JP3365769B2 - 加水分解を触媒する抗体結合部位を有する分子 - Google Patents

加水分解を触媒する抗体結合部位を有する分子

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Description

【発明の詳細な説明】 関連出願 本出願は、1990年１月26日出願の継続中の特許出願第
470,924号（参考としてここにその開示を導入する）の
部分継続出願である。
関連分野 本発明は、抗体、抗原および免疫原に関し、特に、ア
ミドまたはエステル加水分解遷移状態の四面体炭素原子
およびその周りの構造に結合し、加水分解されるアミド
またはエステル結合の酸−塩基部位または親核的触媒部
位を提供する抗体を含む分子に関する。
背景技術 リガンドとレセプター間の結合現象は、生物学的シス
テムにおいて多くの重要な役割を果たしている。このよ
うな現象の例には、デオキシヘモグロビンへの酸素分子
の結合によるオキシヘモグロビンの生成、および蛋白質
とトリプシンのようなプロテアーゼ間に見られる酵素の
その基質への結合がある。さらに、生物学的結合現象の
例には、抗原の抗体への結合や、補体要素C3の所謂CR1
レセプターへの結合が含まれる。
また、多くの薬剤およびその他の治療薬もこの結合現
象に依存していると考えられている。例えば、モルヒネ
等の麻酔薬は、脳の特異的レセプターに結合することが
報告されている。麻酔薬のアゴニストおよびアンタゴニ
ストは、その結合部位に関してモルヒネ等の薬剤と競合
することが報告されている。
モルヒネやその誘導体のような人工的薬剤としてのリ
ガンド、およびエンドルフィンおよびホルモンなどの天
然の生物システムに存在するリガンドは、天然の生物シ
ステムに存在するレセプターに結合する。本明細書で
は、これらを一緒に取り扱う。このような結合は、特に
トリプシンおよびパパインなどの酵素による蛋白質の構
成ポリペプチドへの加水分解、または脂肪のグリセリン
および３個のカルボン酸への分解等、アミドおよびエス
テル結合の加水分解を含む多くの生物学的現象を誘導す
る。
スロビン（Slobin）,Biochemistry,5:2836−2844（19
66）は、ウシ血清アルブミンのｐ−ニトロカルボベンゾ
キシ結合体（conjugate）に対する抗体の調製を報告し
ている。これらの抗体を用いて、ｐ−ニトロフェニルア
セテートおよびエプシロン−アミノカプロン酸エステル
を加水分解した。このアセテートエステルの反応は二次
反応速度定数で説明され、非特異的な反応であると考え
られた。正規のガンマーグロブリンを用いて得られた二
次速度定数は、この特別に調製された抗体の定数とほぼ
等しいことが示された。この特別に調製された抗体は、
アミノカプロン酸エステルの加水分解を阻害することが
示された。
コーエン（Kohen）および共同研究者も抗体を用いて
エステル分解反応を触媒する試みを報告している。この
グループが採用した抗体は、加水分解される結合を含ま
ない、最終的に使用された基質の一部に対するものであ
る。
彼らの初期の研究は（FEBS Letters,100:137−140
（1979）およびBiochim.Biophys.Acta,629:328−337（1
980））、抗ステロイド抗体を用いてステロイドのカル
ボキシエチルチオエーテルの７−ウンベリフェロン（７
−ハイドロキシクマリン）エステルを加水分解した。各
々の場合において、バックグランドまたは正規のIgGで
得られる速度と比較して加水分解速度の増加が見られ
た。両方の場合におけるターンオーバー数は低く（毎分
抗体１モル当たり基質約１モル、またはそれ以下）、反
応速度は抗体の飽和により定常状態に到達するが時間と
ともに減少した。この反応速度の低下は、ステイド酸生
成物の抗体への不可逆的結合によるものである。
コーエン等は、基質分子のジニトロフェニル部分に対
するモノクローナル抗体を用いた７−〔Ｎ−（2,4−ジ
ニトロフェニル）−６−アミノヘキサノイル〕−クマリ
ンの加水分解を報告した（FEBS Letters,111:427−431
（1980））。ここでは、バックグランドを越えた速度の
増加も報告されたが、この反応は、触媒的というよりも
むしろ化学量論的なものであると考えられた。抗体が飽
和するにつれ、速度はゼロに到達すると報告された。抗
体−基質−生成物混合物のクロマトグラフィーにより、
ある程度の初期加水分解活性が回復する事から生成物の
酸の抗体への結合による阻害に起因すると考えられる。
強力な抗体の結合が基質分子の安定状態を生成すると
き、この複合体の低い解離速度は触媒活性を阻害するで
あろう。コーエン等によって報告された結果に関する状
況についても同様のことが考えられる。
これらは興味深いものであるが、上述の構築物は酵素
に必要な結合エネルギーを利用するメカニズムを説明で
きないことから非常に限定されたものになっている（W.
P.ジェンクス（Jencks）,Adv.Enzymol.,43:219（197
5））。
これらの欠点は、ハプテン等の遷移状態アナログを用
いて目的の抗体を生産することにより克服できる。この
ハプテンは触媒システムにおいてインヒビターの役割を
担いうる。
従って、免疫学的結合を用いて実験的に結合相互作用
を触媒プロセスに転換できる。例えば、所定の反応の遷
移状態を似せたハプテン基に対する触媒性抗体を使用
し、その基質をその遷移状態に似せることにより基質反
応を促進できることが示された。ジェンクス,W.P.,Cata
lysis in chemistry and Enzymology,pp.288（マグ
ローヒル、ニューヨーク 1969）。広範囲の提案がなさ
れたにもかかわらず、特異的遷移状態ハプテンおよびこ
の概念を試験する特定の反応は示されなかった。
アミドおよびエステル結合の加水分解は、最近受け入
れられた化学理論により（ａ）アミノまたはエステルの
酸部分の炭素原子、（ｂ）一つがカルボニル基に由来
し、もう一つが媒体の水酸基または水に由来する二つの
酸素原子、および（ｃ）エステルのアルコール部分の酸
素分子またはアミドのアミン部分の窒素原子に結合する
四面体炭素原子を含む遷移状態を生成する、カルボニル
炭素原子の反応により、水性媒体中で進行すると考えら
れている。このような反応の遷移状態は、定義により単
離可能な中間体とは対照的に単離できない推定上の有用
な構築物である。上述の加水分解遷移状態は単離できな
いけれども、多くの科学文献がその主題に向けられてい
る。
先に述べたアミドおよびエステルの加水分解の遷移状
態は良く理解されているが、蛋白質などの特定のアミド
または脂肪などのエステルがこれらの遷移状態を介して
反応するレセプター結合部位のトポロジーのパラメータ
ー、例えばサイズ、形状および荷電は、よく分かってい
ない。それゆえ、多くの結合部位のトポロジーが理解さ
れ、その部位で結合するリガンドの相互作用を研究する
ことは有益であろう。残念なことに、Ｘ線結晶構造が決
定された少数の酵素以外は、一般に生物的加水分解にお
けるレセプター結合部位のトポロジーは分かっていな
い。
この結合部位のトポロジーに関する知識の欠如は、部分
的に細胞中の多くのレセプターの結合部位の位置に関す
る知識の欠如に由来している。さらに、一般にその位置
が分かっているレセプター結合部位に関しても、その結
合部位の化学的特徴、即ち蛋白質および炭水化物組成は
分かっていない。従って、一般に研究者はレセプター結
合部位のトポロジカルな条件を理解すること、即ちこれ
らの条件を満たしうる治療薬の構築に手こずっている。
それゆえ、研究者は動物又は細胞培養実験で強力な治
療薬をスクリーニングし、その強力な治療薬が有効かど
うか確かめなければならない。このようなシステムは有
用だが、高価でしかも時間がかかる。
酵素のように加水分解性レセプターのトポロジーおよ
び化学的反応性が分かっている場合でさえ、一般に加水
分解性プロテアーゼ等の酵素は、その蛋白質のポリペプ
チド鎖に数度の割合で存在する特定のアミノ酸残基に隣
接するそれらの基質、即ちポリペプチド、を切断する。
そのような比較的ランダムな切断が蛋白質のポリペプチ
ド地図を得るのに有効であるが、特定のアミノ酸残基配
列を得ることが目的の場合には、そのような切断は有効
ではない。
例えば、lacZ遺伝子などのベクター遺伝子の転写産物
に融合する所望の蛋白質またはポリペプチドを含む融合
蛋白質を調製するには、最近の遺伝子工学技術が有効で
ある。しかし、このような融合蛋白質を使用すると、そ
のベクター遺伝子産物のフラグメントの存在によって妨
害が起こる。従って、必要とするポリペプチドまたは蛋
白質部分と不必要なものとの間でこのような融合産物を
切断しうる蛋白質分解性酵素様分子を開発できるかどう
かが重要となる。
最近、ラーナー（Lerner）、トラモンタノ（Tramonta
no）およびジャンダ（Janda）〔Science,234:1566（198
6）〕は、触媒的にエステルを加水分解するモノクロー
ナル抗体を報告した。また、トラモンタノおよびラーナ
ーは、米国特許第4,656,567号でエステルを加水分解す
るためのモノクローナル抗体の使用について報告してい
る。ポラック（Pollack）、ヤコブ（Jacobs）およびシ
ュルツ（Schultz）〔Science,234:1570（1986）〕は、
カーボネートの加水分解を触媒するMOPC167と呼ばれる
ミエローマ蛋白質を報告した（レオン（Leon）等、Bioc
hem.,10:1424（1971））。
ラーナー（Lerner）およびトラモンタノ（Tramontan
o）の２件の開示では、カルボン酸エステルまたはカー
ボネートエステルの四面体加水分解遷移状態の安定なア
ナログを提示するために合成されたホスホネートに対す
る抗体が調製された主に議論されているポラック（Poll
ack）等の抗体は、加水分解されるカーボネートアナロ
グに構造的に類似するホスホネートに結合するミエロー
マ蛋白質である。
従って、ラーナーおよびトラモンタノ等の研究では、
加水分解されるべき基質を予め選択し、目的の産物に応
じて免疫化アナログおよび加水分解抗体を合成してい
る。ポラック等は、ミエローマ蛋白質の特異性を調べ
て、加水分解されるべき基質を設計した。また、ポラッ
ク等は、概念的にラーナー等のものと同様のカーボネー
トの加水分解に関する触媒抗体、基質およびアナログ基
質システムについて報告している。このシステムに関す
る研究は、ヤコブス（Jacobs）等、J.Am.Chem.Soc.,10
9:2174（1987）。
公開された特許出願WO 85/02414は、触媒としての抗
体使用の可能性を議論しており、かつｏ−ニトロフェニ
ル−ベータ−Ｄ−ガラクトシドの加水分解におけるポリ
クローナル血清の使用に関するデータを示している。そ
の用途に有効な抗体が、反応体、反応中間体、または反
応体、反応産物または反応中間体のアナログによって誘
導可能であると言われている。“アナログ”という言葉
は、そのアナログに対して生成した抗体がその反応体と
の免疫反応に参加できるが、必ずしもそのアナログの反
応を触媒しない化学構造的点でその反応体と十分類似す
る異性体、同族体、その他の化合物を含むと定義され
る。
この明細書に提供されているデータは、基質（反応
体）ガラクトシドの切断が比較的濃い抗体調製物（1:10
および1:20希釈物）を用いて18時間に渡ってある程度起
こることだけを示している。触媒反応が提唱されてはい
るが、提唱されている触媒抗体のターンオーバーが示さ
れておらず、また切断された基質ガラクトシドの割合も
示されていないことから、触媒活性は示されていなかっ
た。この出願は、実験した未記載基質濃度における吸光
度の直線性を仮定すると、ベーターＤーガラクトシダー
ゼがポリクローナル抗体の約10倍の基質を切断すること
を示していた。
この出願に示されているデータから、使用した抗体調
製物のリジン残基の末端アミノ基によりｏ−ニトロフェ
ニル基の親核的置換が起きた可能性がある。従って、観
測される吸光度は、エプシロンーアミノリジニル ｏ−
ニトロフェニルアニリンの生成、またはエプシロンーア
ミノーリジニル ガラクトシドおよびｏ−ニトロフェノ
ールの生成（ターンオーバーよりもむしろ抗体が消費さ
れることから、いずれかの生成は触媒的に生じるもので
はないであろう）に由来するものであろう。
キム（Kim）等の米国特許第4,792,446号は、抗体触媒
の生産を教示している。これらの触媒は基質と反応し、
かつハプテン分子によって誘導される。この基質および
ハプテン分子は、触媒反応が起こる原子又は基、即ち反
応部位以外の部分で構造に実質的な類似性を有してい
る。反応部位に関して基質とハプテンは、ハプテンの反
応部位または触媒活性核がより高い価数を有し、基質の
類似構造よりも１以上の結合を有する点で異なってい
る。
さらに、ハプテンは、その分子の触媒的に活性な部
分、即ち基質の反応部位の構造的に類似する部分に結合
する基を含む。この付加的基は、−CO2 -基でのようにプ
ラスイオン電荷またはアンモニウムイオンでのように、
マイナスイオン電荷を触媒抗体に導入するのに有用であ
る。また、この付加的基は、基質の−OHを置換し、極性
環境を創造し、非極性環境を創造し、または水が入る孔
を提供すると言われている。
ラーナー等、BioAssays,9:107−112（1988）は、免疫
用ハプテンのイオン電荷基を使用して抗体結合部位の反
対電荷基を生じさせることにより、非荷電基質を使用し
て、酸−塩基触媒作用を容易に生起させうることを教示
している。触媒抗体を誘導するこの方法は、この触媒抗
体が荷電されたハプテンで誘導され、かつ誘導された抗
体触媒の基質が中性分子に切り替わり、その結果、抗体
中にハプテンのイオン電荷と反対に誘導されるイオン電
荷を利用して中性基質の反応の酸−塩基触媒作用を提供
しうることから“ベイト（Bait）・アンド・スイッチ”
と呼ばれる。しかし、この“ベイト・アンド・スイッ
チ”法を行うための具体的なハプテン構造は教示されて
いない。
発明の概要 本発明は、反応体リガンドの所定のカルボン酸アミド
またはエステル結合を触媒的に加水分解する抗体分子ま
たは抗体結合部位部分を含む分子（触媒分子）、かかる
分子の製造法および使用法、並びに該触媒分子を生成す
る細胞に関する。
この触媒活性分子は、モノクローナル抗体分子または
モノクローナル抗体結合部位部分を含む分子であること
が好ましい。これらの分子の抗体結合部位は、少なくと
も二つのリガンド分子と免疫反応（結合）する。第一リ
ガンド分子は、加水分解される結合のカルボン酸および
アミンまたはアルコール部分の各々に結合する炭素含有
化学残基とともに、加水分解される所定のカルボン酸ア
ミドまたはエステル結合を含む反応体リガンドである。
第二リガンドは、触媒分子を誘導するために直接的ま
たは間接的に使用されるハプテン性リガンドである。こ
のハプテン性リガンドは、反応体リガンドと構造的に類
似しており、加水分解される所定の反応体リガンドのカ
ルボン酸アミドまたはエステルの水酸基と、カルボニル
基の位置に対応するリガンド中の位置の飽和炭素原子
と、カルボニル結合ヘテロ原子との各々に結合する四面
体炭素原子を含む。このように、例えば反応体リガンド
においてアミド−CONH−またはエステル−COO−結合が
加水分解される場合、ハプテン性リガンドは、エステル
またはアミド結合含有基に類似する部位に−CH（OH）−
CH2基を含む。四面体炭素原子と、ハプテンの飽和炭素
原子とに結合する炭素含有化学残基は、反応体リガンド
のカルボニル部分と、アミンまたはアルコール部分との
各々に結合する化学残基と構造的に似ている。
また、ハプテン性リガンドは、生理学的pH値の水溶液
中でイオン電荷を有する基を含む。このイオン電荷含有
基は反応体リガンドの対応する部位には無く、先に述べ
た水酸基結合四面体炭素原子から半径約７、好ましくは
約２乃至約５オングストロームの範囲に限定される球状
範囲内に存在する。イオン電荷含有基が生理学的pHの水
溶液中にカルボキシレートまたはアンモニアイオンを提
供することが好ましい。
反応体リガンドは、構造式： R1−CO−Ｘ−R2 （式中、R1およびR2は、反応体の炭素原子含有化学残基
を表し、また、−Ｘ−は、−Ｏ−または−NR3−（R
3は、水素原子または第三炭素含有化学残基である。）
である。）で表すことが出来る。ハプテン性リガンド
は、構造式： Ｒ1'−CH（OH）−CHR3'−Ｒ2' （式中、Ｒ1'およびＲ2'は、それぞれ構造的にR1および
R2に類似する炭素原子含有残基を表し、Ｒ1'およびＲ2'
のうちの少なくとも一つは、生理学的pHの水溶液中でイ
オン電荷を有する基を含み、そのイオン荷電基は、前記
構造の−CH（OH）−基から半径約７、好ましくは約２乃
至約５オングストロームに限定される球状容積内に存在
する。Ｒ3'は、−Ｘ−が−Ｏ−である時はＨであり、ま
た−Ｘ−が−NR3−である時は構造的にR3に類似す
る。） で表すことが出来る。
本発明は、適当なインビボまたはインビトロの媒体中
で培養したとき、先に議論した触媒分子を生産する細胞
に関する。これらの細胞は触媒分子を生産するばかりで
なく、培養培地にこれらの触媒分子を分泌することが好
ましい。
また、本発明は、上述の細胞の製造法に関する。それ
には、動物中のハプテンに対する抗体を誘導するのに十
分な量の前述のハプテン性リガンドを含む免疫原で動物
を免疫する。その動物をハプテン性リガンドと免疫反応
する抗体を分泌するのに十分な時間維持する。
抗体分子または抗体結合部位部分を含む分子をコード
する遺伝子を、その維持した免疫動物の抗体産生細胞か
ら宿主細胞に移してハイブリッド細胞を生成する。これ
らのハイブリッド細胞は、少なくとも二つの起源に由来
する遺伝子を有する。そのハイブリッド細胞を培養する
と、転移した遺伝子から抗体分子または抗体結合部位部
分を含む分子が生産され、またこれらの細胞は遺伝子転
移用抗体産生細胞と比較して実質的に無限に培養するこ
とが出来る。
このハイブリッド細胞を抗体分子または抗体結合部位
部分を含む分子が生産されるのに十分な時間適当な培地
および適当な培養条件で培養し、それらの生産物を回収
したのち、スクリーニングして所定の反応体リガンドの
カルボン酸アミドまたはエステル結合を触媒的に加水分
解する抗体分子または抗体結合部位部分を含む分子を生
産するハイブリッド細胞を同定する。そして、その同定
されたハイブリッド細胞のクローンを増殖する。
また、本発明は、反応体リガンド中の所定のエステル
またはアミド結合を触媒的に加水分解する方法に関す
る。ここでは、先ず触媒的に有効な量の前述の触媒分子
を水性媒体中反応体リガンド分子と混合する。この混合
物を反応体リガンド分子が触媒分子と結合し、かつその
触媒分子が触媒的に所定の結合を加水分解し、加水分解
産物を生成するのに十分な時間維持する。その後、一つ
以上の生成産物が回収される。
図面の簡単な説明 以下の図面も本公開の一部を形成する。
第１図1Aおよび1B図は、特定のハプテン性リガンド
（化合物1a、２、5a、６および７）、インヒビター（化
合物1b）、基質または反応体リガンド（化合物３）およ
び本明細書で議論および使用する反応化合物４の構造式
を示している。
第２図は、二つのpH対logK値の関係を示すグラフであ
る。上の部分（第2A図）は、反応体リガンド（化合物
３）の反応を触媒するモノクローナル抗体30C6の反応に
関するlog値−３乃至−２の範囲のlogkcat app対pHのプ
ロットを示している（黒丸）。各点を通過する線は、以
下の式： を用いて計算した。
下の部分（第2B図）は、バッファ濃度ゼロに外挿した
化合物３の反応に関するlog値−9.5乃至−7.0の範囲のl
ogkobs c対pHのプロットを示している（黒三角）。計算
による線は、以下の式： を用いて得た。
両プロットのpH値は、5.5と8.5の間にある。kcat、Ka
（pKa）、koおよび の値は後の結果のセクションに示してある。
第３図は、第２図と同様に二つに分けたグラフであ
る。上の部分（第3A図）は、反応体リガンド（化合物
３）の反応を触媒するモノクローナル抗体の反応に関す
るlog値約−３乃至約−１に関するlogkcat app対pHのプ
ロットを示す（黒丸）。
第３図の下の部分（第3B図）は、モノクローナル抗体
27A6によって触媒される化合物３の加水分解反応に関す
る、log値約−８乃至−６の範囲のlogkobsd（観測され
た速度定数）対pHのプロットを示す（黒三角）。黒四角
はバッファ濃度ゼロに外挿した同反応のlogkobsd対pHに
関する。計算による線は、以下の式： を用いて得た。
発明の詳細な説明 I.はじめに 本発明は、反応体リガンドに構造的に類似するハプテ
ン性リガンドによって誘導される、レセプターまたは触
媒性分子と集合的に呼ばれる抗体分子またはその抗体結
合部位部分を含む分子に関する。このハプテン性リガン
ドは、反応体リガンドのエステルまたはアミド結合の加
水分解に関する反応配列における遷移状態のイオン電荷
ではなく、その構造を真似る。触媒分子（抗体分子また
は抗体結合部位（パラトープ）部分を含む分子）はハプ
テン性リガンドと、反応体リガンドとに結合する。この
触媒分子は反応体リガンドの所定の部分の加水分解遷移
状態を安定化し、かつその触媒された加水分解反応に対
する酸−塩基または親核的触媒作用に寄与するイオン電
荷アミノ酸残基を提供すると考えられている。これらの
分子は触媒的に反応体リガンドを加水分解する。
抗体および酵素はいずれもタンパク質であり、その機
能は特定の目標分子と結合する能力に依存する。酵素反
応においてはその基質への酵素の結合が一般に化学的触
媒作用を誘導するが、抗体−抗原結合では通常非触媒的
複合体が生成する点で酵素反応と免疫反応とは異なる。
酵素は、タンパク質と結合し加水分解反応の遷移状態
を安定化することでタンパク質の加水分解反応を触媒す
ると考えられる。酵素が反応の遷移状態を安定化しうる
能力、即ち、遷移状態の自由エネルギーを減少し、した
がって反応の活性化エネルギーを減少する能力から、一
般に、酵素反応の速度は非酵素的反応の速度よりも大き
いと考えられている。〔ジエンクス（Jencks）,W.P.,Ad
v.Enzymology,43:219（1975）およびポーリング（Pauli
ng）,L.,Amer.Scientise,36:58（1948）〕。この理論
は、仮定された遷移状態を真似る物質が競合インヒビタ
ーとして酵素に強く結合することが多いという観察から
支持される。レインハード（Leinhard）,G.,Science,18
0:149（1973）およびウォルフェンデン（Wolfenden）,
R.,Acc.Chem.Res.,5:10（1972）。さらに、酵素は対応
する基質または産物に結合するよりも強く反応体の遷移
状態構造に結合することによって、反応の自由エネルギ
ーを低下していると考えられている。
この事は、酵素の本質的な結合エネルギーが基質また
は産物の結合から測定されるものよりも遥かに大きいこ
とを意味している。基本的に酵素の結合エネルギーは、
化学反応を遂行するのに使用される。〔ジェンクス,W.
P.,XVII International Solvay Conference（1983年1
1月）〕。
逆の言い方をすると、遷移状態の適当な類似物にうま
く結合するよう調製された抗体は触媒として機能する。
この結果を確かめることは、酵素機能と抗体構造の相互
関係を明確にすることであり、人工的酵素を考案する有
用な手段を提供する。
ここで述べられている免疫学的加水分解の背景にある
基本的概念は、（ａ）特定の反応体リガンドに結合する
と、アミドまたはエステル結合の加水分解の遷移状態に
優先的に結合して、安定化し、かつ（ｂ）おそらく誘導
された結合部位にイオン荷電した酸−塩基または親核的
反応触媒アミノ酸残基を提供する所定の特異性を有する
抗体の誘導におけるハプテン性リガンドの使用に関す
る。有用なハプテン性リガンドは、アミドまたはエステ
ルの加水分解における高エネルギー遷移状態のイオン電
荷ではなく、その構造（コンフォメーション）に似るこ
とにより関連する基質（反応体リガンド）に結合し、か
つその加水分解物を安定化する能力を有する抗体の生産
を誘導する。また、ハプテン性リガンドには、生理学的
pH値の水溶液中でイオン電荷を提供し、抗体結合部位中
に反対に荷電したアミノ酸残基を誘導する基が含まれ
る。その反対に荷電したアミノ酸残基が酸−塩基または
親核的反応触媒効果を提供すると考えられている。
このような優先的結合および安定化により、加水分解
反応の活性化エネルギーが低下する。このことは触媒の
定義と一致する。結合部位中に荷電アミノ酸残基が存在
することによって、セリンプロテアーゼ等のタンパク質
分解酵素の活性部位にある荷電残基に似ることができ
る。この性質を示す抗体は、荷電残基を誘導し、かつ加
水分解を受ける基質反応体の結合特性を真似ねるよう化
学的に修正した合成ハプテンを用いて免疫すること、即
ち、特定の反応の遷移状態類似物による免疫により得る
ことが出来る。
モノクローナル抗体は、ハプテン性遷移状態モデルを
用いて（ラーナー等、BioAssays,9,:107−122（198
8））多くのアシル転移反応を触媒することが示された
〔（ａ）トラモンタノ等、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,8
3:6736（1986）；（ｂ）トラモンタノ等、Science,234:
1566（1986）；（ｃ）ヤコブス等、J.Am.Chem.Soc.,10
9:2174（1987）；（ｄ）ナッパー（Napper）等、Scienc
e,237:1041（1987）；（ｅ）ジャンダ（Janda）等、Am.
Chem.Soc.,110:4835（1988）；ジャンダ等、Science,24
1:1199（1988）；（ｇ）ジャンダ等、Science,244:437
（1989）〕。
アブザイム（abzyme）とも呼ばれるこれらの加水分解
性抗体またはレセプターの範囲および能力を拡大するた
めに、抗体の結合部位における触媒活性を誘導するため
の新しい方法が開発されなければならない。最近の報告
は、半合成法（（ａ）ポラック等、Science,242:1038
（1988）（ｂ）ポラック等、J.Am.Cehm.Soc.,111:1929
（1989））または部位特異的突然変異誘発（ボールドウ
ィン（Baldwin）等、Science,245:1104（1989））を用
いた抗体結合ポケットまたは部位の修正に注目してい
る。しかし、触媒抗体の使用可能な構造データが少ない
ことから、これらの方法の一般性は低い。
ハプテン性抗原から触媒的に活性な基を初めから誘導
しえる方法は、体細胞変異プロセスを介して免疫応答の
広い変化を利用して“インビボ”突然変異誘発を行いう
ることから、より有効であると思われる。ここで議論し
ている結果は、誘導した抗体分子の結合部以内にアミノ
酸残基を誘導して、従来“ベイト・アンド・スイッチ”
と呼ばれている方法により全てのアシル転移反応を助け
る方法を報告している。
ここで示す計画は、加水分解されるアシル部分に近接
して抗原またはハプテン性リガンド（化合物1a）（第１
図）内にイオン電荷を置くことに関する。このハプテン
に対する抗体は、このハプテンの電荷と逆の電荷を結合
部位に有するアミノ酸を有すると考えられる〔（ａ）プ
レスマン（pressman）等、J.Am.Chem.Soc.,68:250（194
6）；（ｂ）プレスマン等、J.Am.Chem.Soc.,75:686（19
63）；（ｃ）グロスバーグ（Grossberg）等、J.Am.Che
m.Soc.,82:5470（1960）；（ｄ）ショカット（Shokat）
等、Nature（ロンドン）,338:269（1989）〕。
さらに、化合物1aは、アシル転移遷移状態の構造的類
似物または表現物として働く四面体構造を有する水酸基
を抗体に提供する。この位置は電荷を持たないので新た
な静電効果はないであろう。
ハプテン化合物1aに対応するベンゾエート基質または
反応体リガンド（化合物３）（第１図）は、同様の立体
的大きさを有しているが（MM2計算から決定した）、正
の電荷は無い。従って、誘導された触媒抗体結合部位に
存在すると考えられるイオン電化したアミノ酸残基はイ
オン対を形成せず、強力な一般的酸−塩基または親核的
触媒として働く。
ピリジンハプテンリガンド（化合物２）（第１図）
は、構造的に化合物1aと同じであるが、メチル基および
生理学的pH値における電荷を欠いていることからからコ
ントロールとして働く。以前、電荷の相補性を用いて抗
体触媒によるβ−脱離反応における基質プロトンの引き
抜きが行われたが、中性ハプテンとの比較はなされなか
った。ショカット（Shokat）等、Nature（ロンドン）,3
38:269（1989）。
“レセプター”という言葉は、反応体リガンド、イン
ヒビターリガンド、またはハプテン性リガンドと結合す
る生物学的に活性な分子に対して使用される。本発明の
レセプター（触媒性）分子は、抗体、実質的な不変の抗
体または抗体のイディオタイプ含有ポリアミン（パラト
ープ含有）部分である。
レセプター分子の生物学的活性は、少なくとも生理学
的pH値およびイオン強度の水媒体中でレセプターをその
抗原性反応体リガンド、インヒビターリガンドまたはハ
プテン性リガンドと混合すると、結合することから確認
される。また、レセプターは、約５から約９の範囲のpH
値範囲、かつ蒸留水から約１モル濃度の塩化ナトリウム
までのイオン強度範囲の条件下で抗原性リガンドに結合
することが好ましい。
抗体のイディオタイプ含有ポリアミン部分（抗体結合
部位またはパラトープ）は、イディオタイプを含み、か
つ反応体リガンドまたはハプテン性リガンドと結合する
抗体分子の一部分である。このような部分には、従来の
方法で抗体から調製されるFab,Fab'およびＦ（ab'）２
フラグメントが含まれる。例えば、一般にはテオフィロ
ポーロス（Theofilopoulos）およびディクソン（Dixo
n）の米国特許第4,342,566号参照。また、特に天然Igと
同程度の加水分解速度を示すFabフラグメントに関し
て、ポラック等、Science,234:1570（1987）参照。イデ
ィオタイプ含有ポリアミンを提供する抗体は、免疫原に
対して生成、誘導されるので、抗体からイディオタイプ
含有ポリアミンを得るのに切断ステップが必要であるこ
とを理解した上で、イディオタイプ含有ポリアミンレセ
プターが“生成”または“誘導”されると言われる。し
かし、本来の抗体が好ましいので、本発明のレセプター
分子の例として採用している。
本発明で有用なレセプターは、モノクローナル抗体ま
たはその一部であることが好ましい。“モノクローナル
抗体”は、一種のレセプターを生産、場合によっては分
泌する単一細胞クローンから生成されるレセプターであ
る。ハイブリドーマ細胞はこのような細胞の例であり、
抗体産生細胞とミエローマ細胞またはその他の自己複製
細胞系の融合で得られる。
ハイブリドーマ技術を用いて本発明のモノクローナル
抗体を調製する方法はよく知られている。最初にこのよ
うなレセプターを報告したのは、コラー（Kohler）およ
びミルシュタイン（Milstein）,Nature,256:495（197
5）（参考としてここに導入する）である。一般に、モ
ノクローナル抗体は、ハイブリドーマ組織培養物または
ハイブリドーマ組織を導入した哺乳動物の腹水から得ら
れる。いずれの方法も本明細書で説明する。
特定の免疫用ハプテン性リガンドおよび反応体リガン
ドなどの特定のエピトープに結合する独特の特異性、お
よびポリクローナル抗体と比較して高い特異的触媒活性
を有することから、モノクローナル触媒抗体がより好ま
しい。また、ポリクローナル抗体調製物も使用しうる
が、一般に免疫化ハプテン性リガンドに結合するフラク
ションと抗原キャリヤーのエピトープなどの外来のエピ
トープに結合するフラクションに分けられる。
ハプテン性リガンドに結合するポリクローナル抗体
は、アフィニティー吸着体としてハプテン性リガンドを
用いたアフィニティー分離法により分離される。適当な
免疫反応が起こるのに十分な時間、抗体調製物とアフィ
ニティー吸着体の混合物を維持したのち、そのアフィニ
ティー吸着体を抗体調製物の残りの部分から分離する。
アフィニティー吸着体に結合した分離存残抗体部分は
ハプテン性リガンドに結合する抗体を含むが、分離残存
抗体調製物中の抗体はその他のエピトープに結合する。
その後、これらのアフィニティー結合抗体は、グリシン
ー塩酸（pH2）による吸着物の洗浄などのようにアフィ
ニティー吸着体から結合物質を分離する技術で単離でき
る。
“リガンド”とは、レセプター分子抗体結合部位と免
疫反応または結合する分子または複合体である。ここで
は、基本的に二つのタイプのリガンドが関係する。一つ
はハプテン性リガンドであり、レセプター分子の合成を
誘導する免疫原、レセプター分子による触媒反応のイン
ヒビター、およびELISAまたはその他の検定における抗
原として使用される。もう一つは、反応体リガンドまた
は基質と呼ばれ、触媒反応を受ける分子である。実質的
にハプテン性リガンドは、この触媒反応には不活性であ
る。
本明細書で述べられているように、形態（コンフォメ
ーション）的に同じか、もしくは類似する反応体リガン
ドのアミドまたはエステル結合の加水分解における遷移
状態のイオン電荷ではなく、形態を真似ることにより特
定の部位で水酸基に直接結合し、かつ飽和炭素原子に直
接結合する四面体炭素原子を有するハプテンとしてアミ
ドまたはエステル反応体リガンドの化学的アナログを合
成した。
ポリペプチドまたはタンパク質のアミド結合の加水分
解には、ハプテン性免疫原として使用するとき実質的に
加水分解のないハプテン性リガンドが必要である。この
ように、四面体炭素、その水酸基および近接し直接結合
した飽和炭素原子を含むハプテン性リガンドはそのよう
な加水分解を起こさない。
短いポリペプチド鎖は所定の特定部位で同族的タンパ
ク質を確認し、結合するタンパク質の生産を誘導しう
る。本発明は、初期のポリペプチドを用いた研究を大き
く前進させる。
抗体（レセプター）は、免疫用のイオン電荷含有ハプ
テン性第１分子（ハプテン性リガンド）によって誘導さ
れ、第１分子ばかりではなく、類似した部位にイオン電
荷を持たない第２の関連分子（反応体リガンド）を認識
し、結合する。その第２分子と結合することにより、そ
のレセプターは免疫用のハプテン性第１分子のトポロジ
ーに対応する所定のエステルまたはアミド結合の加水分
解（触媒反応）を起こす。トポロジーの対応、即ちイオ
ン電荷ではなくサイズや形の対応により、リガンドの加
水分解が起こる部位を予め選択する手段が得られる。ハ
プテン性リガンドまたは反応体リガンドの構造に似たイ
ンヒビターリガンドもこのレセプター分子と結合する。
結果的に、比較的小さな免疫用のハプテン性リガンド
を合成することにより、複数のアミドまたはエステル結
合を有する別の分子を認識し、結合し、および触媒的に
切断するレセプター分子の生産を誘導する事が出来る。
このように、遺伝子工学による融合タンパク質などのタ
ンパク質またはポリペプチドの所定のアミド結合または
ポリエステル中の所定のエステルのエステル結合を触媒
的に切断するレセプター分子が調製できる。
この結果は、未知のプロテアーゼおよびエステラーゼ
活性を免疫グロブリンに付与できることを意味してい
る。
II.エステル分解の遷移状態およびハプテン性リガンド
の設計 ハプテン性リガンドの設計は、生成する加水分解産物
の構造から、切断する結合を真似られる結合破壊のため
の遷移状態を経て、およびハプテン性リガンドへと逆行
する。エステルまたはアミドの加水分解を含む反応は一
般的概念の代表例を提供し、ここではエステルまたはア
ミドの加水分解反応の例としてこれらを使用する。
トランスアシレーション反応はカルボニル付加ー脱離
メカニズムに特徴を持つ。従って、アシル基はこの遷移
状態において種々の程度の四面体性を有している。W.P.
ジェンクス（Jencks）,Catalysis in Chemistry and
Enzymology,ch.10,（マグローヒル版、ニューヨー
ク、1969）。トランスアシレーション反応を触媒する酵
素は、アシル中心の回りに四面体形態を有する反応体リ
ガンドのアナログと良く結合することが期待できる。こ
の事は、一時的にリガンド（基質）と酵素との間に共有
結合が生成するセリンプロテアーゼ〔ウェステリク（We
sterik）等、J.Biol.Chem.,247,8195（1972）;R.C.トン
プソン（Thompson）,Biochemistry,12,47（1973）およ
びインペラリ（Imperali）等、Biochemistry,25,3760
（1986）〕およびアミドまたはエステルの直接的水和を
触媒する酵素に関しては正しい。後者のカテゴリーは、
切断可能なアミドユニットの代わりにリン酸、ホスホネ
ート、またはホスホンアミデート基を含む四面体構造を
有する化合物によって阻害される〔ウェーバー（Wesve
r）等、J.Mol.Biol.114:119（1977）およびヤコブセン
（jacobsen）等、J.Am.Chem.Soc.,103:654（1981）〕。
カルボン酸エステルの加水分解は、遷移状態のハプテ
ン性立体類似物に近いトランスアシレーションの簡単な
例である。一般に、エステル加水分解反応は、抗体に適
した周囲の条件下で簡便な速度で進行する。従って、い
かなる小さな速度の増加も容易に検出できる。
有用なハプテン性リガンドは、水酸基に結合しおよび
飽和炭素原子にも直接結合した四面体炭素原子を含む。
これらの原子は、立体的にカルボン酸エステルまたはア
ミド結合の加水分解遷移状態の四面体炭素原子、結合酸
素原子または窒素原子（ヘテロ原子）に立体的に似てい
る。しかし、遷移状態のイオン電荷には似ない。従っ
て、この四面体炭素原子、その水酸基、および直接結合
した飽和炭素原子は、反応体リガンド中の加水分解され
る所定のカルボン酸アミドまたはエステル結合のカルボ
ニル基の位置、およびカルボニルが結合したヘテロ原子
（酸素または窒素）の各々に対応するハプテン性リガン
ド中の位置に存在する。加水分解が起こる原子以外は、
ハプテン性リガンドと反応体リガンドは構造的に類似す
るように、反応体リガンドの炭素原子含有残基に構造的
に類似する炭素原子含有化学残基は四面体炭素原子およ
び飽和炭素原子に結合する。
この反応性カルボニルおよび酸素または窒素原子の立
体構造的類似性は、加水分解遷移状態に類似する従来の
研究者に用いられてきたホスホネートまたはホスホンア
ミデート基またはカルボネート基とは異なる。また、本
発明の立体類似体は、本ハプテン中の構造が基質の類似
構造よりもより少ない価数を含みかつ同数（１以上では
ない）の結合を含む点でキム（Kim）等の特許で議論さ
れているものとは異なる。
さらに、本発明で有用なハプテンには、生理学的pH値
の水性媒体中でイオン電荷を有するものが含まれる。イ
オン電荷含有基は、上述の四面体炭素原子に直接結合し
うる。しかし、このイオン電荷含有基は、四面体炭素原
子に間接的に結合し、四面体炭素原子から半径約７オン
グストローム（Å）に限定される球体容積内に存在する
ことが望ましい。また、その半径は約２乃至約５Åであ
ることがより望ましい。
このイオン電荷含有基は反応体リガンドまたは基質中
の対応する部位にはない。また、これらは多くの既知の
基から選択することができる。
例えば、抗体結合部位に相補的な正の電荷を誘導する生
理学的pH値で負の電荷を有する基には、カルボキシル基
（−CO2H），ホスホノ基〔−Ｐ（OH）2O〕，スルホ基
（−SO3H），ホスホロ基〔−OP（OH）Ｏ〕，スルファト
基（−OSO3H）等が含まれる。抗体結合部位中に相補的
な負の電荷を誘導する生理学的pH値で正のイオン電荷を
有する代表的官能基には、アミノ基（NH2），グアニジ
ン基〔−HNC（Ｎ）NH2〕，各置換基がC1−C6低級アルキ
ル基、ベンジル基およびナフチル基等の約10個迄の炭素
原子を含むモノ−およびジ−置換アミノ基、または二つ
の置換基がモルホリン、ピペリジン、ピロリジン、上述
の置換基を有する置換グアニジン化合物、およびトリエ
チルアンモニウム基のような三置換アンモニウムまたは
置換キノリニウムまたはピリジニウム環等の第四化芳香
族環などの第４窒素含有基が含まれる。上記天然に荷電
している各基は、生理学的pH値の水性媒体中で負または
正電荷のイオン基として存在する。
カルボキシレートおよびアンモニウムイオンを提供す
るヘテロ芳香族環に存在するようなカルボキシル基およ
び第四アミンが好ましい。イオン電荷含有基を議論する
場合、四個の置換基又はプロトン化により四級化してい
るか、または非環状型またはＮ−メチルピリジニウム残
基におけるように環の一部として環状型で存在している
かどうかにかかわらず、四級アミンは全てアンモニウム
基の分類に含まれると考える。
生理学的pH値でイオン電荷を有する基が化合物1aで例
示的に使用されているＮ−メチルピリジニウム化合物の
四級窒素原子の場合と同様に、先に述べた四面体炭素原
子に結合する他の基の一部である場合、そのイオン電荷
含有基は、ピリジニウム環の四級窒素原子であると考え
られる。このような構造のイオン電荷含有基は、四面体
炭素原子に間接的に結合し、またイオン電荷、即ち四級
窒素原子を含むイオン電荷含有基の原子は、少なくとも
１原子、好ましくは炭素原子によって四面体炭素原子か
ら分離されている。グリコール酸誘導体などの分子は、
四面体炭素原子およびその水酸基に直接結合するイオン
基を含んでいる。
この反応体リガンドは、ハプテン性リガンドと構造的
に類似しているが、反応体リガンドはハプテン性リガン
ド中の官能基の位置と構造的に類似する位置に存在す
る、生理学的pH値の水性媒体中でイオン電荷を有する前
述の官能基を含んでいない。従って、代表的ハプテン性
リガンド化合物1aは、Ｎ−メチルピリジニウム四級窒素
を含んでいるが、代表的基質リガンド化合物３はその対
応する部位に中性のフェニル基およびその炭素および水
素原子を含んでいる。
また、ハプテン性リガンドおよび／または反応体リガ
ンド（基質）は、生理学的pH値の水性媒体中でイオン電
荷を有する一つ以上の基を含みうる。これらのイオン電
荷含有基は、二つのタイプのリガンド分子間でその位置
が対応してもしなくても良い。さらに、このような付加
的イオン電荷基は、前述のイオン電荷含有基に関して定
義した球状容積内に存在することも可能である。ハプテ
ン性リガンドおよび反応体リガンドのいずれか、または
両方に先に述べた少なくとも一つのイオン電荷基に加え
て一つ以上のイオン電荷基が存在することは、触媒分子
の結合部位へのハプテンの結合を容易にすることから有
用である。特に、この事は本明細書で例示的に用いてい
るような比較的小さいハプテンを使用する場合に有用で
ある。
例えば、デキストランを用いた研究で、抗デキストラ
ン抗体の結合が６乃至７個のグルコース残基を含むデキ
ストランで最高となることが示された。ポリアラニンオ
リゴマーを用いた実験では、４乃至６個のアミノ酸残基
で最高の結合が示された。チャップマン（Chapman）
等、Microbiology,第２版、16章、pp.444−447。より小
さいオリゴマーは結合が小さく、グルコースは結合が見
られなかった。
従って、一つ以上の付加的イオン電荷を含むいずれ
か、または両リガンドを提供することは、電荷相補性を
持つ触媒抗体結合部位およびリガンドが結合部位から推
奨されるフルサイズよりも小さい場合の構造的適合によ
りその結合を助けるうる。
このように、ハプテン性リガンドには、それぞれアン
モニウム基またはカルボキシレート基を提供するアミ
ン、四級窒素原子またはカルボキシル基等の生理学的pH
値の水性媒体中でイオン電荷を提供する少なくとも１個
の基が含まれる。この電荷基は先に定義した球状容積内
に存在するが、反応体リガンドの対応する位置にはな
い。
既に述べたように、少なくとも１個のイオン電荷含有
基がハプテン性リガンド中に存在する球状容積は、四面
体炭素原子から半径約７Å、より好ましくは約２乃至約
５Å以内の範囲に限定される。これらの球状容積および
半径は、当分野でよく知られているコンピュータプログ
ラムまたは分子モデルを用いて計算できる。
ハプテン性リガンド中の少なくとも一つのイオン電荷
含有基の存在が、抗体結合部位に推定的に誘導される相
補的電荷のアミノ酸残基を、加水分解されるエステルま
たはアミドのカルボニル基および結合した酸素または窒
素原子に接近させると理解できる。別のいい方をする
と、ハプテン性リガンドのイオン電荷含有官能基は、四
面体炭素原子、その水酸基、および隣接する飽和炭素原
子から立体障害を受けていない。
有用な反応体リガンドは、構造式： R1−CO−Ｘ−R2 （式中、R1およびR2は、炭素原子含有化学残基を表し、
また、−Ｘ−は、−Ｏ−または−NR3−（R3は、水素原
子または第三炭素含有化学残基である。）である。）で
表すことが出来る。
R1およびR2は、同一でも異なっていてもよい。各残基
はアミノ酸、ポリペプチド、またはタンパク質、並びに
環状または鎖上ヘテロ原子含有残基を含む脂肪族、又は
置換脂肪族の直鎖、分岐または環状残基などの有機残基
であり、また芳香族、置換芳香族、ヘテロ芳香族または
置換ヘテロ芳香族である。反応体リガンドが触媒分子の
作用を実質的に妨害しない水性媒体に溶解し、触媒が結
合するのに十分な大きさであるかぎり、R1とR2の構造は
実質的にどのような炭素含有化学残基でもよい。
R1とR2の場合と同様に、水素（Ｈ）以外ならR3もどの
ような炭素含有化学残基でもよい。
ハプテン性リガンドは反応体リガンドと構造が似てい
る。ハプテン性リガンドは、構造式： Ｒ1'−CH（OH）−CHR3'−Ｒ2' （式中、Ｒ1'およびＲ2'は、それぞれ構造的にR1および
R2に類似する炭素原子含有残基を表している。Ｒ3'は、
−Ｘ−が−Ｏ−である時はＨであり、また−Ｘ−が−NR
3−である時は構造的にR3に類似するものである。Ｒ1'
およびＲ2'のうちの少なくとも一つは、生理学的pHの水
溶液中でイオン電荷を有する基で、反応体リガンドには
存在しない官能基を含み、また、そのイオン荷電基は、
先に議論した球状容積内に存在する。） で表すことが出来る。
好ましい態様において、Ｒ基のペアR1とＲ1',R2とＲ
2',R3とＲ3'は構造的に類似しており、−Ｘ−が−Ｏ−
であること以外は、実質的にR1とＲ1',R2とＲ2',R3とＲ
3'は同じものである。この好ましい状態でのＲ残基の同
様のペア間の相違は、ハプテン性リガンドが反応体リガ
ンド中には存在しないイオン電荷含有基を含み、かつ後
に議論するようにハプテン性リガンドを抗原性（免疫原
性）キャリヤー分子と結合し、免疫結合体を生成するの
に使用する原子または残基を含んでいることである。
従って、先に述べた相違以外は同じ番号の付いた残基
ペアのサイズ、形、電荷および不飽和度が同じであるこ
とが望ましい。同じ番号のＲ残基ペアのサイズが異なる
場合、ハプテン性リガンドは反応体リガンドよりも大き
く、より小さい反応体リガンドが誘導された触媒結合部
位内に適合しうることが望ましい。
本研究で使用した代表的ハプテン性リガンドと反応体
リガンドの構造は特定の基準にしたがって選択した。こ
れには、四面体炭素原子含有前駆体の有効性および安定
性、対応するカルボン酸アミドまたはエステル基質、そ
の構造に関する化学的合成の簡便性、および免疫学的表
示の関する多様な機構への適合性が含まれる。芳香族環
にアミノ置換基を含めることにより、例えば、ベンジル
基またはフェノール基のいずれかは、ハプテンの表示の
ために免疫原キャリヤータンパク質にカップリングする
機能的付加物が提供される。
III.触媒抗体産生細胞および方法 本発明は、適当な培地で培養すると反応体リガンドの
所定のカルボン酸アミドまたはエステル結合を触媒的に
加水分解する触媒モノクローナル抗体（抗体分子または
抗体結合部位を含む分子）を産生する細胞に関する。ま
た、これらの抗体は、インビトロまたはインビボの培養
媒体環境に上記分子を分泌することが望ましい。好まし
い態様では、これらの細胞はハイブリドーマ30C6当のハ
イブリドーマ細胞である。
一般に、このような触媒分子産生細胞は、抗体誘導量
の先に述べたハプテン性リガンドを含む免疫原で、マウ
ス、ラット、ヤギまたはウマ等の実験動物を免疫化する
ことにより製造する。後に述べるように、一般にこの免
疫原はハプテン性リガンドと抗原（免疫原）キャリヤー
との結合体である。
免疫化した動物がハプテン性リガンドと免疫反応する
抗体を分泌するのに十分な時間この動物を維持する。後
に述べるELISA検定が必要とされる免疫反応の存在を確
認するのに有効である。
脾細胞など上述の動物の抗体産生細胞由来の抗体分子
またはその抗体結合部位部分をコードする遺伝子を宿主
細胞に移行する。この遺伝子転移で少なくとも二つの起
源に由来する遺伝子を含むハイブリッド細胞が生成す
る。このハイブリッド細胞は適当に培養すると移行した
遺伝子由来の抗体分子または抗体結合部位部分を生産
し、またその遺伝子が由来する抗体産生細胞と比較して
実質的に無限に培養することが可能である。その遺伝子
が由来する細胞と比較して実質的に無限に培養しうつ細
胞には、ハイブリドーマ細胞、大腸菌細胞、S.セレビシ
エ（cerevisiae）等のイースト細胞、CHO細胞などの哺
乳類の形質転換細胞がある。
このように生産されたハイブリッド細胞をそれらが抗
体分子またはその抗体結合部位部分を生産するのに十分
な時間、インビトロまたはインビボの適当な培養培地中
で培養し、その生産物を回収する。ハイブリドーマ細胞
のためのインビボまたはインビトロ培養条件は、大腸
菌、S.セレビシエ（cerevisiae）,CHO等の細胞に関する
条件と同様に本明細書で議論しており、また一般的にも
良く知られているものである。
その後、回収した分子をスクリーニングし、反応体リ
ガンドの所定のカルボン酸アミドまたはエステル結合を
触媒的に加水分解する分子を生産するハイブリッド細胞
を同定する。このようなハイブリッド細胞が一度同定さ
れれば、そのハイブリッド細胞クローンがたくさん増殖
できる。
上述の方法には、当分野でよく知られ、また本明細書
でも詳しく述べられているハイブリドーマ調製法が含ま
れる。また、実質的に抗体分子の抗体結合部位部分のみ
をコードする遺伝子を一つの哺乳細胞から別の細胞に移
すことが出来ることは良く知られており、上述の方法に
はこのような方法も含まれている。また、上述の方法に
は、抗体結合部位部分を含む分子を遺伝子工学技術を用
いて大腸菌などの非哺乳類細胞で生産するシャストリー
（Shastry）等、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,86:5728（19
89）およびヒューズ（Huse）等、Science,246:1275（19
89）（参考として引用する）の方法が含まれる。これら
の文献の転移遺伝子は、各々大腸菌で発現させるVHまた
はFab抗体部分をコードする遺伝子を調製するためにハ
イブリドーマまたは免疫した動物の脾臓からのmRNAから
調製した。
本発明の別の方法の特徴として、このような細胞によ
って産生されたモノクローナル抗体分子または抗体結合
部位部分を含む分子（触媒分子）を水性媒体中反応体リ
ガンド分子と混合し反応混合物を作る。この反応混合物
を反応体リガンド分子が触媒分子に結合するのに十分な
時間、および触媒分子が所定の結合を触媒的に加水分解
するのに十分な時間維持する。必要ならば、この加水分
解反応産物は回収できる。
本発明の加水分解法は、反応混合物の一部として水性
媒体を使用している。一般にこの媒体には水およびバッ
ファ塩が含まれている。さらに、この媒体には、塩化ナ
トリウムなどの塩ならびにタンパク質含有媒体中にしば
しば見られる水溶性カルシウムおよびマグネシウム塩も
含めうる。メタノール、エタノール、アセトニトリル、
ジメチルスルホキシド、ジオキサン、ヘキサメチルホス
ホラミド、およびN,N'−ジメチルホルムアミドなどの有
機溶媒も存在しうる。また、反応体リガンドおよびレセ
プター分子をエマルジョン化する界面活性剤も存在しう
る。水性媒体中に存在する重要な成分の基準は、これら
の成分が触媒分子の変性などにより触媒反応を実質的に
妨害しないことである。さらに、この水性媒体には触媒
分子によって触媒される結合切断反応を阻害する塩、タ
ンパク質、特に酵素が実質的に含まれない。
水性媒体は、一般にpH約５−９、好ましくは約6.0−
8.0である。これよりも高いまたは低いpHは、触媒反応
が実質的に妨害又は阻害されない限り使用できる。
一般に、この触媒反応は周囲室温、即ち約20℃から約
25℃または37℃、および周囲大気圧、即ち約１気圧で行
われる。しかし、周囲大気圧下、水性媒体の凝固点以下
および沸点以上の温度も使用しうる。良く知られている
ように、本発明の触媒分子などのタンパク質は、水性媒
体が沸騰する高温、例えば約100℃では変性してしまう
ので、約40℃以下の温度で反応させるのが好ましい。
反応混合物中の反応体リガンドは、その水性媒体中の
溶解度までの量で存在する。不溶性の反応体リガンドを
含む２相系も使用しうるが、通常は用いない。通常用い
られる反応体リガンドの濃度は、その水性媒体中の反応
体リガンドの溶解度に対応する約0.1マイクロモル濃度
（μＭ）から約10ミリモル濃度（mM）の範囲である。産
物が必要な場合は、反応メカニズムや反応速度を研究す
る場合の濃度よりも高い濃度で行われる。
また、触媒効果量の触媒分子が使われることもある。
従って、一般に触媒分子は反応体リガンドに対して約1:
2から約1:10,000、好ましくは約1:10から約1:100のモル
比で使用される。
一般に、反応体リガンドに対する触媒分子の比は、反
応体リガンドに対する触媒分子の特異的活性および反応
を行う使用者の目的に依存する。従って、産物を必要と
する場合は、比較的高濃度の触媒分子と高い反応体リガ
ンドに対する触媒分子の比が用いられる。反応メカニズ
ムや反応速度を調べる場合には、一般により低い濃度お
よび比が使われる。化学量論的量までの触媒分子が使わ
れることもあるが、触媒分子を使用するのであるから化
学量論的量を使用することは無駄である。
反応維持時間は、選択する触媒分子と反応体リガン
ド、それらの濃度、pH値および温度などのパラメータ
ー、並びに反応の目的に依存する。速度論の研究には、
しばしば分から時間のオーダーが採用され、反応産物が
ほしい場合には、時間から日のオーダーが採用されるこ
とが多い。
IV.結 果 ハプテン性リガンド化合物1aおよび２は、後に述べる
ように４−ニトローフェネチルブロマイドを原料として
各々５および４ステップで合成された。（全ての新規化
合物は、満足のいくスペクトル（NMR,IR）および燃焼分
析（±0.3％）結果を示した）。両ハプテン性リガンド
化合物1aおよび２をキャリヤータンパク質ウシ血清アル
ブミン（BSA）およびキーホール・リンペット・ヘモシ
アニン（KLH）と結合し（Ｎ−ヒドロキシサクシンイミ
ドエステルを介して）、免疫原結合体を生成した。化合
物1aおよび２のKLH結合体で129GlX＋マウスを免疫化
し、抗体を生成させてスクリーニングを行った。
〔（ａ）コラー等、Nature（ロンドン）、256:495（197
5）；（ｂ）エンガル（Enguall）,Method Enzymol.,7
0:419（1980）〕。
ハプテン性リガンド化合物1aによる免疫化により23個
のハイブリドーマを生成し、一方ハプテン性リガンド化
合物２は各ハプテンに結合した21個のハイブリドーマを
生じた。すべてのモノクローナル抗体はIgGクラスであ
り、アニオン交換クロマトグラフィーと、それに続くプ
ロテインＧカラムによるアフィニティークロマトグラフ
ィーで精製した。これらの抗体はドデシル硫酸ナトリウ
ムポリアクリルアミドゲル電気泳動により均一であるこ
とが確かめられた。
まず、濃度20μＭのモノクローナル抗体を、５−
〔〔４−（ヒドロキシ）フェニル〕アミノ〕−５−オク
ソ−ペンタン酸、化合物４を生成するために、ペンゾエ
ートエステル反応体リガンド化合物３（500μＭ）に対
してスクリーニングした（50mMリン酸バッファ、pH7.
5、100mM NaCl）。（分析は、カラム:RP−C18;流速:1m
l/分；検出:UV254nm;溶出液：水／アセトニトリル（op:
10）のHPLCで行った。加水分解産物、化合物４（第１
図、保持時間７分）を回収し、基準試料を用いたRP−HP
LCおよびマススペクトル分析で同定した。） ハプテン性リガンドに対して得られた23個のモノクロ
ーナル抗体のうち、７個に触媒活性が見られた。ハプテ
ン性リガンド化合物２に対する抗体には、反応体リガン
ドエステル化合物３の加水分解速度を速めるものはなか
った。
触媒活性が認められた７個の抗体は、遊離したハプテ
ン化合物1bの添加により完全に阻害された。この結果
は、触媒作用が基質の抗体結合ポケットまたは結合部位
への結合に基づくものであることを示している。
ハプテン性リガンド化合物２対化合物1aによって誘導
される触媒性抗体の数が膨大であることは重要である。
これら７個の触媒性抗体のうちの１個がハイブリドーマ
に対して支配的であり、モノクローナル抗体30C6を詳細
に調べた。
モノクローナル抗体30C6（20μＭ）によって触媒され
る基質である反応体リガンド化合物３（50mM リン酸、
100mM NaCl、pH7.2、37℃）の加水分解の初期速度はミ
カエリス・メンテンの速度式に従った（加水分解産物化
合物４の濃度は、１−２時間に渡り内部標準とピーク高
さを比較するHPLCで測定した。）標準曲線は、加水分解
産物化合物４の濃度0.5mMまで直線性を示し、kcat app値
およびＫm'値は各々５±0.2×10-3min-1および1.12±0.
05mMであった。ベンゾエート反応体リガンド化合物３の
抗体触媒加水分解は、ピリジニウム塩、化合物1bにより
完全に阻害された（Ｋ＝83±５μＭ）。
基質化合物３の加水分解のpH依存性を、モノクローナ
ル抗体30C6（20μＭ）の存在下pH6.0−7.2（ビスートリ
ス）および7.2−8.0（リン酸）の範囲で検定した（いず
れも50mMバッファおよび100mM NaCl、37℃（第２
図））。kcat app値のpH依存性は、解離基の塩基型の関
与を明らかにした。そのpKa値は、6.26±0.05であった
（第2A図）。バッファイオンの濃度変化（12.5−50mM）
は、kcatのバッファ種存在に関する依存性を示さなかっ
た。
直接比較するために、バッファ濃度ゼロに外挿した同
一のpH領域に関する反応体リガンドの加水分解速度（k
obs c）も測定した。pHー速度プロフィールは、切断に関
係する化学種がpH6.0−6.5の領域では水（ko＝0.6×10
-9min-1）であり、またpH6.6以上では水酸化基 であることを示した。
水中での加水分解に対する基質、化合物３のpH非依存
的抗体触媒性加水分解の速度の比、kcat/kO'比は、100
万倍以上の抗体による速度増加に対応している。抗体触
媒反応の至適pHが、まだ未同定の（おそらく、負の電荷
のもの）アミノ酸により中性pH領域に移動することは重
要である。
後に述べるように、４−ニトロフェネチルブロマイド
を原料としてハプテン化合物5aおよび６を合成した。同
様に、ジメチルアニリニウム抗原化合物７は、４−アミ
ノベンジルアルコールから合成した。化合物5a,6および
７は、それぞれ18,22および26個のハイブリドーマを生
成した。これら全てのモノクローナルレセプター分子は
IgGクラスに属する。
まず、５−〔（４−ヒドロキシフェニル）アミノ〕−
５−オクトペンタン酸、化合物４の生成に関するベンゾ
エートエステル化合物３（500μＭ）のHPLC検定により2
0μＭの濃度の抗体をスクリーニングした（リン酸バッ
ファ、50mM,pH7.5,100mM NaCl,37℃）。化合物5aに対
して得られた18個のモノクローナル抗体のうち３個が触
媒活性を有することが分かった。また、各々ハプテン化
合物６および７による免疫化で得られた22および26個の
抗体は、化合物３の加水分解速度にほとんど効果を示さ
ないか、または阻害効果を示した。触媒活性が認められ
た３個の抗体は、50μＭのカルボン酸化合物5bの存在に
より完全に阻害された。
最も有効な触媒性抗体、即ちハプテン化合物5aによる
免疫化で得られるハイブリドーマ27A6から分泌されるモ
ノクローナルレセプターの速度論を詳細に調べた。ま
た、このモノクローナルレセプターはレセプターまたは
抗体27A6と呼ばれる。レセプター27A6により触媒される
化合物３の加水分解の初速度は、ミカエリスーメンテン
の速度論に従い、Kcat appおよびKm値は各々0.01±0.002
min-1および（243±15）×10-6Mであった（50mM ４−
（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンプロパンス
ルホン酸（EPPS）,100mM NaCl,pH8.5,37℃）。ベンゾ
エート化合物３の抗体触媒による加水分解は、カルボン
酸化合物5bにより競合的に阻害された（Kl＝６±２μ
Ｍ）。
化合物３の加水分解のpH依存性をpH7.2乃至8.4（EPP
S）およびpH8.4乃至10.0〔２−（シクロヘキシルアミ
ノ）エタンスルホン酸（CHES）〕（いずれも50mM バッ
ファおよび100μＭ NaCl,37℃）の範囲に関しモノクロ
ーナルレセプター27A6（20μＭ）の存在下で検定した
（第３図）。この領域におけるlogKcat appのpH依存性
（第3A図）は線型で、バックグランド加水分解速度（lo
gKobsd;第3B図、黒三角）およびバッファ濃度ゼロに外
挿した化合物３の加水分解速度（KOH＝2.3×10−2mi
n-1）（第3B図、黒四角）も同様に線型であった。モノ
クローナル抗体27A6存在下におけるバッファ濃度変化
（12.5−50mM）は、バッファ濃度に関するKcat appの依
存性を示さなかった。EPPSおよびCHES（50mMバッファ、
100mM NaCl,pH8.6）中での検定では、モノクローナル
レセプター27A6に関する速度に差は見られなかった。
モノクローナルレセプター27A6のエステル分解活性
は、蛋白質の50倍モル過剰量のジエチルピロカーボネー
トまたはマレイン酸無水物による影響を受けなかった。
フェニルグリオキサルによる同様の処理では、触媒活性
の75％が失われた。また、この抗体調製物は、ELISAで
見られるように４倍量のタイター値（ハプテン、化合物
5bに対する結合）の減少を示した。この蛋白質のインヒ
ビター化合物5b（蛋白質の５倍モル過剰量）存在下での
同様の処理は、触媒活性が僅か35％減少しただけでタイ
ター値の変化はなかった。
これらの知見から、ハプテン化合物5a,6および７に対
する他の触媒性または非触媒性抗体を先に示した様にフ
ェニルグリオキサルを用いて化学的に修飾した。化合物
６（2G4,4E3,6H4,6A11）および７（52D11,57G12,70F3,5
G3,60A4）に対する抗体は影響を受けなかった（ELIS
A）。対照的に、化合物5a（57G11,60A4,52D11および5G
3）を用いて誘導された５個全ての抗体の結合は、いく
らか減少した（ELISA）。触媒性抗体57G11および70F3
は、タイター値が４倍減少し、また抗体60A4,52D11およ
び5G3は、それぞれ３、２および１倍のタイター値の減
少を示した。
各基質に転移させる化学残基（エステルまたはアミ
ド）の近傍、または直接置換により点電荷を有する同族
的ハプテンシリーズ（第１図）から誘導した抗体を使用
することに基づく前述の方法が効果的であることが示さ
れてきた。これらのハプテンに対する抗体は、抗体結合
部位にハプテン電荷と反対の電荷を有するアミノ酸残基
を有していると考えた。基質エステル化合物３はこの電
荷を欠いているが、全体的には同様の構造を保持してい
る。故に、化合物３の結合に当たっては結合部位のアミ
ノ酸残基は本来の電荷安定化の役割を持たず、強力な一
般的酸／塩基または遷移状態安定化要素として働きう
る。
抗体ーハプテンの電荷相補性がこの目的の達成に本質
的であると思われるが、ハプテン設計の別の２つの面も
重要であると考えられる。第１は加水分解を受けるアシ
ル基の置換であり、もう一方は非電荷ハプテンの使用の
必要性である。
第１のポイントは適当なアシル部分アイソステア（is
ostere）を用いて行われる。発生する遷移状態の適当な
表示として使われている四面体幾何構造を有する水酸基
を採用した。この部位を意識的に非電荷のままで置き、
付加的静電効果を無くした。しかし、米国特許第4,626,
567号およびヨーロッパ特許出願第０ 260 439A2号に
公開されているように“第二世代ハプテン”には、この
部位に荷電を有するリン酸基が含まれることが予想され
る。非電荷ハプテン〔即ち、化合物２および６（第１
図）〕は、電荷は無いが化合物１および５と実質的に構
造が一致することから、この仮説の正当性を検証するの
に必要である。
上記の結果は、抗体誘導にＮ−メチルピリジニウム
塩、化合物1aを使用した場合有用であるアシル転移反応
を触媒する“ベイト・アンド・スイッチ”法を示してい
る。このハプテンを用いて得られるモノクローナル抗体
の30％が触媒性であった。この数は印象的であるが、こ
れらのレセプターの一つが触媒反応においてイオン化可
能な基（pKa＝6.26±0.05）の塩基型が関与していると
いう知見のほうがより興味深い。さらに、抗体触媒反応
の至適pHはほぼ中性であり、また中性ハプテン化合物２
の使用は触媒性抗体を誘導する傾向を示さなかった。
ハプテン化合物７を後述するように合成した。この分
子のもっとも顕著な性質は、基質のアシル炭素を直接置
換する四面体カチオン電荷にある。このハプテンはこの
分野の典型的なリン酸ハプテン代用物からの極端な逸脱
と考えられるが、“ベイト・アンド・スイッチ”法に関
する多くの未回答の問題に適応される。二つの関連事
項、基質の切断を受ける結合との位置関係を含むカチオ
ン電荷およびこのアシル炭素の水酸基アイソステアによ
る置換の関連性は重要である。
ハプテン化合物７に対する26個の抗体からは、バック
グランド速度を越えた加水分解速度を促進するものは見
つからなかった。この結果は、シュルツ（Schultz）研
究グループによって設計された同様の抗原が脱離反応を
起こす触媒抗体を誘導する高い傾向（66％）を示したこ
とから非常に興味深い（ショカット（Shokat）等、Natu
re（ロンドン）,338:269（1989））。ここでの反応は全
く異なるものであるが、シュルツ（Schultz）のグルー
プは、エステル分解反応に対する抗体を誘導するのにメ
チルピリジニウムハプテン化合物１を用いたときに見ら
れるように、触媒反応にカルボキシレートが関係すると
いう確かな証拠を発見した。これらの結果は、ハプテン
化合物1aおよび２に対して得られた抗体に関する知見と
合わせて以下のことを示している。（１）ハプテン化合
物1aから誘導されたモノクローナルレセプターに見られ
る速度の増加は、単に触媒塩基として作用するカルボキ
シレートの存在によるものではない。（２）遷移状態を
表すのに使用するハプテン中の官能性は重要ではない。
（３）遷移状態の一つのカチオン電荷および少なくとも
一つの中性的表現の組み合わせが加水分解レセプター分
子の誘導に必要である。
カチオン性ハプテン化合物1aを用いて行われる場合と
同様に、全体の過程を構造的に類似するアニオン性ハプ
テンを用いて考えてみた。安息香酸ハプテン化合物5aは
必要条件を満たしている。化合物5aのバックボーンはハ
プテン1aおよび２と相同的であるが、加水分解を企てて
いるアシル部分に近いアニオン点電荷を有している。カ
ルボキシレート基の選択は、ハプテン分子内のこのタイ
プの官能性が抗体結合ポケット内に正電荷のアミノ酸
（即ち、リジンまたはアルギニン）を誘導する強い傾向
を有するというプレスマン（Pressman）の知見に基づい
ている〔（ａ）プレスマン（Pressman）等、J.Am.Chem.
Soc.,68:250（1946）；（ｂ）プレスマン（Pressman）
等、J.Am.Chem.Soc.,75:686（1953）；（ｃ）グロスバ
ーグ（Grossberg）等、J.Am.Chem.Soc.,82:5470（196
0）〕。いずれのアミノ酸残基側鎖も遷移状態の一般酸
または静電的安定化による触媒反応を助けていると考え
られる。アルギニン残基を含む後者の過程も酵素触媒作
用と考えられている〔（ａ）ローダン（Riordan）等、S
cience,（ワシントン、D.C.）195:884（1977）；（ｂ）
コットン（Cotton）等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,76:25
51（1979）；（ｃ）スプリングス（Springs）等、Tet.L
ett.,32:3223（1977）〕。
ヒドロキシエチル安息香酸化合物5bを合成した。この
化合物にタンパク質キャリヤーとのカップリングが容易
なようにＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを与え
て化合物5aとした。化合物5a−KLH結合体による免疫化
でモノクローナル抗体18種が生成し、その内３個は触媒
性であり、またその活性は遊離ハプテン化合物5bにより
阻害を受けた。化合物5aより誘導される触媒性レセプタ
ーの数は化合物1aの場合よりも多くないが、化合物1aお
よび5aの中性同族体（化合物６）により誘導されるモノ
クローナル抗体はいずれも触媒性では無いことは興味深
い。抗原設計に含まれる電荷基の重要性がここでも見ら
れる。
モノクローナルレセプター30C6（化合物1a由来）のpH
ー速度プロフィールは、解離基の塩基型が触媒活性に関
係することを示した。また、化合物5aから誘導されるモ
ノクローナルレセプター27A6に見られるように、Kcat
appがバッファ濃度に依存しないことも重要である（第
１図）。レセプター30C6の挙動とは反対に、レセプター
27A6に関するKcat appのpH依存性の知見もある（第3A
図）。この知見は“ベイト・アンド・スイッチ”理論の
本質に矛盾するように思われるが、結合部位のアミノ酸
残基側鎖のpKa値が検定したpH範囲の外にあり、またタ
ンパク質ー基質の静電的相互作用（静電的触媒作用）が
このレセプターの反応を促進する本質的特性であると考
えられる〔ファースト（Fersht）,Enzyme Structure
and Mechanism,フリーマン編、ニューヨーク（198
5）〕。
pH効果によりレセプター27A6の加水分解反応における
アミノ酸の関与を検出する事は出来ないが、アルギニン
修飾試薬フェニルグリオキサルによる３個全ての触媒性
抗体（27A6,57G12,70F3）の特異的失活が観測された
（タカハシ（Takahashi）,J.Biol.Chem.,243:6171（196
8））。この活性の減少（触媒／結合）は結合部位にお
ける試薬とアミノ酸残基側鎖との反応によるものと説明
しうる。即ち、その活性はハプテン化合物5bの存在によ
り有意に減少する。
しかし、構造変化とそれに続く別の部位における試薬
の反応も同じ結果を招くであろう。従って、結合部位が
変化し、もはや基質化合物３またはハプテン化合物5bを
結合しなくなるタンパク質の構造の安定化に続いて結合
部位以外のアルギニン残基が化学的に修飾されうる。こ
の事はここでは適用されないように思われる。
触媒的およびELISA検定およびフリードマン（Freedma
n）等、Immunochem.,9:169（1972）およびメイヤーズ
（Mayers）等、Immunochem.,9:169（1972）に示されて
いる先の結合研究は、グアニジウム結合部位のグリオキ
シル化が、負の電荷のハプテンに対する抗体のみの触媒
および／または結合活性を破壊するが、中性ハプテン化
合物６または正電荷のハプテン化合物７に対する抗体の
ものは破壊しないことを示している。もし、グリコシル
化を上述のメカニズムにより結合部位から離れたグアニ
ジウムを変化させることで行ったならば、化合物６また
は化合物７のハプテンに対する抗体が同じような影響を
受けるとは考えにくい。従って、ここで調べられた範囲
を越えたpKa値のグアニジウム側鎖を有するアルギニン
が結合部位に存在し、観測される触媒活性に関連してい
ると考えられる。
多くの触媒グループを生成しうる多重荷電の付加的速
度効果が予想される。より膨大な潜在的触媒抗体へのア
プローチと共に〔シャストリー（Shastry）等、Proc.Na
tl.Acad.Sci.USA,86:5728（1989）〕、この効果はより
すぐれた触媒の開発の可能性を開いた。
V.リガンド調製 特筆しないかぎり、反応は窒素雰囲気下、火炎乾燥ガ
ラス器具中で行った。試薬および溶媒はオーブン乾燥し
た注射器および針を用いた。ジクロロメタンおよびアセ
トニトリルは水素化カルシウム存在下で連続的に蒸留し
た。テトラヒドロフラン（THF）は金属ナトリウム／ベ
ンゾフェノンケチル存在下で蒸留した。試薬は全てアル
ドリッチ ケミカルから購入した。クロマトグラフィー
用溶媒は市販のものを購入しそのまま使用した。反応は
E.メルク シリカゲル60Fガラスプレート（0.25mm）を
用いた分析用薄層クロマトグラフィー（TLC）でモニタ
ーした。フラッシュクロマトグラフィーは、スチル（St
ill）等、J.Org.Chem.,43:2923（1978）の方法に従って
E.メルク シリカゲル60（230−400メッシュ）ガラスプ
レートを用いて行った。
融点測定はフィッシャー・ジョンズ（Fisher−John
s）融点測定器で測定し、補正は行わなかった。全ての
プロトンNMRスペクトル（300MHz）は、ブルカAM−300ス
ペクトロメーターを用い、室温、CDCl3,CD3CN,またはDM
SO溶液中で測定した。化学シフト（α）は、内部標準テ
トラメチルシラン（0.00ppm）に対するppm値で表されて
いる。元素分析（C,H,N）は、ガルブレイスラボラトリ
ー（ノックスビル、TN）で行った。
実施例1:p−ニトロフェニルアセトアルデヒド ｐ−ニトロフェニルアセトアルデヒドは、ｐ−ニトロ
フェニルエチレンからレスブリッジ（Lethbridge）等、
J.Chem.Soc.Perkin I,35（1973）の方法で合成した。
ｐ−ニトロフェニルエチレンは、１−ブロモ−２−（ｐ
−ニトロフェニル）エタン（アルドリッチ（ミルウォー
キー、WI）から市販されている。）からストラスバーグ
（Strassburg）等、J.Am.Chem.Soc.69:2142（1947）の
方法で合成した。
実施例2:化合物Ｉ ｎ−ブチルリチウム（3.33×10-2mole）をエーテル／
窒素浴中−100℃に保持したテトラヒドロフラン（THF;1
00ml）に添加した。この混合物を攪拌しつつ15分間かけ
て２−ブロモピリジン（3.64×10-2mole）を添加した。
反応容器をアセトン/CO2浴に移すことにより−78℃まで
昇温し、この混合物を１時間攪拌した。
実施例１で得られTHF（30ml）に溶解したｐ−ニトロ
フェニルアセトアルデヒド（５グラム、3.03×10-2mol
e）をゆっくりこの混合物に添加し、−78℃で３時間攪
拌した。
攪拌後、この混合物を塩化アンモニウムの飽和溶液
（500ml）およびジエチルエーテルの中に注いだ。この
混合物を２回ジエチルエーテルで抽出し、合わせたエー
テル層を硫酸ナトリウムで乾燥後、CH2Cl2中15％CH3CN
を用いたカラムにかけた。生成物、化合物Ｉ（１−ヒド
ロキシ−１−（２−ピルジニル）−２−（ｐ−ニトロフ
ェニル）エタン）を648mg回収した（2.7×10-3mole、収
率９％）。1 H NMR δ8.55（d,1H）;8.10（d,2H）;7.65（m,1H）;
7.3（d,2H）;7.2（m,2H）;5.05（dd,1H）;3.20（m,2
H）。
実施例3:化合物II 乾燥メタノール（12ml）を窒素を吹きつけて乾燥した
25ml反応容器に入れた。
実施例２で得た化合物Ｉ（100mg）をこのメタノール
に溶かしオレンジ色の溶液を作った。この溶液に窒素を
吹き込み、10％パラジウム／カーボン（Pd/C,75mg）を
添加した。反応容器の縁を少量のメタノールで洗浄した
後、溶液に窒素を吹き込み、ついで水素を吹き込んだ。
この反応混合物を約１時間攪拌した後、セライトで濾過
した。このフィルターをジクロロメタン（CH2Cl2）で４
回洗浄し、ついでこのフィルターから薄層クロマトグラ
フィー（TLC）の原点物質が無くなるまでメタノールで
３回洗浄した。この濾液を硫酸ナトリウムで乾燥し、溶
媒を除去して85.6mgの黄色結晶物、化合物II（１−ヒド
ロキシ−１−（２−ピリジニル）−２−（ｐ−アミノフ
ェニル）エタン）を得た（収率97.6％）。
実施例4:化合物２ 実施例３からの化合物II（155mg,7.24×10-4mole）を
乾燥CH2Cl2（1.5ml）およびトリエチルアミン〔（Et
3N）（1.45×10-3mole）〕と混合した。さらに、Ｎ−ヒ
ドロキシスクシンイミドイルグルタロイルクロライド
（359mg,1.45×10-3mole）を添加し、この反応溶液を25
℃で約40分間攪拌した。反応産物をロータリーエバポレ
ーターで乾燥し、61.5mgの５−〔（2,5−ジオキソ）−
１−ピロリジニル）オキシ〕−Ｎ−〔４−〔２−ヒドロ
キシ−２−（２−ピリジニル）エチル）フェニル〕−５
−オクソ−ペンタアミド（化合物２）（収率20％）を得
た。1 H NMR（DMSO−d6） δ9.82（s,1H）;8.48（d,1H,J＝
4.3Hz）;7.75（dd,1H,J＝２×7.6Hz）;7.42（d,2H,J＝
7.9Hz）;7.22（m,2H）;7.05（d,2H,J＝7.9Hz）;5.38
（d,1H,J＝5.1Hz）;4.76（dd,1H,J＝4.0,3.5Hz）;3.05
（dd,2H,J＝13.7,4.0Hz）;2.80（s,4H）;2.76（t,2H,J
＝8.2Hz）;2.42（t,2H,J＝8.2Hz）;1.90（m,2H）。
C22H23N3O6に対する理論値:C,62.12;H,5.41;N,9.88％。
実験値:C,62.19;H,5.37;N,9.92％。
実施例5:化合物1a 実施例４の化合物２（30mg,7.06×10-5mole）をアセ
トン中沃化メチル（7.06×10-4mole）と混合し、約17時
間還流した。この反応混合物をクロロホルムで３回洗浄
した後、熱い酢酸エチルで３回洗浄して20mgのハプテン
性リガンド２−〔２−〔５−〔（2,5−ジオキソ−１−
ピリジニル）オキシ〕−1,5−ジオキソペンチル〕−４
−アミノフェニル〔−１−ヒドロキシエチル〕−１−メ
チル−ピリジニウムヨーダイド（化合物1a）を得た。1 H NMR（DMOS−d6） δ9.86（s,1H）;8.92（d,1H,J＝
6.1Hz）;8.55（d,1H,J＝8.0Hz）;8.08（t,1H,J＝6.8H
z）;8.00（t,1H,J＝7.9Hz）;7.48（d,2H,J＝7.9Hz）;7.
12（d,2H,J＝7.9Hz）;6.30（d,1H,J＝5.1Hz）;5.34（d
d,1H,J＝4.0,3.5Hz）;4.35（s,3H）;3.02（dd,2H,J＝1
3.6,4.0Hz）;2.08（s,4H）;2.72（t,2H,J＝8.2Hz）;2.4
5（t,2H,J＝8.2Hz）;1.90（m,2H）。
C23H26N3O6Iにる理論値:C,48.67;H,4.59;N,7.41％。
実験値:C,48.11;H,4.51;N,7.37％。
実施例6:2−〔（４−ニトロフェニル）メチル〕−1,3−
ジオキソラン（化合物III） ｐ−ニトロフェニルアセトアルデヒド（500mg,3.0×1
0-3mole）を約1.5mlのCH2Cl2に溶解した。この混合物に
CaSO4（383mg）、続いてレキシン（Rexyn）101樹脂（プ
ロトン型、フィッシャ・サイエンティフィック、128m
g）およびエチレングルコール（13.8×10-3mole）を添
加した。この混合物を窒素雰囲気下で約４時間攪拌し
た。使用する前に、このレキシン101およびCaSO4を乾燥
機で約120℃に20時間維持し、その後デシケーターで冷
却した。
サンプルを取り出し、CH2Cl2による薄層クロマトグラ
フィーで分析した。さらに、レキシン101およびCaSO4を
加え、この混合物を一晩攪拌した（約16−18時間）。こ
の攪拌混合物にCH2Cl2（10ml）を加えた。このサンプル
を薄層クロマトグラフィーで分離して原点に物質がない
ことが確認された。
水（10ml）を添加して混合物を攪拌し、その有機層を
分離して硫酸ナトリウムにより乾燥した後、ヘキサン：
酢酸エチル（2:1）を用いたフラッシュクロマトグラフ
ィーで精製して化合物IIIを435.8mg得た（収率70％）。
1H NMR:δ8.10（d,2H）;7.4（d,2H）;5.10（t,1H）;3.
8（s,4H）;3.0（d,2H）。
二回目の合成では、塩化メチレン10.0ml中のｐ−ニト
ロフェニルアルデヒド（3.0g,18.2mmol）の攪拌溶液に
エチレングリコール（5.4ml,97mmol）を添加した。これ
に1.0gのレキシン101（Ｈ）（フィッシャーサイエンテ
ィフィック）カチオン交換樹脂および一晩オーブンで乾
燥した（120℃）3.0gの粉末硫酸カルシウムを添加し
た。この混合物を室温で24時間攪拌し、つづいて100ml
の水に注ぎ塩化メチレン50ml部で三回抽出した。有機層
を合わせて硫酸ナトリウムで乾燥し、ヘキサン：酢酸エ
チル（2:1）を用いたフラッシュクロマトグラフィーで
精製して2.28gの生成物を得た（理論値の60％）。1 H NMR（CDCl3） δ8.18（d,J＝8.6Hz,2H）,7.42（d,
J＝8.6Hz,2H）,5.08（t,J＝4.3Hz,1H）,3.8−4.0（m,4
H）,3.06（d,J＝4.3Hz,2H）。
C10H11NO4に対する理論値:C,57.42;H,5.26;N,6.70。
実験値:C,57.51;H,5.19;N,6.65。
実施例7:4−（1.3−ジオキソラン−２−イルメチル）−
ベンゼンアミン（化合物IV） 実施例６の化合物III（231mg）をメタノール（約3m
l）に溶かし、窒素を吹き込んだ。Pd/C（120mg）をこの
混合物に加え、反応容器の縁をエタノールで濯いだ（約
2ml）。この混合物に窒素、つづいて水素を吹き込ん
だ。この反応混合物を45分間攪拌し、セライトで濾過し
た。このセライトをメタノールで数回濯ぎ、濾液と濯ぎ
液をエバポレートして化合物IVを184.4mg得た（収率90.
6％）。
別の合成法では、化合物III（2.0g,9.6mmol）を20ml
のメタノールに添加し、これに10％パラジウム／活性炭
（200mg）を加えた後、このフラスコに水素風船を付
け、室温で６時間激しく攪拌した。この反応混合物をセ
ライトで濾過し、濃縮して1.63gの生成物を得た（理論
値の95％）。この物質は、これ以上精製すること無しに
以下の実施例で繰り返し使用した。
TLC Rf＝0.3,1:1 酢酸エチル：ヘキサン。
実施例8:N−〔４−（1,3−ジオキソラン−２−イルメチ
ル）フェニル−Ｎ−（フェニルメチル）−ベンゼンメタ
ンアミン（化合物Ｖ） 実施例７の化合物IV（1.91g,1.07×10-2mole）をCH2C
l2（10ml）およびEt3N（4.45ml,3.2×10-2mole）と混合
攪拌した。化合物の約半分が溶けた後に、この攪拌混合
物にベンジルブロマイド（1.07×10-1mole）を滴下し
た。それからアミン全部が溶ける。約１時間後反応を停
止する。この溶液をCH2Cl2:HCl（9:1）を用いたカラム
にかけ目的産物3.048mgを回収した（化合物IV）。1 H NMR:δ7.25（s,10H）;7.05（d,2H）;6.85（d,2H）;
5.00（t,1H）;4.60（s,4H）;3.9（m,4H）;2.8（d,2
H）。
上述の合成を繰り返して、CH2Cl210ml中の化合物IV
（2g,11.2mmol）のサスペンジョンに攪拌しながらトリ
エチルアミン（4.5ml,32mmol）を添加した。ベンジルブ
ロマイド（6.4ml,107mmol）の添加は、激しく攪拌しな
がら30分間に渡って滴下し、その混合物を更に１時間攪
拌した。この反応混合物をCH2Cl2（50ml）で希釈し、0.
5MHCl（２×25ml）で抽出した。有機層を合わせ硫酸ナ
トリウムで乾燥後塩化メチレン：ヘキサン（4:1）を用
いたフラッシュクロマトグラフィーで精製して目的物3.
2gを得た（理論値の80％）。1 H NMR（CDCl3）δ7.35−7.23（m,10H）,7.06（d,J＝
8.6Hz）,6.66（d,J＝8.6Hz,2H）,5.50（5,J＝4.3Hz,1
H）,4.62（s,4H）,3.8−4.00（m,4H）,2.82（d,J＝4.3H
z,2H）。
C24H25NO2に対する理論値:C,80.22;H,6.96;N,3.90 実験値:C,80.35,H,7.11;N,3.86。
実施例9:4−〔ビス（フェニルメチル）アミノ−ベンゼ
ンアセトアルデヒド（化合物VI） 実施例８の化合物Ｖ（2g,5.6×10-3mole）をアセトン
（6ml）に溶解し、窒素雰囲気下で攪拌した。4M HCl
（6ml）をこの混合物に添加し僅かに黄色味を帯びてく
るまで攪拌を続ける。この反応混合物をCH2Cl2を入れた
分液ロートに移し、NaCl水溶液で洗浄した。有機層を硫
酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で一晩乾燥した（16−18
時間）。
このサンプルをTLC（CH2Cl2:ヘキサン＝4:1）で展開
し、ニンヒドリンで染色すると５個のスポットが出現し
た。この反応産物を50mmプレ吸着シリカカラムで分離
し、目的産物（化合物VI）に対応する500mgのスポット
を回収した（収率29％）。1 H NMR:δ9.5（t,1H）;7.1（s,10H）;6.8（d,2H）;4.5
（s,4H）;3.4（d,2H）。
別の調製法では、15mlアセトン中2.0gの化合物Ｖ（5.
6mmol）溶液に2mlの4M HClを添加した。この溶液を室
温で24時間攪拌した。これにシリカ（10g）を添加し乾
燥するまで濃縮した。予め吸着させた粗反応産物を含む
フラッシュクロマトグラフィーを塩化メチレン：ヘキサ
ン（4:1）で展開し、目的産物0.7gを得た（理論値の40
％）。1 H NMR（CDCl3） δ9.7（t,J＝2.9Hz,1H）,7.40−720
（m,10H）,7.00（d,J＝8.6Hz,2H）,6,7（d,J＝8.6Hz,2
H）,4.66（s,4H）,3.54（d,J＝2.9Hz,2H）。
C22H21NOに対する理論値:C,83.81;H,6.67;N,4.44。
実験値:C,84,06;H,6.58;N,4.50。
実施例10:2−〔２−（４−アミノフェニル−１−ヒドロ
キシエチル〕−安息香酸（化合物VII） ２−ブロモ安息香酸（88mg,4.33×10-4mole）をTHF
（2ml）に溶かし、−78℃まで冷却する。ｎ−ブチルリ
チウム（ｎ−buLi）（8.38×10-4mole）を添加し、この
混合物を２時間攪拌した。
実施例９で得た化合物VI（91mg,2.89×10-4mole）のT
HF（1ml）溶液をこの混合物に加え、−78℃で４時間攪
拌した。この反応混合物を酢酸エチルで希釈し、飽和NH
4Clで２回洗浄した後1M HClで１回洗浄した。有機層を
分離し、硫酸ナトリウムで乾燥後、一晩（約16−18時
間）かけてエバポレーションした。
生成物のCH2Cl2:ヘキサン（4:1）を用いた薄層クロマ
トグラフィーでは、二つのスポットが出現した。カラム
から両スポットを回収した。目的産物の化合物VIIが32m
g得られた（収率25％）。1 H NMR:7.1−7.8（m,14H）;6.9（d,2H）;6.6（d,2H）;
5.6（t,1H）;4.6（s,4H）;3.0（m,2H） 別の調製法では、２−ブロモ安息香酸（957mg,4.8mol
e）を20mlのテトラヒドロフランに溶解し、−78℃に冷
却したのち（CO2/アセトン）、ｎ−ブチルリチウム（ｎ
−BuLi;5.8mM,1.6M（ヘキサン中）、9.2mole）を添加し
１時間攪拌した。カニュールを用いて−78℃に冷却した
10mlTHF中のアルデヒド化合物VI（1.9g,3.2mole）を添
加し、−78℃で４時間攪拌した。この反応混合物を飽和
塩化アンモニウム溶液に注ぎ、続いて酢酸エチル（２×
50ml）で抽出した。有機層を合わせ硫酸ナトリウムで乾
燥した後、塩化メチレンを用いたフラッシュクロマトグ
ラフィーで精製して860mgの精製物を得た（収率62
％）。1 H NMR（CDCl3） δ7.90−7.80（m,1H）,7,68−7.40
（m,2H）,7.40−7.05（m,11H）,7.0（d,J＝8.6Hz,2H）,
6.64（d,J＝8.6Hz,2H）,5.62（t,J＝7.1Hz,2H）,3.64
（br s,2H）,3.4−2.8（m,2H）。
C29H27N03に対する理論値:C,80.37;H,6.24;N,3.23 実験値:C,80.44;H,6.29;N,3.19。
実施例11:2−〔２−〔ビス（フェニルメチル）アミノ〕
フェニル〕−１−ヒドロキシエチル安息香酸（化合物5
b） 実施例10で得た化合物VII（32mg）をメタノール（2m
l）に溶解した。Pd/C（10mg）を添加後この反応混合物
に水素を吹き込み、CH2Cl2:酢酸エチル（1:1）による薄
層クロマトグラフィーで全ての原料が無くなるまで約1.
5時間攪拌して16.2mgの化合物5bを得た（収率86％）。
再度合成するときには、カルボン酸塩、化合物VII（3
20mg,7.3×10-4mole）を20mlのメタノールに溶解した。
続いて10％パラジウム／活性炭（32mg）を添加し、フラ
スコに水素を吹き込んだ後90分間激しく攪拌した。セラ
イトによる濾過および濃縮により生成物179mgを得た
（収率95％）。この物質は精製すること無しに以下の実
施例に使用した。TLC Rf＝0.6,1:1 塩化メチレン：酢
酸エチル。
実施例12:2−〔２−〔４−〔〔５−〔（2,5−ジオキソ
−１−ピロリジニル）オキシ〕−1,5−ジオキソペンチ
ル〕アミノ〕フェニル〕−１−ヒドロキシエチル安息香
酸（化合物5a） 実施例11で得た化合物5b（16.2mg,6.3×10-5mole）を
CH2Cl2（70μｌ）に溶解し、Et3N（1.26×10-4mole）を
攪拌しながら添加した。
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドイル グルタロイル
クロライド（19.1mg,8.19×10-5mole）を添加し、この
混合物を窒素雰囲気下で攪拌した。この混合物を直接分
取用TLCに乗せ、CH2Cl2:酢酸エチル（1:1）で展開して
目的のハプテン性リガンド化合物5aを14.3mg得た（収率
50％）。1 H NMR:δ9.2（s,1H）;7.2−6.8（m,6H）;6.6（d,2
H）;5.2（t,1H）;2.6（m,2H）;2.1（s,4H）;2.0（t,1
H）;1.8（t,2H）;1.4（m,2H）。
別の合成では、カルボン酸塩VIII（100mg,3.9×10-4m
ole）を800μｌの塩化メチレンおよびトリエチルアミン
（109μｌ、7.8×10-4mole）に溶解した。この混合物に
（５−〔（2.5−ジオキソ−１−ピロリジニル）オキ
シ〕−５−オキソ−ベンタノイルクロライド（188mg,5.
1×10-4mole）を添加し20分間攪拌した。この粗反応物
を塩化メチレン：酢酸エチル（1:1）を用いたフラッシ
ュクロマトグラフィーカラムで精製し、159mgの目的産
物を得た（収率90％）。1 H NMR（CDCl3） δ9.24（s,1H）,7.36−6.8（m,6
H）,6.42（d,J＝8.6Hz,2H）,5,20（t,J＝7.1Hz,1H）,2.
66−2.36（m,2H）,2.15（5,4H）,2.1−1.96（m,2H）,1.
96−1.7（m,2H）,1.5−1.16（m,2H）。
C24H24N2O8に対する理論値:C,61.54;H,5.13;N,5.98。
実験値:C,61.62;H,5.10;N,5.89。
実施例13:化合物IX 実施例３の化合物II（262mg,1.22×10-3mole）および
グルタル酸無水物（140mg）をCH2Cl2（10ml）に溶解
し、16−18時間攪拌した。さらにグルタル酸無水物を加
え、Et3N（1.47×10-3mole）の水溶液に注いだ。この溶
液を酢酸エチルで希釈し、その水層を取り出してトリフ
ルオロ酢酸（TFA）で抽出した。この水層を酢酸エチル
で抽出し、標準的な10:90から90:10のCH2Cl2:H2O勾配を
用いたHPLCで精製して240mgの目的化合物（化合物IX）
を得た（収率60％）。1 H NMR:δ8.3（m,3H）;7.6.（t,2H）;6.9（d,2H）;6.7
（d,2H）;5.1（t,1H）;2.8（m,2H）;2.0（m,4H）;1.5
（m,2H）。
実施例14:化合物1b 実施例13で得た化合物IX（58mg,1.77×10-4mole）を
沃化メチル（8.84×10-4mole）と混合し、封入管中でア
セトン（約5ml）に溶かした後、80℃で約16−18時間加
熱した。沈殿を濾過した後、CHCl3で濯いで化合物1bを5
6mg得た（収率67％）。1 H NMR:δ8.5−7.5（m,4H）;7.2−6.8（m,4H）;5.2
（t,1H）;3.2（m,2H）;2.2（t,2H）;1.8（t,2H）;1.2
（m,2H）。
実施例Ｘ ｐ−ニトロフェノール（1g,7.10×10-3mole）をCH2Cl
2（3ml）に溶解し、Et3N（7.19×10-3mole）を添加して
黄色の溶液とした。
この溶液にベンジルクロライド（8.63×10-3mole）を
添加し、いくらか沸騰させた。約５分後に黄色が消失し
沈殿が生成した。この沈殿溶液にCH2Cl2（2ml）を添加
し、ついで酢酸エチル（3ml）を加えて沈殿を溶解し
た。この溶液を１時間攪拌した。
この溶液に水を加え、約45分間攪拌した後1M HClで
１回、10％NaHCO3で２回、1M HClで２回および飽和NaC
lで２回洗浄した。この有機層を硫酸ナトリウムで乾燥
後、エバポレーションし、減圧下で保存したのちにCH2C
l2:ヘキサン（2:1）を用いたカラムで分離した。TLCで
小さいほうのRf値を持つスポットを回収し、化合物Ｘ
（ｐ−ニトロフェニルベンゾエート）1.2613gを得た
（収率72％）。1 H NMR:δ8.4−8.0（m,4H）;7.7−7.3（m,5H）。
実施例16:化合物XI 実施例15の化合物Ｘ（530mg,2.18×10-3mole）、12M
HCl（200μｌ）、Pd/C（275mg）および水素ガスをメ
タノール（約15ml）中で混合し、CH2Cl2:メタノール
（9:1）の薄層クロマトグラフィーで原料が無くなるま
で窒素雰囲気下で2.5時間攪拌した。この溶液を濾過
し、乾燥して化合物XIを518mg得た（収率95％）。
実施例17:化合物３ 実施例16の化合物XI（518mg,2.08×10-3mole）をCH2C
l2（10ml）およびグルタル酸無水物（260mg,2.28×10-3
mole）と混合した。Et3N（4.58×10-3mole）をこの溶液
に溶かし、16−18時間攪拌した。
CH2Cl2:酢酸エチルによる薄層クロマトグラフィーで
原料を確認した。さらに、グルタル酸無水物を0.25mg添
加し、原料がなくなるまで更に３時間攪拌した。この溶
液を酢酸エチルで希釈し、1M HClで２回洗浄した。有
機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮後粗生成物655mg
を得た。この生成物をCH3CN:CH3OH:H2O（4:1:4）を用い
たFPLCで精製し397mgの化合物３を得た。1 H NMR:δ9.9（s,1H）;8.1（d,2H）;7.7−7.4（m,5
H）;7.1（d,2H）;2.3（t,4H）;1.8（m,2H）。
実施例18:化合物４ グルタル酸無水物（1.34g,1.17×10-2mole）およびｐ
−アミノフェノール（1.6g,1.47×10-2mole）をCH2Cl2
（5ml）に溶解し、35℃で１時間攪拌した。この混合物
を酢酸エチルで希釈し、1M HClで２回洗浄した。有機
層を硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒をエバポレートし
た。HPLCで水層に生成物があることが確認され、これを
凍結乾燥して粗生成物214mgを得た。
この粗生成物をH2O（16ml）、メタノール（5ml）およ
びCH3CN（5ml）に溶かし、FPLCで精製して化合物４を89
mg得た。1 H NMR:δ9.6（s,1H）;7.3（d,2H）;6.6（d,2H）;2.2
（m,4H）;1.7（m,2H）。
実施例19:2−〔２−（４−アミノフェニル）−１−ヒド
ロキシエチル〕−１−メチルベンゼン（化合物XII） ｎ−BuLi（2.8ml,ヘキサン中2.6M,4.4mmole）を30ml
のTHFに添加し、−78℃に冷却した（CO2/アセトン）。
この溶液に２−ブロモトルエン（0.573ml,4.8mmole）を
加え、30分間攪拌した。次に15mlのTHFに溶解し、−78
℃に冷却したアルデヒド化合物VI（1.9g,3.2mmole）を
加え２時間攪拌した。この反応混合物を塩化アンモニウ
ム飽和溶液に注ぎ、塩化メチレンで抽出した（２×25m
l）。有機層を合わせて硫酸ナトリウムで乾燥し、ヘキ
サン：塩化メチレン：酢酸エチル（6:1:1.5）を用いた
フラッシュクロマトグラフィーで精製して900mgの化合
物XIIを得た（収率69％）。1 H NMR（CDCl3）：δ7.9−7.8（m,1H）,7.68−7.40
（m,2H）,7.40−7.15（m,12H）,7.05（d,J＝8.6Hz,2
H）,6.70（d,J＝8.6Hz,2H）,5.3（t,J＝7.1Hz,1H）,4.6
2（s,4H）,3.0−2.7（m,2H）,2.3（s,3H）。
C29H29NOに対する理論値:C,85,50;H,7.13;N,3.44。
実験値:C,85.58;H,7.08;N,3.41。
実施例20:2−〔２−〔４−〔ビス（フェニルメチル）ア
ミノ〕フェニル〕−１−ヒドロキシエチル〕−１−メチ
ルベンゼン（化合物XIII） 50ml酢酸エチル中の化合物XII（900mg,2.2mmole）溶
液に10％パラジウム／活性炭（100mg）を添加した。反
応容器は、PARR水素化装置を用い50psiの水素で加圧し
た。反応は４時間後に完了し、反応物をセライトで濾過
したのち減圧下で濃縮して化合物XIIIを476mg得た（収
率95％）。この物質は、これ以上精製すること無しに次
の実施例で使用した。TLC Rf＝0.05,4:1 塩化メチレ
ン：ヘキサン。
実施例21:2−〔２−〔４−カルボキシ−１−オキソブチ
ル）アミノ〕フェニル〕−１−ヒドロキシエチル〕−１
−メチルベンゼン（化合物６） トリエチルアミン（351μｌ、2.5mmole）を含む塩化
メチレン10ml中の化合物Ｖ（476mg,2.1mmole）溶液に
（５−〔（2,5−ジオキソ−１−ピロリジニル）オキシ
ル〕５−オキソ−ペンタノイルクロライド（572mg,2.3m
mole）を加えた。この溶液を30分間攪拌し、酢酸エチル
（2.5ml）で希釈した後、1M HCl（２×15ml）で洗浄
し、硫酸ナトリウムで乾燥した。この粗生成物を塩化メ
チレン：酢酸エチル（1:1）を用いたフラッシュクロマ
トグラフィーで精製して780mgの化合物６を得た（収率8
5％）。1 H NMR（CDCl3）δ9.24（s,1H）,7.4−6.85（m,6H）,
6.45（d,J＝8.6Hz,2H）,5.20（t,J＝7.1Hz,1H）,2.65−
2.4（m,2H）,2.3（s,3H）,2.15（s,4H）,2.1−1.96（m,
2H）,1.96−1.72（m,2H）,1.5−1.20（m,2H）。
C24H26N2O6に対する理論値:C,65.75;H,5.94;N,6.49。
実験値:C,65.79;H,5.91;N,6.41。
実施例22:5−〔（2,5−ジオキソ−１−ピロリジニル）
オキシ〕−Ｎ−〔４−（ヒドロキシメチル）フェニル〕
−５−オキソ−ペンタンアミド（化合物XIV） 10ml塩化メチレン中のトリエチルアミン（1.13ml,8.2
mmole）溶液にｐ−アミノベンジルアルコール（1.9g,8.
1mmole）を溶かした。この溶液に（５−〔（2,5−ジオ
キソ−１−ピロリジニル）オキシ〕−５−ペンタノイル
クロライド（2.21g,8.9mmlole）を添加し１時間攪拌し
た。この反応混合物を塩化メチレン（25ml）で希釈し、
2M HClで抽出した（２×26ml）。この有機層を硫酸ナ
トリウムで乾燥し、CH2Cl2:メタノール（9:1）を用いた
フラッシュクロマトグラフィーで精製して2.43gの化合
物XIVを得た（収率90％）。1 H NMR（CDCl3）δ8.0（br x,2H）,7.52（d,J＝8.6H
z,2H）,7.30（d,J＝8.6Hz,2H）,4.62（s,2H）,3.45（s,
2H）,2.9（s,4H）,2.75（t,J＝10Hz,2H）,2.5（t,J＝10
Hz,2H）,2.38−2.10（m,2H）。
C16H18N2O6に対する理論値:C,57.49;H,5.39;N,8.38。
実験値:C,57.42;H,5.44;N,8.29。
実施例23:N−〔４−（ブロモメチル）フェニル〕−５−
〔（2,5−ジオキソ−１−ピロリジニル）オキシル−５
−オキソ−ペンタンアミド（化合物XV） 20mlのジメチルホルムアミド中の化合物XIV（2.9g,6m
mole）溶液にジブロモトリフェニルホスホラン（3.04g,
7.2mmole）を添加した。この反応混合物を50℃に温め、
４時間攪拌した。ついで、酢酸エチル１リットルで希釈
し、ブライン（４×200ml）で抽出して硫酸ナトリウム
で乾燥した。酢酸エチル:CH2Cl2（1:1）を用いたフラッ
シュクロマトグラフィーで精製して1.20gの化合物XVを
得た（収率50％）。1 H NMR（CDCl3）δ8.0（br s,1H）,7.50（d,J＝8.6H
z,2H）,7.39（d,J＝8.6Hz,2H）,4.5（s,2H）,2.9（s,4
H）,2.75（t,J＝10Hz,2H）,2.5（t,J＝20Hz,2H）,2.38
−2.10（m,2H）。
C16H17N2O5に対する理論値:C,58.72;H,t.20;N,8.56。
実験値:C,58.66;H,5.24;N,8.50。
実施例24:4−〔〔５−〔（2,5−ジオキソ１−ピロリジ
ニル）オキシル〕−1,5−ジオキソペンチル）アミノ〕
−N,N−ジメチル−Ｎ−ブロミドベンゼンメタンアミウ
ム−ブロマイド（化合物７） ブロマイド化合物XV（1.9g,2.5mmole）を60mlCH2Cl2
に溶解し、ジメチルアニリン（1.6ml,12.5mmole）を添
加した。この溶液を沈殿で生じるまで30分間攪拌し、さ
らに１時間攪拌した。そのサスペンジョンを分液ロート
に移し、蒸留水で抽出した（３×30ml）。洗浄液を集め
て凍結乾燥し、1.17gの化合物７を得た（収率90％）。1 H NMR（D2O）δ7.60（s,5H）,7.38（d,J＝8.6Hz,2
H）,7.9（d,J＝8.6Hz,2H）,4.95（s,2H）,3.62（s,6H,
2.9（s,4H）,2.75（t,J＝10Hz,2H）,2.5（t,10Hz,2H）,
2.38−2.10（m,2H）。
C24H28N3O5Brに対する理論値:C,55.60;H,5.41;N,8.11。
実験値:C,55.67;H,5.39;N,8.07。
実施例25:スクシンイミジルアジポイルクロライドおよ
びグルタロイルクロライド（結合試薬）の合成 チオニルクロライド（15ml）中のアジピン酸モノメチ
ルエステル（5.4g,33.3mmole）溶液を40℃に２時間加熱
する。この混合物を濃縮し、減圧下で蒸留して（沸点:2
0mmHgで119℃）酸クロライドメチルエステルを3.58g得
た（収率60％）。これを20mlのジクロロメタンに溶解
し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（2.75g,24.0mmol
e）、ついでトリエチルアミン（4.2ml,30mmole）を添加
した。この混合物を10分間攪拌し、酢酸エチルで希釈し
てから0.5M HClおよびブラインで洗浄した。この溶液
を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過後濃縮して無色油状の
メチルスクシンイミジルアジペート4.5gを得た（収率8
7.5％）。
100MHzのCDCl3中のプロトンNMR（内部標準TMS）：δ3.7
3（s,3H）,2.90（s,4H）,2.70（m,2H）,2.37（m,2H）,
1.79（m,4H）。
10mlアセトニトリル中メチルスクシンイミジルアジペ
ート（4.5g,17.5mmole）、クロロトリメチルシラン（1
1.1ml,87.5mmole）および沃化ナトリウム（13.1g,87.5m
mole）を12時間還流した。この混合物を室温に冷却した
後、酢酸エチルで希釈した。この反応混合物を有機層が
無色になるまで５％重炭酸ナトリウム水溶液で繰り返し
洗浄した。さらに、ブラインで洗浄後、無水硫酸ナトリ
ウムで乾燥し、濾過してから濃縮することにより白色固
体のアジピン酸モノスクシンイミジルエステル3.2gを得
た（収率71％）。
100MHzのCDCl3中でのプロトンNMR（内部標準TMS）：
δ3.90（s,4H）,2.70（m,2H）,2.4（m,2H）,1.80（m,4
H）。
アジピン酸スクシンイミジルエステル（1.00g,3.80mm
ole）およびチオニルクロライド（5ml）の混合物を40℃
で３時間加熱し、室温に冷却してから減圧下で濃縮し
た。残渣を乾燥ヘキサンと共に数回攪拌し、油状物質を
分取後、減圧下で乾燥してスクシンイミジルアジポイル
クロライド0.97gを得た（収率90％）。これを乾燥テト
ラハイドロフランに溶解し、５モル濃度溶液を調製して
タンパク質キャリヤーへのカップリングに適した化合物
の合成に使用した。
100MHzのCDCl3中でのプロトンNMR（内部標準TMS）:3.
00（m,2H）,2.90（s,4H）,2.70（m,2H）,1.80（m,4
H）。
同様にスクシンイミジルグルタロイルクロライド〔５
−〔（2,5−ジオキソ−１−ピロリジニル）オキシ〕−
５−オキソ−ペンタノイルクロライド〕を合成し、後に
述べるように使用した。
VI.結合体および接種物の調製 ハプテン性リガンド分子とキーホールリンペットヘモ
シアニン（KLH）またはウシ血清アルブミン（BSA）等の
タンパク質キャリヤーとの結合体は、例えば、MBS（ｍ
−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ
ドエステル）等の結合剤によるキャリヤーの活性化、お
よびハプテン性リガンドのチオール基へのカップリング
により調製しうる。例えば、リュー（Liu）等、Bioche
m.,80,690（1979）参照。また、当分野でよく知られて
いるように、中間の連結基によって化合物をキャリヤー
に結合することが有利なことがよくある。
有用なキャリヤーはよく知られており、一般にはタン
パク質そのものである。代表的キャリヤーには、キーホ
ールリンペットヘモシアニン（KLH）、エデスチン、チ
ログロブリン、ウシ血清アルブミンまたはヒト血清アル
ブミン等（各々BSAまたはHSA）のアルブミン、ヒツジ赤
血球などの赤血球、破傷風トキソイド、コレラトキソイ
ドおよびポリ（Ｄ−リジン:D−グルタミン酸）等のポリ
アミノ酸等がある。
キャリヤーの選択は、抗原の決定部分よりも抗原の最
終的使用目的に依存し、本発明とは特に関連しない基準
に基づく。例えば、結合体を実験動物に使用する場合、
特定の動物内で不都合な反応を起こさないキャリヤーを
選択するべきである。
キャリヤー−ハプテン結合体を生理食塩水、PBSまた
は滅菌水などの生理学的に許容可能な希釈剤の水性組成
物に溶解または分散し、接種物を調製する。完全または
不完全フロイントアジュバントまたはミョウバン等のア
ジュバントもこの接種物に含ませうる。良く知られてい
るように、この接種物は、抗体を誘導するのに充分な量
を注射によって動物に導入し、抗体を生成させるという
ように使用される。
代表的免疫原性結合体は、先に示したようにスペーシ
ング要素としてハプテン性リガンドのベンジル基（反応
体リガンドエステルのフェノール部分に相当する）上に
直鎖の炭素原子を導入する方法を適用してハプテン性リ
ガンドから合成される。別の代表的免疫原性結合体は、
反応体リガンドの酸部分に対応するハプテン性リガンド
の部分にスペーシング／連結要素として直鎖状の炭素原
子を導入する方法を適用することによりハプテン性リガ
ンドから合成しうる。
アジペートまたはグルタレート付加物の柔軟な炭素鎖
は、キャリヤータンパク質への共有結合による構造的束
縛に基づく免疫反応性に対するいかなるバイアスも減少
すると結論した。また、この目的のために合成された二
官能性試薬は、キャリヤーのリジン残基とアミド結合を
形成するための活性化したカルボキシル基を提供する。
ここで本実験で使用する特定のカップリング法をより詳
細に説明する。ハプテン性リガンドは、その構造のフェ
ノール部分のアミノ基を介してシーホールリンペットヘ
モシアニンに結合した。
本発明によれば中間連結剤は、先に述べたように合成
したスクシンイミジルアジポイルまたはグルタロイルク
ロライドであることが望ましい。抗原性（免疫原性）結
合体は以下のように合成する。
代表的操作では、250μｌのジメチルホルムアミド中
ハプテンとスクシンイミジルアジポイルクロライドまた
はスクシンイミジルグルタロイルクロライドの反応生成
物2.5mgを攪拌しながらゆっくりと750μｌの0.01M リ
ン酸ナトリウムバッファー（pH7.2）中2mgのKLH溶液に
加えた。温度は４℃で、混合物を約１時間攪拌してハプ
テン結合KLH結合体を形成させた。この結合体反応生成
物は、通常の手段で精製した。
VII.モノクローナルレセプターの調製 先のKLH結合体（約100μｇ）を使用し、完全フロイン
トアジュバントを用いた腹腔内注射（IP）で４匹の週令
８才のマウス（129GlX+株）を免疫化した。さらに、２
週間後ミョウバン中の50μｇの結合体をIP注射した。１
ヵ月後、ハプテンに対する抗体値がもっとも高いマウス
に50μｇのKLH−結合体を静脈注射した。３日後、ハイ
ブリドーマおよびモノクローナル抗体調製のためにその
脾臓を取り出した。
モノクローナル抗体は、ナイマン（Niman）等、Proc.
Natl.Acad.Sci.USA,77:4524（1980）およびナイマン
等、“モノクローナル抗体およびＴ−細胞産物”カッツ
（Katz）、D.H.編、23−51（CRCプレス、ボカレート
ン、FL 1982）に報告されている方法で調製した。簡単
に言うと、脾細胞（１×108）を2.0×107個のSp2/Oミエ
ローマ細胞と融合した。１％ニュートリドーマおよび２
％BSAを含む150μｌのHAT−DMEM培地を入れた45枚の96
穴プレートにプレーティングした。本発明のハイブリド
ーマを生成するのに使用したリンパ球には、霊長類、齧
歯動物（例えば、マウスまたはラット）、ウサギ、モル
モット、ウシ、イヌ、ヒツジ、ブタ等の哺乳類由来のも
のを使用しうる。一般には、その宿主を免疫原、この場
合はハプテン性リガンドの注射、つづいて二次免疫注射
で感作し、その脾臓を摘出する。
ミエローマ細胞系列は、リンパ球と同系列であること
が好ましい。従って、一般にマウスーマウスハイブリッ
ド（シャルマン（Shulman）等、Nature,276,269（197
8））またはラットーラットハイブリッド（ガルフレ（G
alfre）等、Nature,277,131（1979））等の融合ハイブ
リッドが使用される。しかし、ハイブリドーマの生成に
ラットーマウスハイブリッドが成功した例もある（ゴー
ディング（Goding），“細胞融合によるモノクローナル
抗体の生成",“道具としての抗体”マカロニス（Marcha
lonis）等編、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ版、
p.273（1982））。本発明に使用するのに適当なミエロ
ーマ系列には、MPC−11（ATCC CRL 167）、P3X63−Ag
8.653（ATCC CRL 1580）、Sp2/O−ag14（ATCC CRL
1581）,P3X63Ag8U.1（ATCC CRL 1597）,Y3−Ag1.2.3.
（フランス、パリ、コレクション・ナショナル・デ・カ
ルチャー・デ・マイクロオーガニズム、番号Ｉ−078）
およびP3X63Ag8（ATCC TIB ９）等が含まれる。本発
明には、非分泌性マウスミエローマ系列Sp2/OまたはSp2
/O−Ag14が好ましい。
最終的に生成されたハイブリドーマ細胞は、当分野で
よく知られているこれらの細胞に関する通常のインビト
ロ組織培養技術にしたがって培養しうる。さらに、ハイ
ブリドーマ細胞は生成した腹水液から得られるモノクロ
ーナルレセプターを用いる同様に良く知られた方法を用
いて動物中で培養することがより好ましい。腹水液の生
成に使用する動物には、カリフォルニア、ラ・ホラ、ス
クリプス・クリニック・アンド・リサーチ・ファンデー
ションのマウスコロニーで飼育されたBalb/c ｘ 129G
lX+マウスがあるが、ハイブリドーマの調製にマウス以
外の動物を使用するときには、腹水液の生産にマウスま
たはその他の動物が使用される。
特に、代表的モノクローナルレセプターはコラー等、
Nature,256,495（1975）の標準的ハイブリドーマ技術で
生成した。特に、129GlX+マウスは、リン酸緩衝液（PB
S）（pH7.4）および完全フロイントアジュバントの1:1
混合物300μｌ中結合体（例えば、KLHに結合した化合物
1a,2または5a）100μｇを含む接種物を用いた腹腔内注
射で免疫化した。２週間後、このマウスにPBS（pH7.4）
および10mg/mlミョウバンの1:1混合物中先の結合体50μ
ｇを含む溶液を同様の方法で注射した。さらに８週間
後、PBS（pH7.4）200μｌ中50μｇの結合体を含む溶液
を静脈注射した。４日後、このマウスから脾臓を取り出
し、その脾細胞をミエローマ細胞と融合した。
この脾細胞を集め、単一細胞サスペンジョンとした。
核のある脾細胞（1.4×108）を細胞融合促進剤（ポリエ
チレングリコール2000）の存在下、非分泌性ミエローマ
細胞Sp2/O（３×107）と融合した。96穴プレートへのハ
イブリドーマ細胞のプレーティング、および未融合のミ
エローマ細胞は増殖できない、4500mg/lグルコース（10
％）、10％ウシ胎児血清（FCS）、ヒポキサンチン、ア
ミノプテリンおよびチミジンを含むダルベッコ修正イー
グル培地（DMEM）（即ち、HAT培地）中での増殖によ
り、特定のモノクローナル抗体を生産するハイブリドー
マを選択した。
２−３週間後、各ウェルの細胞クローン上の上清を採
取し、ELISA法で抗原としての化合物1a,2または5aに対
する抗体の存在を確かめた。ポジティブのウェルを限界
希釈２回でクローン化した。２回のクローニング後化合
物1aまたは２特異的抗体を生産しつづけるクローンを増
殖させて大量の上清液を得た。化合物1aと免疫反応する
23個のモノクローナルレセプターの内の７個（約30％）
は、反応体リガンドエステル化合物３を触媒的に分解し
た。これらの触媒作用は、いずれも化合物1b等の適当な
ハプテン性リガンドによって阻害しうる。比較的高い割
合の誘導モノクローナルレセプターがエステル分解反応
を触媒しえた。ハプテン化合物３によって誘導された21
個の抗体はいずれも反応体リガンド化合物３に対する触
媒活性は示さなかった。同様に、最初に化合物5a,6また
は７と結合する抗体を生産したコロニーを２度サブクロ
ーン化した。その後も化合物5aでは18個、化合物６では
22個、および化合物７では26個が活性を保持していた。
これらの抗体はEgGクラスであった。
塩を用いてプリスタン感作Balb/c ｘ 129GlX+マウ
ス中で生成した腹水液からモノクローナル触媒分子を沈
殿させ、アニオン交換クロマトグラフィー（DEAE）、つ
いでアフィニティークロマトグラフィー（プロテイン
Ｇ）で精製した後、50mMリン酸塩（100mM NaCl,pH7.
5）に対して透析した。抗体はドデシル硫酸ナトリウム
ポリアクリルアミドゲル電気泳動で均一であると判定さ
れた。
30C6と命名されたハイブリドーマの一つをさらに研究
し、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
（ATCC）（12301 パークローンドライブ、ロックビ
ル、MD）に寄託した。このハイブリドーマは1990年１月
24日寄託し、受理番号HB10341を得た。その他の２個の
ハイブリドーマ、27A6および57G11も同様に1990年12月1
1日にATCCに寄託し、各々受理番号HB 10621およびHB
10622を得た。
この寄託は、寄託期間が寄託日から30年間、または寄
託機関における寄託に対する最後の請求から５年間、ま
たはこの出願から成立する米国特許の有効期間の内のい
ずれか長い期間である、というブダペスト条約に従う。
寄託機関のハイブリドーマが生育不能になった場合はそ
のハイブリドーマは補充される。
また、本発明のモノクローナルレセプターは、マウス
などの哺乳動物の腹腔内に注射などで導入することによ
り生産しうる。既に述べたように、米国特許第4,361,54
9号（参考としてここに導入する）に見られるように同
系列または準同系列の哺乳類を用いることが望ましい。
このハイブリドーマの導入は、適当な増殖期間、例えば
１−２週間の後に抗体産生ハイブリドーマの生成を誘導
し、宿主の血液および末梢浸出液（腹水）から回収しう
る高濃度のレセプターを提供する。また、宿主マウスは
その血液または腹水中に通常のレセプターを有している
が、一般に通常のレセプターの濃度はこのモノクローナ
ルレセプター濃度のわずか約５パーセントである。
ハイブリドーマの上清中に存在するモノクローナルレ
セプターは、精製することなしに使用しうるし、またこ
のレセプターはセファロース6Bまたは4B（ファルマシ
ア、ピスカタウェイ、NJ）等のイムノソーバントに結合
したAD169感染細胞を用いたアフィニティークロマトグ
ラフィーおよび約pH2.5の塩酸グリシン等の酸性バッフ
ァによるイムノソーバントからの溶出等の標準的技術を
使用してマウスの血清または腹水から回収しうる。
本実験では一般にIgGフラクションは45％飽和硫酸ア
ンモニウムによる沈殿化および先に述べたような塩化ナ
トリウムによる溶出を用いるDEAE−セファセルでのクロ
マトグラフィーによってマウス腹水から回収した。100m
Mの塩で溶出するフラクションを透析した後、濃縮し
た。
VIII.酵素結合イムノソルベント検定法（ELISA） リガンドの結合および化学修飾の効果は、タイター範
囲内の固定濃度の抗体と種々の濃度の試薬またはリガン
ドを用いたELISAで検定した。ハプテンに対する試薬の
比が1000:1以下の時にそのタイターが50％減少した場合
に阻害が起きたと定義した。
検定は、平底ポリビニルマイクロプレート（ダイナテ
ク、アレキサンドリア、VA）で行った。リン酸緩衝液
（PBS）中抗原としてBSAに結合した化合物1aを含む溶液
（各ウェル当たり50μｌ）でウェルをコーティングし
た。リガンドはミリリットル当たり１μｇの濃度でコー
ティングした。それからプレートをドライオーブン中37
℃で一晩インキュベートした。乾燥したプレートは使用
するまで４℃で保存した。。ELISA検定の前に乾燥した
プレートをそれぞれ0.1％ポリオキシアルキレン（20）
ソルビタンモノラウレート（Tween20）および0.02％シ
メローサル（エチルマーキュリチオサルチル酸ナトリウ
ム（シグマ、セントルイス、MO）を含む10mMPBS（pH7.
4）で２分間２回洗浄し再水和した。
非特異的結合を減らすために、ハイブリドーマ上清を
希釈剤として0.1％BSAを含む洗浄バッファで1:2に希釈
した。希釈したハイブリドーマ上清50μｌを各ウェルに
入れ、ジャイロシェーカー上４℃で１時間インキュベー
トして、モノクローナル抗体含有上清と、結合した化合
物４とを接触させた。各２分間２回の洗浄後、1:1000希
釈のパーオキシダーゼラベルしたヤギ抗マウスIgG＋IgM
（タゴ、バーリンガム、CA）を各ウェルに加え、この反
応混合物を４℃で１時間インキュベートしてラベル化抗
体を、結合モノクローナル抗体に結合させた。
結合したパーオキシダーゼ活性を検定するのに使用す
る基質は、使用直前に調製した。これは0.12％H2O2を含
む80mMクエン酸ーリン酸バッファ（pH6.0）中400μg/ml
のｏ−フェニレレンジアミン（シグマ、セントルイス、
MO）である。２回の最終的洗浄の後、基質溶液50μｌを
各ウェルに加え、暗所で15分間発色させた。各ウェルに
4M硫酸25μｌを添加して発色を停止し、マルチスカン
（Multiskan）ELISAプレートリーダーを用いて492ナノ
メーター（nm）の光学密度を測定した。
IX.速度測定 精製したモノクローナル抗体をEPPSバッファ（1mM,pH
8.0,100mM NaCl）またはCHESバッファ（1mM,pH8.0,100
mM NaCl）に対して透析した。そのタンパク質濃度は、
BCA法（ピアス）で測定した。検定はCH3CN/H2O（0.1％T
FA）（1/1）の非勾配溶出液によるHPLC（逆相カラム、C
18、VYDAC 201TP54）で行った。内部標準としてｏ−ア
セトアミドフェノールを用いて生成物〔４−（カルボキ
シブチルアミド）フェノール〕の量を算出した。
1mlの適当なバッファ〔50mM EPPS（pH7.2−8.6）;CH
ES（pH8.6−10.0）,100mM NaCl〕で抗体ストック溶液
を希釈し、タンパク質濃度を20μＭとした。反応液には
共溶媒として５パーセントのジオキサンを添加した。反
応温度は37±0.1℃であった。初期線型速度は、全基質
の５％加水分解までの領域で測定した。テストした抗体
はELISA結合検定で決定された反応条件下で少なくとも4
8時間安定であることが分かった。観測された速度は、
抗体非存在下での非触媒的加水分解速度に対して補正し
た。速度パラメーターVmaxKmは、ミカエリス・メンテン
式に従う双曲線に初期速度と基質濃度の値を非線型最小
二乗法で当てはめることにより決定した。
pHの関数としての初期速度の変化はpH8.6以上ではCHE
S（50mM）（100mM NaCl）において、他のpH領域ではEP
PS（50mM）（100mM NaCl）において測定した。pH8.6の
EPPSおよびCHES（50mM）（100mM NaCl）で測定した場
合、抗体27A6の速度に差は無かった。バッファイオン濃
度の変化（12.5−50mM）は、バッファ種の存在に関する
Ｋcat'（抗体27A6）の依存性を示さなかった。
等式１は、バッファ濃度ゼロに外挿した化合物３の加
水分解速度（Kobsd）に関するpH/速度関係を示してい
る。ブルース（bruice）等、Bioorganic Chemistry,1;
ベンジャミン版、ニューヨーク（1965）。
Kobsd＝KOH〔OH-〕 黒四角の線（第3b図）は、pH7.2−10.0の範囲で固定濃
度の化合物３（400μＭ）に対しバッファ濃度を変化さ
せたときに得られたものである（12.5−50mM）。使用し
たバッファおよびpH範囲は上述のものと同様である。K
OH−値はKobsとKw/aHのプロットの傾斜から算出した。
X.抗体の化学修飾 （ａ）フェニルグリオキサール；フェニルグリオキサー
ル溶液（6mM）（125mM NaHCO3,pH7.5）50μｌアリコー
トを抗体を含む（20μＭ）バッファ（125mM NaHCO3,pH
7.5）195μｌに添加した。この混合物を攪拌後室温に１
時間放置した。ついで、この反応混合物をマイクロダイ
アライザー（ピアス）に移し、１時間当たり約150mMの
速度で２時間125mM NaHCO3（pH7.5）に対して透析し
た。このマイクロダイアライザーを50mM CHES,100mM
NaCl（pH8.4）で濯ぎ（４×60ml）、このバッファ中で
一晩（15−18時間）放置した。翌朝、再びこのマイクロ
ダイアライザーを50mM CHES,100mM NaCl（pH 8.4）
で濯いだ（３×50ml）。サンプルを取り出し、タンパク
質濃度を再計算（BCA）してから触媒活性（HPLC）また
は結合（ELISA）検定を行った。同様の操作をハプテン
（200μＭ）についても行った。
（ｂ）マレイン酸無水物；マレイン酸無水物溶液（0.06
M、ジオキサン）5mlアリコートを20μＭの抗体を含む20
mMほう酸（pH8.9）、100mM NaCl溶液299μｌに添加し
た。この溶液を攪拌し、室温に１時間放置した。つい
で、この反応混合物をマイクロダイアライザーに移し、
上述したように50mM CHES（pH8.4）,100mM NaCl溶液
に対して透析した。サンプルを取り出し、タンパク質濃
度を計算（BCA）してから触媒活性又は結合を検定し
た。
（ｃ）ジエチルピロカーボネート;0.6Mのジエチルピロ
カーボネートのエタノール溶液10μｌを1mlの酢酸ナト
リウム溶液（NaOAc）（150mM,pH6,100mM NaCl）で希釈
した。この溶液５μｌを抗体20μＭを含むNaOAc（150m
M,pH6.0,100mM NaCl）299μｌに添加した。この混合物
を攪拌後一晩（約15−18時間）４℃で放置した。この反
応混合物をマイクロダイアライザーに移し、上述のよう
にCHES（50mM,pH8.4,100mM NaCl）に対して透析した。
サンプルを取り出し、タンパク質濃度を計算（BCA）し
た後、触媒活性および結合の検定を行った。
以上の事項は本発明を説明するものであり、これを制
限するものではない。本発明の精神および範囲を逸脱す
ること無しに多くの変化および修正が可能である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 15/02 Ｃ１２Ｒ 1:91 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 15/00 Ｃ Ｃ１２Ｒ 1:91） 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ＨＢ１０６２１ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ＨＢ１０６２２ (56)参考文献 Ｂｉｏａｓｓａｙｓ，ｖｏｌ．９ （1988）ｐ．107−112 Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．338（1989) ｐ．269−271 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 9/00 ＣＡ（ＳＴＮ)

Claims (18)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】反応体リガンドの所定のカルボン酸アミド
    またはエステルを触媒的に加水分解する抗体分子または
    抗体結合部位部分を含む分子であって、該分子の抗体結
    合部位が、以下の部分： （ａ）加水分解される所定のカルボン酸アミドまたはエ
    ステル結合を含む反応体リガンド、および （ｂ）前記反応体リガンドに構造的に類似するハプテン
    性リガンドであって、該ハプテン性リガンドが、加水分
    解される所定のカルボン酸アミドまたはエステル結合の
    水酸基、そのカルボニル基の位置に対応する前記ハプテ
    ン性リガンド中の位置に存在する飽和炭素原子、および
    そのカルボニル結合ヘテロ原子の各々に結合する四面体
    炭素原子を含み、さらに前記ハプテン性リガンドが、生
    理学的pHの水溶液中でイオン電荷を有するイオン電荷含
    有基を含み、該イオン電荷含有基が、前記反応体リガン
    ドの対応する位置には存在せず、かつ前記四面体炭素原
    子から半径約７オングストローム以内に規定される球状
    容積内に存在する前記ハプテン性リガンド、 に結合する分子。
  2. 【請求項２】前記イオン電荷含有基が、前記イオン電荷
    を有する該イオン電荷含有基の原子と、前記四面体炭素
    原子との間で、少なくとも１原子によって間接的に該四
    面体炭素原子に結合する請求の範囲第１項記載の分子。
  3. 【請求項３】前記分子がモノクローナル抗体である請求
    の範囲第１項記載の分子。
  4. 【請求項４】前記ハプテン性リガンドが、前記イオン電
    荷含有基として、生理学的pHでアンモニウムイオンまた
    はカルボキシレートイオンを含む請求の範囲第１項記載
    の分子。
  5. 【請求項５】反応体リガンドの所定のカルボン酸アミド
    またはエステル結合を触媒的に加水分解するモノクロー
    ナル抗体分子または抗体結合部位を含む分子であって、
    該分子の抗体結合部位が、 （ａ）加水分解される所定のカルボン酸アミドまたはエ
    ステル結合を含む反応体リガンドであって、以下の構造
    式： （式中、R1およびR2は反応体の炭素原子含有化学残基を
    示し、また、−Ｘ−は−Ｏ−または−NR3−（R3は水素
    または第３炭素含有化学残基である）である。） で表される反応体リガンド、および （ｂ）前記反応体リガンドに構造的に類似するハプテン
    性リガンドであって、以下の構造式： （式中、Ｒ1'およびＲ2'は各々R1およびR2に構造的に類
    似する炭素原子含有残基を表し、かつＲ1'およびＲ2'の
    内の少なくとも一つは生理学的pH値の水溶液においてイ
    オン電荷を有する基を含み、かつ生理学的pH値の水溶液
    においてイオン電荷を提供する前記少なくとも一つ基
    が、前記構造式中の−CH（OH）−基から半径約７オング
    ストロームで規定される球状容積内に存在する。また、
    −Ｘ−が−Ｏ−である時Ｒ3'はＨであり、−Ｘ−が−NR
    3−である時Ｒ3'はR3に構造的に類似する。） で表されるハプテン性リガンド、 に結合する分子。
  6. 【請求項６】前記−Ｘ−が−Ｏ−である請求の範囲第５
    項記載の分子。
  7. 【請求項７】前記生理学的pH値でイオン電荷を有する前
    記基がアンモニウムイオンまたはカルボキシレートイオ
    ンである請求の範囲第６項記載の分子。
  8. 【請求項８】ATCC受理番号HB10341のハイブリドーマ30C
    6によって分泌される請求の範囲第７項記載の分子。
  9. 【請求項９】ATCC受理番号HB10621のハイブリドーマ27A
    6によって分泌される請求の範囲第７項記載の分子。
  10. 【請求項１０】前記イオン電荷含有基が、イオン電荷を
    有する該イオン電荷含有基の原子と前記四面体炭素原子
    とを少なくとも１原子隔てて該四面体炭素原子に間接的
    に結合し、かつ前記イオン電荷含有基が前記四面体炭素
    原子から半径約２乃至約５オングストロームで規定され
    る球状容積内に存在する請求の範囲第５項記載の分子。
  11. 【請求項１１】培地中での培養で、反応体リガンドの所
    定のカルボン酸アミドまたはエステルを触媒的に加水分
    解するモノクローナル抗体分子または抗体結合部位部分
    を含む分子を産生する細胞であって、前記分子の抗体結
    合部位が、 （ａ）加水分解される所定のカルボン酸アミドまたはエ
    ステル結合を含む反応体リガンド、および （ｂ）前記反応体リガンドに構造的に類似するハプテン
    性リガンドであって、前記ハプテン性リガンドが、加水
    分解される所定のカルボン酸アミドまたはエステル結合
    の水酸基、そのカルボニル基の位置に対応するハプテン
    性リガンド中の位置に存在する飽和炭素原子、およびそ
    のカルボニル結合ヘテロ原子の各々に結合する四面体炭
    素原子を含み、前記ハプテン性リガンドが、さらに生理
    学的pHの水溶液中でイオン電荷を有するイオン電荷含有
    基を含み、該イオン電荷含有基が、前記反応体リガンド
    の対応する位置には存在せず、かつ前記四面体炭素原子
    から半径約７オングストローム以内に規定される球状容
    積内に存在する、ハプテン性リガンド、 に結合する、細胞。
  12. 【請求項１２】ハイブリドーマ細胞であって、さらに前
    記カルボン酸アミドまたはエステル結合を触媒的に加水
    分解する前記モノクローナル抗体または抗体結合部位部
    分を含む分子を培養培地中に分泌する請求の範囲第11項
    記載の細胞。
  13. 【請求項１３】ATCC受理番号HB10341のハイブリドーマ3
    0C6の細胞である請求の範囲第12項記載のハイブリドー
    マ細胞。
  14. 【請求項１４】ATCC受理番号HB10621のハイブリドーマ2
    7A6の細胞である請求の範囲第12項記載のハイブリドー
    マ細胞。
  15. 【請求項１５】反応体リガンド中の所定のエステルまた
    はアミド結合を触媒的に加水分解する方法であって、以
    下の工程： （ａ）触媒的有効量の請求の範囲第１項記載のモノクロ
    ーナル抗体分子または抗体結合部位部分を含む分子を水
    性媒体中で前記反応体リガンド分子と混合し、反応混合
    物を調製する、および （ｂ）前記反応体リガンド分子が前記抗体分子または抗
    体結合部位部分を含む分子に結合し、かつ該抗体分子ま
    たは抗体結合部位部分を含む分子が前記所定の結合を触
    媒的に加水分解し、かつ生成物を提供するのに十分な時
    間、前記反応混合物を維持する、 工程を含む方法。
  16. 【請求項１６】前記抗体分子またはその抗体結合部位部
    分を含む分子が、ATCC受理番号HB10341のハイブリドー
    マ30C6またはATCC受理番号HB10621のハイブリドーマ27A
    6により分泌される請求の範囲第15項記載の方法。
  17. 【請求項１７】培地中での培養で、反応体リガンドの所
    定のカルボン酸アミドまたはエステル結合を触媒的に加
    水分解する抗体分子または抗体結合部位部分を含む分子
    を産生する細胞を調製する方法であって、以下の工程： （ａ）加水分解される所定のカルボン酸アミドまたはエ
    ステル結合の水酸基、そのカルボニル基の位置に対応す
    るハプテン性リガンド中の位置に存在する飽和炭素原
    子、およびそのカルボニル結合ヘテロ原子の各々に結合
    する四面体炭素原子を含むハプテン性リガンドを含む免
    疫原で動物を免疫し、この場合、前記ハプテン性リガン
    ドが、さらに前記反応体リガンドの対応する位置には存
    在せず、かつ前記四面体炭素原子から半径約７オングス
    トローム以内に規定される球状容積内に存在する、生理
    学的pHの水溶液中でイオン電荷を有するイオン電荷含有
    基を含み、 （ｂ）前記動物が、前記ハプテン性リガンドと免疫反応
    する抗体を分泌するのに十分な時間、該動物を維持し、 （ｃ）抗体分子または抗体結合部位部分を含む分子をコ
    ードする遺伝子を、前記工程（ｂ）の前記免疫化動物の
    抗体産生細胞から宿主細胞に転移して、少なくとも二つ
    の起源に由来する遺伝子を含むハイブリッド細胞を生成
    し、該ハンブリッド細胞は、（ｉ）培養したときに該転
    移遺伝子から、抗体分子または抗体結合部位部分を含む
    分子を生産し、かつ（ii）実質的に永久に培養すること
    ができ、 （ｄ）前記ハンブリッド細胞が抗体分子または抗体結合
    部位部分を生産するのに十分な時間、適当な培地中で該
    ハイブリドーマ細胞を培養し、 （ｅ）培養した前記ハンブリッド細胞から抗体分子また
    は抗体結合部位部分を含む分子を回収し、 （ｆ）得られた抗体分子または抗体結合部位部分を含む
    分子をスクリーニングし、前記所定のカルボン酸アミド
    またはエステル結合を触媒的に加水分解する抗体分子ま
    たは抗体結合部位部分を含む分子を生産するハンブリッ
    ド細胞を同定し、そして （ｇ）前記所定のカルボン酸アミドまたはエステル結合
    を触媒的に加水分解する抗体分子または抗体結合部位部
    分を含む分子を生産する前記同定されたハンブリッド細
    胞のクローンを増殖する、 工程を含む方法。
  18. 【請求項１８】前記工程（ｃ）で生成した細胞がハイブ
    リドーマ細胞である請求の範囲第17項記載の方法。
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