Opiaattiagonistien ja -antagonistien kuva-25 taan kilpailevan lääkkeiden, kuten morfiinin, kanssa näistä sitoutumiskohdista.
’ / Ligandit, kuten ihmisen tekemät lääkkeet, kuten morfiini ja sen johdannaiset, ja ne, • · jotka ovat luonnollisesti läsnä biologisissa järjestelmissä, kuten endorfiinit ja hor-monit, sitoutuvat reseptoreihin, jotka ovat luonnollisesti läsnä biologisissa järjes-.*·*. telmissä, ja ne käsitellään tässä yhdessä. Tällainen sitoutuminen voi johtaa jouk-, ·. 30 koon biologisia ilmiöitä, mukaan lukien erityisesti amidi- ja esterisidosten hydro- • · · ; lyysi, kuten sellainen, jossa proteiinit hydrolysoituvat ainesosapolypeptideiksi ent- • · syymillä, kuten trypsiinillä tai papaiinilla, tai jossa rasvaa pilkotaan glyseriiniksi ja kolmeksi karboksyylihapoksi vastaavasti.
2 108437
Slobin, Biochemistry 5 (1966) 2836-2844, kuvasi vasta-aineiden valmistamisen naudan seerumialbumiinin p-nitrokarbobentsoksikonjugaatille. Sen jälkeen näitä vasta-aineita käytettiin p-nitrofenyyliasetaatti- ja epsilon-aminokaproaattiestereiden hydrolysoimiseen. Asetaattiesterin reaktiota kuvattiin toisen kertaluvun nopeusva-5 kiolla ja sanottiin, että se vaikuttaa ei-spesifiseltä. Normaalia gammaglobuliinia käyttämällä saadun toisen kertaluvun nopeusvakion sanottiin olevan suunnilleen yhtä suuri kuin spesifisesti valmistettujen vasta-aineiden. Erityisesti valmistettujen vasta-aineiden läsnäolon sanottiin estävän aminokaproaattiesterin hydrolyysin.
Kohen ja avustajat kuvasivat myös yritykset esterolyysin katalysoimiseksi vasta-10 aineita käyttämällä. Tämän ryhmän käyttämät vasta-aineet oli jokaisessa tapauksessa herätetty viime kädessä käytetyn substraattimolekyylin osaa vastaan, joka ei sisältänyt hydrolysoitavaa sidosta.
Heidän ensimmäisessä työssään [FEBS Letters, 100 (1979) 137-140 ja Biochim. Biophys. Acta, 629 (1980) 328-337] käytettiin anti-steroidivasta-aineita hydro-15 lysoimaan steroidin karboksietyylitioeetterin 7-umbelliferoni- (7-hydroksikuma-riini)estereitä. Kussakin tapauksessa havaittiin hydrolyyttisen nopeuden lisäys verrattuna taustaan tai normaalilla IgG:llä saatuun nopeuteen verrattuna. Kummassakin tapauksessa vaihtokertoimet olivat alhaiset (noin 1 mooli substraatteja/mooli vasta-ainetta/min, tai alle), ja reaktionopeudet hidastuivat ajan myötä saavuttaen vasta-20 aineen kyllästystason. Tämä nopeuden hidastuminen johtui steroidihappotuotteen ir- • · · 4 ’ . reversiibelistä sitoutumisesta vasta-aineeseen.
I ' ' Kohen et ai. kuvasi myös 7-[-N-(2,4-dinitrofenyyli)-6-aminoheksanoyyli]kuma-riinin hydrolyysit käyttämällä monoklonaalisia vasta-aineita, jotka oli herätetty tä-män substraattimolekyylin dinitrofenyyliosia vastaan [FEBS Letters, 111 (1980) » · .♦:*25 427-431]. Myös tässä kuvattiin nopeuden kasvu taustaan verrattuna, mutta reaktion sanottiin olevan paremminkin stökiometrisen kuin katalyyttisen. Kuvattiin nollaa . lähestyvä nopeuden lasku, kun saavutettiin vasta-aineen saturaatio. Jälleen lasku johtui tuoteinhibitiosta, jonka aiheutti tuotehapon sitoutuminen vasta-aineeseen, • · ···’ koska jonkin verran alkuperäisestä hydrolyysiaktiivisuudesta voitiin regeneroida : V 6 0 vasta-aine/substraattituoteseoksen kromatografialla.
• i · • · *;* Kun voimakasta vasta-ainesitoutumista ohjataan substraattimolekyylien stabiileihin • · : tiloihin, kompleksin hidas dissosiaationopeus estää katalyysin. Tilanteen uskotaan ':": olevan tällaisen Kohenin ja apulaisten kuvaamien tulosten kohdalla.
3 108437
Vaikka edellä olevat konstruktiot ovatkin kiinnostavia, niillä on vakavina rajoituksina sitoutumisenergian mekanismin hyödyntämisessä epäonnistuminen, mikä on olennaista entsyymeillä [W. P. Jencks, Adv. Enzymol. 43 (1975) 219].
Nämä puutteet voidaan korjata käyttämällä hapteenina siirtymätila-analogia haluttu -5 jen vasta-aineiden aikaansaamiseen. Tämä hapteeni voi omaksua inhibiittorin tehtävän katalyyttisessä järjestelmässä.
Siten immunologista sitoutumista voidaan käyttää sitoutumisvuorovaikutusten kääntämiseen kokeellisesti katalyyttisiksi prosesseiksi. Ehdotettiin esimerkiksi, että määrätyn reaktion siirtymätilaa muistuttavan hapteeniryhmän vasta-aineen käytön 10 pitäisi aiheuttaa substraattireaktion nopeutuminen pakottamalla substraatit muistuttamaan siirtymätilaa. Jencks, W.P., Catalysis in Chemistry and Enzymology, s. 288 (McGraw-Hill, New York 1969). Tästä laajasta esityksestä huolimatta ei ehdotettu spesifisiä siirtymätilahapteeneja eikä ehdotettu spesifisiä reaktioita, joissa konseptia voitaisiin testata.
15 Amidi- ja esterisidosten hydrolyysin ajatellaan olevan nykyisin hyväksytty kemiallinen teoria edettäessä vesiväliaineessa reaktiolla karbonyylihiiliatomissa siirtymätilan muodostamiseksi, joka sisältää tetraedrisen hiiliatomin, joka on sitoutunut (a) amidin tai esterin happo-osan hiiliatomiin, (b) kahteen happiatomiin, joista toinen on karbonyyliryhmästä ja toinen on väliaineen hydroksyyli-ionista tai vesimolekyy · • '20 listä, ja (c) esterin alkoholiosan happiatomiin tai amidin amiiniosan typpiatomiin.
Tällaisten reaktioiden siirtymätilat ovat käyttökelpoisia ajateltavissa olevia konst- • ruktioita, joita määritelmän mukaan ei voida eristää verrattuna välituotteisiin, jotka : ’ · *: ovat eristettävissä. Vaikka edellä olevia hydrolyyttisiä siirtymätiloja ei voida eristää, on kohteelle omistettu runsaasti tieteellistä kirjallisuutta.
»«« • ♦· *·* *25 Vaikka uskotaan, että edellä kuvattu amidin ja esterin hydrolyysin siirtymätila on hyvin ymmärretty, ei topologian parametrejä, esimerkiksi, kokoa, muotoa ja varaus- *:**· ta reseptorinsitomiskohdilla, joissa erityiset amidit kuten proteiinit, tai esterit, kuten • · · rasvat, reagoivat näiden siirtymätilojen kautta, ole ymmärretty yhtä hyvin. Tämän vuoksi olisi edullista, jos tunnettaisiin useiden sitoutumiskohtien topologia niin, että .*•*.30 voitaisiin tutkia vuorovaikutuksia ligandeilla, jotka sitoutuvat noihin kohtiin. Epä-• · onneksi reseptorinsitomiskohtien topologia biologisissa hydrolyyseissä on yleensä : tuntematon, lukuun ottamatta suhteellisen pientä joukkoa entsyymejä, joiden rönt· *:: genkiderakenteet on määritetty.
4 1 O 8 4 37 Tämä sitoutumiskohtatopologian tiedon puute johtuu osaksi siitä, ettei tunneta edes useiden reseptorien sitoutumiskohtien sijaintia soluissa. Lisäksi niillä reseptorinsi-tomiskohdilla, joiden sijainti on tunnettu, on sitoutumiskohdan kemiallinen identiteetti, ts. proteiini- ja hiilihydraattikoostumus, yleensä tuntematon. Siten tutkijalla 5 on yleensä esteitä yrittäessään ymmärtää reseptorinsitomiskohtien topologisia vaatimuksia ja sen vuoksi yrittäessään konstruoida terapeuttisia aineita, jotka voivat täyttää nuo vaatimukset.
Tutkijoiden on sen vuoksi seulottava mahdollisia terapeuttisia aineita eläin- tai so-lukasvatustutkimuksissa varmistaakseen, voiko mahdollinen terapeuttinen aine olla 10 käyttökelpoinen. Vaikka tällaiset järjestelmät ovat käyttökelpoisia, niiden käyttö on kallista ja aikaa vaativaa.
Vaikka hydrolyyttisen reseptorin, kuten entsyymin, topologia ja kemiallinen reaktiivisuus ovat tunnetut, entsyymit, kuten hydrolyyttiset proteaasit, katkaisevat sub-straattinsa, polypeptidiketjut, tyypillisesti erityisen aminohappotähteen vierestä, jo-15 ka voi esiintyä proteiinin polypeptidiketjussa useita kertoja. Vaikka tällainen suhteellinen sattumanvarainen katkaisu voi olla käyttökelpoista proteiinin polypepti-dikartan saamisessa, tämä suhteellisen sattumanvarainen katkeaminen ei ole yhtä käyttökelpoista, kun on toivottavaa tuottaa erityisiä aminohappotähdesekvenssejä.
Esimerkiksi nykyaikaiset yhdistelmä-DNA-tekniikat ovat olleet käyttökelpoisia : ’' 20 valmistettaessa fuusioproteiineja, jotka sisältävät haluttua proteiinia tai polypeptidiä :.i,: fuusioituna vektorigeenin, kuten lac z-geenin, transkriptiotuotteeseen. Tällaisten j \ : fuusioproteiinien käyttöä estää kuitenkin vektorigeenituotteen fragmenttien läsnä- olo. Sen vuoksi olisi myös eduksi, jos voitaisiin kehittää proteolyyttisiä entsyy-mityyppisiä molekyylejä, jotka katkaisisivat tällaiset fuusiotuotteet toivotun ja ei- ♦ ♦ . * :· 25 toivotun fuusiopolypeptidi- tai -proteiiniosan välistä.
Viime aikoina Lemer, Tramontano ja Janda [Science, 234 (1986) 1566] ovat ku- « vanneet monoklonaaliset vasta-aineet, jotka hydrolysoivat esteriä katalyyttisesti.
* * *
Tramontano ja Lemer kuvaavat myös monoklonaalisten vasta-aineiden käytön este-.v. rien hydrolysoimiseen US-patenttijulkaisussa 4656567. Pollack, Jacobs ja Schultz .•••30 [Science 1570 (1986) 234] kuvasivat myeloomaproteiinin, jota kutsutaan nimellä MOPC167 [Leon et ai., Biochem. 10 (1971) 1424] ja joka katalysoi karbonaatin • « :.: : hydrolyysiä.
• · Näissä kahdessa Lemer- ja Tramontano-kuvauksessa vasta-aineet herätettiin fosfo-naattia vastaan, joka syntetisoitiin edustamaan karboksyylihappoesterin tai karbo- ί 5 108437 naattiesterin tetrahedraalisen hydrolyyttisen siirtymätilan stabiilia analogia. Pääasiallisesti käsitelty Pollack et ai. -vasta-aine oli myeloomaproteiini, joka sattui sitoutumaan fosfonaattiin, joka oli rakenteellisesti analoginen hydrolysoidulle karbonaat-tianalogille.
5 Siten Lemer ja Tramontano et ai. -työssä hydrolysoitava substraatti oli ennalta valittu, jolloin immunisointianalogi ja hydrolyyttiset vasta-aineet syntetisoitiin halutun tuotteen mukaisesti. Pollack et ai. suunnitteli substraatin, joka hydrolysoituisi, kun he tuntisivat myeloomaproteiinin spesifisyyden. Pollack et ai. kuvasi (yllä) myös katalyyttinen vasta-aine-, substraatti- ja analogisubstraatti -järjestelmän olemassa-10 olon karbonaattihydrolyysia varten, joka oli konseptiltaan samanlainen kuin Lemer et al.:in. Tähän työhön liittyvä järjestelmä kuvataan julkaisussa: Jacobs et ai.; J. Am. Chem. Soc., 109 (1987) 2174.
Julkaistussa WO-patenttihakemuksessa 85/02414 kuvataan vasta-aineiden mahdollinen käyttö katalysaattoreina ja esitetään tietoja, jotka liittyvät polyklonaalisen see-15 rumin käyttöön o-nitrofenyyli-p-D-galaktosidia hydrolysoitaessa. Tässä sovellutuksessa käyttökelpoisten vasta-aineiden sanotaan olevan indusoitavissa reaktantilla, reaktiovälituotteella tai reaktantin, tuotteen tai reaktiovälituotteen analogilla. Käsite "analogi" määritetään tässä käsittämään isomeerit, homologit tai muut yhdisteet, jotka muistuttavat reaktanttia kemialliselta rakenteeltaan riittävästi niin, että analo-«. 20 gia vastaan herätetty vasta-aine voi osallistua immunologiseen reaktioon reaktantin i · tl kanssa muttei välttämättä katalysoi analogin reaktiota.
• I
: \: Tuossa julkaisussa esitetyt tiedot ilmaisevat vain, että jonkin verran substraatti(- re- i' ·': aktantti)galaktosidin katkeamista tapahtui 18 tunnin aikana käytettäessä suhteellisen konsentroitua vasta-ainevalmistetta (laimennokset 1:10 ja 1:20). Vaikka syyksi väi- • · tettiin katalyysiä, ei katalyyttistä aktiivisuutta osoitettu, koska väitettyä katalyyttisen vasta-aineen vaihtoa ei havaittu, eikä ilmaistu katkaistun substraattigalaktosidin %-osuutta. Tuossa patenttihakemuksessa ei ilmaistu, että β-D-galaktosidaasi katkaisi noin 10 kertaa niin paljon substraattia kuin polyklonaaliset vasta-aineet, olettaen ab- • « • · · * sorbanssin olevan lineaarista tutkitulla nimeämättömällä substraattikonsentraatiolla.
* * I • · · • * * t*.*t30 Tuossa patenttihakemuksessa esitetyistä tiedoista on mahdollista, että käytetyn vas- 4 4 ”* ta-aineen lysiinitähteen terminaalisella aminoryhmällä tapahtui o-nitrofenyyli- • · · ,· i ryhmän nukleotidistä korvautumista. Siten havaittu absorbanssi voisi olla johtunut '•' i epsilon-aminolysinyyli-o-nitrofenyylianiliinin muodostumisesta tai epsilon-amino- lysinyyli-galaktosidin ja o-nitrofenolin muodostumisesta, joista kummankaan esiin- , 108437 tyminen ei olisi katalyyttistä, koska vasta-ainetta kului, paremminkin kuin vaihdosta.
US-patenttijulkaisussa 4792446, Kim et ai, kuvataan vasta-ainekatalysaattoreiden tuottaminen. Nämä katalysaattorit reagoivat substraatin kanssa ja niitä synnyttää 5 hapteenimolekyyli, jolloin substraatti- ja hapteenimolekyyleillä on oleellisesta rakenteellista samankaltaisuutta muissa osissa kuin atomissa tai ryhmässä, jossa katalyyttinen reaktio tapahtuu, ts. reaktiokohdassa. Tässä reaktiokohdassa substraatti ja hapteeni poikkevat siinä, että hapteenin reaktiokohta tai katalyyttisesti aktiiviset keskukset sisältävät korkeamman valenssin ja yhden tai useita sidoksia kuin sub-10 straatin analoginen rakenne sisältää.
Lisäksi hapteeni sisältää ryhmän, joka on sitoutunut molekyylin katalyyttisesti aktiiviseen osaan, ts. substraatin reaktiivisen kohdan rakenteellisesti analogisen osan. Tämän mainitun ryhmän sanotaan olevan käyttökelpoinen lisäämään katalysaattori-vasta-aineeseen positiivisen ionivarauksen, kuten -CO2 -ryhmällä, tai negatiivisen 15 ionivarauksen, kuten ammoniumionilla. Tämän lisätyn ryhmän sanotaan myös kor vaavan substraatin -OH:n, muodostavan polaarisia ympäristöjä, muodostavan ei-poolisia ympäristöjä tai aikaansaavan onkalolta vettä varten.
Lemer et ai, BioAssays 9 (1988) 107-112 kuvaa myös immunisoivan hapteenin io-nisesti varatun ryhmänkäytön indusoimaan vastakkaisesti varautuneen ryhmän läs-' '20 näolon vasta-aineenyhdistämiskohtaosa niin, että happo/emäs-katalyysiä voidaan helpottaa käyttämällä varaamatonta substraattia. Tätä strategiaa katalyyttisten vasta- • ’.· aineiden indusoimiseen kutsutaan julkaisussa nimellä "tärppää ja katkaise" siksi, et- : ’ · ‘: tä katalyyttinen vasta-aine indusoidaan tai houkutellaan varautuneella hapteenilla, ja indusoidun vasta-ainekatalysaattorin substraatti katkaistaan neutraaliksi molekyy- • » .’Γ.25 liksi niin että komplementaarista ionivarausta, joka on indusoitu vasta-aineessa hapteenin ionivaraukselle, voidaan käyttää neutraalin substraatin reaktion happo/emäs-katalyysin aikaansaamiseen. Ei kuitenkaan kuvata spesifisiä hapteenirakenteita t··' "tärppää ja katkaise"-strategian suorittamiseksi.
♦ « » ♦ . y. Keksinnön lyhyt yhteenveto ,*•*,30 Tämä keksintö koskee vasta-ainemolekyyliä tai molekyyliä, joka sisältää vasta-« « aineenyhdistämiskohtaosan (katalyyttisen molekyylin), joka hydrolysoi katalyytti-: · : sesti reaktanttiligandin ennalta valittua karboksyylihappoamidista tai -esterisidosta, * - ; menetelmiä tällaisen molekyylin valmistukseen ja käyttöön ja soluja, jotka tuottavat katalysaattorimolekyyliä.
7 108437
Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa.
Katalyyttisesti aktiiviset molekyylit ovat edullisesti monoklonaalisia vasta-aine-molekyylejä tai molekyylejä, jotka sisältävät monoklonaalisia vasta-aineen-yhdistämiskohtaosia. Noiden molekyylien vasta-aineenyhdistämiskohtaosa immu-5 noreagoi (sitoutuu) ainakin kahdessa ligandimolekyylissä. Ensimmäinen ligandi-molekyyli on reaktanttiligandi, joka sisältää ennalta valitun karboksyylihappoamidi-tai esterisidoksen, joka hydrolysoidaan, samoin kuin hiiltä sisältävän kemiallisen tähteen, joka on sitoutunut hydrolysoitavan sidoksen kuhunkin karboksyylihappo-ja amiini- tai alkoholiosaan.
10 Toinen ligandi on hapteeniligandi, joka käytetään suoraan tai epäsuorasti katalyyttisten molekyylien indusoimiseen. Hapteeniligandi on rakenteellisesti reaktanttili-gandille analoginen, ja sisältää tetraedrisen hiiliatomin liittyneenä hydroksyyliryh-mään ja tyydytettyyn hiiliatomiin hapteeniligandissa asemaan, joka vastaa karbo-nyyliryhmän asemaa, ja karbonyylisitoutuneeseen heteroatomiin, vastaavasti, hyd-15 rolysoitavassa esivalitussa reaktanttiligandikarboksyylihappoamidissa tai -esterissä.
0 O
1 II
Siten esimerkiksi amidi- (-C-NH-) tai esteri- (-C-O-)-sidos on hydrolysoituva reak-tanttiligandissa, hapteeniligandi
:' '20 OH
yv I
:' ·': sisältää ryhmän -CH-CH2- asemassa, joka on analoginen esteri- tai amidisidoksen sisältävälle ryhmälle. Hiiltä sisältävät kemialliset tähteet, jotka ovat liittyneet hap- • · : teenin tetraedriseen hiiliatomiin ja tyydytettyyn hiiliatomiin, ovat rakenteellisesti .·:·25 analogisia (samanlaisia) kemiallisille tähteille, jotka ovat liittyneet reaktanttiligan-din karboksyyliosaan ja amiini- tai alkoholiosaan, vastaavasti.
« ‘: *' ♦ Hapteeniligandi sisältää myös ryhmän, jossa on ionivaraus vesiliuoksessa fysiologi- *”*: sissa pH-arvoissa. Tämä ionivarauksen sisältävä ryhmä puuttuu reaktanttiligandin ,·*·. vastaavasta asemasta ja sijaitsee pallomaisen tilavuuden sisällä, jonka määrittää sä-• ♦ · !.*30 de noin 0,7, ja edullisemmin noin 0,2 - noin 0,5 nm edellä mainitusta hydroksyyli-*; * ryhmään liittyneestä tetraedrisestä hiiliatomista. Ionisen varauksen sisältävä ryhmä •. - · aikaansaa edullisesti karboksylaatti- tai ammoniumionin vesiliuoksessa fysiologisil- •:": la pH-arvoilla.
8 108437
Reaktanttiligandi voidaan esittää rakenteella O
II
r‘-c -x-r2 5 jossa R ja R ovat reaktantin hiiliatomipitoisia kemiallisia tähteitä, ja -X- on -O- tai -NR3-, jossa R3 on vety tai kolmas hiiltä sisältävä kemiallinen tähde. Hapteeniligan-di voidaan esittää rakenteella
OH
10 R1,-CH-CHR3'-R2'
1 O
jossa R ' ja R ' ovat hiiliatomin sisältäviä tähteitä, jotka ovat rakenteellisesti analogisia ryhmille R1 ja R2, vastaavasti. Ainakin toinen ryhmistä R1' ja R2' sisältää ryhmän, jossa on ionivaraus vesiliuoksessa fysiologisilla pH-arvoilla, ja että ionisesti varautunut ryhmä sijaitsee pallomaisen tilavuuden sisällä, jonka määrittää säde noin
15 OH
i 0,7, ja edullisesti noin 0,2 - noin 0,5 nm mainitun rakenteen -CH-ryhmästä. R3' on H, kun -X- on -O-, tai R3' on rakenteellisesti analoginen R3:lle kun -X- on -NR3-.
: ·' · Otetaan huomioon myös solut, jotka tuottavat edellä kuvattuja katalyyttisiä mole- f 20 kyylejä kasvatettaessa sopivassa in vivo tai in vitro -väliaineessa. Edullisesti nämä : solut eivät ainoastaan tuota katalyyttisiä molekyylejä, vaan myös erittävät nämä ka- : ‘ ·': talyyttiset molekyylit kasvatusväliaineeseen. Yksi tällainen edullinen solutyyppi on hybridoomasolu.
• · « ·· • · · *·* * Otetaan myös huomioon menetelmä edellä olevien solujen valmistamiseksi. Tässä 25 eläin immunisoidaan immunogeenillä, joka sisältää edellä kuvattua hapteeniligan- dia, jota on läsnä riittävä määrä indusoimaan eläimessä hapteenin vasta-aineita.
*3*; Eläintä ylläpidetään riittävä ajanjakso, jotta eläin erittäisi vasta-aineita, jotka . 4 ·. immunoreagoivat hapteeniligandin kanssa.
♦ · · • ·
Geenejä, jotka koodittavat vasta-ainemolekyylejä tai molekyylejä, jotka sisältävät : ;';30 vasta-aineenyhdistämiskohtaosia, siirretään ylläpidetyistä, immunisoiduista vasta-.... .· ainetta tuottavista soluista isäntäsoluihin hybridisolujen muodostamiseksi. Nuo hyb-ridisolut sisältävät geenejä ainakin kahdesta lähteestä. Kasvatettaessa hybridisolut tuottavat vasta-ainemolekyylejä tai molekyylejä, jotka sisältävät vasta-aineen- 9 ’08437 : yhdistämiskohtaosia siirretyistä geeneistä, ja näitä soluja voidaan kasvattaa olennaisen epämääräisen ajan verrattuna geeninsiirto-vasta-ainetta tuottaviin soluihin.
Hybridisoluja kasvatetaan sopivassa väliaineessa ja sopivissa kasvatusolosuhteissa riittävä ajanjakso, jotta nämä hybridisolut tuottaisivat vasta-ainemolekyylejä tai mo-5 lekyylejä, jotka sisältävät vasta-aineenyhdistämiskohtaosia, jotka otetaan talteen ja seulotaan sitten hybridisolun tunnistamiseksi, joka tuottaa vasta-ainemolekyylejä tai molekyylejä, jotka sisältävät vasta-aineenyhdistämiskohtaosia, jotka hydrolysoivat reaktanttiligandin ennalta määrätyn karboksyylihappoamidi- tai -esterisidoksen ka-talyyttisesti. Sitten kasvatetaan tunnistetun hybridisolun klooneja.
10 Otetaan myös huomioon menetelmä ennalta valitun esteri- tai amidisidoksen hydro-lysoimiseksi katalyyttisesti reaktiivisessa ligandissa. Tässä katalyyttisesti tehokas määrä edellä kuvattuja katalyyttisiä molekyylejä sekoitetaan reaktantti-ligandimolekyylien kanssa vesiväliaineessa reaktioseoksen muodostamiseksi. Reak-tioseosta ylläpidetään riittävä ajanjakso reaktanttiligandimolekyylien sitoutumiseksi 15 katalyyttisiin molekyyleihin ja jotta katalyyttiset molekyylit hydrolysoisivat ennalta valitun sidoksen katalyyttisesti ja muodostaisivat hydrolyysituotteita. Tämän jälkeen voidaan ottaa talteen yksi tai useita muodostuneita tuotteita.
Piirrosten lyhyt kuvaus
Piirroksissa, jotka muodostavat osan tästä kuvauksesta.
. . '20 Kuvio 1 kuvioissa IA ja IB kuvaa spesifisten hapteeniligandien (Yhdisteet la, 2, ::·. 5a, 6 ja 7), inhibiittorin (Yhdiste Ib), substraatin tai reaktanttiligandin (Yhdiste 3) ja |tässä kuvatun ja käytetyn reaktioyhdisteen 4 rakennekaavoja.
« 1 • · ·Υ·: Kuvio 2 on kaavio, jossa esitetään kaksi pH-arvoa log K -arvon funktiona. Yläosa :T: (kuvio 2A) kuvaa kaaviota log k^tp-arvosta pH-arvon funktiona log-arvoilla välillä 25 -3 ja -2 (umpinaiset ympyrät) reaktanttiligandiyhdiste 3:n monoklonaalisella vasta- aineella 30C6 katalysoidulla reaktiolla. Pisteiden kautta kulkeva linja laskettiin • ’ “: käyttämällä yhtälöä • · · :V: K, kg?-OM-· • · ·
: J-.30 Ka + aH
* I ♦ · ';Alaosassa (kuvio 2B) esitetään kaavio k£bs -arvosta pH:n funktiona log-arvoille välillä -9,5 ja -7,0 (umpinaiset kolmiot) yhdisteen 3 reaktiolle ekstrapoloituna pusku-rikonsentraatioon nolla. Laskettu linja saatiin käyttämällä yhtälöä 108437 ίο k‘bs =Ko + Hoh-[OH-].
pH-arvot molemmille kuvioille ovat välillä 5,5 ja 8,5. Arvot suureille kcat, Ka (pKa), ko ja koH- esitetään jäljempänä luvussa Tulokset.
Kuvio 3 on kaksiosainen kaavio, joka on samanlainen kuin kuvio 2. Yläosa (kuvio 5 3A) kuvaa kaaviota log k^f :sta pH:n funktiona log-arvoille välillä noin -3 ja noin - 1 (umpinaiset ympyrät) reaktanttiligandiyhdiste 3:n monoklonaalisella vasta-aineella 27A6 katalysoidulla reaktiolla.
Kuvion 3 alaosassa (kuvio 3B) esitetään kaaviot log kobs^stä (havaittu nopeusvakio) 10 pH:n funktiona log-arvoille noin -8 - noin -6 (umpinaiset kolmiot) yhdisteen 3 hyd-rolyysireaktiolle katalysoituna monoklonaalisella vasta-aineella 27A6. Umpinaiset neliöt liittyvät log k0bsd-arvoon pH:n funktiona samalle reaktiolle ekstrapoloituna puskurikonsentraatioon nolla. Laskettu linja saatiin käyttämällä yhtälöä
Kobsd= Koh-[OH ].
15 Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus I. Johdanto Tämä keksintö koskee vasta-ainemolekyylejä tai molekyylejä, jotka sisältävät sen vasta-aineenyhdistämiskohtaosia, joita voidaan yhteisesti kutsua reseptoreiksi tai :·'· katalyyttisiksi molekyyleiksi, joita indusoi hapteeniligandi, joka on rakenteeltaan :. f .20 analoginen reaktanttiligandille. Hapteeniligandi matkii steerisesti siirtymätilan kon-: ·': formaatiota muttei ionivarausta reaktiosekvenssissä reaktanttiligandin esteri- tai : ‘ : amidisidoksen hydrolysoimiseksi. Katalyyttiset molekyylit [vasta-ainemolekyylit tai molekyylit, jotka sisältävät vasta-aineenyhdistämiskohta(paratooppisia)osia] sitou-tuvat hapteeniligandiin ja reaktanttiligandiin. Katalyyttisten molekyylien ajatellaan 25 stabiloivan reaktanttiligandin ennalta valitun osan hydrolyyttistä siirtymätilaa, sa-. moin kuin aikaansaavan ionisesti varautuneen aminohappotähteen, joka myötävai-kutiaa happo/emäs- tai nukleofiiliseen katalyysiin katalysoitua hydrolyysireaktiota * « ···’ varten. Nämä molekyylit hydrolysoivat reaktanttiligandia katalyyttisesti.
• · • · « • · · # ’. ‘ Vasta-aineet j a entsyymit ovat molemmat proteiinej a, j oiden toiminta riippuu niiden 30 kyvystä sitoutua spesifisiin kohdemolekyyleihin. Entsymaattiset reaktiot poikkeavat :, · i immunologisista reaktioista siinä, että entsymaattisessa reaktiossa entsyymin sitou-: "i tuulinen substraattiinsa johtaa tyypillisesti kemialliseen katalyysiin, kun taas ei-katalyyttinen kompleksi on tavallinen seuraus vasta-aine/antigeeni-sitoutumisesta.
11 108437
Entsyymien uskotaan katalysoivan proteiinien hydrolyysiä yhdistymällä proteiinin kanssa hydrolyysireaktion siirtymätilan stabilisoimiseksi. Yleisesti uskotaan, että entsymaattisen reaktion nopeus kasvaa suhteessa ei-entsymaattisen reaktion nopeuteen johtuen entsyymin kyvystä stabiloida reaktion siirtymätila, ts. alentaa siirtymä-5 tilan vapaaenergiaa, ja siten reaktion aktivoitumisen vapaaenergiaa (free energy of activation) [Jencks, W.P., Adv. Enzymology 43, 219 (1975) ja Pauling, L., Amer. Scientist 36 (1948) 58]. Tätä teoriaa tukee havainto, että aineet, joiden ajatellaan olevan mallina oletetuille siirtymätiloille, sitoutuvat entsyymeihin usein voimakkaammin kuin kompetitiiviset inhibiittorit. Leinhard, G., Science 180 (1973) 149 ja 10 Wolfenden, R., Acc. Chem. Res. 5 (1972) 10. Edelleen ajatellaan, että entsyymi toteuttaa tämän reaktion vapaaenergian alentamisen sitoutumalla reaktantin siirtymäti -lageometriaan voimakkaammin kuin se sitoutuu vastaavaan substraatt(e)i(h)in tai tuotteeseen(tuotteisiin).
Tämä tarkoittaa, että entsyymin luontainen sitoutumisenergia on paljon suurempi 15 kuin mitä voidaan niitata substraattien tai tuotteiden sitoutumisesta. Oleellisesti, entsyymin sitoutumisenergiaa käytetään kemiallisen reaktion suorittamiseen [Jencks, W.P., XVII International Solvay Conference (marraskuu 1983)].
Päinvastainen ehdotus on, että vasta-aine, joka valmistetaan sitomaan optimaalisesti sopivaa siirtymätilan jäljitelmää, toimisi katalysaattorina. Tämän tuloksen osoitta-. 20 minen täydentää entsyymitoiminnan ja vasta-ainerakenteen korrelaatiota ja antaa • ’ '' käyttöön käyttökelpoisen lähestymistavan keinotekoisten entsyymien suunnitteluun.
• * I
• « ; ‘ : Tässä kuvatun immunologisen hydrolyysin perusajatus ottaa huomioon hapteenili- • * ; v; gandin käytön indusoitaessa ennalta määrätyn spesifisyyden omaavia vasta-aineita, : jotka (a) sitoutuvat valikoivasti ja täten stabiloivat amidi- tai esterisidoksen hydro- • · * .•;/25 lyysin siirtymätilaa määriteltyyn reaktanttiligandiin sitoutumisen jälkeen ja (b) ai-• · · kaansaavat oletettavasti ionisesti varautuneen happo/emäs- tai nukleofiilistä reaktio-. ta katalysoivan aminohappotähteen indusoidussa liittymiskohdassa. Tässä käyttöjä* kelpoinen hapteeniligandi simuloi amidi- tai esterihydrolyysissä suurienergisen siir-* · » tymätilan konformaatiota muttei ionivarausta indusoimaan vasta-aineiden muodos- ;Y;30 lumista, joilla on kyky sitoa sukulaissubstraatteja (reaktanttiligandeja) ja stabiloi-• · .···. maan niiden hydrolyysejä. Hapteeniligandi sisältää myös ryhmän, joka aikaansaa ionivarauksen vesiliuoksessa fysiologisilla pH-arvoilla indusoimaan vastakkaisesti | varautunutta aminohappotähdettä vasta-aineenyhdistämismiskohtaosassa. Tämän ‘: ; vastakkaisesti varautuneen aminohappotähteen uskotaan aikaansaavan happo/emäs-3 5 tai nukleofiilisen reaktion katalyyttisen vaikutuksen.
12 108437 Tällaisesta suosivasta sitoutumisesta ja stabilisoimisesta on tuloksena hydrolyysire-aktion aktivaatioenergian aleneminen, täyttäen täten katalyysin kiteerin. Varautuneen aminohappotähteen läsnäolo liittymiskohdassa voi matkia varautuneita tähteitä, jotka ovat läsnä proteolyyttisten entsyymien, kuten seriiniproteaasien, aktiivisis-5 sa kohdissa. Vasta-aineita, joilla on tämä ominaisuus, voidaan saada immunisoimal la synteettisillä hapteeneilla, jotka ovat kemiallisesti modifioituja indusoimaan varautuneita tähteitä, samoin kuin muistuttamaan sidoshydrolyysiin osallistuvan sub-straattireaktanttiligandin sitoutumisominaispiirteitä, ts. immunisoimalla erityisen reaktion siirtymätilan steerisellä matkijalla.
10 Monoklonaalisten vasta-aineiden on osoitettu katalysoivan joukkoa asyylinsiirtore-aktioita [(a) Tramontano et ai. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83 (1986) 6736; (b) Tra-montano et ai. Science 234 (1986) 1566; (c) Jacobs et ai., J. Am. Chem. Soc. 109 (1987) 2174; (d) Napper et ai, Science 237 (1987) 1041; (e) Janda et ai. Am. Chem. Soc. 110 (1988) 4835; (f) Janda et ai, Science 241 (1988) 1199; (g) Janda et ai, 15 Science 244 (1989) 437], käyttämällä hapteenisia siirtymätilamalleja, [(Lemer et ai, BioAssays 9 (1988) 107-122].
Näiden myös abtsymeiksi kutsuttujen hydrolyyttisten vasta-aineiden tai reseptorien alan ja kykyjen laajentamiseksi on kehitettävä uusia strategioita katalyyttisen aktii visuuden aikaansaamiseksi vasta-aineiden liittymiskohdissa. Viimeaikaiset raportit • 20 ovat kohdistaneet huomion vasta-aineen sitoutumistaskun tai -kohdan modifiointiin « joko puolisynteettisillä menetelmillä [(a) Pollack et ai, Science, 242 (1988) 1038, ,;';' (b) Pollack et ai, J. Am. Chem. Soc.. 111 (1989) 1929] tai kohtasuunnatulla muta- • ·' geneesillä [Baldwin et ai., Science 245 (1989) 1104], Tällaisten strategioiden ylei- - .' syys voi vähentyä johtuen katalyyttisten vasta-aineiden saatavilla olevien rakenne- • · :· *25 tietojen puutteesta.
··« • · · • · «
Tunnettiin, että prosessi, joka voisi indusoida katalyyttisesti aktiivisia ryhmiä de . novo hapteeniantigeenistä, voisi osoittautua edullisemmaksi, koska immuunivasteen ... laajaa vaihtelevuutta voidaan käyttää hyväksi somaattisen mutaatioprosessin kautta • · ·; · * "in vivo"-mutageneesin suorittamiseen. Jäljempänä esitetyt tulokset kuvaavat taktii-: Y:30 kan, joka saa esille aminohappotähteen(tähteiden) indusoidun vasta-ainemolekyylin sitoutumiskohdan sisällä auttamaan missä hyvänsä asyylinsiirtoreaktiossa metodo-, . \ logialla, joka aikaisemmin kuvattiin "tärppää ja katkaise"-katalyysiksi.
':· Tässä olevaan suunnitelmaan liittyi ionivarauksen sijoittaminen antigeeni- tai hap- teeniligandiyhdisteen la (kuvio 1) sisälle hyvin lähelle hydrolysoitavaa asyyliryh-35 mää. Tätä hapteenia vastaan kohotettujen vasta-aineiden otaksutaan omaavan liit- 13 108437 tymiskohdassa aminohappotähteen(tähteitä), jo(i)lla on varauskomplementaarisuutta tähän hapteeniseen varaukseen [(a) Pressman et ai., J. Am. Chem. Soc. 68 (1946) 250; (b) Pressman et ai, J. Am. Chem. Soc. 75 (1953) 686; (c) Grossberg et ai., J. Am. Chem. Soc. 82 (1960) 5470; (d) Shokat et al., Nature (Lontoo), 338 (1989) 5 269].
Lisäksi yhdiste la esittää vasta-aineeseen hydroksyylisen ryhmän, jolla on tetrahe-draalinen geometria, joka toimii asyylinsiirtosiirtymätilan eteerisenä jäljitelmänä tai esityksenä. Tämä asema pidettiin varauksettomana niin, ettei ollut elektro staattisia lisävaikutuksia.
10 Bentsoaattisubstraatti- tai reaktanttiligandiyhdisteellä 3 (kuvio 1), joka vastaa hap-teeniyhdistettä la, on samanlaiset steeriset dimensiot (määritettynä MM2-laskelmista), mutta siitä puuttuu positiivinen varaus. Siten ionisesti varautunut aminohappotähde, jonka oletetaan olevan indusoidussa katalyyttisessä vasta-aineenyhdistämismiskohtaosassa, vapautuu ioniparinmuodostuksesta ja toimii mah-15 dollisena yleisenä happo/emäs- tai nukleofi ilisenä katalysaattorina.
Pyridiinihapteeniligandiyhdiste 2 (kuvio 1), toimii kontrollina, koska se on rakenteellisesti identtinen yhdisteen la kanssa, mutta siitä puuttuu metyyliryhmä ja varaus fysiologisissa pH-arvoissa. Varauksen komplementaarisuutta on käytetty aikaisemmin substraattiprotonin erottamiseen vasta-ainekatalysoidussa β-eliminointi · . .'.20 reaktiossa, vaikka ei suoritettu vertailua neutraaliin hapteeniin. Shokat et ai., Nature : (Lontoo) 338 (1989) 269.
• « · Käsitettä "reseptori" käytetään tässä tarkoittamassa biologisesti aktiivista molekyy-:m ·’ liä, joka sitoutuu reaktanttiligandiin, inhibiittoriligandiin tai hapteeniligandiin. Tä-män keksinnön mukaiset reseptori-(katalyyttinen)molekyylit ovat vasta-aineita, • · · *25 oleellisen käsittelemättömiä vasta-aineita tai vasta-aineidiotyypin sisältäviä poly-amidi-(paratooppipitoisia )osia.
« • · ... Reseptorimolekyylin biologisesta aktiivisuudesta on todisteena reseptorin sitoutu- *1* minen antigeeniseen reaktanttiligandiinsa, inhibiittoriligandiin tai hapteeniligandiin • · v.: niiden sekoittuessa vesiväliaineessa, ainakin fysiologisissa pH-arvoissa ja ionivah- :.,,:30 vuuksissa. Reseptorit sitoutuvat edullisesti myös antigeeniseen ligandiin pH- : arvoalueella noin 5 - noin 9 ja ionivahvuuksilla, joka on sama kuin tislatun veden - • « · ] ‘ ‘ ! noin 1 M natriumkloridin ionivahvuus.
Vasta-aineiden idiotyyppipitoiset polyamidiosat (vasta-aineenliittymiskohdat tai pa·· ratoopit) ovat niitä vasta-ainemolekyylien osia, jotka sisältävät idiotyypin, ja sitou- 14 1 08437 tuvat reaktanttiligandiin tai hapteeniligandiin. Tällaisia osia ovat mm. Fab-, Fab'- ja F(ab')2-fragmentit, jotka on valmistettu vasta-aineista hyvin tunnetuilla entsymaatti-silla katkaisutekniikoilla. Katso esimerkiksi US-patenttijulkaisua 4342566, Theofi-lopoulos ja Dixon, yleisesti, ja erityisesti, Pollack et ai. [Science 234 (1987) 1570] 5 joka kuvasi, että nopeutuneet hydrolyyttiset nopeudet Fab-fragmenteilla olivat samat kuin natiivin Ig:n. Koska vasta-aineet, joista idiotyypin sisältävät polyamidit saadaan, kuvataan immunogeenejä vastaan kohotetuiksi tai näiden indusoimiksi, idiotyypin sisältäviä polyamidireseptoreita kuvataan "kohotetuiksi" tai "indusoiduiksi" ymmärtäen, että tyypillisesti vaaditaan katkaisuvaihetta idiotyypin sisältä-10 vän polyamidin saamiseksi vasta-aineesta. Käsittelemättömät vasta-aineet ovat kuitenkin edullisia, ja niitä käytetään kuvaavina tämän keksinnön mukaisista resepto-rimolekyyleistä.
Tämän keksinnön mukaisesti käyttökelpoiset reseptorit (katalyyttiset molekyylit) ovat edullisesti monoklonaalisia vasta-aineita tai niiden osia. "Monoklonaalinen 15 vasta-aine" on reseptori, joka on tuotettu klooneilla yhdestä ainoasta solusta, joka tuottaa, ja usein erittää, vain yhdentyyppistä reseptorimolekyyliä. Hybridoomasolu on yksi esimerkki tällaisesta solusta ja on fuusioitu vasta-ainetta tuottavasta solusta ja myeloomasolusta tai muusta kuolemattomasta solulinjasta.
Tekniikat tämän keksinnön mukaisten monoklonaalisten vasta-aineiden valmistami- ·. 20 seksi hybridoomateknologiaa käyttämällä ovat hyvin tunnetut. Tällaiset reseptorit . kuvasivat ensin Kohler ja Milstein, Nature 256 (1975) 495, joka liitetään täten tähän ,;';' viitteeksi. Monoklonaalisia vasta-aineita saadaan tyypillisesti hybridoomakudosvil- jelmistä tai vatsaontelonesteestä, joka on saatu nisäkkäistä, joihin on lisätty hybri- : · * doomakudosta. Molemmat menetelmät kuvataan tässä.
• * « ♦ · • M • · • *•*•25 Monoklonaaliset katalyyttiset molekyylit ovat tässä edullisia johtuen niiden ainut- laatuisesta spesifisyydestä erityiseen epitooppiin sitoutumisessa, kuten erityiseen .,.,; immunisoivaan hapteeniligandiin j a reaktanttiligandiin, samoin kuin niiden suhteel- • · lisesti suuremmasta spesifisestä katalyyttisestä aktiivisuudesta polyklonaalisiin vas-*;·' ta-aineisiin verrattuna. Tässä voidaan myös käyttää polyklonaalisia vasta- iV:30 ainevalmisteita, mutta ne on tyypillisesti erotettava fraktioiksi, jotka sitoutuvat im- :''': munisoivaan hapteeniligandiin, ja niihin, jotka sitoutuvat vieraisiin epitooppeihin, ; \ kuten antigeenisen kantajan epitooppiin.
‘:· Polyklonaaliset vasta-aineet, jotka sitoutuvat hapteeniligandiin, voidaan erottaa af- finiteettierotuksella käyttämällä affiniteettisorbenttina hapteeniligandia. Kun vasta-35 ainevalmistetta on sekoitettu ja pidetty yllä riittävä aika affiniteettisorbentin kanssa 15 108437 sopivan immunoreaktion tapahtumiseksi, affiniteettisorbentti erotetaan vasta-aine-valmisteen loppuosasta.
Erotettu, jäljellä oleva vasta-aineosa, joka on sitoutunut affiniteettisorbenttiin, sisältää vasta-aineet, jotka sitoutuvat hapteeniligandiin, kun taas vasta-aineet vasta-aine-5 valmisteen loppuosassa sitoutuvat ulkopuolisiin epitooppeihin. Nuo affiniteetti-sitoutuneet vasta-aineet voidaan tämän jälkeen eristää käyttämällä tavallisia tekniikkoja sitoutuneiden entiteettien erottamiseksi affmiteettisorbenteista, kuten pesemällä sorbenttia glysiinihydrokloiidilla pH-arvossa 2.
"Ligandi" on tässä määritettynä molekyyli tai kompleksi, joka immunoreagoi resep-10 torimolekyylivasta-aineyhdistämiskohtaosan kanssa tai sitoutuu siihen. Tässä oietaan huomioon ligandin kaksi pääasiallista tyyppiä. Ensimmäistä kutsutaan hap-teeniligandiksi ja sitä käytetään immunogeeninä indusoimaan reseptorimolekyylien valmistusta, reseptorimolekyylin katalysoiman reaktion inhibiittorina ja antigeeninä ELISA- tai muissa määrityksissä. Toista kutsutaan reaktanttiligandiksi tai substraa-15 tiksi, ja se on molekyyli, joka osallistuu katalysoituun reaktioon. Hapteeniligandi ori oleellisen inerttiä katalysoituun reaktioon osallistumiselle.
Kuten tässä kuvattiin, on syntetisoitu amidi- tai esterireaktanttiligandien kemiallisia analogeja hapteeneiksi, jotka sisältävät tetraedrisen hiiliatomin, joka on sitoutunut suoraan hydroksyyliryhmään ja myös suoraan tyydytettyyn hiiliatomiin spesifisessä, : ' · 20 ennalta määrätyssä kohdassa matkimaan siirtymätilan konformaatiota muttei ioniva- ' ': rausta rakenteellisesti samanlaisen tai analogisen reaktanttiligandin amidi- tai este- :v: risidoksen hydrolyysissä.
a · t * a a a f *. \ Polypeptidien tai proteiinien amidisidoksen hydrolyysi vaatii hapteeniligandeja, jot-• · « ka ovat oleellisen vapaita hydrolyysistä hapteenisena immunogeeninä käytettäessä, v 25 Siten hapteeniligandi, joka sisältää tetrahedrisen hiilen, sen hydroksyyliryhmä ja viereinen, suoraan sitoutunut tyydytetty hiiliatomi ovat vapaita tällaisesta mahdolli- * ί * * i sesta hydrolyysistä.
IM
• ·
Lyhyet polypeptidiketjut voivat indusoida vasta-aineiden tuotannon, jotka tunnistava vatja sitoutuvat homologiseen proteiiniin ennalta määrätyssä spesifisessä kohdassa.
• 4 ·\..·’30 Tämä keksintö edistää aikaisempaa polypeptidejä koskevaa työtä tärkeän askeleen ; , eteenpäin.
4 « · · « : ; Tässä vasta-aineet (reseptorit) indusoidaan immunisoimalla ionivarauksen sisältävän hapteenisen ensimmäisen molekyylin (hapteeniligandi) ja tunnistamalla ja sitoutumalla ei ainoastaan tuohon ensimmäiseen molekyyliin, vaan toiseen, sen su- 16 1 08437 kuiseen molekyyliin (reaktanttiligandi), joka on vapaa ionivarauksesta analogisessa asemassa. Tähän toiseen molekyyliin sitoutumisessa reseptori aiheuttaa hydrolyysiä (joka tässä osoitettuna on katalyyttistä) ennalta valitulla esteri- tai amidisidoksella, joka vastaa topologialtaan immunisoivan, hapteenisen ensimmäisen molekyylin to-5 pologiaa. Vastaavuus topologiassa, ts. koossa ja muodossa muttei ionivarauksessa, antaa käyttöön tavan valita ennalta paikan, jossa ligandin hydrolyysi tapahtuu. Myös reseptorimolekyylit sitovat inhibiittoriligandeja, jotka muistuttavat hapteenisen ligandin tai reaktanttiligandin rakennetta.
Näin ollen syntetisoimalla suhteellisen pienen, immunisoivan hapteenisen ligandin 10 voidaan indusoida reseptorimolekyylien muodostuminen, jotka tunnistavat, sitoutuvat ja katkaisevat katalyyttisesti esteri- tai amidisidoksen toisessa molekyylissä, joka sisältää suuren joukon amidi- tai esterisidoksia. Täten voidaan valmistaa resepto-rimolekyylejä, jotka hydrolysoivat katalyyttisesti proteiinin tai polypeptidin kuten yhdistelmä-DNA-fuusioproteiinin valittua, ennalta määrättyä amidisidosta tai ennal-15 ta valitun esterin esterisidosta polyesterissä.
Tämän tulos tarkoittaa, että immunoglobuliineille voidaan antaa tähän asti tuntemattomien proteaasien ja esteraasien aktiivisuus.
II. Esterolyysin siirtymätila ja hapteeniligandin suunnittelu
Hapteeniligandin suunnittelu kulkee takaisin päin muodostettavien hydrolyysituot-: ‘' ‘ 20 teiden rakenteesta, matkittavan siirtymätilan sidoksen katkaisun kautta ja sitten hap-i, teeniligandiin. Reaktiot, joihin liittyy amidi- tai esterihydrolyysi, antavat käyttöön j '': kuvaavia esimerkkejä yleisestä konseptista, ja niitä käytetään tässä esimerkkeinä es- i ’ ': teri- tai amidihydrolyysireaktiosta.
• · • · · • φφ
Transasylointiprosesseille ovat tunnusomaisia karbonyylinlisäys/eliminointi-meka-
» 9 I
’·' ‘25 nismit. Asyyliryhmällä voi sen vuoksi olla tässä siirtymätilassa vaihtelevia asteita tetrahedristä luonnetta. W. P. Jencks, Catalysis in Chemistry and Enzymology, luku *:"r 10, (McGraw-Hill, New York, 1969). Entsyymien, jotka katalysoivat transasylointi- reaktioita, voisi odottaa sitovan hyvin niitä reaktanttiligandin analogeja, joilla on • __ keskuksen ympärillä tetrahedrinen konfiguraatio. Tämä pätee seriiniproteaaseilla, 30 joissa muodostuu tilapäisesti kovalenttinen sidos ligandin (substraatin) ja entsyymin C välille [Westerik et ai., J. Biol. Chem. 247 (1972) 8195; R.C. Thompson, Bioche- ’ ; i mistry 12 (1973) 47 ja Imperali et ai., Biochemistry 25 (1986) 3760], samoin kuin "·' · entsyymeillä, jotka katalysoivat amidien tai esterien suoraa hydraatiota. Viimeksi mainittua luokkaa inhiboivat yhdisteet, joissa on lohkaistavan amidiyksikön sijasta 35 tetrahedrinen konfiguraatio, mukaan lukien fosfaatti-, fosfonaatti tai fosfonami·; 17 108437 daattiryhmä [Weaver et ai., J. Mol. Biol. 114 (1977) 119 ja Jacobsen et ai., J. Am. Chem. Soc. 103 (1981) 654].
Karboksyylihappoesterien hydrolyysi on yksinkertaisempi esimerkki transasyloin-nista, jota approksimoidaan siirtymätilan hapteenisella eteerisellä matkimisella. Es-5 terihydrolyysireaktiot etenevät yleensä sopivilla spontaaneilla nopeuksilla ympäristön olosuhteissa, jotka ovat vasta-aineille sopivat. Tämän vuoksi mikä hyvänsä pieni nopeuden kiihtyminen voidaan havaita helposti.
Käyttökelpoinen hapteeniligandi sisältää tetraedrisen hiiliatomin, joka on sitoutunut hydroksyyliryhmään samoin kuin se on myös kiinnittynyt suoraan tyydytettyyn hii-10 liatomiin. Nämä atomit matkivat steerisesti karboksyylihappoesteri- tai amidisidok-sen hydrolyyttisen siirtymätilan tetraedristä hiiliatomia ja liittynyttä happiatomia tai typpiatomia (heteroatomia), mutteivät matki siirtymätilan ionivarausta. Siten tetra-edrinen hiiliatomi, sen hydroksyyliiyhmä ja suoraan sitoutunut tyydytetty hiiliatomi ovat hapteeniligandissa asemassa, joka vastaa reaktanttiligandissa hydrolysoitavan 15 ennalta valitun karboksyylihappoamidin tai esterisidoksen karbonyyliryhmän asemaa, samoin kuin karbonyylisidottua heteroatomia (happi tai typpi), vastaavasti. Hiiliatomin sisältävät kemialliset tähteet, jotka ovat rakenteellisesti analogisia reak-tanttiligandin hiiliatomin sisältäville tähteille, sitoutuvat tetraedriseen hiiliatomiin ja tyydytettyyn hiiliatomiin niin, että hapteeni-ja reaktanttiligandit ovat rakenteellises-20 ti samanlaisia tai analogisia lukuun ottamatta atomeja, joissa hydrolyysi tapahtuu.
: Siten tämä reaktiivisen karbonyylin ja happi- tai typpiatomin rakenteellinen steeri- ;v; nen matkija poikkeaa fosfonaatti- tai fosfonamidaattiryhmistä tai karbonaattiryh-mästä, joita aikaisemmat tutkijat käyttivät hydrolyyttisen siirtymätilan analogeina, *·. : Tämän keksinnön mukainen eteerinen matkija poikkeaa myös Kim et ai.
^..^25 -patenttijulkaisussa kuvatuista ryhmistä siinä, että tämän keksinnön mukaisen hap·· * teenin rakenne sisältää alhaisemman valenssin kuin analoginen rakenne substraatissa ja sisältää saman lukumäärän sidoksia kuin substraatin analoginen raken- * * ne, ei yhtä tai useaa.
« * * · · Tässä käyttökelpoinen hapteeni sisältää edelleen ryhmän, jolla on ionivaraus vesi- *;*;'30 liuoksessa fysiologisilla pH-arvoilla. Tämä ionivarauksen sisältävä ryhmä voi sitou- ’···* tua suoraan ennalta mainittuun tetraedriseen hiiliatomiin. Edullisesti ionivarauksen « : : ‘: sisältävä ryhmä on kuitenkin liittynyt tetraedriseen hiiliatomiin epäsuorasti ja sijait- •: · * see pallomaisen tilavuuden sisällä, jonka määrittää säde noin 0,7 nm tetraedrisestä hiiliatomista. Edullisemmin tämä säde on noin 0,2 - noin 0,5 nm.
1β 1 08437 18
Ionivarauksen sisältävä iyhmä puuttuu vastaavasta asemasta reaktanttiligandissa tai substraatissa, ja se voidaan valita joukosta hyvin tunnettuja ryhmiä.
Esimerkiksi ryhmiä, jotka sisältävät fysiologisilla pH-arvoilla negatiivisen varauksen, indusoimaan vasta-aineenliittymiskohdassa komplementaarisen positiivisen va-5 rauksen, ovat mm. karboksyyli (-COH2), fosfono [-P(0H)20], sulfo (-SO3H), fosfo-ro [-0P(0H)0], sulfaatto (-0S03H) ja vastaavat. Esimerkinomaisia ryhmiä, jotka sisältävät fysiologisilla pH-arvoilla positiivisen ionivarauksen, komplementaarisen negatiivisen varauksen indusoimiseksi vasta-aineenliittymiskohdassa, ovat mm. amino (-NH2), guanidiini [-HNC(N)NH2], mono- ja di-substituoitu amino, jossa 10 kumpikin substituentti sisältää jopa noin 10 hiiliatomia, kuten Ci-Cö-alempi alkyyli, bentsyyli, fenyyli ja naffyyli, tai jossa kaksi substituenttia muodostavat 5-6-jäsenisen ryhmän kuten morfoliini, piperidiini, pyrrolidiini, substituoidut guani-diiniyhdisteet, joissa on edellä mainitut substituentit, ja kvatemääriset typpipitoiset ryhmät, kuten trisubstituoidut ammoniumyhdisteet, kuten trietyyliammoniumryhmä, 15 tai kvatemisoitu aromaattinen rengas, kuten substituoitu kinolinium- tai pyri-diniumrengas. Kukin näistä edellä olevista neutraalisti varatuista ryhmistä esiintyy vesiliuoksessa fysiologisilla pH-arvoilla negatiivisesti tai positiivisesti varautuneena ionisena ryhmänä.
Edullisia ovat karboksyyliryhmät ja kvatemääriset amiinit sellaisina kuin ne esiin- . 20 tyvät heteroaromaattisissa renkaissa, jotka tuottavat karboksylaatti- ja ammonium- ioneja. Kvatemäärisiä amiineja, olivatpa ne kvatemisoituja neljällä substituentti- ' ·: ·' ryhmällä tai protonoimalla ja olivatpa ne läsnä asyklisessä muodossa tai syklisessä i '.: muodossa osana rengasta, kuten N-metyylipyridiniumtähde, pidetään ionivarauksen i '. ' sisältävistä ryhmistä keskusteltaessa kaikkia ammoniumryhmien luokkaan kuuluvi- :1\i25 na.
• · · · • · 9 * · · * Kun fysiologisilla pH-arvoilla ionivarauksen sisältävä ryhmä on osa toista ryhmää, joka on sitoutunut edellä mainittuun tetraedriseen hiiliatomiin kuten kvatemäärinen ’ 1 typpiatomi N-metyylipyridiniumyhdisteessä, jota käytetään tässä kuvaavasti yhdis- teessä la, niin ionivarauksen sisältävää ryhmää pidetään pyridiniumrenkaan kvater- :Y;30 näärisenä typpiatomina. Siten ionivarauksen sisältävä ryhmä on tällaisessa raken- • · . 1 · ·. teessä liittynyt tetraedriseen hiiliatomiin epäsuorasti, ja atomi tuossa ionivarauksen sisältävässä ryhmässä, joka sisältää ionivarauksen, ts. kvatemäärinen typpiatomi, on ; : : erotettu tästä tetraedrisestä hiiliatomista ainakin yhdellä atomilla, edullisesti hii- : : liatomilla. Molekyyli, kuten glykolihappojohdannainen, sisältää ionisen ryhmän liit- 3 5 tyneenä suoraan tetraedriseen hiiliatomiin ja sen hydroksyyliryhmään.
19 108437
ReaJktanttiligandi on rakenteellisesti analoginen (samanlainen) hapteeniligandille ja kääntäen, mutta reaktanttiligandi on vapaa edellä kuvatusta ryhmästä, joka sisältää vesiliuoksessa fysiologisilla pH-arvoilla ionivarauksen, joka ryhmä sijaitsee asemassa, joka on rakenteellisesti analoginen tälle ryhmälle hapteeniligandissa. Siten 5 kuvaava hapteeniligandiyhdiste la sisältää kvatemäärisen N-metyylipyridinium-typen, kun taas kuvaava substraattiligandiyhdiste 3 sisältää neutraalisti varautuneen fenyylirenkaan, ja sen hiili-ja vetyatomit ovat vastaavassa asemassa.
Hapteeniligandi ja/tai reaktanttiligandi (substraatti) voi myös sisältää yhden tai useita muita ryhmiä, jotka sisältävät vesiliuoksessa fysiologisilla pH-arvoilla ionivara-10 uksen. Ionivarauksen sisältävät ryhmät voivat olla näissä kahdentyyppisissä ligan-dimolekyyleissä vastaavissa tai ei-vastaavissa asemissa. Lisäksi tällainen ionisesti varautunut lisäryhmä voi esiintyä saman pallomaisen tilavuuden sisällä, joka määriteltiin edellä kuvatulle ionivarauksen sisältävälle ryhmälle.
Edellä kuvatun ainakin yhden tuollaisen ionisesti varautuneen ryhmän lisäksi voi 15 yhden tai usean ionisesti varautuneen ryhmän läsnäolo hapteeniligandissa tai reak-tanttiligandissa tai molemmissa olla myös käyttökelpoista helpottamaan hapteenin sitoutumista katalysaattorimolekyylin yhdistämiskohtaan. Tapaus on näin erityisesti, kun käytetään suhteellisen pientä hapteenia kuten tässä käytetään kuvaustarkoi-tuksessa.
* y ‘20 Esimerkiksi tutkimukset dekstraaneilla ovat osoittaneet, että anti-dekstraanivasta-:aineiden maksimaalinen sitoutuminen tapahtuu dekstraaneilla, jotka sisältävät 6 tai • ‘ f: 7 glukoositähdettä. Tutkimukset polyalaniinioligomeereillä ovat osoittaneet maksi·· maalisen sitoutumisen koolla 4-6 aminohappotähdettä. Chapman et ai., Micro- :\i biology, 2. painos, luku 16, s. 444-447. Pienemmät oligomeerit sitoutuvat vähem- • · . *: · 25 män hyvin, sitoutumisen puuttuessa glukoosilta.
*
Siten toisen tai molempien ligandien varustaminen yhdellä tai usealla lisätyllä ioni-· varauksella voi auttaa sitoutumista katalyyttisellä vasta-aineenyhdistämiskohdalla • ·« varauksen täydentämisellä samoin kuin rakenteellisella sovituksella, kun ligandi on .·!·. pienempi kuin täysi koko, jonka sitoutumiskohta voi majoittaa.
• *
Siten hapteeniligandi sisältää ainakin yhden ryhmän, joka aikaansaa vesiliuoksessa I fysiologisilla pH-arvoilla ionivarauksen, kuten amiini, kvatemäärinen ryhmä tai : karboksylaattiryhmä, vastaavasti. Tämä varautunut ryhmä on määritellyn pallomai sen tilavuuden sisällä, ja se puuttuu vastaavasta asemasta reaktanttiligandissa.
108437
Kuten jo mainittiin, pallomainen tilavuus, jonka sisällä ainakin yksi ionivarauksen sisältävä lyhmä sijaitsee hapteeniligandissa, määritellään säteellä noin 0,7 nm tet-raedrisestä hiiliatomista, ja on edullisemmin tilavuuden sisällä, joka määritellään säteellä noin 0,2 - noin 0,5 nm tuosta tetraedrisestä hiiliatomista. Tuollaiset pallomai-5 set tilavuudet ja säteet voidaan laskea alalla hyvin tunnettuja tietokoneohjelmia käyttämällä tai molekyylimalleja käyttämällä.
On ymmärrettävä, että tuon ainakin yhden, ionivarauksen sisältävän ryhmän sijoitus hapteeniligandissa on sellainen, että vasta-aineenliittymiskohdan oletetusti indusoidulla komplementaarisesti varautuneella aminohappotähteellä on pääsy karbonyyli-10 ryhmään ja sen sitoutuneeseen, hydrolysoitavan esterin tai amidin happi- tai typ-piatomiin. Ts. hapteeniligandin ryhmä, joka sisältää ionivarauksen, ei ole tetraedri-sen hiiliatomin, sen hydroksyyliryhmän eikä viereisen tyydyttyneen hiiliatomin steerisesti estämä.
Eräällä käyttökelpoisella reaktanttiligandilla on rakenne 15 O
II
r’-c- -x-r2 jossa R1 ja R2 ovat hiiliatomin sisältäviä kemiallisia tähteitä, ja -X- on -O- tai -NR3-, •. jossa R3 on vety tai kolmas hiiltä sisältävä kemiallinen tähde.
:.:. :20 R1 ja R2 voivat olla samat tai erilaiset. Kumpikin ryhmä voi olla aminohappotähde, • polypeptidi tai proteiini, samoin kuin orgaaninen radikaali kuten alifaattinen tai substituoitu alifaattinen suoraketjuinen tai haaroittunut avoketjuinen tai syklinen tähde, mukaan lukien syklinen tai avoketjuinen heteroatomin sisältävä tähde, ja voi • · myös olla aromaattinen, substituoitu aromaattinen, heteroaromaattinen tai substi-u · 25 oitu heteroaromaattinen tähde. Niin pitkään kuin reaktanttiligandi voidaan liuottaa < ; vesiväliaineeseen, joka ei oleellisesti estä katalysaattorimolekyylin vaikutusta ja on riittävän suuri katalysaattorin sidottavaksi, voivat ryhmien R jaR spesifiset raken- •: * * teet olla oleellisesti mitä hyvänsä hiiltä sisältäviä kemiallisia tähteitä.
• · · • ♦ ♦ .···. Kun R3 on muu kuin vety (H), se voi olla oleellisesti mikä hyvänsä hiiltä sisältävä ' 30 kemiallinen tähde, kuten oli ryhmien R1 ja R2 tapaus.
.;: Hapteeninen ligandi on rakenteellisesti analoginen (samanlainen) reaktanttiligandil- le. Hapteenisella ligandilla on rakenne 2i 1 08437
OH
R1 '-CH-CHR3 '-R2' jossa R1' ja R2' ovat hiiliatomin sisältäviä tähteitä, jotka ovat rakenteellisesti analo-5 gisia (samanlaisia) ryhmille R1 ja R2, vastaavasti, ja R3' on rakenteellisesti analoginen (samanlainen) ryhmälle R3, kun -X- on -NR3-. Kun -X- on -O-, R3' on vety. Ai-nakin toinen lyhmistä R ' ja R ' aikaansaa myös ryhmän, joka sisältää vesiliuoksessa fysiologisilla pH-arvoilla ionivarauksen ja joka puuttuu reaktanttiligandista, ja tämä ryhmä on aikaisemmin käsitellyn pallomaisen tilavuuden sisällä.
10 Edullisessa toteutuksessa R-ryhmäparien jäsenet R1 ja R1', R2 ja R2', R3 ja R3' ovat rakenteellisesti analogisia niin, että R1 ja R1' ovat oleellisen identtiset, R2 ja R2' ovat oleellisen identtiset ja R3 ja R3' ovat oleellisen identtiset paitsi kun -X- on -0-. Tässä edullisessa tilanteessa, samalla lailla numeroitujen R-ryhmien parien väliset erot ovat, että hapteeniligandi sisältää ionivarauksen sisältävän ryhmän, jota ei ole läsnä 15 reaktanttiligandissa, ja hapteeniligandi sisältää myös atomin tai ryhmän, jota käytetään yhdistämään hapteeniligandi antigeeniseen (immunogeeniseen) kantajamo-lekyyliin muodostamaan immunogeeninen konjugaatti, jota käsitellään jäljempänä
Siten samalla lailla numeroidut pariryhmät ovat edellä mainittuja eroja lukuun ottamatta suunnilleen samankokoisia, -muotoisia, -varauksista ja saman tyydyttymät-.! ·. .20 tömyysasteen omaavia. Kun samalla lailla numeroitujen pari-R-ryhmien koko poik- ; ; keaa, on edullista, että hapteeniligandi on kooltaan suurempi kuin reaktanttiligandi : . . niin, että pienempi reaktanttiligandi voidaan majoittaa indusoidun katalyyttisen si-: v, toutumiskohdan sisälle.
« » •V·: Hapteeniligandeja ja reaktanttiligandeja kuvaavat rakenteet, joita käytettiin tässä • « · v 25 tutkimuksessa, valittiin määrättyjen kriteerien mukaan. Näitä olivat mm. tetraedri- sen hiiliatomin sisältävien prekursorien, vastaavan karboksyylihappoamidi- tai este- ·;·· risubstraatin saatavuus ja stabiilius, kemiallisen synteesin mukavuus sen valmista- .···. miseksi ja erilaisten kaavioiden sopeutettavuus immunologiseen esitykseen. Sisäl-• · # lyttämällä aromaattisiin renkaisiin aminosubstituentteja, joko bentsyyli- tai fenoli- • ♦ · *•*•*30 ryhmä, esimerkiksi, voidaan varustaa funktionaalisella lisäkkeellä immunogeenisiin :: kantajaproteiineihin liittämistä varten hapteeniseen esitykseen.
‘ ; III. Katalyyttistä vasta-ainetta tuottavat solut ja menetelmät • > * « Tässä otetaan huomioon myös solut, jotka sopivassa väliaineessa kasvatettaessa tuottavat monoklonaalisia katalysaattorimolekyylejä (vasta-ainemolekyylejä tai mo-35 lekyylejä, jotka sisältävät vasta-aineenyhdistämiskohtaosia), jotka hydrolysoivat ka- 22 1 08437 talyyttisesti reaktanttiligandin ennalta valittua karboksyylihappoamidi- tai este-risidosta. Solut edullisesti myös erittävät edellä kuvatut molekyylit kasvatus-väliainympäristöönsä, olipa tuo kasvatusväliaineympäristö sitten in vitro tai in vivo. Eräässä edullisessa suoritusmuodossa solut ovat hybridoomasoluja, kuten hybri-5 dooma 30C6.
Yleensä tällaiset katalysaattorimolekyyliä tuottavat solut valmistetaan immunisoimalla laboratorioeläimen, kuten hiiren, rotan, vuohen tai hevosen, immunogeenillä, joka sisältää vasta-ainetta indusoivan määrän edellä kuvattua hapteenista ligandia. Tyypillisesti immunogeeni on konjugaattia hapteeniligandista ja antigeenisestä 10 (immunogeenisestä) väliaineesta, jota kuvataan jäljempänä.
Näin immunisoitua eläintä ylläpidetään riittävä ajanjakso, jotta eläin erittäisi vasta-aineita, jotka immunoreagoivat hapteeniligandin kanssa. Jäljempänä kuvattava ELISA-määritys on käyttökelpoinen vaaditun immunoreaktion läsnäolon määrittämiseen.
15 Geenejä, jotka koodittavat vasta-ainemolekyylejä tai molekyylejä, jotka sisältävät niiden vasta-aineenyhdistämiskohtaosia ylläpidettyjen eläinten vasta-ainetta tuottavista soluista kuten pernasoluista, siirretään isäntäsoluihin. Tämä geeninsiirto muodostaa hybridisoluja, jotka sisältävät geenejä ainakin kahdesta lähteestä. Hybri-disolut tuottavat siirretyistä geeneistä sopivasti kasvatettaessa vasta-aine-.'.•,20 molekyylejä tai vasta-aineenyhdistämiskohtaosia, ja niitä voidaan kasvattaa oleelli- : :'; sen epämääräisen ajan suhteessa vasta-ainetta tuottaviin soluihin, joista geenit siir- :' rettiin. Esimerkinomaisia soluja, joita voidaan kasvattaa oleellisen epämääräisen : , ajan suhteessa geeninsiirtosoluihin, ovat mm. hybridoomasolut, E. coli -solut, hii- ]·.*: vasolut, kuten S. cerevisiae, transformoidut nisäkässolut, kuten CHO-solut ja vas- :./25 taavat.
• « · • · · Näin tuotettuja hybridisoluja kasvatetaan sopivassa kasvatusväliaineessa, esimer- ·:··; kiksi in vivo tai in vitro, riittävä ajanjakso, jotta kasvatetut hybridisolut tuottaisivat ·*"; vasta-ainemolekyylejä tai molekyylejä, jotka sisältävät niiden vasta- • · · .·. aineenyhdistämiskohtaosia, jotka molekyylit otetaan tämän jälkeen talteen. Esimer- • · · *;*;*30 kinomaisia in vivo- ja in vitro -kasvatusolosuhteita hybridoomasoluja varten kuva-’ ; ’ taan tässä ja ne ovat hyvin tunnettuja, kuten ovat kasvatusolosuhteet soluja kuten E.
: colia, S. cerevisiaeta, CHO.ta ja vastaavia, varten.
Sitten talteen otetut molekyylit seulotaan, jotta tunnistettaisiin hybridisolu, jok?: tuottaa molekyylejä, jotka hydrolysoivat reaktanttiligandin ennalta määrättyä kar- 23 1 08437 boksyylihappoamidi- tai esterisidosta katalyyttisesi! Kun tällainen hybridisolu kerran tunnistetaan, niin tästä hybridisolusta kasvatetaan lisää klooneja.
Edellä oleva menetelmä ottaa huomioon hybridooman valmistamisen, tekniikan tasolla hyvin tunnetun menetelmän, ja sitä käsitellään tässä yksityiskohtaisesti. Tek-5 nilkan tasolla on myös tunnettua, että geenejä, jotka koodittavat oleellisesti vain vasta-ainemolekyylin vasta-aineenyhdistämiskohtaosaa, voidaan siirtää yhdestä ni-säkässolusta toiseen, ja edellä kuvattu menetelmä on myös tarkoitettu kuuluvaksi tällaisiin prosesseihin. Edellä kuvattu prosessi on tarkoitettu ottamaan huomioon myös menetelmän, jonka ovat kuvanneet: Shastry et ai., Proc, Natl. Acad. Sei., USA 10 86 (1989) 5728; ja Huse et ai., Science 246 (1989) 1275, joiden kuvaukset liitetään tähän viitteeksi, jossa menetelmässä tuotetaan vasta-aineenyhdistämiskohtaosia sisältäviä molekyylejä ei-nisäkäsorganismeissa, kuten E. colissa, yhdistelmä-DNA-tekniikkoja käyttämällä. Noiden julkaisujen siirretyt geenit olivat tulosta hybridoo-mista tai immunisoitujen eläinten pernoista olevan mRNArn käytöstä valmistettaes-15 sa geenejä, jotka koodittavat VH- tai Fab-vasta-aineosia, vastaavasti, jotka ekspres-soituvat E. coli -soluissa.
Keksinnön toisessa menetelmänäkökannassa tällaisten solujen tuottama katalyyttinen määrä monoklonaalisia vasta-ainemolekyylejä tai molekyylejä, jotka sisältävät niiden vasta-aineenyhdistämiskohtaosia (katalyyttiset molekyylit) sekoitettiin vesi-·, 20 väliaineessa reaktanttiligandimolekyylien kanssa reaktioseoksen muodostamiseksi. ] . Näin muodostettua reaktioseosta ylläpidetään riittävä ajanjakso reaktanttiligandi- [;:' molekyylien sitoutumiseksi katalyyttisiin molekyyleihin, ja jotta katalyyttiset mole- ; ;' kyylit hydrolysoisivat ennalta valitun sidoksen katalyyttisesti. Hydrolyysireaktion : ·: tuote voidaan ottaa talteen haluttaessa.
• · I I · • · · • · .*:*.25 Tämän keksinnön mukaisessa hydrolyyttisessä menetelmässä käytetään hyväksi ve-siväliainetta osana reaktioseosta. Tämä väliaine sisältää tyypillisesti vettä ja pusku·· risuoloja. Lisäksi väliaine voi sisältää muita suoloja, kuten natriumkloridia, samoin • « ... kuin vesiliukoisia kalsium- ja magnesiumsuoloja, joita esiintyy usein proteiinipitoi- "** sissa väliaineissa. Läsnä voi olla myös orgaanisia liuottimia kuten metanoli, etanoli, :V:30 asetonitriili, dimetyylisulfoksidi, dioksaani, heksametyylifosforamidi ja N,N-: “ ‘: dimetyyliformamidi. Läsnä voi olla myös pinta-aktiivisia aineita, jotka emulgoivat . ' . reaktanttiligandin ja reseptorimolekyylin. Vesipohjaisessa väliaineessa läsnä olevien " ‘ ; valmistusaineiden kriittinen ominaispiirre on, että valmistusaineet eivät oleellisesti häiritse tai estä katalyyttistä reaktiota, kuten denaturoimalla katalyyttistä molekyy-35 liä. Lisäksi vesipohjainen väliaine on oleellisen vapaata suolasta, proteiineista 24 1 08437 yleensä, ja erityisesti entsyymeistä, jotka estävät katalyyttisen molekyylin katalysoimaa sidoksenhajotusreaktiota.
Vesipohjaisen väliaineen pH-arvo on tyypillisesti noin 5 - noin 9, ja edullisesti noin pH 6,0 - noin 8,0. Voidaan myös käyttää mainittuja pH-arvoja korkeampia ja mata-5 lampia arvoja, mikäli katalysoitua reaktiota ei taaskaan oleellisesti häiritä tai estetä.
Katalyyttiset reaktiot suoritetaan tyypillisesti ympäröivässä huoneenlämpötilassa, ts. noin 20 - noin 25 °C:ssa tai 37 °C:ssa, ja ympäröivässä ilmakehän paineessa, ts. noin 101 kPaissa. Voidaan kuitenkin käyttää myös lämpötiloja alas suunnilleen vesipohjaisen väliaineen jäätymispisteeseen ja ylös jopa suunnilleen väliaineen kiehumis-10 pisteeseen ympäristön paineessa. Kuten on tunnettua, proteiineilla, kuten keksinnön mukaisilla katalyyttisillä molekyyleillä, on taipumus denaturoitua korotetuissa lämpötiloissa kuten sellaisissa, joissa vesipohjainen väliaine kiehuu, esimerkiksi noin 100 °C:ssa, ja siten lämpötilat alle noin 40 °C ovat edullisia.
Reaktanttiligandi on läsnä reaktioseoksessa määrä jopa sen liukoisuuteen asti vesi-15 pohjaisessa väliaineessa. Voidaan myös käyttää 2-faasijärjestelmää, joka sisältää liukenematonta reaktanttiligandia, mutta normaalisti sitä ei käytetä. Normaalisti käytettyjä reaktanttiligandin konsentraatioita ovat noin 0,1 - noin 10 μΜ, määrän ollessa myös funktio reaktanttiligandin liukoisuudesta vesipohjaiseen väliaineeseen. Kun halutaan tuotetta sinänsä, käytetään suhteellisesti korkeampia konsentraatioita : 20 verrattuna alhaisempiin konsentraatioihin, joissa on määrä tutkia reaktiomekanismia tai reaktiokinetiikkaa.
·,!, Läsnä on myös katalyyttisesti tehokas määrä katalyyttisiä molekyylejä. Siten kata-lyyttisiä molekyylejä käytetään tyypillisesti moolisuhteessa reaktanttiligandiin noin 1:2 - noin 1:10000, jolloin edullinen moolisuhde on noin 1:10 - noin 1:100.
♦ · » • « t « 25 Katalyyttisten molekyylien suhde reaktanttiligandiin riippuu tyypillisesti katalyyt-·:<·; tisten molekyylien spesifisestä aktiivisuudesta reaktanttiligandia kohtaan ja reakti-.··*. on käyttötarkoituksesta. Siten kun halutaan tuotetta, käytetään suhteellisesti korke- *" ampaa katalyyttisten molekyylien konsentraatiota, ja korkeampaa katalyyttisen mo- *·*·* lekyylien suhdetta reaktanttiligandiin. Kun tutkitaan reaktion reaktiomekanismia tai :...:30 -kinetiikkaa, käytetään tyypillisesti alhaisempaa konsentraatiota ja suhdetta. Voi-: ; ’ . daan myös käyttää stökiometrinen määrä katalyyttisiä molekyylejä tai alle, mutta ., : koska käytetään katalyyttisiä molekyylejä, jopa stökiometrisen määrän käyttö voi olla tuhlailevaa.
25 1 08437
Reaktion ylläpitoajanjakso on funktio useista parametreistä, mukaan lukien valitut katalyyttiset molekyylit ja reaktanttiligandit, niiden konsentraatiot, pH-arvot ja lämpötilat, samoin kuin siitä mitä reaktiolta tahdotaan. Kun suoritetaan kinetiikkatut-kimuksia, tavataan usein ylläpitoaikoja luokkaa minuutteja - tunteja. Kun halutaan 5 reaktiotuotteita, ovat tavallisempia ylläpitoajat tunteja - päiviä.
IV. Tulokset
Hapteeniligandiyhdisteet la ja 2 syntetisoitiin viidessä ja neljässä vaiheessa, vastaavasti, lähtien 4-nitrofenetyylibromidista, kuten jäljempänä kuvataan. [Kaikilla uusilla yhdisteillä oli tyydyttävät spektroskooppiset - (NMR, IR) ja polttoanalyysit.( 0,3 10 %)]. Molemmat hapteeniligandiyhdisteet la ja 2 liitettiin (N-hydroksisukkini- midiesterin kautta) väliaineproteiineihin naudan seerumialbumiini (BSA) ja "keyhole limpet"-hemosyaniini (KLH) immunogeenisten konjugaattien muodostamiseksi. 129GlX+-hiiriä immunisoitiin yhdisteiden la ja 2 KLH-konjugaatilla, ja muodostettiin vasta-aineita ja seulottiin tässä muualla kuvatulla tavalla, [(a) Kohler et ai, Na-15 tore (Lontoo), 256 (1975) 495; (b) Enguall, Method Enzymol. 70 (1980) 419].
Immunisointi hapteeniligandiyhdisteessä la tuotti 23 hybridomaa, kun taas hap-teeniligandiyhdiste 2 tuotti 21 hybridomaa, jotka sitoutuvat vastaaviin hapteeneihin. Kaikki monoklonaalit olivat IgG-luokkaa, ja ne puhdistettiin vatsaontelonesteestä anioninvaihtokromatografialla, minkä jälkeen seurasi affiniteettikromatografia pro -. 20 teiini-G-kolonnilla. Vasta-aineet arvosteltiin homogeenisiksi natriumdodekyyli- ’ . sulfaattipolyakryyliamidigeelielektroforeesilla.
; Monoklonaaliset vasta-aineet konsentraatiolla 20 μΜ seulottiin aluksi (fosfaattipus- kuri 50 mM, pH 7,5, 100 mM NaCl, 37 °C) bentsoaattiesterireaktanttiligandiyhdis- : tettä 3 vastaan, (500 μΜ) 5-[[4-(hydroksi)fenyyli] amino]-5-oksopentaanihapon, .••/.25 yhdisteen 4 tuotantoa varten. [Analyysi suoritettiin HPLCillä RP-C18-kolonnilla eluoimalla veslasetonitriilillä (op: 10) virtauksella 1 ml/min UV-detektori- . asetuksella 254 nm. Hydrolyysituote, yhdiste 4 (kuvio 1; retentioaika 7 min) kerät- [..* tiin (otettiin talteen), ja se havaittiin RP-HPLC-koinjektiolla ja massaspektrianalyy- • · ···* sillä autenttisen näytteen kanssa samanlaiseksi.] • ♦ • · · ♦ ♦ · l!30 Hapteeniligandiyhdisteellä la saaduista 23 monoklonaalisesta vasta-aineesta, 7 ha- ’: * valttiin katalyyttiseksi. Millään hapteeniligandiyhdisteen 2 vasta-aineesta ei havaittu • · • · : lainkaan taipumusta nopeuttaa reaktanttiligandiesteriyhdisteen 3 hydrolyysinopeut- ': i ta.
26 1 08437
Seitsemän vasta-ainetta, joiden havaittiin olevan katalyyttisiä, estyivät täysin lisättäessä vapaata hapteeniyhdistettä Ib. Tällaiset tulokset viittaavat siihen, että katalyysi seuraa substraatin sitoutumisesta vasta-aineensitoutumistaskuun tai yhdisty-miskohtaan.
5 Merkittävintä oli hapteeniligandiyhdisteen la indusoimien katalyyttisten vasta-aineiden suunnaton lukumäärä verrattuna yhdisteeseen 2. Yksi näistä seitsemästä katalyyttisestä vasta-aineesta, jota kutsuttiin hybridooma- ja monoklonaaliseksi vasta-aineeksi 30C6, karakterisoitiin yksityiskohtaisesti.
Substraatti- tai reaktanttiligandiyhdisteen 3 (50 mM fosfaattia, 100 mM NaCl, pH 10 7,2, 37 eC) alkuhydrolyysinopeus katalysoituna monoklonaalisella vasta-aineella 30C6 (20 μΜ) noudatti Michaelis-Menten-kinetiikkaa [hydrolyysituoteyhdisteen 4 konsentraatiot määritettiin HPLC-mittauksilla sen huipun korkeudesta suhteessa sisäisen standardin huipun korkeuteen 1-2 tunnin aikana (3 tai useampia määrityksiä).] Standardikäyrä osoitti lineaarisuuden hydrolyysituoteyhdisteen 4 konsentraa-15 tioilla jopa 0,5 mM arvojen k^f ja Km ollessa 5 0,2 x 10'3 min'1 ja 1,12 0,05 mM, vastaavasti. Bentsoaattireaktanttiligandiyhdisteen 3 vasta-ainekatalysoitu hydrolyysi estyi kompetitiivisesti (K, = 83 5 μΜ) lisäämällä pyridiniumssuolayhdistettä Ib.
Substraattiyhdisteen 3 hydrolyysin pH-riippuvuutta tutkittiin monoklonaalisten vasta-aineiden 30C6 läsnä ollessa (20 μΜ) pH-välillä 6,0 ja 7,2 (Bis-tris) ja 7,2 - 8,0 ’ ’20 (fosfaatti), sekä 50 mM puskurin ja 100 mM NaCl:n läsnä ollessa, 37 °C (kuvio 2).
'··* k^f :n pH-riippuvuus paljasti emäksisellä muodolla dissosioituvan ryhmän läsnä • olon, jonka pKa:ksi määritettiin 6,26 0,05 (kuvio 2A). Puskurin ionikonsentraation • · * vaihtelu (12,5 - 50 mM) ei osoittanut k^in riippuvuutta puskurilajin läsnäolosta.
« · · • ♦ · • · .*:·» Suoraa vertailua varten mitattiin myös reaktanttiligandiyhdisteen 3 hydrolyysino-25 peudet (kpbs) identtisellä pH-alueella ekstrapoloituna puskurikonsentraatioon nolla (kuvio 2B). pH/nopeus-profiili paljasti (Bruice et ai., Bioorganic Chemistry; Ben-.···. jämin: New York, 1965; voi. 1), hajottamisessa osallisena oleviksi lajeiksi veden pH-alueella 6,0 - 6,5 (ko = 0,6 x 10'9 min'1) ja hydroksidin pH-arvosta 6,6 ja yli (koH-= 4,2 x 10'2 min'1).
• · • « . *. 30 Suhde kcat/ko, vertailu substraattiyhdisteen 3 pH-arvosta riippumattoman vasta-» · · · ainekatalysoidun hydrolyysin nopeudesta hydrolyysinopeuteen vedessä vastaa no- : peuden kiihtymistä vasta-aineella yli miljoonakertaisesti. Merkittävällä tavalla vas- ta-ainekatalysoidun reaktion pH-optimi on liikkunut neutraalille pH-alueelle edel- 27 1 08437 leen tunnistamattoman aminohappotähteen osallistumisella, joka tähde on luultavasti negatiivisesti varautunut.
Hapteeniyhdisteet 5a ja 6 syntetisoitiin lähtien 4-nitrofenetyylibromidista jäljempänä kuvatulla tavalla. Dimetyylianiliniumantigeeniyhdiste 7 valmistettiin lähtien 4-5 aminobentsyylialkoholista myös jäljempänä kuvatulla tavalla. Yhdisteiden 5a, 6 ja 7 konjugaatti tuotti 18, 22 ja 26 hybridoomaa vastaavasti, monoklonaaliset reseptori-molekyylit olivat kaikista niistä IgG-luokkaa.
Vasta-aineet konsentraatiolla 20 μΜ seulottiin aluksi (fosfaattipuskuri, 50 mM, pH 7,5, 100 mM NaCl, 37 °C) HPLC-määrityksellä bentsoaattiesteriyhdistettä 3 (500 10 μΜ) vastaan 5-[(4-hydroksifenyyli)amino]-5-oksopentaanihapon, yhdisteen 4 muodostumisen suhteen. Yhdisteellä 5a saaduista 18 monoklonaalisesta vasta-aineesta 3 havaittiin katalyyttisiksi. Hapteeniyhdisteillä 6 ja 7 immunisoinneista saaduilla 22 ja 26 vasta-aineella, vastaavasti, nähtiin merkityksetön - tai estovaikutus yhdisteen 3 hydrolyysin spontaaniin nopeuteen. Kolme katalyyttiseksi havaittua vasta-ainetta 15 estettiin täysin, kun läsnä oli 50 μΜ karboksylaattiyhdistettä 5b.
Kinetiikka tehokkaimmalla katalyyttisellä vasta-aineella, hybridooman 27A6 erittämällä monoklonaalisella reseptorilla, joka saatiin immunisoinneista hapteeniyh-disteellä 5 a, karakterisoitiin yksityiskohtaisesti. Monoklonaalista reseptoria kutsut· raan myös nimellä reseptori tai vasta-aine 27A6. Yhdisteen 3 [50 mM 4-(2-"20 hydroksietyyli)-l-piperatsiinipropaanisulfonihappo (EPPS), 100 mM NaCl, pH 8,5, '.:,: 37 °C] hydrolyysin alkunopeus katalysoituna reseptorilla 27A6 noudatti Michaelis- : Menten-kinetiikkaa k^f - ja Km-arvoilla 0,01 0,002 min"1 ja (243 15)xl0'6 M, vas- : taavasti. Bentsoaattiyhdisteen 3 vasta-ainekataiysoitu hydrolyysi estyi kompetitiivi- • · :.*·· sesti(Ki = 6 2 μΜ) karboksylaattiyhdistettä 5b lisäämällä.
• ♦ « • · « « · · 25 Yhdisteen 3 hydrolyysin pH-riippuvuutta tutkittiin monoklonaalisen reseptorin . 27A6 läsnä ollessa (20 μΜ) pH-välillä 7,2 - 8,4 (EPPS) ja pH-arvoilla 8,4 ja 10,0 [./ [2-(sykloheksyyliamino)etaanisulfonihappo (CHES)], sekä 50 mM puskuria että ♦♦·* 100 μΜ NaCl, 37 °C:ssa (kuvio 3). log k^tp :n pH-riippuvuus (kuvio 3A) oli lineaa- m · vV rinen tällä alueella, samoin kuin hydrolyysin taustanopeus (log K0bsd; kuvio 3B, : ' :30 umpinaiset kolmiot) ja yhdisteen 3 hydrolyysinopeus ekstrapoloituna pusku- : rikonsentraatioon nolla (Koh- = 2,3 x 10'2 min1) (kuvio 3B, umpinaiset ympyrät).
» « * ‘ | Puskurikonsentraation vaihtelu (12,5 - 50 mM) monoklonaalisen reseptorin 27A6 läsnä ollessa ei ilmaisee k^f :n riippuvuutta puskurilajin konsentraatiosta. Havai- 28 1 08437 tuissa nopeuksissa ei ollut eroa monoklonaalisella reseptorilla 27A6, kun määritettiin pH-arvossa 8,6 EPPSissä ja CHESissä (50 mM puskuria, 100 mMNaCl).
Monoklonaalisen reseptorin 27A6 esterolyyttiseen aktiivisuuteen ei vaikuttanut käsittely dietyylipyrokarbonaatilla tai maleiinihappoanhydridillä 30-kertaisella molaa · 5 risella ylimäärällä proteiiniin nähden. Samanlainen käsittely fenyyliglyoksaalilla tuotti katalyyttisen aktiivisuuden 75-%:isen menetyksen. Tällä samalla vasta-aine-valmisteella nähtiin myös nelinkertainen tiitterin lasku (sitoutuminen hapteeniyhdis-teeseen 5b) ELISA:lla. Proteiinin identtinen käsittely inhibiittoriyhdisteen 5b läsnä ollessa (viisinkertainen ylimäärä proteiiniin nähden) antoi tulokseksi vain 35-%:isen 10 katalyyttisen aktiivisuuden menetyksen eikä olennaista tiitterin muutosta.
Näistä havainnoista johtuen muita hapteeniyhdisteiden 5a, 6 ja 7 katalyyttisiä ja ei-katalyyttisiä vasta-aineita modifioitiin kemiallisesti fenyyliglyoksaalilla täsmälleen samalla edellä kuvatulla tavalla. Vasta-aineisiin yhdisteille 6 (2G4, 4E3, 6H4, 6A11) ja 7 (52D11, 57G12, 70F3, 5G3, 60A4) ei ollut vaikutusta (ELISA). Vasta-15 kohtana viidellä vasta-aineella, jotka indusoitiin käyttämällä yhdistettä 5a (57G11, 60A4, 52D11 ja 5G3) nähtiin kaikilla jonkin verran sitoutumisen menetystä (ELISA). Katalyyttisillä vasta-aineilla 57G11 ja 70F3 havaittiin nelinkertainen tiitterin aleneminen, ja vasta-aineilla 60A4, 52D11, ja 5G3 oli kolmin-, kaksin- ja yksinkertainen tiitterin pieneneminen, vastaavasti.
; '20 Edellä kuvattu strategia, joka perustuu vasta-aineiden käyttöön, jotka indusoitiin : hapteenien homologisesta sarjasta (kuvio 1), joista jokaisessa on pistevaraus välit- • · ; tömässä läheisyydessä, tai suorana substituutiona, kemialliseen ryhmään (esteri tai I a amidi), joka on määrä transformoida vastaavassa substraatissa (kuvio 1), on osoit- .·. : tautunut tehokkaaksi. Ajateltiin, että näitä hapteeneja kohotetut vasta-aineet omaa- • ·« 4L/25 vat vasta-aineenyhdistämiskohtaosassa tai sitoutumiskohdassa aminohappotäh-» · · * teen(tähteitä), jolla on varaus, joka on komplementaarinen tälle hapteenivaraukselle. Substraattiesteriyhdisteestä 3 puuttuu tämä varaus, mutta sillä on säilynyt samanlai- ’ * nen yleisrakenne. Siten yhdisteen 3 sitomisen jälkeen aminohappotähde(tähteet) si-toutumiskohdassa on vapaa alkuperäisestä varauksenstabilisointitehtävästään ja voi .'.‘.30 nyt toimia mahdollisena yleisenä happo/emäksenä tai siirtymätilaa stabiloivana .···. elementtinä.
• » t : Vaikka vasta-aine/hapteeni-varauskomplementaarisuus arvioitiin oleelliseksi koko . ’ projektin yleismenestykselle, ajateltiin kahden muun hapteenisuunnittelualueen olevan tärkeä. Ensimmäinen oli hydrolysoitavan asyylifunktionaalisuuden korvaami-35 nen, kun taas toinen edellytti varauksettomien hapteenien käyttöä.
29 1 08437
Ensimmäinen kohta kohdattiin käyttämällä sopivaa asyyliosaisosteeriä. Käytettiin hydroksyyliryhmää, jolla on tetraedrinen geometria ja joka toimi kehittyvän siirtymätilan riittävänä esityksenä. Tämä asema jätettiin tarkoituksella varauksetta niin, ettei esiintyisi enempää elektrostaattisia vaikutuksia. On kuitenkin ennustettavissa, 5 että "toisen sukupolven hapteenit" voisivat sisältää tässä asemassa varautuneen fos-foriryhmän kuten kuvataan US-patenttijulkaisussa 4629567 ja julkaistussa EP-patenttihakemuksessa 0260439A2. Varauksettomia hapteeneita [ts. yhdisteet 2 ja 6 (kuvio 1)] tarvittiin kontrolleina hypoteesin paikkansapitävyyden varmistamiseen, koska ne olivat käytännöllisesti katsoen rakenteellisesti identtiset yhdisteiden 1 ja 5 10 kanssa, mutta ilman varausta.
Edellä olevat tulokset osoittivat asyylinsiirtoreaktioita katalysoivan "tärppää ja kat-kaise"-strategian olevan käyttökelpoinen, kun N-metyylipyridmiumsuolayhdistettä la käytettiin vasta-aineinduktioon. Tällä hapteenilla 30 % saaduista monokloriäali-sista vasta-aineista oli katalyyttisiä. Vaikka tämä luku on vaikuttava, oli kiinnosta-15 vampi keksintö, että yksi näistä reseptoreista käytti katalyyttisessä prosessissa ionisoituvan ryhmän perusmuodon myötävaikutusta (pKa = 6,26 0,05). Lisäksi vasta-ainekatalysoidun reaktion pH-optimi oli lähellä neutraalia eikä neutraalin hap-teeniyhdisteen 2 käyttö osoittanut taipumusta katalyyttisten vasta-aineiden indu-sointiin.
. 20 Hapteeniyhdiste 7 valmistettiin jäljempänä kuvatulla tavalla. Tämän molekyylin ‘ , merkittävin ominaispiirre on tetraedrinen kationivaraus, joka korvaa suoraan sub- «tl ;:' straatin asyylihiilen. Vaikka tätä hapteenia voitaisiin pitää vielä enemmän radikaali- » » » ·' sena poikkeamana tekniikan tason tyypillisistä fosfonaattihapteenikorvikkeista, sen i V pitäisi kohdistua joukkoon aikaisemmin vastaamattomia kysymyksiä koskien "tärp- • t :.**:25 pää ja katkaise"-strategiaa. Seikoista kaksi ovat kationivarauksen tärkeys, mukaan :T: lukien sen sijoitus suhteessa substraatin katkaistavaan sidokseen, ja läsnä olevan asyylihiilen hydroksi-isosteerillä korvaamisen asiaankuuluvuus.
Hapteeniyhdistettä 7 vastaan nostetuista 26 vasta-aineesta yhdenkään ei havaittu » · ·;** nopeuttavan hydrolyysinopeutta olennaisessa määrin taustanopeuteen verrattuna.
:Y:30 Tämä tulos oli jännittävä sen tosiseikan valossa, että Schultzin tutkimusryhmän “» suunnittelemalla samanlaisella antigeenillä oli suuri taipumus (66 %) indusoida ka- . ’. talyyttisiä vasta-aineita eliminointireaktiota varten [Shokat et ai., Nature (Lontoo) ' - ; 338 (1989) 269]. Vaikka reaktiot olivat aivan erilaiset, Schultzin ryhmä löysi var- t · » moja todisteita siitä, että karboksylaatti oli osallisena katalyyttisessä prosessissa, 35 kuten havaittiin käyttämällä metyylipyridiniumhapteeniyhdistettä 1 indusoimaan vasta-aineita esterolyyttiseen reaktioon. Nämä tulokset yhdistettynä havaintoihiii 30 1 08437 vasta-aineista, jotka saatiin hapteeniyhdisteistä la ja 2, viittaavat seuraavaan: (1) Nopeuden lisääntyminen nähtynä monoklonaalisilla reseptoreilla, jotka on indusoitu hapteeniyhdisteestä la, eivät johdu ainoastaan katalyyttisenä perustana toimivan karboksylaatin läsnäolosta. (2) Funktionaalisuus hapteenissa, jota käytetään siirty-5 mätilan edustamiseen, on kriittinen. (3) Vaaditaan kationivarauksen ja siirtymätilan ainakin yhden neutraalin esityksen yhdistelmää hydrolyyttisten reseptorimolekyy-lien indusointiin.
Suunniteltiin samanlainen kokonaisprosessi kuin saatiin käyttämällä kationista hap-teeniyhdistettä 1, käyttämällä rakenteellisesti samanlaista anionista hapteenia. Bent-10 soehappohapteeniyhdiste la täytti välttämättömät vaatimukset. Yhdisteen 5a runko oli homologinen hapteeniyhdisteille la ja 2, kun se taas sisälsi anionisen pistevara-uksen välittömässä läheisyydessä asyyliiyhmään nähden, jonka suunnittelimme hydrolysoida. Karboksylaattiryhmän valinta perustui havaintoihin, jotka Pressman teki ja jotka osoittivat, että tämäntyyppisellä funktionaalisuudella hapteenimolekyy-15 Iin sisällä on voimakas taipumus indusoida positiivisesti varattua aminohappoa (ts. lysiini tai arginiini) vasta-aineensitomistaskun sisällä [(a) Pressman et ai., J. Am. Chem. Soc., 68 (1946) 250; (b) Pressman et ai., J. Am. Chem. Soc. 75 (1953) 686; (c) Grossberg et ai., J. Am. Chem. Soc.. 82 (1960) 5470]. Tuntui siltä, että kumpikin aminohappotähdesivuketju voisi auttaa katalyyttisessä prosessissa siirtymätilan 20 yleisellä happo- tai elektrostaattisella stabiloinnilla. Viimeksi mainittu prosessi, jo- .! ·.. hon liittyy arginiinitähteet, on vedetty mukaan entsyymikatalyysiin [(a) Riordan et : ;·. ai., Science (Washington, D.C.) 195 (1977) 884; (b) Cotton et ai., Proc. Natl. Acad.
: v. Sei. USA 76 (1979) 2551; (c) Springs et ai., Tet. Lett. 32 (1977) 3223.
: Syntetisoitiin hydroksietyylibentsoehappoyhdiste 5b. Yhdiste varustettiin N- • · ;.‘*:25 hydroksisukkinimidiesterillä yhdisteeksi 5a proteiinikantajaan sitomisen helppou-• · · ',· · den vuoksi. Immunisoinnit yhdiste 5a/KLH-konjugaatille tuottivat 18 mono- klonaalista vasta-ainetta, joista 3 oli katalyyttisiä ja joiden katalyysi inhiboitiin va-•; · ·: paalia hapteeniyhdisteellä 5b. Vaikka yhdisteen 5a indusoimien katalyyttisten resep- .···. torien lukumäärä ei ollut yhtä suuri kuin yhdisteellä la, oli miellyttävää keksiä, ettei 30 yksikään yhdisteiden la ja 5a neutraalin homologin (yhdiste 6) indusoimista 22 • ·· *;*·’ monoklonaalisesta vasta-aineesta ollut katalyyttinen. Jälleen kerran nähdään anti-’...: geenisuunnitelman sisältämän varautuneen funktionaalisuuden tärkeys.
’; Havainnot monoklonaalisen reseptorin 30C6 (indusoitu yhdisteestä la) pH/nopeus- profiilista ilmaisi, että dissosioituvan ryhmän perusmuoto oli osallisena katalyysis-35 sä. Myös huomattavaa oli k^f :n riippumattomuus puskurilajien konsentraatiosta, 31 1 08437 kuten havaittiin monoklonaalisella reseptorilla 27A6, joka indusoitiin yhdisteellä 5a (kuvio 1). Vastakohtana reseptorin 30C6 käyttäytymiselle keksittiin k^f :n pH- riippuvuus reseptorilla 27A6 (kuvio 3A). Vaikka tämä löytö vaikuttaa olevan ristiriidassa "tärppää ja katkaise"-teorian olemuksen kanssa, ajatellaan, että yhdisty-5 miskohta-aminohappotähdesivuketju(je)n pKa voi olla tutkitun pH-alueen ulkopuolella, tai että elektrostaattiset proteiini/substraatti-vuorovaikutukset (elektrostaat-tinen katalyysi) on oleellinen ominaispiirre tämän reseptorin kyvyssä nopeuttaa reaktiota [Fersht, Enzyme Structure and Mechanism, Freeman, toimittaja, New York (1985)].
10 Vaikkakaan ei voitu havaita lainkaan aminohapon sekaantumista reseptorin 27A6 hydrolyyttisessä reaktiossa pH-vaikutusten kautta, havaittiin näiden kaikkien kolmen (27A6, 57G12, 70F3) katalyyttisen vasta-aineen spesifinen inaktivoituminen käyttämällä arginiinia modifioivaa reagenssia fenyyliglyoksaali [Takahashi, J. Biöl. Chem. 243 (1968) 6171]. Aktiivisuuden (katalyyttmen/sitoutuminen) menetetyksen 15 voidaan selittää johtuvan reagenssin reaktiosta aminohappotähdesivuketjun kanssa sitoutumiskohdassa; sitä voidaan vähentää merkittävästi hapteeniyhdisteen 5b läsnäololla.
Konformaation muutos reagenssin reaktion jälkeen eri kohdassa johtaisi kuitenkin samanlaiseen johtopäätökseen. Siten on mahdollista, että arginiinitähde jossain *. 20 muualla kuin sitoutumiskohdassa on muuttunut kemiallisesti johtaen proteiinin kon- . formaatioiden stabilisoitumiseen, jossa proteiinissa sitoutumiskohta muuttuu niin, ettei se enää sido substraattiyhdistettä 3 tai hapteeniyhdistettä 5b. Tämä monimut- !. ; kaisuus ei kuitenkaan vaikuta pätevän tässä.
« · <
Katalyyttinen määritys ja ELISA-määritys osoittavat samoin kuin aikaisemmat si-:':'·25 toutumistutkimuksetkin, jotka on merkinnyt muistiin Freedman et ai., Immuno-chem. 9 (1972) 169 ja Mayers et ai. Immunochem. 9 (1972) 169, että guanidinium-ryhmien glyoksalaatio tuhoaa katalyyttisen ja/tai sitomisaktiivisuuden vain nega-..... tiivisesti varattujen hapteenien vastaisilla vasta-aineilla, eikä neutraalihapteeni-T yhdisteen 6 tai positiivisesti varatun hapteeniyhdisteen 7 vastaisilla vasta-aineilla.
;.:.:30 Jos glyoksalaatio aiheutti vaikutuksen muuttamalla guanidiniumia erillään sitoutu-miskohdasta edellä olevalla mekanismilla, on vaikea nähdä, miksi yhdisteen 6 tai 7 : .·. hapteenien vasta-aineisiin ei vaikutettaisi samalla lailla. Siten uskotaan, että argi- * ’ · niini, jonka guanidiumsivuryhmän pKa-arvo on tutkitun alueen yläpuolella, on si toutumiskohdassa ja on osallisena havaitussa katalyysissä.
32 '108437
Ennustetaan kokoonpano useista varauksista, jotka voivat tuottaa joukon katalyyttisiä ryhmiä tuottaen additiivisen nopeusvaikutuksen. Tämä vaikutus yhdistyneenä pääsyyn mahdollisten katalyyttisten vasta-aineiden paljon suurempaan valikoimaan [Shastry et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86 (1989) 5728] parantaa mahdollisuutta 5 kehittää ylivoimaisia katalysaattoreita.
V. Ligandin valmistus
Ellei toisin mainita, reaktiot suoritettiin liekillä kuivatuissa lasiastioissa typpi-ilmakehässä. Reagenssin- ja liuotinsiirrot suoritettiin uunissa kuivatuilla ruiskuilla ja neuloilla. Dikloorimetaani ja asetonitriili tislattiin jatkuvatoimisesti kalsiumhyd-10 ridistä. Tetrahydrofuraani a (THF) tislattiin natriummetalli/bentsofenoniketyylistä.
Kaikki reagenssit ostettiin yhtiöstä Aldrich Chemical Company. Kaikki kromato-grafialiuottimet saatiin kaupallisesti ja käytettiin sellaisinaan. Reaktioita seurattiin analyyttisillä ohutlevykromatografiamenetelmillä (TLC) käyttäen E. Merck-silika-geeli 60F -lasilevyjä (0,25 mm). Flash-kromatografia suoritettiin käyttämällä E. 15 Merck -silikageeliä 60 (230-400 mesh) tavalla, joka kuvataan julkaisussa: Still et ai.; J. Org. Chem. 43 (1978) 2923.
Sulamispisteet määritettiin Fisher-Johns-sulamispistelaitteella ja ne ovat korjaamattomia. Kaikki protoni-NMR-spektrit (300 MHz) saatiin CDCI3-, CD3CN- tai DMSO-liuoksissa ympäristön lämpötilassa Bruker AM-300 -spektrometrillä, ke-·. 20 mialliset siirtymät (a) esitetään yksikössä ppm suhteessa sisäiseen tetrametyy-lisilaaniin (0,00 ppm). Alkuaineanalyysit (C, H, N) suoritettiin yhtiössä Galbraith .;:’ Laboratories, Knoxville, TN.
Esimerkki 1: p-nitrofenyyliasetaldehydi p-nitrofenyyliasetaldehydi valmistettiin menetelmällä, joka kuvataan julkaisussa: • · ."•.25 Lethbridge et ai.; J. Chem. Soc. Perkin I, 35 (1973) p-nitrofenyylietyleenistä. p·· mtrofenyylietyleem valmistettiin menetelmällä, joka kuvataan julkaisussa: Strass-burg et ai.; J. Am. Chem. Soc. 69 (1947) 2142 l-bromi-2-(p-nitrofenyyli)etaanista • · ... (kaupallisesti saatavissa yhtiöstä Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI).
• ·
.·.·. Esimerkki 2: Yhdiste I
• « · .*·« 30 n-butyylilitiumia (3,33 x 10'2 mol) lisättiin tetrahydrofuraaniin (THF; 100 ml), jota pidettiin -100 °C:ssa eetteri/typpi-hauteessa. Tähän seokseen lisättiin 2-bromipyri-: diiniä (3,64 x 10'2 mol) sekoittaen 15 min. Reaktioseoksen lämpötila nostettiin •: -: -78 °C:seen siirtämällä reaktioastian asetoni/C02-hauteeseen, ja seosta sekoitettiin 1 tunti.
33 108437 p-nitrofenyyliasetaldehydi (5 g, 3,03 x 10‘2 mol), joka saatiin esimerkistä 1, liuotettuna THF:ään (30 ml), lisättiin hitaasti reaktioseokseen, ja seosta sekoitettiin 3 tuntia -78 °C:ssa.
Sekoittamisen jälkeen seos kaadettiin ammoniumkloridin kylläiseen liuokseen (500 5 ml) ja dietyylieetteriin. Seos uutettiin kahdesti dietyylieetterillä, yhdistetyt eetteri-kerrokset kuivattiin natriumsulfaatilla, ja ajettiin pylväällä 15-%:isella ChkCNillä CH2Cl2:ssa. Kerättiin tuote, yhdiste I (l-hydroksi-l-(2-pyridinyyli)-2-(p-nitrofenyy-li)etaani), jolloin saatiin 648 mg (2,7 x 10'3 mol, saanto 9 %).
!H-NMR Δ 8,55 (d, 1H); 8,10 (d, 2H); 7,65 (m, 1H); 7,3 (d, 2H); 7,2 (m, 2H); 5,05 10 (dd, 1H); 3,20 (m, 2H).
OH I
Yhdiste I
Esimerkki 3: Yhdiste II
: ·. . 15 Kuivaa metanolia (12 ml) lisättiin kuivaan 25 ml:n reaktioastiaan, jota huuhdottiin : typellä.
• ♦* • ♦ • ♦ ♦ : Yhdiste I (100 mg), joka saatiin esimerkissä 2, liuotettiin metanoliin oranssinvärisen liuoksen tuottamiseksi. Liuos huuhdottiin typellä, ja liuokseen lisättiin 10-% *: ” ί Pd/C:tä (75 mg). Reaktioastian sivut huuhdottiin pienellä määrällä metanolia, ja liu- *‘“;20 os huuhdottiin typellä, ja sitten huuhdottiin vedyllä. Reaktioseosta sekoitettiin noin 1 tunti, ja suodatettiin sitten seliittikerroksen läpi. Suodatin pestiin neljästi dikloo-rimetaanilla (CH2C12), ja sitten huuhdottiin kolmesti metanolilla kunnes suodatti-‘* mesta ei saatu TLC:llä (thin-layer chromatography) täplää muodostavaa materiaalia. : : Suodoshuuhtelut kuivattiin natriumsulfaatilla ja haihdutettiin kuiviin, jolloin saatiin •.• 25 85,6 mg (saanto 97,6 %) keltaista kiteistä kiinteää ainetta, Yhdistettä II (1-hydroksi* l-(2-pyridinyyli)-2-(p-aminofenyyli)etaani).
34 1 0 8 4 3 7
Oy-O-
OH M
Yhdiste II
Esimerkki 4: Yhdiste 2:
Yhdiste II (155 mg, 7,24 x 1CT4 mol) esimerkistä 3 sekoitettiin kuivan CH2Cl2:n (1,5 ml) ja trietyyliamiinin [(Et3N) (1,45 x 10'3 mol)] kanssa. Lisättiin N-hydroksi- λ 5 sukkinimidoyyliglutaroyylikloridia (359 mg, 1,45 x 10" mol), ja tulokseksi saatua reaktioseosta sekoitettiin 25 °C:ssa noin 40 min. Reaktiotuote haihdutettiin kuiviin i pyöröhaihduttimella, jolloin saatiin tulokseksi 61,5 mg (saanto 20 %) 5-[(2,5- :. i,: diokso)-l-pyrolidinyyli)oksi]-N-[4-[2-hydroksi-2-(2-pyridinyyli)etyyli]fenyyli]-5- j '/ oksopentaaniamidia, (Yhdiste2).
;./:10 ‘H-NMR (DMSO-de) Δ 9,82 (s, 1H); 8,48 (d, 1H, J=4,3Hz); 7,75 (dd, 1H, J=2x7,6
Hz); 7,42 (d, 2H, J=7,9Hz); 7,22 (m, 2H); 7,05 (d, 2H, J=7,9 Hz); 5,38 (d, 1H, : J=5,l Hz); 4,76 (dd, 1H, J=4,0, 3,5 Hz); 3,05 (dd, 2H, J=13,7, 4,0 Hz); 2,80 (s, 4H); 2,76 (t, 2H, J=8,2 Hz); 2,42 (t, 2H, J=8,2 Hz); 1,90 (m, 2H).
• € « · · • · . * * *; Alkuanalyysi C22H23N306:lle: v#:i5 Laskettu: C, 62,12; H, 5,41; N, 9,88.
c ·
Saatu : C, 62,19; H, 5,37; N, 9,92%.
35 1 0 8 4 3 7 ί^ι — 5 2
Yhdiste 2
Esimerkki 5: Yhdiste la
Yhdistettä 2 (30 mg, 7,06 x 10‘5 mol) esimerkistä 4 sekoitettiin metyylijodidin (7,06 x 10-4 mol) kanssa asetonissa (0,5 ml), ja refluksoitiin noin 17 tuntia. Reaktioseos 5 huuhdottiin kolmesti kloroformilla ja huuhdottiin sitten kolmesti kuumalla etyyliasetaatilla, jolloin saatiin 20 mg (saanto 50 %) hapteenista ligandia 2-[2-[5-[(2,5-diokso-l-pyrolidinyyli)oksi]-l,5-dioksopentyyli]-4-aminofenyyli]-l-hydrok-sietyyli]-l-metyylipyridiniumjodidi, (Yhdiste la).
!H-NMR (DMSO-dö) Δ 9,86 (s, 1H); 8,92 (d, 1H, J=6,lHz); 8,55 (d, 1H, J=8,0 Hz); 10 8,08 (t, 1H, J=6,8 Hz); 8,00 (t, 1H, J=7,9Hz); 7,48 (d, 2H, J=7,9 Hz); 7,12 (d, 2H, :' * . J=7,9 Hz); 6,30 (d, 1H, J=5,1 Hz); 5,34 (dd, 1H, J=4,0, 3,5 Hz); 4,35 (s, 3H); 3,02 (dd, 2H, J=13,6, 4,0 Hz); 2,80 (s, 4H); 2,72 (t, 2H, J=8,2 Hz); 2,45 (t, 2H, J=8,2 Hz); 1,90 (m, 2H).
< ( ·. \ AlkuanalyysiC23H26N306l:lle: :{^15 Laskettu: C, 48,67; H, 4,59; N, 7,41. v ; Saatu: C, 48,11; H, 4,51; N, 7,37 %.
ch3 & ö o : la • ·
Yhdiste la 36 1 0 8 4 3 7
Esimerkki 6: 2-[(4-nitrofenyyli)metyyIi-l,3-dioksoIaani (Yhdiste III) p-nitrofenyyliasetaldehydiä (500 mg, 3,0 x 10'3 mol) liuotettiin CH3Cl:ään (noin 1,5 ml). Seokseen lisättiin CaS04:ää (383 mg), minkä jälkeen Rexyn 101 -hartsia (pro-tonimuoto, Fisher Scientific; 128 mg) ja etyleeniglykolia (13,8 x 10'3 mol). Seosta 5 sekoitettiin typen alla noin 4 tuntia. Rexyn 101:tä ja CaS04:ää pidettiin ennen käyttöä 20 tuntia noin 120 °C:ssa kuivausuunissa ja kuivattiin sitten kuivauskaapissa.
Näyte poistettiin ja ajettiin TLC pelkällä CH2Cl2:lla. Lisättiin lisää Rexyn 101:tä ja CaS04:ää, ja seos sekoitettiin yön yli (noin 16-18 tuntia). Sekoitettiin seokseen lisättiin CH2Cl2:ta (10 ml). Näytteestä ajettiin TLC, eikä havaittu täplää muodostavaa 10 materiaalia.
Lisättiin vettä (10 ml), seosta sekoitettiin, ja orgaaninen kerros erotettiin, kuivattiin natriumsulfaatilla, ja puhdistettiin flash-kromatografialla käyttämällä heksaani:etyy-liasetaattia (2:1), jolloin saatiin 435,8 mg (70 %:n saanto) yhdistettä III.
^-NMR: Δ 8,10 (d, 2H); 7,4 (d, 2H); 5,10 (t, 1H); 3,8 (s, 4H); 3,0 (d, 2H).
15 Toisessa valmistuksessa lisättiin etyleeniglykolia (5,4 ml, 97 mmol) sekoitettuun liuokseen, jossa oli p-nitrofenyyliasetaldehydiä (3,0 g, 18,2 mmol) 10,0 ml:ssa me- tyleenikloridia. Tähän lisättiin 1,0 g Rexyn 101 (H) (Fisher Scientific)-kationin- vaihtohartsia ja 3,0 g jauhettua kalsiumsulfaattia, jota oli kuivattu uunissa (120 °C) yön yli. Seosta sekoitettiin 24 tuntia huoneenlämpötilassa, ja seuraavaksi reak- . .' 20 tioseos kaadettiin 100 mkaan H20:ta, ja uutettiin kolmesti 50 ml:n erillä metyleeni- : , kloridia. Yhdistetyt orgaaniset kerrokset kuivattiin natriumsulfaatilla ja puhdistettiin : ·, flash-kromatografialla, 2:1 heksaaniietyyliasetaatti, jolloin saatiin 2,28 g, 60 % teo- '. . reettisesta määrästä.
• · · • · '·?' ’H-NMR (CDCI3) Δ 8,18 (d, J=8,6Hz, 2H), 7,42 (d, J=8,6Hz, 2H), 5,08 (t, J=4,3Rz; 25 1H), 3,8-4,0 (m, 4H), 3,06 (d, J=4,3Hz, 2H).
« # * r ..." Alkuanalyysi CioHnN04:lle: • « .v. Laskettu: C, 57,42; H, 5,26; N, 6,70.
♦ · · • · : Saatu : C, 57,51; H, 5,19; N, 6,65.
; Esimerkki 7: 4-(l,3-dioksolan-2-yylimetyyli)bentseeniamiini (Yhdiste IV) ‘30 Yhdistettä III (231 mg) esimerkistä 6 liuotettiin metanoliin (noin 3 ml), ja seos huuhdottiin typellä. Seokseen lisättiin Pd/C:tä (120 mg), ja reaktioastian laidat huuhdottiin metanolilla (noin 2 ml). Seos huuhdottiin typellä ja sitten huuhdottiin 37 1 0 8 4 3 7 vedyllä. Reaktioseosta sekoitettiin 45 min ajan ja suodatettiin sitten seliitin läpi. Se-liitti huudottiin useita kertoja metanolilla, ja suodos ja huuhtelut haihdutettiin pyö-röhaihduttimella, jolloin saatiin 184,4 mg (saanto 90,6 %) yhdistettä IV.
Toisessa valmistuksessa lisättiin yhdistettä III (2,0 g, 9,6 mmol) 20 ml:aan me-5 tanolia. Tähän suspensioon lisättiin 10 % Pd/C:tä (200 mg), ja kolvi varustettiin ve-typallolla ja sekoitettiin nopeasti huoneenlämpötilassa 6 tuntia. Reaktioseos suodatettiin seliitin läpi ja konsentroitiin, jolloin saatiin 1,63 g, 95 % teoreettisesta määrästä. Tätä materiaalia käytettiin puhdistamatta enempää seuraavan esimerkin toistossa. TLC Rf= 0,3, 1:1 etyyliasetaatti:heksaanit.
10 Esimerkki 8: N-[4-(l,3-dioksoIan-2-yylimetyyli)fenyyIi-N-(fenyylimetyyli)bent-seenimetaaniamiini (Yhdiste V)
Yhdistettä IV (1,91 gm, 1,07 x 10'2 mol) esimerkistä 7 sekoitettiin CH2Cl2:n (10 ml) ja Et3N:n (4,45 ml, 3,2 x 10’2 mol) kanssa ja sekoitettiin. Sekoitettuun seokseen lisättiin tipoittain bentsyylibromidia (1,07 x 10'1 mol) sen jälkeen kun noin puolet 15 yhdisteestä IV oli liuennus liuokseen. Sitten liukeni kaikki amiini. Reaktio pysäytettiin noin 1 tunnin kuluttua. Liuos ajettiin pylväällä CH2Cl2:HCl:ssä (9:1) ja kerättiin 3,048 mg (saanto 79 %) haluttua tuotetta (Yhdiste V): ‘H-NMR: Δ 7,25 (s, 10H); 7,05 (d, 2H); 6,85 (d, 2H); 5,00 (t, 1H); 4,60 (s, 4H); 3,9 (m, 4H); 2,8 (d, 2H).
. .-20 Toistaen edellä olevan synteesin, yhdisteen IV (2 g, 11,2 mmol) sekoitettuun sus- .!]·. pensioon 10 ml:ssa metyleenikloridia lisättiin trietyyliamiinia (4,5 ml, 32 mmol).
i. ; Bentsyylibromidin (6,4 ml, 107 mmol) lisääminen suoritettiin tipoittain 30 min ai- \ \ kana sekoittaen nopeasti, sekoittaen tulokseksi saatua seosta vielä ylimääräiset 60 « ♦ · *· ” min. Reaktioseos laimennettiin metyleenikloridilla (50 ml) ja uutettiin (2 x 25 ml) l25 0,5 M HCl.llä. Yhdistetyt orgaaniset uutteet kuivattiin natriumsulfaatilla ja puhdis tettiin flash-kromatografialla 4:1 metyleenikloridi:heksaaneissa, jolloin saatiin 3,2 •: * ·: g, 80 % teoreettisesta määrästä.
«·· • · T *H-NMR (CDC13) Δ 7,35-7,23 (m, 10H), 7,06 (d, J=8,6 Hz, 2H) 6,66 (d, J=8,6 Hz, :X: 2H) 5,50 (5, J=4,3 Hz, 1H), 4,62 (s, 4H), 3,8-4,00 (m, 4H), 2,82 (d, J=4,3 Hz, 2H).
* «« « · •30 Alkuanalyysi C24H25N02:lle: ««· « ·:··: Laskettu: C, 80,22; H, 6,96; N, 3,90.
Saatu: C, 80,35; H, 7,11; N, 3,86.
38 1 0 8 4 3 7
Esimerkki 9: 4-[bis(fenyyIimetyyli)aminobentseeniasetaldehydi (Yhdiste VI)
Yhdistettä V (2 g, 5,6 x 10'3 mol) esimerkistä 8 liuotettiin asetoniin (6 ml) ja sekoitettiin typen alla. Seokseen lisättiin 4 M HC1 (6 ml), ja sekoitusta jatkettiin kunnes reaktioseos oli hieman keltaista. Reaktioseos siirrettiin erotussuppiloon, joka sisälsi 5 CH2Cl2:ta, ja pestiin NaCl:n vesiliuoksella. Orgaaninen kerros kuivattiin natrium-sulfaatilla ja säilytettiin yön yli (16 -18 tuntia) tyhjössä.
Ajettiin näyte TLC:llä ja värjäys ninhydriinillä osoitti 5 täplää CH2Cl2:heksaanissa (4:1). Reaktiotuote lisättiin 50 mm:n esiabsorboituun silikakolonniin, ja kerättiin 500 mg (saanto 29 %) täplää, joka vastasi haluttua tuotetta (yhdiste VI).
10 ^-NMR: Δ 9,5 (t, 1H); 7,1 (s, 10H); 6,8 (d, 2H); 4,5 (s, 4H); 3,4 (d, 2H).
Toisessa valmistuksessa liuokseen, jossa oli 2,0 g (5,6 mmol) yhdistettä V 15 ml:ssa asetonia, lisättiin 2 ml 4 M HC1. Tätä liuosta sekoitettiin 24 tuntia huoneenlämpötilassa. Reaktioseokseen lisättiin silikageeliä (10 g), ja seos konsentroitiin kuiviin. Flash-kromatografia ajettiin 4:1 metyleenikloridi:heksaaneissa esiabsorboidulla 15 raa'alla reaktiotuotteella, jolloin saatiin 0,7 g, 40 % teoreettisesta määrästä.
*H-NMR (CDC13) Δ 9,7 (t, J=2,9 Hz, 1H), 7,40-720 (m, 10H), 7,00 (d, J=8,6 Hz, 2H), 6,7 (d, J=8,6Hz, 2H), 4,66 (s, 4H), 3,54 (d, J=2,9Hz, 2H). ‘
Alkuaineanalyysi C22H2iNO:lle:
Laskettu: C, 83,81; H, 6,67; N, 4,44.
\-.-.20 Saatu : C, 84,06; H, 6,58; N, 4,50.
• ·
Esimerkki 10: 2-[2-(4-aminofenyyli-l-hydroksietyyli]bentsoehappo (yhdiste v': VII) 2-bromibentsoehappoa (88 mg, 4,33 x 10"4 mol) liuotettiin THF:ään (2 ml) ja jääh-·:· Ί dytettiin -78 °C:seen. Lisättiin n-butyylilitiumia (n-buLi) (8,38 x 10-4 mol), ja seosta . *". 25 sekoitettiin 2 tuntia.
Yhdistettä VI (91 mg, 2,89 x 10-4 mol), joka saatiin esimerkistä 9, lisättiin seokseen liuotettuna THF:ään (1 ml), ja seosta sekoitettiin 4 tuntia -78 °C:ssa. Reaktioseos ; ’. laimennettiin etyyliasetaattiin ja pestiin kahdesti kylläisellä NH4Cl:llä, minkä jäi · ' ; keen pestiin kerran 1 M HCl:llä. Orgaaninen jae erotettiin, kuivattiin natriumsulfaa· * 30 tiliä, ja haihdutettiin pyöröhaihduttimessa yön yli (noin 16-18 tuntia).
39 1 0 8 4 3 7
Tuotteen TLCtssä CH2Cl2:heksaanissa (4:1) näkyi kaksi täplää. Molemmat täplät kerättiin kolonnista. Haluttu tuote saatiin antaen 32 mg (saanto 25 %) yhdisteenä VII.
Ή-NMR: 7,1-7,8 (m, 14H); 6,9 (d, 2H); 6,6 (d, 2H); 5,6 (t, 1H); 4,6 (s, 4H); 3,0 (m, 5 2H).
Toisessa valmistuksessa 2-bromibentsoehappoa (957 mg, 4,8 mmol) liuotettiin 20 ml:aan tetrahydrofuraania ja jäähdytettiin -78 °C:seen (C02/asetoni), lisättiin n-butyylilitiumia (n-BuLi; 5,8 mM, 1,6 M heksaaneissa, 9,2 mmöl) ja sekoitettiin 1 tunti. Lisättiin aldehydiyhdiste VI (1,9 g, 3,2 mmol) liuotettuna 10 inkaan teträhyd-10 rofiiraania jäähdytettynä -78 °C:seen kanyylin kautta ja sekoitettiin sen jälkeen 4 tuntia -78 °C:ssa. Reaktioseos kaadettiin kylläiseen ammoniumkloridiin, minkä jälkeen seurasi uutto etyyliasetaatilla (2 x 50 ml). Yhdistetyt orgaaniset uutteet kuivattiin natriumsulfaatilla ja puhdistettiin flash-kromatografialla käyttäen pelkkää mety-leenikloridia, jolloin saatiin 860 mg, 62 % teoreettisesta määrästä.
15 Ή-NMR (CDCls) Δ 7,90-7,80 (m, 1H), 7,68-7,40 (m, 2H), 7,40-7,05 (m, 11H), 7,0 (d, J=8,6 Hz, 2H), 6,64 (d, J=8,6 Hz, 2H), 5,62 (t, J=7,l Hz, 2H), 3,64 (br s, 2H), 3,4-2,8 (m, 2H).
Alkuaineanalyysi C29H29N03:lle: : 7 Laskettu: C, 80,37; H, 6,24; N, 3,23.
ί'·;.·20 Saatu: C, 80,44; H, 6,29;N, 3,19.
• < « • « \ \ Esimerkki 11: 2-[2-[4-[bis(fenyylimetyyIi)amino]fenyyIi]-l-hydroksietyyIi]bent- soehappo (yhdiste 5b) • · ·
Yhdistettä VII (32 mg), joka saatiin esimerkissä 10, liuotettiin metanoliin (2 ml). Lisättiin Pd/C:tä (10 mg), ja reaktioseosta huuhdottiin vedyllä ja sekoitettiin noin ‘:‘*:25 1,5 tuntia kunnes kaikki täplää aiheuttava materiaali oli kulunut, määritettynä TLC:llä CH2Cl2:etyyliasetaatissa (1:1), antaen tulokseksi 16,2 mg (saanto 86 %) ,v, yhdistettä 5b.
• i i lii
Toistosynteesissä karboksylaattiyhdistettä VII (320 mg, 7,3 x 10"* mol) liuotettiin ; . 20 ml:aan metanolia. Tämän jälkeen lisättiin 10 % Pd/C:tä (32 mg), lisättiin kolviin ni · .... 30 vetyä, ja sekoitettiin nopeasti 90 min ajan. Suodatettiin seliitin läpi, minkä jälkeen seurasi konsentrointi, jolloin saatiin 179 mg, 95 % teoreettisesta määrästä. Tätä ma- 40 1 08437 teriaalia käytettiin seuraavan esimerkin toistossa puhdistamatta enempää. TLC Rp 0,6, 1:1 metyleenikloridi:etyyliasetaatti.
Esimerkki 12: 2-[2-[4-[[5-[(2,5-diokso-l-pyrolidinyyli)oksi]-l,5-dioksopen- tyyli]amino]fenyyIi]-l-hydroksietyylibentsoehappo (yhdiste 5a) 5 Yhdistettä 5b (16,2 mg, 6,3 x 10'5 mol), joka saatiin esimerkissä 11, liuotettiin CH2Cl2:een (70 μΐ), ja lisättiin sekoittaen Et3N:ää (1,26 x 10"4 mol).
Lisättiin N-hydroksisukkinimidoyyliglutaroyylikloridia (19,1 mg, 8,19 x 10'5 mol), ja reaktioseosta sekoitettiin typen alla. Sitten reaktioseos lisättiin suoraan prepara-tiiviselle TLC-levylle ja eluoitiin CH2C12:etyyliasetaatilla (1:1), jolloin saatiin 14,3 10 mg (saanto 50 %) haluttua hapteeniligandiyhdistettä 5 a.
^-NMR: Δ 9,2 (s, 1H); 7,2-6,8 (m, 6H); 6,6 (d, 2H); 5,2 (t, 1H); 2,6 (m, 2H); 2,1 (s, 4H); 2,0 (t, 2H); 1,8 (t, 2H); 1,4 (m, 2H).
Toistosynteesissä karboksylaattia VIII (100 mg, 3,9 x 10"4 mol) liuotettiin 800 pl:aan metyleenikloridia ja trietyyliamiinia (109 μΐ, 7,8 x 10-4 mol). Tämän liuotta-15 misen jälkeen lisättiin (5-[(2,5-diokso-l-pyrolidinyyli)oksi]-5-okso-pentanoyyli-kloridia (118 mg, 5,1 x 10-4 mol) ja sekoitettiin 20 min ajan.
Puhdistus suoritettiin lisäämällä raaka reaktioseos flash-kromatografiapylvääseen ja . eluoimalla 1:1 metyleenikloridi:etyyliasetaatilla, jolloin saatiin 159 mg, 90 % teo reettisesta määrästä.
i -'äo Ή-NMR (CDC13) Δ 9,24 (s, 1H), 7,36-6,8 (m, 6H), 6,42 (d, J=8,6 Hz, 2H) 5,20 (t, :'·;: J=7,1 Hz, 1H), 2,66-2,36 (m, 2H), 2,15 (5, 4H), 2,1-1,96 (m, 2H), 1,96-1,7 (m, 2H), 1,5-1,16 (m, 2H).
• · • · • · ·
Alkuaineanalyysi C24H24N20g:lle:
Laskettu: C, 61,54; H, 5,13; N, 5,98.
• · · ‘·;·:25 Saatu: C, 61,62; H, 5,10; N, 5,89.
• · « · « » · ·
Esimerkki 13: Yhdiste IX
« ·
Yhdistettä II esimerkistä 3 (262 mg, 1,22 x 10'3 mol) ja glutaarihappoanhydridiä : (140 mg) liuotettiin CH2Cl2:een (10 ml) ja sekoitettiin 16 - 18 tuntia. Liuokseen li- sättiin lisää glutaarihappoanhydridiä (40 mg), ja reaktioseosta sekoitettiin 3 tuntia ja 30 kaadettiin sitten Et3N:n vesiliuokseen (1,47 x 10‘3 mol). Sitten liuos laimennettiin etyyliasetaatilla, ja vesikerros poistettiin ja säädettiin happamaan pH-arvoon tri- 41 1 08437 fluorietikkahapolla (TFA). Vesikerros uutettiin etyyliasetaatilla, puhdistettiin HPLC:llä käyttämällä vakio 10:90 - 90:10 CH3CN:H20 gradienttia, jolloin saatiin 240 mg (saanto 60 %) haluttua yhdistettä (yhdiste IX).
‘H-NMR: Δ 8,3 (m, 3H); 7,6 (t, 2H); 6,9 (d, 2H); 6,7 (d, 2H); 5,1 (t, 1H); 2,8 (m, 5 2H); 2,0 (m, 4H); 1,5 (m, 2H).
IX
Yhdiste IX
Esimerkki 14: Yhdiste Ib
Yhdistettä IX (58 mg, 1,77 x 10-4 mol) esimerkistä 13 sekoitettiin metyylijodidin (8,84 x ΙΟ"4 mol) kanssa ja liuotettiin suljetussa putkessa asetoniin (noin 5 ml), ja 10 kuumennettiin noin 16 - 18 tuntia 80 °C:ssa. Sakka suodatettiin ja huuhdottiin : '" CHCl3:lla, jolloin saatiin 56 mg (saanto 67 %) yhdistettä Ib.
: v. 'H-NMR: Δ 8,5-7,5 (m, 4H); 7,2-6,8 (m, 4H); 5,2 (t, 1H); 3,2 (m, 2H); 2,2 (t, 2H); lv! 1,8 (t, 2H); 1,2 (m, 2H).
• · • · · • · * ch3 OH 6 6 • · · • · Λ « « · • · · · * « * · « ‘ ’ * Yhdiste Ib 42 1 0 8 4 3 7
Esimerkki 15: Yhdiste X
p-nitrofenolia (1 g, 7,19 x 10'3 mol) liuotettiin CH2Cl2:een (3 ml), ja lisättiin Et3N:ää (7,19 x 10"3 mol) keltaisen liuoksen tuottamiseksi.
Liuokseen lisättiin tipoittain bentsyylikloridia (8,63 x 10'3 mol), mistä seurasi hie-5 man kiehumista. Keltainen väri hävisi noin 5 min kuluttua, ja muodostui sakka. Sakkaa sisältävään liuokseen lisättiin CH2Cl2:ta (2 ml), minkä jälkeen lisättiin etyyliasetaattia (3 ml), joka liuotti sakan. Liuosta sekoitettiin 1 tunti.
Liuos sekoitettiin veden kanssa ja sekoitettiin noin 45 min ajan, minkä jälkeen pes-10 tiin 1 M HClillä, ja sitten kahdesti 10-prosenttisella NaHC03:lla, kahdesti 1 M HCl:llä, ja kahdesti kylläisellä NaCkllä. Orgaaninen kerros kuivattiin natriumsul-faatilla, haihdutettiin pyöröhaihduttimella, säilytettiin tyhjössä, ja erotettiin kolonnilla CH2Cl2:heksaanissa (2:1). TLC:llä pienemmän Rfin täplä kerättiin, jolloin saatiin 1,2613 g (saanto 72 %) yhdistettä X (p-nitrofenyylibentsoaatti).
15 ^-NMR: Δ 8,4-8,0 (m, 4H); 7,7-7,3 (m, 5H).
O
, ^°Ono> • « · • i t » • · » « ·
··.’ Yhdiste X
• · « « * *
Esimerkki 16: Yhdiste XI
*:··: Yhdistettä X (530 mg, 2,18 x 10'3 mol) esimerkistä 15, 12 M HC1 (200 μΐ), Pd/C
·**': (275 mg) ja vetykaasua sekoitettiin metanolissa (noin 15 ml) ja sekoitettiin 2,5 tun- /.20 tia typen alla kunnes kaikki täplää aiheuttava materiaali TLC:llä määritettynä *:/ CH2Cl2:MeOH:ssa (9:1) oli kulunut. Liuos suodatettiin ja kuivattiin, jolloin saatiin * ·; *' 518 mg (saanto 95 %) yhdistettä XI.
• * · * I ♦ ' < · 43 1 08437
O
0λοΌΜ": ci
Yhdiste XI
Esimerkki 17: Yhdiste 3
Yhdistettä XI (518 mg, 2,08 x 10'3 mol) esimerkistä 16 sekoitettiin CHfeCfem (10 ml) ja glutaarihappoanhydridin (260 mg, 2,28 x 10"3 mol) kanssa. Liuokseen liuotet-5 tiin Et3N:ää (4,58 x 10'3 mol), ja reaktioseosta sekoitettiin 16 - 18 tuntia.
TLC:llä havaittiin täplää muodostavaa materiaalia Ct^C^etyyliasetaatissa (9:1).
Liuokseen lisättiin enemmän glutaarihappoanhydridiä (0,25 mg), ja reaktioseosta sekoitettiin vielä 3 tuntia kunnes kaikki täplää muodostava materiaali oli kulunut
Liuos laimennettiin etyyliasetaatilla, pestiin kahdesti 1 M HCl.llä. Orgaaninen faasi 10 kuivattiin natriumsulfaatilla ja haihdutettiin, jolloin saatiin 655 mg raakatuotetta.
Raakatuote puhdistettiin FPLC:llä CH3CN:CH30H:H20:lla (4:1:4), jolloin saatiin '*7 3 97 mg yhdistettä 3.
« * *
* I
‘H-NMR: Δ 9,9 (s, 1H); 8,1 (d, 2H); 7,7-7,4 (m, 5H); 7,1 (d, 2H); 2,3 (t, 4H); 1,8 (m, 2H).
• · • * · • ·· • « ·"’· O o
HoWshn|)-0 1/ o * · · • · · 3 I · • · « ί Yhdiste 3 * ' * * (tr l « « 44 1 08 437
Esimerkki 18: Yhdiste 4
Ghitaarihappoanhydridiä (1,34 gm, 1,17 x 10'2 mol) ja p-aminofenolia (1,6 gm, 1,47 x 10'2 mol) liuotettiin CH^C^ieen (5 ml) ja sekoitettiin 35 °C:ssa 1 tunti. Seos laimennettiin etyyliasetaattiin, ja pestiin kahdesti 1 M HCl:llä. Orgaaninen kerros kui-5 vattiin natriumsulfaatilla ja haihdutettiin pyöröhaihduttimessa. HPLC osoitti tuotteen liuenneen vesikerrokseen, joka lyofilisoitiin, jolloin saatiin 214 mg raakatuotet-ta.
Raakatuote liuotettiin H20:hon (16 ml), metanoliin (5 ml) ja CH3CN:een (5 ml), ja puhdistettiin FPLC:llä, jolloin saatiin 89 mg yhdistettä 4.
10 !H-NMR: Δ 9,6 (s, 1H); 7,3 (d, 2H); 6,6 (d, 2H); 2,2 (m, 4H); 1,7 (m, 2H).
4 : ’" Yhdiste 4 1 t
Esimerkki 19: 2-[2-(4-aminofenyyli)-l-hydroksietyyli]-l-metyylibentseeni (yh-disteXII) *. n-BuLi:tä (2,8 ml, 2,6 M heksaaneissa, 4,4 mmol) lisättiin 30 ml:aan THF:ää ja • · · •;.;:15 jäähdytettiin -78 °C:seen (C02/asetoni). Tähän liuokseen lisättiin 2-bromitolueenia • * t # V 4 (0,573 ml, 4,8 mmol) ja annettiin sekoittua 30 min ajan. Seuraavaksi lisättiin aide- hydiyhdistettä VI (1,9 g, 3,2 mmol) liuotettuna 15 ml:ssa THF:ää ja jäähdytettynä "·' 7. -78 °C:seen, ja tulokseksi saatua seosta sekoitettiin 2 tuntia. Reaktioseos kaadettiin ·“*: kylläiseen ammoniumkloridiliuokseen ja uutettiin 2 x 25 ml:lla metyleenikloridia.
,Λ#20 Yhdistetyt orgaaniset kerrokset kuivattiin natriumsulfaatilla ja puhdistettiin flash- • Il ' ‘ kromatografialla 6:1:1,5 heksaanit:metyleenikloridi:etyyliasetaatissa, jolloin saatiin ; ' 900 mg yhdistettä XII, 69 % teoreettisesta määrästä.
i t « < i ;;;,j Ή-NMR (CDCIs) Δ 7,9-7,8 (m, m), 7,68-7,40 (m, 2H), 7,40-7,15 (m, 12H), 7,05 (d, J=8,6 Hz, 2H), 6,70 (d, J=8,6 Hz, 2H), 5,3 (t, J=7,l Hz, 1H), 4,62 (s, 4H) 3,0-2,7 25 (m, 2H), 2,3 (s, 3H).
45 1 08437
Alkuanalyysi C29H29NO:lle:
Laskettu: C, 85,50; H, 7,13; N, 3,44.
Saatu: C, 85,58; H, 7,08; N, 3,41.
Esimerkki 20: 2-[2-[4-[bis(fenyylimetyyIi)amino]fenyyli]-l-hydroksietyyIi]-l» 5 metyylibentseeni (yhdiste XIII)
Yhdisteen XII (900 mg, 2,2 mmol) liuokseen 50 ml:ssa etyyliasetaattia lisättiin 10-% Pd/C:tä (100 mg). Reaktioastia paineistettiin 345 kPa.han vedyllä PARR-hydrogenointilaitteessa. Reaktio oli edennyt loppuun 4 tunnin kuluttua, ja sitten suodatettiin seliitin läpi ja konsentroitiin tyhjössä, jolloin saatiin 476 mg yhdistettä 10 XIII, 95 % teoreettisesta määrästä. Tätä materiaalia käytettiin seuraavassa esimerkissä enempää puhdistamatta. TLC Rf = 0,05, 4:1 metyleenikloridi:heksaanit.
Esimerkki 21: 2-[2-[4-karboksi-l-oksobutyyli)amino]fenyyli]-l-hydroksi- etyyli]-l-metyylibentseeni (yhdiste 6)
Yhdisteen V (476 mg, 2,1 mmol) liuokseen 10 ml:ssa metyleenikloridia, joka sisälsi 15 trietyyliamiinia (351 μΐ, 2,5 mmol), lisättiin (5-[(2,5-diokso-l-pyrolidin- yyli)oksyyli]-5-okso-pentanoyylikloridia (572 mg, 2,3 mmol). Liuosta sekoitettiin 30 min, minkä jälkeen se laimennettiin etyyliasetaatilla (25 ml), pestiin 1 M HCl:llä (2 x 15 ml) ja kuivattiin natriumsulfaatilla. Raakamateriaali puhdistettiin flash* .' ,, kromatografialla, 1:1 metyleenikloridi:etyyliasetaatti, jolloin saatiin 780 mg yhdis* . , ,20 tettä 6, 85 % teoreettisesta määrästä.
: ‘;: ‘H-NMR (CDC13) Δ 9,24 (s, 1H), 7,4-6,85 (m, 6H), 6,45 (d, J=8,6 Hz, 2H), 5,20 (t, i V J=7,l Hz, 1H), 2,65-2,4 (m, 2H) 2,3 (s, 3H), 2,15 (s, 4H), 2,1-1,96 (m, 2H), 1,96- V-l 1,72 (m, 2H), 1,5-1,20 (m, 2H).
• · « • · · • · *
Alkuanalyysi C24H26N206:lle: "*‘:25 Laskettu: C, 65,75; H, 5,94; N, 6,39.
* · · • ·
Saatu: C, 65,79; H, 5,91; N, 6,41.
• · · • · · • ·
Esimerkki 22: 5-[(2,5-diokso-l-pyrolidinyyIi)oks]-N-[4-(hydroksimetyyli)fen- i i i • ’ · yyli]-5-oksopentaaniamidi (Yhdiste XIV) ; Trietyyliamiinin (1,13 ml, 8,2 mmol) liuokseen 10 ml:ssa metyleenikloridia liuotet- ‘30 tiin p-aminobentsyylialkoholia (1,9 g, 8,1 mmol). Tähän liuokseen lisättiin (5-[(2,5- diokso-l-pyrolidinyyli)oksi]-5-pentanoyylikloridia (2,21 g, 8,9 mmol) ja sekoitettiin yksi tunti. Reaktioseos laimennettiin metyleenikloridilla (25 ml) ja uutettiin 2 x 46 1 0 8 4 3 7 26 ml:lla 2 M HCl-liuosta. Tulokseksi saatu orgaaninen kerros kuivattiin natrium-sulfaatilla ja puhdistettiin flash-kromatografialla 9:1 metyleenikloridimetanolissa, jolloin saatiin 2,43 g yhdistettä XIV, 90 % teoreettisesta määrästä.
^-NMR (CDC13) Δ 8,0 (br x, 2H), 7,52 (d, J=8,6 Hz, 2H), 7,30 (d, J=8,6 HZ, 2H), 5 4,62 (s, 2H), 3,45 (s, 2H), 2,9 (s, 4H) , 2,75 (t, J-10 Hz, 2H), 2,5 (t, J=10 Hz, 2H), 2,38-2,10 (m, 2H).
Alkuanalyysi CiöHigNjCMle:
Laskettu: C, 57,49; H, 5,39; N, 8,38.
Saatu: C, 57,42; H, 5,44; N, 8,29.
10 Esimerkki 23: N-[4-(bromimetyyIi)fenyyIi]-5-[(2,5-diokso-l-pyrolidinyyli)- oksyyIi-5-okso-pentaaniamidi (yhdiste XV)
Yhdisteen XIV (2,9 g, 6 mmol) liuokseen 20 ml:ssa dimetyyliformamidia lisättiin dibromitrifenyylifosforaania (3,04 g, 7,2 mmol). Seuraavaksi reaktioseos lämmitettiin 50 °C:seen ja sekoitettiin 4 tuntia. Sitten reaktioseos laimennettiin 1 litralla 15 etyyliasetaattia, uutettiin suolaliuoksella (4x 200 ml) ja kuivattiin natriumsulfaatilla. Puhdistettiin flash-kormatografialla, 1:1 etyyliasetaatti:metyleenikloridi, jolloin saatiin 1,20 g yhdistettä XV, 50 % teoreettisesta määrästä.
‘H-NMR (CDCI3) Δ 8,0 (br s, 1H), 7,50 (d, J=8,6 Hz, 2H), 7,39 (d, J=8,6 Hz, 2H), : 4,5 (s, 2H), 2,9 (s, 4H), 2,75 (t, J=10 Hz, 2H), 2,5 (t, J=20 Hz, 2H), 2,38-2,10 (m, :-:20 2H).
Alkuanalyysi CiöHnNzOsdle: ♦ ♦ · • · · • · :T: Laskettu: C, 58,72; H, 5,20; N, 8,56.
. Saatu: C, 58,66; H, 5,24; N, 8,50 • ·
Esimerkki 24: 4-[[5-[(2,5-diokso-l-pyrolidinyyli)oksyyli]-l,5-dioksopentyyIiJ- .v.25 amino]-N,N-dimetyyli-N-bromidibentseenimetaaniaminiumbromidi (Yhdiste7) • ♦ · !.! Bromidiyhdiste XV (1,9 g, 2,5 mmol) liuotettiin 60 ml:aan metyleenikloridia, min- *;· kä jälkeen lisättiin dimetyylianiliinia (1,6 ml, 12,5 mmol). Liuosta sekoitettiin 30 * min ajan, minkä jälkeen muodostui sakka; sekoitusta jatkettiin 4 tuntia. Muodostu- -; : nut suspensio siirrettiin erotussuppiloon ja uutettiin 3x30 ml:lla tislattua vettä. Yh- 30 distetyt vesipesut lyofilisoitiin, jolloin saatiin 1,17 g tuoteyhdistettä 7, 90 % teoreettisesta määrästä.
47 1 08437 ^-NMR (D20) Δ 7,60 (s, 5H), 7,38 (d, J=8,6 Hz, 2H), 7,9 (d, J=8,6 Hz, 2H), 4,95 (s, 2H), 3,62 (s, 6H), 2,9 (s, 4H), 2,75 (t, J=10 Hz, 2H), 2,5 (t, J=10 Hz, 2H), 2,38-2,10 (m,2H).
Alkuanalyysi C^H^NsOsBnlle: 5 Laskettu: C, 55,60; H, 5,41; N, 8,11.
Saatu: C, 55,67; H, 5,39; N, 8,07.
Esimerkki 25: Sukkinimidyyliadipoyyli- ja glutaroyylikloridien valmistus (liit-tämisreagenssit)
Adipiinihappomonometyyliesterin (5,4 g, 33,3 mmol) liuosta tionyylikloridissa (15 10 ml) kuumennettiin 2 tunnin ajan 40 °C:ssa. Sitten seos konsentroitiin ja tislattiin tyhjössä (kp. 119 °C/267 Pa), jolloin saatiin 3,58 g (saanto 60 paino-%) happoklori-dimetyyliesteriä. Tämä liuotettiin 20 ml:aan dikloorimetaania, ja lisättiin N-hydroksisukkinimidiä (2,75 g, 24,0 mmol), ja sitten trietyyliamiinia (4,2 ml, 30 mmol). Seosta sekoitettiin 10 min, sitten laimennettiin etyyliasetaatilla ja pestiin 0,5 15 M HCl:llä ja suolaliuoksella. Liuos kuivattiin vedettömällä magnesiumsulfaatilla, suodatettiin ja konsentroitiin, jolloin saatiin 4,5 g (saanto 87,5 paino-%) metyy-lisukkinimidyyliadipaattia) värittömänä öljynä.
!H-NMR (CDCI3, 100 MHz) (suhteessa sisäiseen TMS-standardiin): Δ 3,73 (s, 3H), : 2,90 (s, 4H), 2,70 (m, 2H), 2,37 (m, 2H) ja 1,79 (m 4H) • * * • « · ΓΛ20 Metyylisukkinimidyyliadipaatin (4,5 g, 17,5 mmol), klooritrimetyylisilaanin (11,1 i'·': ml, 87,5 mmol) ja natriumjodidin (13,1 g, 87,5 mmol) liuosta 10 ml:ssa asetonitrii- liä kuumennettiin refluksoiden 12 tuntia. Sitten seos jäähdytettiin huoneenlämpöti-laan ja laimennettiin etyyliasetaatilla. Reaktioseos pestiin toistuvia kertoja 5- • · · prosenttisella natriumbisulfiitin vesiliuoksella, kunnes orgaaninen liuos oli väritön. .25 Kun se pestiin suolaliuoksella, kuivattiin vedettömällä magnesiumsulfaatilla, suoda-8/ tettiin ja konsentroitiin, saatiin 3,2 g (saanto 71 paino-%) adipiinihappomonosuk- ♦ · · * kinimidyyliesteriä valkoisena kiinteänä aineena.
« · • · · *,* 'H-NMR (CDCI3, 100 MHz) (suhteessa sisäiseen TMS-standardiin): Δ 3,90 (s, 4H), : ·; ·1 2,70 (m, 2H), 2,4 (m, 2H), 1,80 (m, 4H).
8,,.-30 Adipiinihapposukkinimidyyliesterin (1,00 g, 3,80 mmol) ja tionyylikloridin (5 ml) seosta kuumennettiin 3 tuntia 40 °C:ssa, jäähdytettiin sitten huoneenlämpötilaan ja konsentroitiin tyhjössä. Jäännös sekoitettiin useita kertoja kuivan heksaanin kanssa, 48 108437 öljy erotettiin ja kuivattiin tyhjössä, jolloin saatiin 0,97 g (saanto 90 paino-%) suk-kinimidyyliadipoyylikloridia. Tämä liuotettiin kuivaan tetrahydrofiiraaniin 5 M liuoksen tekemiseksi, jota käytettiin sellaisenaan valmistettaessa yhdisteitä, jotka soveltuvat liittämiseen proteiiniväliaineisiin.
5 ^-NMR (CDCI3, 100 MHz) (suhteessa sisäiseen TMS-standardiin): 3,00 (m, 2H), 2,90 (s, 4H), 2,70 (m, 2H), 1,80 (m, 4H).
Sukkinimidyyliglutaroyylikloridi [5-[(2,5-diokso-1 -pyrolidinyyli)oksi]-5-okso-pen-tanoyylikloridi] valmistettiin samalla lailla, ja sitä käytetään jäljempänä kuvatulla tavalla.
10 VI. Konjugaattien ja siirrostusten valmistus
Voidaan valmistaa hapteeniligandimolekyylien konjugaatteja proteiiniväliaineiden kuten "keyhole limpet"-hemosyaniinin (KLH) tai naudan seerumialbumiinin (BSA) kanssa esimerkiksi aktivoimalla väliaineen liittämisreagenssilla kuten MBS (m-maleimidobentsoyyh-N-hydroksisukkinimidiesteri), ja liittämällä hapteeniligandin 15 tioliryhmään. Katso esimerkiksi Liu et ai., Biochem. 80 (1979) 690. Kuten myös tiedetään tekniikan tasolla, on usein eduksi sitoa yhdiste väliaineeseensa välissä olevalla liittäjäryhmällä.
Käyttökelpoiset väliaineet ovat tekniikan tasolla hyvin tunnettuja, ja niitä ovat usein ,' ,, itse proteiinit. Esimerkinomaisia tällaisia väliaineita ovat "keyhole limpet" . ,' ,20 -hemosyaniini (KLH), edestiini, tyroglobuliini, albumiinit, kuten naudan seerumial- bumiini tai ihmisen seerumialbumiini (BSA tai HS A, vastaavasti), punaiset verisolut, kuten lampaan punasolut (SRBC), tetanustoksoidi, koleratoksoidi samoin '. . kuin polyaminohapot kuten poly(D-lysiini:D-glutamiinihappo) ja vastaavat.
• · · • ·
Kantajan valinta riippuu enemmän antigeenin lopullisesta ajatellusta käytöstä kuin 25 antigeenin determinanttiosasta, ja se perustuu kriteereihin, jotka eivät erityisesti liity ... * tähän keksintöön. Jos esimerkiksi konjugaattia on määrä käyttää laboratorioeläimis- sä, pitäisi valita kantaja, joka ei muodosta erityistä eläintä vastaan epäsuotuisaa reaktiota.
• · • · · ♦ · · « ·
Kantaja/hapteeni-konjugaatti liuotetaan tai dispergoidaan siirrostuksen muodosta-. ·. 30 miseksi vesikoostumukseen fysiologisesti siedettävästä laimennusaineesta kuten ; normaali suolaliuos, PBS, tai steriili vesi. Siirrostukseen voidaan myös sisällyttää adjuvanttia kuten täydellistä tai epätäydellistä Freundin adjuvanttia tai alunaa. Siir-rostusta lisätään vasta-aineiden muodostamiseen käytettyyn eläimeen injektiolla riittävä määrä vasta-aineiden indusoimiseksi, kuten on hyvin tunnettua.
108437 49
Esimerkinomaisia immunogeenisiä konjugaatteja valmistettiin hapteeniligandista sovittamalla niiden synteesit hiiliatomien suoran ketjun sisällyttämiseksi hapteenili-gandibentsyyliryhmään (vastaten reaktanttiligandiesterin fenoliosaa) välike-elementiksi, kuten aikaisemmin mainittiin. Muita esimerkinomaisia immunogeeni-5 siä konjugaatteja voidaan valmistaa välike/liittämiselementiksi hapteeniligandista sovittamalla näitä synteesejä hiiliatomien suoran ketjun sisällyttämiseksi hapteenili-gandin osaan, joka vastaa reaktanttiligandin happo-osaa.
Vedettiin johtopäätös, että adipaatti- tai glutaraattilisäkkeen joustava hiiliketju vähentäisi kaikkea immunoreaktiivisuuden poikkeamaa johtuen konformaatiopakosta, 10 jonka kovalenttinen kiinnitys kantajaproteiiniin aiheuttaa. Tähän tarkoitukseen valmistettu kaksoistoiminen reagenssi myös vapauttaa ennalta aktivoidun karboksyyli-ryhmän liittymistä varten amidisidoksen muodostuksen kautta kantajan ly-siinitähdeiden kanssa. Tässä kuvataan edelleen tässä tutkimuksessa käytettyä erityistä liittämismenetelmää. Hapteeniligandit liitettiin "keyhole limpet"-hemo-15 syaniiniin (KLH) rakenteen fenolisen osan aminoryhmän kautta.
Tämän keksinnön mukaisesti välikeliittämisreagenssi on edullisesti sukkinimidyy-liadipoyyli- tai glutaroyylikloridi, jotka valmistettiin edellä kuvatulla tavalla. Antigeeninen (immunogeeninen) konjugaatti valmistetaan seuraavalla tavalla.
Esimerkinomaisessa proseduurissa 2,5 mg edellä mainittua hapteenin ja sukkinimi-. . 20 dyyliadipoyylikloridin tai sukkinimidyyliglutaroyylikloridin reaktiotuotetta 250 : pl:ssa dimetyyliformamidia lisätään hitaasti sekoittaen 2 mg:aan KLH:ta 750 pl:ssa :'. ; 0,01 M natriumfosfaattipuskuria pH-arvossa 7,2. Käytetään lämpötilaa 4 eC, ja tu-
« I
; v, lokseksi saatua seosta sekoitetaan noin 1 tunti hapteeniliitetyn KLH-konjugaatin *,·.*; muodostamiseksi. Tämän jälkeen näin muodostunut konjugaattireaktiotuote • ♦ · I./25 puhdistetaan tavallisella tavalla.
I · « VII. Monoklonaalisten reseptorien valmistus ·:·: Edellä mainittuja KLH-konjugaatteja (noin 100 pg) käytettiin immunisoimaan nel- ♦***; jän ryhmiä 8-viikkoisia hiiriä (129GlX+-kanta) vatsaontelonsisäisellä (IP) injektiol-·« · la täydellisessä Freundin adjuvantissa. Edelleen IP-injektio 50 pg konjugaattia alu-*;*’*30 nassa annettiin 2 viikkoa tämän jälkeen. 1 kuukausi tämän jälkeen hiiri, jolla oli ' ·; ‘ korkein vasta-ainetiitteri hapteenille, injisoitiin laskimonsisäisesti 50 pg:lla KLH- : :': konjugaattia. Pernat otettiin kolme päivää tämän jälkeen hybridoomien ja monoklo- •; · · · naalisten vasta-aineiden valmistamiseksi.
50 108437
Monoklonaaliset vasta-aineet saatiin tavalla, joka kuvataan julkaisuissa: Niman et ai., Proc. NatiL Acad. Sei. USA 77 (1980) 4524; ja Niman et ai., teoksessa Monoclonal Antibodies and T-cell Products, toimittaja, Katz, D.H., 23-51 (CRC Press, Boca Raton, FL 1982). Lyhyesti, pernasoluja (1 x 108) fuusioitiin 2,0 x 107 Sp2/0-5 myeloomasolun kanssa. Solut siirrostettiin 45:lle 96-kaivoiselle levylle; kunkin kaivon sisältäessä 150 μΐ HAT-DMEM-väliainetta sisältäen lisäksi 1 % nutridoomaa ja 2 % BSA:ta. Tämän keksinnön mukaisten hybridoomien muodostamiseen käytetyt imusolut voivat olla peräisin mistä hyvänsä nisäkkäästä, kuten primaatti, rodentti (esimerkiksi hiiri tai rotta), kani, marsu, lehmä, koira, lammas, sika tai vastaava. 10 Isäntä voidaan sopivuuden mukaan herkistää immunogeenin injektiolla, tässä tapauksessa hapteenisen ligandin, minkä jälkeen seuraa tehostusinjektio, ja sitten pernan eristäminen.
On edullista, että myeloomasolulinja on samasta lajista kuin imusolut. Tämän vuoksi käytetään tyypillisesti fuusioituja hybridejä kuten hiiri-hiiri-hybridejä [Shulman 15 et ai., Nature 276 (1978) 269] tai rotta-rotta-hybridejä [Galfre et ai., Nature 277 (1979) 131], Hybridoomien muodostuksessa on kuitenkin menestyksellisesti käytetty myös joitain rotta-hiiri-hybridejä [Goding, "Production of Monoclonal Antibodies by Cell Fusion," teoksessa Antibody as a Tool, Marchalonis et ai. toimittajat, John Wiley & Sons Ltd., p. 273 (1982)]. Sopivia myeloomalinjoja tämän keksinnön 20 mukaisesti käytettäväksi ovat mm. MPC-11 (ATCC CRL 167), P3X63-Ag8.653 (ATCC CRL 1580), Sp2/0-Agl4 (ATCC CRL 1581), P3 X 63 Ag8U.l (ATCC . .': CRL 1597), Y3-Agl.2.3. (tallennettu laitokseen Collection Nationale de Cultures de : , , Microorganisms, Pariisi, Ranska, numero 1-078) ja P3X63 Ag8 (ATCC TIB 9). Ei- erittävä hiirimyeloomalinja Sp2/0 tai Sp2/0-Agl4 on edullinen tässä keksinnössä '..25 käytettäväksi.
:J*: Lopulta muodostuneita hybridoomasoluja voidaan kasvattaa tavallisella in vitro- kudosviljelyllä käyttämällä tällaisille soluille hyvin tunnettuja tekniikkoja. Edulli-·;<·* semmin hybridoomasoluja kasvatetaan eläimissä käyttämällä samalla lailla hyvin tunnettuja tekniikkoja monoklonaalisilla reseptoreilla, jotka saadaan näin muodos-• ' 30 tuneesta vatsaontelonesteestä. Vatsaontelonesteen muodostamiseen käytetyt eläimet *·*.· olivat Balb/c x 129G1X -hiiriä, joita kasvatettiin hiirikoloniassa yhtiössä Scripps Clinic ja Research Foundation, La Jolla, California, kuitenkin kun hybridoomien ; . ·. valmistukseen käytetään muita eläimiä kuin hiiriä, voidaan vatsaontelonesteen val- : mistukseen käyttää hiiriä tai tuota eläintyyppiä.
35 Erityisesti esimerkinomainen monoklonaalinen reseptori tuotettiin standardihybri- doomatekniikalla, jonka on kuvannut: Kohler et ai.; Nature 256 (1975) 495. Spesifi- 51 1 08437
sesti, 129GlX+-hiiriä inmumisoitiin vatsaontelonsisäisellä injektiolla siirrostusta, jossa oli 100 pg konjugaattia (esimerkiksi, yhdiste la, 2 tai 5a sitoutuneena KLH;hon) 300 piissä l:l-seosta fosfaattipuskuroidusta suolaliuoksesta (PBS) pH
7,4 ja täydellisestä Freundin adjuvantista. 2 viikkoa myöhemmin hiiret injisoitiin 5 jälleen samalla tavalla 50 pgilla edellä esitettyä konjugaattia 300 piissä l:l-seosta PBS:stä (pH 7,4) ja 10 mg/ml alunasta. Edelleen 8 viikon kuluttua hiiret immunisoitiin laskimonsisäisesti 50 pgilla konjugaattia 200 piissä PBSiää (pH 7,4). Pernat poistettiin hiiristä 4 päivää myöhemmin, ja pernasolut fuusioitiin myeloomasolui-hin.
10 Pernasolut yhdistettiin ja tehtiin 1-solususpensio. Nukleoituja pernasoluja (1,4 x 108) fuusioitiin sitten 3 x 107 Sp2/0-ei-erittävän myeloomasolun kanssa solun-fuusionedistäjän (polyetyleeniglykoli 2000) läsnä ollessa. Hybridooma, joka tuottaa erityistä monoklonaalista vasta-ainetta, valittiin siirrostamalla hybridoomasolut 96-kaivoisiin levyihin ja kasvattamalla Dulbeccon modifioidussa Eagle-väliaineessa 15 (DMEM), joka sisälsi 4500 mg/1 glukoosia (10 %), 10 % naudan sikiön seerumia (FCS), hypoksantiinia, aminopteriinia ja tymidiiniä (ts. HAT-väliaine), joka ei ylläpidä fuusioimattomien myeloomasolujen kasvua.
2-3 viikon kuluttua kerättiin supematantti solukloonin päältä kustakin kaivosta ja testattiin ELISA-määrityksellä ("enzyme linked immunosorbent assay", joka kuva-' . 20 taan jäljempänä) yhdisteen la, 2 tai 5 vasta-aineiden läsnäolo antigeeneinä. Kukin : hapteeniligandi konjugoitiin BSAihan ELISA-määrityksiä varten. Positiiviset kaivot kloonattiin kahdesti rajoittavalla laimennoksella. Ne kloonit, jotka jatkoivat yhdiste : la- tai 2-spesifisen vasta-aineen tuottamista kahden kloonauksen jälkeen, laajennet- : tiin suurempien supematanttinestetilavuuksien tuottamiseen.
• ♦ • · · « · · .•:\25 Seitsemän 23 monoklonaalisesta reseptorista (noin 30 %), jotka immunoreagoivat « · « yhdisteen la kanssa, hydrolysoivat katalyyttisesti reaktanttiligandiestereitä Yhdiste 3. Jokainen näistä katalyyseistä voitiin inhiboida sopivalla hapteenisella ligandilla * ♦ < - kuten yhdisteellä Ib. Siten suhteellisen suuri %-osuus indusoiduista monoklonaali- • * sista reseptoreista pystyi katalysoimaan esterolyyttistä reaktiota. Millään 21 vasta- :Y:30 aineesta, jotka indusoitiin hapteeniyhdisteellä 2, ei ollut katalyyttistä aktiivisuutta • · : ": reaktanttiligandiyhdistettä 3 kohtaan. Samalla lailla koloniat, jotka tuottivat aluksi vasta-aineita, jotka liittyvät yhdisteisiin 5a, 6 tai 7, alildoonattiin kahdesti, minkä ·' · · ; jälkeen 18 yhdisteelle 5a, 22 yhdisteelle 6 ja 26 yhdisteelle 7 pysyi aktiivisina. N,4~ ; * mä vasta-aineet olivat kaikki IgG-luokkaa.
'108437 f 52
Monoklonaaliset katalyyttiset molekyylit saostettiin pristaanilla alustetuissa Balb/c x 129GlX+-hiirissä kasvatetuista vatsaontelonesteistä suolalla, puhdistettiin anioninvaihtokromatografialla (DEAE), minkä jälkjeen seurasi affiniteetti-kromatografia (proteiini G), ja dialysoitiin 50 mM fosfaattiin (100 mM NaCl, pH 5 7,5). Vasta-aineet arvosteltiin homogeenisiksi (95 %) natriumdodekyylisulfaatti- polyakryyliamidigeelielektroforeesilla.
Hybridoomista yhtä, joka nimettiin 30C6, tutkittiin edelleen, ja se on talletettu laitokseen American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD. Tämä hybridooma talletettiin 24. tammikuuta 1990, ja se sai tulonume-10 ron HB 10341. Kaksi muuta hybridooma 27A6 ja 57G11 talletettiin samalla lailla ATCC-laitokseen 11. jouukuuta 1990, ja saivat tulonumerot HB 10621 ja HB 10622, vastaavasti.
Nämä talletukset tehtiin kansainvälisen Budapestin sopimuksen mukaisesti siten, että talletusten keston pitäisi olla 30 vuotta talletuspäivästä tai 5 vuotta talletuksen vii-15 meisen pyynnön jälkeen talletuspaikassa tai tästä hakemuksesta saatavan US-patenttijulkaisun voimassaoloajan, kumpi hyvänsä on pitempi. Hybridoomia täydennetään, jos ne kuolevat talletuksessa.
Tämä keksinnön mukainen monoklonaalinen reseptori voidaan tuottaa myös lisäämällä hybridooma injektiolla nisäkkään, kuten hiiren, vatsaonteloon. Edullisesti, ku-: ' · ·20 ten jo mainittiin, käytetään syngeenisiä (saman lajin toisella yksilöllä) tai semisyn- : geenisiä nisäkkäitä, kuten US-patenttijulkaisussa 4361549, jonka kuvaus liitetään ;' ·': tähän viitteeksi. Hybridooman lisääminen aiheuttaa vasta-ainetta tuottavien hybri- doomien muodostumisen sopivan ajanjakson, esimerkiksi 1-2 viikon kuluttua, ja : siitä on tuloksena suuri konsentraatio tuotettua reseptoria, joka voidaan saada tai- , ·’; · *25 teen isäntähiiren verenkierrosta ja vatsaontelon nesteestä (ascites). Vaikka isäntähii- • · · iillä on veressään ja vatsaontelonesteessä myös normaaleja reseptoreita, normaalien . reseptorien konsentraatio on tyypillisesti vain noin 5 % monoklonaalisen reseptorin konsentraatiosta.
• · «-• ♦ « ♦ ♦ ♦ .♦!*. Hybridoomasupematantissa läsnä olevaa monoklonaalista reseptoria voidaan käyt-• · · * * 30 tää puhdistamatta, tai reseptori voidaan ottaa talteen hiiren vatsaontelonesteestä tai seerumista käyttämällä valiotekniikkoja, kuten affmiteettikromatografiaa, käyttä-},; j mällä AD 169 -infektoituja soluja, jotka on liitetty immunosorbenttiin, kuten Sepha-: · : rose 6B tai 4B (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ), minkä jälkeen seuraa eluointi immunosorbentista käyttämällä hapanta puskuria, kuten glysiinihydroklori-35 dia, pH-arvossa noin 2,5.
i 53 1 08437 ; Näissä tutkimuksissa IgG-fraktiot saatiin tyypillisesti hiiren vatsaontelonesteestä saostamalla 45-prosenttisella kylläisellä ammoniumsulfaatilla, minkä jälkeen seurasi kromatografia DEAE-Sephacelilla natriumkloridieluoinnilla aikaisemmin mainitulla tavalla. Dialysoitiin ja konsentroitiin fraktio, joka eluoitui 100 mM suolalla.
5 VIII. ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay)
Ligandien sitoutuminen ja kemiallisen modifioinnin vaikutus määritettiin ELIS Ailia vasta-aineella kiinteällä konsentraatiolla sen tiitterialueella ja vaihtelevalla reagens-si- tai ligandikonsentraatiolla. Inhibitio raportoidaan jos tiitteri alenee 50 %:a rea-10 genssiihapteeni-suhteella alle 1000:1.
Määritykset suoritettiin tasapohjaisilla polyvinyylimikrotiitterilevyillä (Dynatech, Alexandria, VA). Kuvausmielessä kaivot päällystettiin liuoksella, joka sisälsi yhdistettä la sidottuna BSAihan antigeeniligandina fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (PBS) käyttäen 50 μΐ liuosta/kaivo. Ligandit päällystettiin tasolla 1 pg/ml. Sitten 15 levyjä inkuboitiin kuivassa uunissa yön yli 37 °C:ssa. Kuivattuja levyjä varastoitiin käyttöön asti 4 °C:ssa. Ennen ELISA-määritystä kuivatut levyt dehydratoitiin kahdella 2 min pesulla 10 mmol (mM) PBS.llä, pH 7,4, joka sisälsi 0,1 % polyoksalky-leeni(20)sorbitaanimonolauraattia (Tween 20) ja 0,02 % Thimerosalia (natriumetyy-lielohopeatiosalisylaatti), (Sigma, St. Louis, MO).
. ,'.20 Ei-spesifisen sitoutumisen vähentämiseksi hybridoomasupematantit laimennettiin : v. 1:2 pesupuskuriin, joka sisälsi 0,1 % BSA:ta laimennusaineena. 50 μΐ laimennettuja 1 t !. l hybridoomasupematantteja lisättiin tämän jälkeen kuhunkin kaivoon ja inkuboitiin 1 tunti 4 °C:ssa gyroravistelijalla monoklonaalista vasta-ainetta sisältävän supema- • · · tantin saattamiseksi kontaktiin sitoutuneen yhdisteen kanssa, minkä jälkeen seurasi *«* *25 kaksi 2 min pesua, kuhunkin kaivoon lisättiin 50 μΐ peroksidaasi-leimattua vuohi-anti-hiiri-IgG + IgM:ää (Tago, Burlingame, CA), laimennettuna 1:1000, ja reak- 9 tioseosta inkuboitiin 1 tunti 4 °C:ssa leimatun vasta-aineen kiinnittämiseksi kiinnit-tyneeseen monoklonaaliseen vasta-aineeseen.
Substraatti, jota käytettiin sitoutuneen peroksidaasin aktiivisuuden määritykseen, :...:30 valmistettiin juuri ennen käyttöä, ja se koostui 400 pg:sta/ml o-fenyleenidiamiinia : (Sigma, St. Louis, MO) 80 mM sitraatti-fosfaattipuskurissa, pH 6,0, sisältäen 0,12 ,, : % H2O2. Kahden lopullisen pesun jälkeen kuhunkin kaivoon lisättiin 50 μΐ sub- straattiliuosta, ja väri sai kehittyä 15 min ajan pimeässä. Värinkehitys pysäytettiin 54 1 08437 lisäämällä kuhunkin kaivoon 25 μΐ 4 M H2S04:ää, ja optinen tiheys 492 nm:llä mitattiin Multiskan ELISA-levylukijalla.
IX. Kineettiset mittaukset
Puhdistetut monoklonaaliset vasta-aineet dialysoitiin EPPS-puskuria (1 mM, pH 5 8,0, 100 mM NaCl) tai CHES-puskuria (1 mM, pH 8,0, 100 mM NaCl) vastaan. Sen proteiinikonsentraatio määritettiin BCA-menetelmällä (Pierce). Määritykset suoritettiin HPLC:llä (käänteisfaasikolonni, Qg, VYDAC 201TP54) CH3CN/H20:lla (0,1 %TFA) isokraattisella ohjelmalla 10/90. o-asetamidofenolin sisäistä standardia käytettiin muodostuneen tuotteen [4-(karboksibutyramido)fenoli] määrän laskemi-10 seen.
Vasta-aineen kantaliuos laimennettiin 1 mlraan sopivaa puskuria [50 mM, EPPS (pH 7,2 - 8,6); CHES (pH 8,6 - 10,0), 100 mM NaCl] lopullisen proteiinikonsent-raation 20 μΜ antamiseksi. Reaktiot sisälsivät 5 % apuliuotindioksaania, ja lämpötilaa pidettiin 37 0,1 °C:ssa. Lineaariset alkunopeudet mitattiin <5 % hydrolyysillä 15 kokonaissubstraatista. Testattujen vasta-aineiden havaittiin olevan ELISA- sitoutumismäärityksellä määritettynä reaktio-olosuhteissa stabiileja ainakin 48 tuntia. Havaitut nopeudet korjattiin katalysoimattomalle hydrolyysinopeudelle vasta-aineen puuttuessa. Kineettiset parametrit Vmax Km määritettiin ei-lineaarisella pienimmän neliösumman keinolla alkunopeus/substraattikonsentraatio-kuviosta hyper-, 20 bolisena käyränä, joka kuvataan Michaelis-Menten-yhtälöllä.
Mitattiin alkunopeuksien vaihtelu pH:n funktiona CHES:ssä (50 mM) (100 mM ; ; NaCl) pH-arvolla yli 8,6 ja EPPS:ssä (50 mM) (100 mM NaCl) muuten. Vasta- i'1'; aineella 27A6 ei havaittu nopeuksissa eroa, kun testattiin pH-arvolla 8,6 EPPS:ssä » t ;\t: ja CHESissä (50 mM) (100 mM NaCl). Puskuri-ionikonsentraation vaihtelu (12,5 - • · ,-:-.25 50 mM) ei osoittanut riippuvuutta Kcat':stä (vasta-aine 27A6) puskurilajin läsnä ol lessa.
*
Yhtälö 1 kuvaa pH-nopeusprofiilia, joka on saatu yhdisteen 3 hydrolyysille (Kobsd) ekstrapoloituna puskurikonsentraatioon nolla. Bruice et ai. Bioorganic Chemistry.
,v, voi. 1; Benjamin: New York (1965).
* · · • · :' .':30 Kobsd = Koh [OH·] « · · : '· ; Umpinaisten neliöiden linja (kuvio 3b) muodostettiin vaihtelemalla puskurikonsent- ' ’ raatiota (12,5 - 50 mM) yhdisteen 3 kiinteällä konsentraatiolla (400 μΜ) pH- alueella 7,2 - 10,0. Käytetyt puskurit ja niiden testattu pH-alue oli täsmälleen sama 55 1 08 437 kuin edellä kuvattu. KoH--arvo voidaan laskea kulmakertoimesta kaaviosta K0bS Kw/aH:n funktiona.
X. Vasta-aineiden kemiallinen modifiointi (a) Fenyyliglyoksaali; 50 μ1:η erä fenyyliglyoksaaliliuosta (6 mM), (125 mM NaH-5 CO3, pH 7,5) lisättiin puskuriin 195 μΐ, (125 mM, pH 7,5 NaHCOs), joka sisälsi vasta-ainetta (20 μΜ). Seosta sekoitettiin ja jätettiin seisomaan 1 tunniksi huoneenlämpötilassa. Sitten tämä reaktioseos siirrettiin mikrodialysoijaan (Pierce) ja dialysoitiin 125 mM, pH 7,5 NaHC03:lla läpivirtauksella noin 150 ml/h 2 tunnin ajan. Mikrodialysaattori huuhdottiin 4 x 60 ml:n erällä pH 8,4, 50 mM CHES:ää, 10 100 mM NaCl, ja jätettiin seisomaan tähän puskuriin yön yli (noin 15 - 18 tuntia).
Mikrodialysoijaa huuhdottiin jälleen seuraavana aamuna 3 x 50 ml:n erällä pH 8,4, 50 mM CHES:ää, 100 mM NaCl. Näytteet poistettiin, proteiinikonsentraatiot laskettiin uudelleen (BCA), ja ajettiin määritykset katalyyttiselle aktiivisuudelle (HPLC) tai sitoutumiselle (ELISA). Samanlaista proseduuria käytettiin hapteenin ollessa 15 läsnä (200 μΜ).
(b) Maleiinihappoanhydridi; 5 ml:n erä maleiinihappoanhydridiliuosta (0,06 M, dioksaani) lisättiin 299 pkaan 20 mM, pH 8,9 boraattia, 100 mM NaCl, joka sisälsi 20 μΜ vasta-ainetta. Liuosta sekoitettiin ja jätettiin seisomaan huoneenlämpötilaan 1 tunniksi. Sitten tämä reaktioseos siirrettiin mikrodialysoijaan ja dialysoitiin edellä . 20 kuvatulla tavalla 50 mM CHES:llä, pH 8,4, 100 mM NaCl. Näytteet poistettiin, las-: 7 kettiin proteiinikonsentraatiot (BCA) ja ajettiin määritykset katalyyttiselle 4 · " ·: ' aktiivisuudelle tai sitoutumiselle.
» I « i « (c) Dietyylipyrokarbonaatti; 10 μΐ 0,6 M dietyylipyrokarbonaattiliuosta etanolissa • · .·. : laimennettiin 1 ml:aan natriumasetaattia (NaOAc) (150 mM, pH 6, 100 mM NaCl).
''•/25 5 μΐ tätä liuosta lisättiin 299 pl:aan NaOAcrtä (150 mM, pH 6,0, 100 mM NaCl), • · · joka sisälsi 20 μΜ vasta-ainetta. Seosta sekoitettiin ja jätettiin seisomaan 4 °C:seen . yön yli (noin 15-18 tuntia). Sitten tämä reaktioseos siirrettiin mikrodialysoijaan ja '/ dialysoitiin edellä kuvatulla tavalla CHES.llä (50 mM, pH 8,4, 100 mM NaCl).
Poistettiin näytteet, määritettiin proteiinikonsentraatiot (BCA) ja suoritettiin määri- :Υβ0 tykset katalyyttiselle aktiivisuudelle ja sitoutumiselle.
• · < 4« 4 4 ' · ;· * Edellä oleva on tarkoitettu tämän keksinnön kuvaamiseksi, mutta rajoittamatta. Lu- : kuisia variaatioita ja modifikaatioita voidan suorittaa keksinnön hengestä ja suoja- •: · ·: alasta poikkeamatta.
Claims (16)
1. Vasta-ainemolekyylit tai molekyylit, jotka sisältävät vasta-aineenyhdistämis-kohtaosia, jotka hydrolysoivat katalyyttisesti reaktanttiligandin ennalta valittua kar-boksyylihappoamidi- tai -esterisidosta, mainittujen molekyylien vasta-aineenyhdis- 5 tämiskohtaosan sitoutuessa (a) reaktanttiligandiin, joka sisältää ennalta valittua karboksyylihappoamidi- tai -esterisidosta, jota hydrolysoidaan: ja (b) hapteeniligandiin, joka on rakenteellisesti analoginen mainitulle reaktantti-ligandille, joka sisältää tetraedrisen hiiliatomin, joka on liittynyt hydroksyyliryh- 10 mään, samoin kuin tyydytettyyn hiiliatomiin hapteeniligandin asemassa, joka vastaa karbonyyliryhmän asemaa, samoin kuin ennalta valitun hydrolysoitavan karboksyylihappoamidi- tai esterisidoksen karbonyyliliittyneeseen heteroatomiin, vastaavasti, mainitun hapteeniligandin sisältäessä edelleen ryhmän, jossa on vesiliuoksessa fysiologisilla pH-arvoilla ionivaraus, ionivarauksen sisältävän ryhmän puuttuessa 15 mainitun reaktanttiligandin vastaavasta asemasta ja sijaitsee pallomaisen tilavuuden sisällä, joka määritetään säteellä noin 0,7 nm mainitusta tetraedrisestä hiiliatomista.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukaiset molekyylit, tunnetut siitä, että mainittu ionivarauksen sisältävä ryhmä on liittynyt epäsuorasti mainittuun tetraedriseen hiiliatomiin ainakin yhdellä atomilla, joka erottaa mainitun tetraedrisen hiiliatomin , 20 mainitun ionivarauksen sisältävän ryhmän atomista, joka sisältää ionivarauksen.
: 3. Patenttivaatimuksen 1 mukaiset molekyylit, tunnetut siitä, että ne ovat ήχοι ’ -'; noklonaalisia vasta-aineita. i
< » \ \ 4. Patenttivaatimuksen 1 mukaiset molekyylit, tunnetut siitä, että mainittu hap- • · · teeniligandi sisältää fysiologisilla pH-arvoilla ammoniumionin tai karboksylaatti-"25 ionin mainittuna ionivarauksen sisältävänä ryhmänä.
5. Monoklonaaliset vasta-ainemolekyylit tai molekyylit, jotka sisältävät vasta-.··«, aineenyhdistämiskohtaosia, jotka hydrolysoivat katalyyttisesti reaktanttiligandin ennalta valittua karboksyylihappoamidi- tai -esterisidosta, mainittujen molekyylien • · ;:: vasta-aineyhdistämiskohtaosan liittyessä: « ·« ',,.30 (a) reaktanttiligandiin, joka sisältää ennalta valitun karboksyylihappoamidi- tai 1 . ·. esterisidoksen, joka hydrolysoidaan, mainitun reaktanttiligandin rakenteen ollessa 57 1 08 437 0 II r!-c -x-r2 jossa R1 ja R2 ovat reaktantin hiiliatomin sisältäviä kemiallisia ryhmiä, ja 5 -X- on -O- tai -NR3-, jossa R3 on vety tai kolmas hiiltä sisältävä kemiallinen tähde; ja (b) hapteeniligandiin, joka on rakenteellisesti analoginen mainitulle reaktanttiligandille, jolloin mainitulla hapteeniligandilla on rakenne OH 10 | R^-CH-CHR^-R2' jossa R1' ja R2' ovat hiiliatomin sisältäviä tähteitä, jotka ovat rakenteellisesti analo- 1 Λ 10 gisia ryhmille R ja R, vastaavasti, ja ainakin yksi ryhmistä R ja R ' sisältää ryhmän, jossa on vesiliuoksessa fysiologisilla pH-arvoilla ionivaraus, ainakin yhden 15 mainituista ryhmistä aikaansaadessa fysiologisilla pH-arvoilla ionivarauksen, joka sijaitsee pallomaisen tilavuuden sisällä, jonka määrittelee säde noin OH 0,7 nm mainitun rakenteen mainitusta -CH-ryhmästä, ja R3 on H, kun -X- on -O-, ·. 20 taiR3 on rakenteellisesti analoginen R3:lle, kun-X-on-NR3-.
: ‘ 6. Patenttivaatimuksen 5 mukaiset molekyylit, tunnetut siitä, että -X- on -O-,
7. Patenttivaatimuksen 6 mukaiset molekyylit, tunnetut siitä, että mainittu • « : ryhmä, joka sisältää fysiologisilla pH-arvoilla ionivarauksen, on ammoniumioni tai karboksylaatti-ioni. tav »
8. Patenttivaatimuksen 7 mukaiset molekyylit, tunnetut siitä, että niitä erittää : hybridooma 30C6, jolla on ATCC-tulonumero HB 10341. t · · • ( «
9. Patenttivaatimuksen 7 mukaiset molekyylit, tunnetut siitä, että niitä erittää \ v hybridooma 27A6, jolla on ATCC-tulonumero HB 10621. I < i • 1 I I
/·’ 10. Patenttivaatimuksen 5 mukaiset molekyylit, tunnetut siitä, että mainittu io- * » » !·· 30 nivarauksen sisältävä ryhmä on liittynyt epäsuorasti mainittuun tetraedriseen hii- "· : liatomiin, ainakin yhden atomin erottaessa mainitun tetraedrisen hiiliatomin maini tusta varauksen sisältävän ryhmän atomista, joka sisältää ionivarauksen, ja että mai- 58 1 08437 nittu ionivarauksen sisältävä ryhmä sijaitsee pallomaisen tilavuuden sisällä, jonka määrittää säde noin 0,2 - noin 0,5 nm mainitusta tetraedrisestä hiiliatomista.
11. Hybridoomasolut, tunnetut siitä, että ne ovat hybridoomaa 30C6, jolla on ATCC-tulonumero HB 10341.
12. Hybridoomasolut, tunnetut siitä, että ne ovat hybridoomaa 27A6, jolla on ATCC-tulonumero HB 10621. »
13. Menetelmä ennalta valitun esteri- tai amidisidoksen hydrolysoimiseksi kata-lyyttisesti reaktiivisessa ligandimolekyylissä, tunnettu siitä, että se sisältää vaiheet, joissa: 10 (a) sekoitetaan vesiväliaineessa katalyyttisesti tehokas määrä patenttivaatimuksen 1 mukaisia monoklonaalisia vasta-ainemolekyylejä tai molekyylejä, jotka sisältävät vasta-aineenyhdistämiskohtaosia, mainittujen reaktanttiligandimolekyylien kanssa reaktioseoksen muodostamiseksi; ja (b) ylläpidetään mainittua reaktioseosta ajanjakso, joka on riittävä, jotta mainitut 15 reaktanttiligandimolekyylit sitoutuisivat mainittuihin vasta-ainemolekyyleihin tai molekyyleihin, jotka sisältävät vasta-aineenyhdistämiskohtaosia, ja mainitut vasta-ainemolekyylit tai molekyylit, jotka sisältävät niiden vasta-aineenyhdistämiskohta-osia, hydrolysoisivat katalyyttisesti mainittuja ennalta valittuja sidoksia ja muodostaisivat tuotteita. 1.-.20
14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittuja . t!( vasta-ainemolekyylejä tai molekyylejä, jotka sisältävät niiden vasta-aineen- !, ! yhdistämiskohtaosia, erittää hybridooma 30C6, jolla on ATCC-tulonumero HB ·, ·*. 10341, tai hybridooma 27A6, jolla on ATCC-tulonumero HB 10621. • · · • o t ·
15. Menetelmä solujen valmistamiseksi, jotka väliaineessa kasvatettaessa tuotta- 25 vat vasta-ainemolekyylejä tai molekyylejä, jotka sisältävät vasta-aineenyhdistämis- kohtaosia, jotka hydrolysoivat katalyyttisesti reaktanttiligandin ennalta valittua kar- ..... boksyylihappoamidi- tai -esterisidosta, tunnetut siitä, että se käsittää vaiheet, jois- ’!* sa: • · \v (a) immunisoidaan eläintä immunogeenillä, joka sisältää hapteeniligandia, joka 1,,,30 sisältää tetraedrisen hiiliatomin, joka on liittynyt hydroksyyliryhmään, samoin kuin : tyydytettyyn hiiliatomiin hapteeniligandissa asemassa, joka vastaa kar- "' \ bonyyliryhmän asemaa, samoin kuin ennalta valitun, hydrolysoitavan karboksyyli- • « happoamidi- tai esterisidoksen karbonyyliliittyneeseen heteroatomiin, vastaavasti, mainitun hapteenisen ligandin sisältäessä edelleen ryhmän, joka sisältää vesiliuok- 59 1 08437 sessa fysiologisilla pH-arvoilla ionivarauksen, ionivarauksen sisältävän ryhmän puuttuessa mainitun reaktanttiligandin vastaavasta asemasta, ja sijaitessa pallomaisen tilavuuden sisällä, jonka määrittelee säde noin 0,7 nm mainitusta tetraedri-sestä hiiliatomista; 5 (b) ylläpidetään mainittua eläintä riittävä ajanjakso, jotta mainittu eläin erittäisi vasta-aineita, jotka immunoreagoivat mainitun hapteenisen ligandin kanssa; (c) geenejä, jotka koodittavat vasta-ainemolekyylejä tai molekyylejä, jotka sisältävät vasta-aineenyhdistämiskohtaosia mainituista ylläpidetyistä, vaiheen (b) immunisoiduista eläimistä, siirretään isäntäsoluihin muodostamaan hybridisoluja, jot- 10 ka sisältävät geenejä ainakin kahdesta lähteestä, ja josta muodostuneet hybridisolut (i) tuottavat kasvatettaessa vasta-ainemolekyylejä tai molekyylejä, jotka sisältävät vasta-aineenyhdistämiskohtaosia mainituista siirretyistä geeneistä ja (ii) joita hybridisoluja voidaan kasvattaa oleellisen epämääräinen aika; (d) kasvatetaan hybridisoluja sopivassa kasvatusväliaineessa riittävä ajanjakso, 15 jotta nämä hybridisolut tuottaisivat vasta-ainemolekyylejä tai molekyylejä, jotka sisältävät vasta-aineenyhdistämiskohtaosia; (e) otetaan talteen vasta-ainemolekyylit tai molekyylit, jotka sisältävät vasta-aineenyhdistämiskohtaosia kasvatetuista hybridisoluista; (f) seulotaan saadut vasta-ainemolekyylit tai molekyylit, jotka sisältävät vasta-20 aineenyhdistämiskohtaosia, jotta tunnistettaisiin hybridisolu, joka tuottaa vasta- ainemolekyylejä tai molekyylejä, jotka sisältävät vasta-aineenyhdistämiskohtaosia, jotka hydrolysoivat mainittua ennalta määrättyä karboksyylihappoamidi- tai este-risidosta katalyyttisesti; ja (g) kasvatetaan klooneja mainitusta tunnistetusta hybridisolusta, joka tuottaa vas- ' 25 ta-ainemolekyylejä tai molekyylejä, jotka sisältävät vasta-aineenyhdistämis- kohtaosia, jotka hydrolysoivat mainittua ennalta määrättyä karboksyylihappoamidi- !..· tai esterisidosta katalyyttisesti. • 1 · • · ·
16. Patenttivaatimuksen 15 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vaiheessa ·:···' (c) muodostuneet solut ovat hybridoomasoluja. ♦ • 1 · • · · 108437 60
Applications Claiming Priority (6)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US47092490A | 1990-01-26 | 1990-01-26 | |
US47092490 | 1990-01-26 | ||
US64490991 | 1991-01-23 | ||
US07/644,909 US5187086A (en) | 1990-01-26 | 1991-01-23 | Molecules with antibody combining sites that catalyze hydrolysis reactions through use of a charged hapten |
US9100507 | 1991-01-24 | ||
PCT/US1991/000507 WO1991011512A1 (en) | 1990-01-26 | 1991-01-24 | Molecules with antibody combining sites that catalyse hydrolysis reactions |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
FI923367A0 FI923367A0 (fi) | 1992-07-24 |
FI923367A FI923367A (fi) | 1992-07-24 |
FI108437B true FI108437B (fi) | 2002-01-31 |
Family
ID=27043278
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
FI923367A FI108437B (fi) | 1990-01-26 | 1992-07-24 | Molekyylit, jotka sisõltõvõt vasta-aineenyhdistõmiskohtaosia, jotka katalysoivat hydrolyysireaktioita |
Country Status (14)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5187086A (fi) |
EP (1) | EP0512074B1 (fi) |
JP (1) | JP3365769B2 (fi) |
AT (1) | ATE168718T1 (fi) |
AU (1) | AU655412B2 (fi) |
CA (1) | CA2034947C (fi) |
DE (1) | DE69129845T2 (fi) |
DK (1) | DK0512074T3 (fi) |
ES (1) | ES2120959T3 (fi) |
FI (1) | FI108437B (fi) |
IE (1) | IE910277A1 (fi) |
NO (1) | NO311432B1 (fi) |
PT (1) | PT96584B (fi) |
WO (1) | WO1991011512A1 (fi) |
Families Citing this family (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5463028A (en) | 1992-04-03 | 1995-10-31 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Reagents for generating a polyclonal hydrolytic antibody response against cocaine and the monoclonal hydrolytic antibodies against cocaine derived through these reagents |
US5606512A (en) * | 1994-07-27 | 1997-02-25 | The Dow Chemical Company | Determining the biodegradability of iminodiacetic acid derivatives |
AU727445B2 (en) * | 1995-08-18 | 2000-12-14 | Donald W Landry | Detection of organic compounds through regulation of antibody-catalyzed reactions |
EP0935612A4 (en) * | 1996-03-26 | 2001-12-12 | Amrad Operations Pty Ltd | Precursors of catalytic antibodies |
AUPO930697A0 (en) * | 1997-09-19 | 1997-10-09 | Walter And Eliza Hall Institute Of Medical Research, The | Catalytic antibodies and a method of producing same |
ATE393573T1 (de) * | 2001-06-01 | 2008-05-15 | Wyeth Corp | Zusammensetzungen für die systemische verabreichung von sequenzen, die für knochenmorphogenese-proteinen kodieren |
TWI267378B (en) * | 2001-06-08 | 2006-12-01 | Wyeth Corp | Calcium phosphate delivery vehicles for osteoinductive proteins |
US20030185858A1 (en) * | 2001-08-15 | 2003-10-02 | Birkett Ashley J. | Immunogenic HBc chimer particles stabilized with an N-terminal cysteine |
ES2324860T3 (es) * | 2001-12-28 | 2009-08-18 | Prysmian S.P.A. | Cable de telecomunicaciones resistente al agua. |
US20040009498A1 (en) * | 2002-01-14 | 2004-01-15 | Diversa Corporation | Chimeric antigen binding molecules and methods for making and using them |
US7556969B2 (en) * | 2002-12-19 | 2009-07-07 | Northeastern University | Intensified neutral loss tags and use thereof in mass spectrometry |
EP2528443B1 (en) * | 2010-01-25 | 2017-01-11 | DH Technologies Development Pte. Ltd. | Quantitative analysis of vitamin d3, vitamin d2, and metabolites thereof |
JP5717138B2 (ja) * | 2011-05-23 | 2015-05-13 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | タンパク質固定化表面修飾材料 |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2540508B2 (ja) * | 1983-11-29 | 1996-10-02 | イージエン・インコーポレイテッド | 化学反応を触媒する方法 |
US4792446A (en) * | 1986-06-23 | 1988-12-20 | Igen, Inc. | Production of antibody catalysts |
-
1991
- 1991-01-23 US US07/644,909 patent/US5187086A/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-01-24 AU AU73395/91A patent/AU655412B2/en not_active Ceased
- 1991-01-24 DK DK91904939T patent/DK0512074T3/da active
- 1991-01-24 JP JP50467491A patent/JP3365769B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1991-01-24 ES ES91904939T patent/ES2120959T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-01-24 DE DE69129845T patent/DE69129845T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1991-01-24 WO PCT/US1991/000507 patent/WO1991011512A1/en active IP Right Grant
- 1991-01-24 EP EP91904939A patent/EP0512074B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-01-24 AT AT91904939T patent/ATE168718T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-01-25 CA CA002034947A patent/CA2034947C/en not_active Expired - Fee Related
- 1991-01-25 IE IE027791A patent/IE910277A1/en not_active IP Right Cessation
- 1991-01-25 PT PT96584A patent/PT96584B/pt not_active IP Right Cessation
-
1992
- 1992-07-23 NO NO19922921A patent/NO311432B1/no unknown
- 1992-07-24 FI FI923367A patent/FI108437B/fi active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CA2034947A1 (en) | 1991-07-27 |
IE910277A1 (en) | 1991-07-31 |
JP3365769B2 (ja) | 2003-01-14 |
PT96584A (pt) | 1991-10-15 |
EP0512074A1 (en) | 1992-11-11 |
CA2034947C (en) | 1998-04-14 |
ES2120959T3 (es) | 1998-11-16 |
DE69129845D1 (de) | 1998-08-27 |
NO922921L (no) | 1992-09-25 |
EP0512074B1 (en) | 1998-07-22 |
NO922921D0 (no) | 1992-07-23 |
WO1991011512A1 (en) | 1991-08-08 |
AU7339591A (en) | 1991-08-21 |
PT96584B (pt) | 1998-07-31 |
US5187086A (en) | 1993-02-16 |
NO311432B1 (no) | 2001-11-26 |
EP0512074A4 (en) | 1993-07-14 |
DE69129845T2 (de) | 1999-03-18 |
FI923367A0 (fi) | 1992-07-24 |
FI923367A (fi) | 1992-07-24 |
AU655412B2 (en) | 1994-12-22 |
JPH05506571A (ja) | 1993-09-30 |
DK0512074T3 (da) | 1999-04-26 |
ATE168718T1 (de) | 1998-08-15 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US5030717A (en) | Antibodies which catalyze hydrolysis of ester bonds | |
US4659567A (en) | Molecules with antibody combining sites that bind to hydrolytic transition states | |
AU643186B2 (en) | Peptide analogs and their use as haptens to elicit catalytic antibodies | |
FI108437B (fi) | Molekyylit, jotka sisõltõvõt vasta-aineenyhdistõmiskohtaosia, jotka katalysoivat hydrolyysireaktioita | |
US4900674A (en) | Antibody combining sites that exhibit amide or ester synthase activity | |
US5126258A (en) | Molecules with antibody combining sites that exhibit catalytic properties | |
WO1994025573A1 (en) | Catalytic antibodies which hydrolyze primary amides and methods for eliciting such antibodies | |
FI95928B (fi) | Molekyylit, joissa on vasta-ainetta liittävät kohdat ja joilla on stereospesifinen katalyysi | |
US5900237A (en) | Catalytic antibodies which hydrolyze primary amides and methods for eliciting such antibodies | |
US5250426A (en) | Molecules with antibody combining sites that induce asymmetry | |
AU735176B2 (en) | Catalytic antibodies which hydrolyze primary amides and methods for eliciting such antibodies | |
JP2002515721A (ja) | 不斉性を誘発する抗体結合部位を有する分子 | |
US20020045231A1 (en) | Catalytic antibodies which hydrolyze primary amides and methods for eliciting such antibodies |