DE69129845T2

DE69129845T2 - Moleküle mit antikörperbindungsstellen, die hydrolysereaktionen katalysieren

Info

Publication number: DE69129845T2
Application number: DE69129845T
Authority: DE
Inventors: Kim San Diego Ca 92107 Janda
Original assignee: Scripps Research Institute
Current assignee: Scripps Research Institute
Priority date: 1990-01-26
Filing date: 1991-01-24
Publication date: 1999-03-18
Anticipated expiration: 2011-01-25
Also published as: CA2034947A1; IE910277A1; JP3365769B2; PT96584A; EP0512074A1; CA2034947C; ES2120959T3; DE69129845D1; NO922921L; FI108437B; EP0512074B1; NO922921D0; WO1991011512A1; AU7339591A; PT96584B; US5187086A; NO311432B1; EP0512074A4; FI923367A0; FI923367A

Description

Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Antikörper, Antigene und Immunogene, und insbesondere auf Moleküle, die eine Antikörperbindungsstelle enthalten, welche das tetraedrische Kohlenstoffatom eines Amid- oder Esterhydrolyse-Übergangszustands und umgebende Strukturen bindet und außerdem eine Stelle für die Säure-Base-Katalyse oder die nukleophile Katalyse der Amid- oder Esterbindung, welche hydrolysiert wird, bereitstellt.

Hintergrund der Erfindung

Bindungsphänomene zwischen Liganden und Rezeptoren spielen zahlreiche entscheidende Rollen in biologischen Systemen. Beispiele für solche Phänomene sind die Bindung von Sauerstoffmolekülen an Desoxyhämoglobin unter Bildung von Oxyhämoglobin, und die Bindung eines Substrats an ein Enzym, welches auf es einwirkt, wie etwa zwischen einem Protein und einer Protease wie Trypsin. Zu weiteren Beispielen für biologische Bindungsphänomene gehören die Bindung eines Antigens an einen Antikörper und die Bindung der Komplement- Komponente C3 an den sogenannten CR1-Rezeptor.
Es wird auch angenommen, daß viele Arzneimittel und andere Heilmittel von Bindungsphänomenen abhängen. Zum Beispiel wird berichtet, daß Opiate wie Morphin an spezifische Rezeptoren im Gehirn binden. Es wird berichtet, daß Opiat-Agonisten und -Antagonisten mit Arzneimitteln wie Morphin um diese Bindungsstellen konkurrieren.
Liganden, wie vom Menschen hergestellte Arzneimittel, wie Morphin und seine Derivate, und Liganden, die in biologischen Systemen von Natur aus vorkommen, wie Endorphine und Hormone, binden an Rezeptoren, die in biologischen Systemen von Natur aus vorkommen, und werden in der vorliegenden Schrift zusammen abgehandelt. Eine solche Bindung kann zu einer Reihe von biologischen Phänomenen führen, darunter insbesondere die Hydrolyse von Amid- und Esterbindungen, wenn Proteine durch ein Enzym wie Trypsin oder Papain zu den Polypeptiden, aus denen sie aufgebaut sind, hydrolysiert werden, oder wenn ein Fett zu Glycerin bzw. drei Carbonsäuren aufgespalten wird.
Slobin, Biochemistry, 5 : 2836-2844 (1966) berichtet über die Herstellung von Antikörpern gegen ein p-Nitrocarbobenzoxykonjugat von Rinderserumalbumin. Diese Antikörper wurden anschließend verwendet, um p-Nitrophenylacetat und Epsilon-Aminocaproatester zu hydrolysieren. Die Reaktion des Acetatesters wurde durch eine Geschwindigkeitkonstante zweiter Ordnung beschrieben, und schien nichtspezifisch zu sein. Die Geschwindigkeitskonstante zweiter Ordnung, die erhalten wurde, wenn normales Gammaglobulin verwendet wurde, war angeblich ungefähr die gleiche wie die der speziell hergestellten Antikörper. Die Anwesenheit der speziell hergestellten Antikörper hemmte angeblich die Hydrolyse des Aminocaproatesters. Kohen und Mitarbeiter berichteten auch über Versuche, Antikörper zu verwenden, um eine Esterolyse zu katalysieren. Die von dieser Gruppe verwendeten Antikörper waren in jedem Fall gegen einen Teil des letztlich verwendeten Substratmoleküls gerichtet, welcher die zu hydrolysierende Bindung nicht enthielt.
In ihrer ursprünglichen Arbeit [FEBS Letters, 100 : 137-140 (1979) und Biochem. Biophys. Acta, 629 : 328-337 (1980)] wurden Anti-Steroid-Antikörper verwendet, um 7-Umbelliferonester (7-Hydroxycumarinester) eines Carboxyethylthioethers eines Steroids zu hydrolysieren. In jedem Fall wurde eine Zunahme der Hydrolysegeschwindigkeit, verglichen mit dem Hintergrund oder mit einer mit normalem IgG erhaltenen Geschwindigkeit, beobachtet. In beiden Fällen waren die Wechselzahlen niedrig (ungefähr 1 Mol Substrate pro Mol Antikörper pro Minute, oder weniger), und die Reaktionsgeschwindigkeiten nahmen mit der Zeit ab, wobei sie bei Sättigung des Antikörpers einen stabilen Zustand (Plateau) erreichten. Diese Verlangsamung der Geschwindigkeit wurde auf eine irreversible Bindung des Steroidsäureprodukts an den Antikörper zurückgeführt.
Kohen et al. berichteten auch über Hydrolysen von 7-[-N-(2,4-Dinitrophenyl)-6- aminohexanoyl]-cumann unter Verwendung von monoklonalen Antikörpern, die gegen die Dinitrophenylteile dieses Substratmoleküls gerichtet waren [FEBS Letters, 111 : 427-431 (1980)]. Hierbei wurde ebenfalls eine Zunahme der Geschwindigkeit gegenüber dem Hintergrund berichtet, aber es hieß, daß die Reaktion eher stöchiometrisch als katalytisch war. Es wurde über eine Abnahme der Geschwindigkeit, welche gegen null ging, berichtet, sobald die Sättigung des Antikörpers erreicht war. Auch hier wurde die Abnahme auf eine Produkthemmung zurückgeführt, die durch die Bindung des sauren Produkts an den Antikörper verursacht wird, da ein Teil der ursprünglichen Hydrolyseaktivität durch Chromatographie eines Antikörper-Substrat-Produkt-Gemisches regeneriert werden konnte.
Wenn eine starke Antikörperbindung auf stabile Zustände von Substratmolekülen gerichtet ist, erschwert die langsame Dissoziationsgeschwindigkeit des Komplexes die Katalyse. Man nimmt an, daß dies der Fall bei den von Kohen und Mitarbeitern berichteten Ergebnissen ist. Die vorstehenden Konstruktionen werden, wenngleich sie interessant sind, dadurch erheblich eingeschränkt, daß es nicht gelingt, den Mechanismus der Verwendung der Bindungsenergie anzusprechen, welcher für Enzyme wesentlich ist [W.P. Jencks, Adv. Enzymol., 43, 219 (1975)].
Diese Mängel können durch Verwendung eines Analogons des Übergangszustands als Hapten zum Erhalt der gewünschten Antikörper behoben werden. Dieses Hapten kann die Rolle eines Inhibitors in dem katalytischen System annehmen.
Somit kann eine immunologische Bindung verwendet werden, um experimentell Bindungswechselwirkungen auf katalytische Verfahren zu lenken. Zum Beispiel wurde vorgeschlagen, daß die Verwendung eines Antikörpers gegen eine Haptengruppe, welche dem Übergangszustand einer bestimmten Reaktion ähnelt, eine Beschleunigung der Substratreaktion dadurch herbeiführen sollte, daß die Substrate dazu gezwungen werden, dem Übergangszustand zu gleichen. Jencks, W.P., Catalysis in Chemistry and Enzymology, Seite 288 (McGraw-Hill, New York 1969). Ungeachtet dieses allgemeinen Vorschlags, wurden spezifische Übergangszustandshaptene nicht vorgeschlagen, und es wurden auch keine spezifischen Reaktionen vorgeschlagen, in denen das Konzept überprüft werden könnte.
Aufgrund der gegenwärtig anerkannten chemischen Theorie geht man davon aus, daß die Hydrolyse von Amid- und Esterbindungen in wäßrigen Medien über eine Reaktion am Carbonylkohlenstoffatom unter Ausbildung eines Übergangszustands vor sich geht, welcher ein tetraedrisches Kohlenstoffatom enthält, das an (a) ein Kohlenstoffatom des Säureteils des Amids oder Esters, (b) zwei Sauerstoffatome, von denen eines von der Carbonylgruppe und das andere von einem Hydroxylion oder Wassermolekül des Mediums stammt, und (c) das Sauerstoffatom des Alkoholteils eines Esters oder das Stickstoffatom des Aminteils eines Amids gebunden ist. Übergangszustände solcher Reaktionen sind brauchbare gedankliche Konstruktionen, die definitionsgemäß nicht isoliert werden können, im Gegensatz zu Zwischenprodukten, die isolierbar sind. Obwohl die vorstehenden Übergangszustände der Hydrolyse nicht isoliert werden können, ist diesem Thema eine große Menge an wissenschaftlicher Literatur gewidmet worden.
Wenngleich man glaubt, den vorstehend beschriebenen Übergangszustand für Amid- und Esterhydrolysen gut zu verstehen, sind die Parameter für die Topologie, z. B. die Größe, Gestalt und Ladung von Rezeptorbindungsstellen, an denen bestimmte Amide, wie etwa Proteine, oder Ester, wie etwa Fette, über diese Übergangszustände reagieren, nicht so gut bekannt. Es wäre deshalb nützlich, wenn die Topologie einer Mehrzahl von Bindungsstellen bekannt wäre, so daß die Wechselwirkungen der Liganden, welche an diesen Stellen binden, untersucht werden könnten. Unglücklicherweise ist die Topologie von Rezeptorbindungsstellen bei biologischen Hydrolysen im allgemeinen nicht bekannt, mit Ausnahme einer relativ kleinen Anzahl von Enzymen, deren Röntgenkristallstrukturen bestimmt worden sind. Die fehlende Kenntnis der Topologie der Bindungsstelle ist zum Teil durch eine fehlende Kenntnis selbst der Lage von vielen Bindungsstellen von Rezeptoren in Zellen bedingt. Außerdem ist bei denjenigen Rezeptorbindungsstellen, deren Lage bekannt ist, die chemische Identität, d. h. die Protein- und Kohlenhydratzusammensetzung der Bindungsstelle im allgemeinen nicht bekannt. Somit stößt der Forscher bei dem Versuch, die topologischen Anforde rungen von Rezeptorbindungsstellen zu verstehen und deshalb bei dem Versuch, Heilmittel zu konstruieren, welche diese Anforderungen erfüllen können, auf allgemeine Hindernisse. Die Forscher müssen deshalb mögliche Heilmittel in Untersuchungen an Tieren oder Zellkulturen durchmustern (screenen), um festzustellen, ob ein mögliches Heilmittel brauchbar sein könnte. Solche Systeme sind, obgleich sie brauchbar sind, teuer und zeitraubend anzuwenden.
Selbst wenn die Topologie und chemische Reaktivität eines hydrolytischen Rezeptors, wie etwa eines Enzyms, bekannt sind, spalten Enzyme wie etwa hydrolytische Proteasen typischerweise ihre Substrate, Polypeptidketten, in der Nachbarschaft zu einem bestimmten Aminosäurerest, welcher mehrfach in der Polypeptidkette des Proteins vorkommen kann. Wenngleich eine solche relativ zufällige Spaltung zum Erhalten einer Polypeptidkarte des Proteins brauchbar sein kann, ist diese relativ zufällige Spaltung nicht so brauchbar, wenn bestimmte Aminosäurerestsequenzen hergestellt werden sollen.
Zum Beispiel haben sich moderne Genmanipulationsmethoden bei der Herstellung von Fusionsproteinen als brauchbar erwiesen, welche ein gewünschtes Protein oder Polypeptid an das Transkriptionsprodukt eines Vektorgens wie etwa das Lac Z Gen angeknüpft enthalten. Die Verwendung solcher Fusionsproteine wird jedoch durch die Anwesenheit von Fragmenten des Vektorgenprodukts behindert. Es wäre deshalb auch von Vorteil, wenn proteolytische enzymartige Moleküle entwickelt werden könnten, welche solche Fusionsprodukte zwischen den erwünschten und unerwünschten Fusionspolypeptid- oder Proteinteilen spalten würden. Kürzlich berichteten Lerner, Tramontano und Janda [Science, 234,1566 (1986)] über monoklonale Antikörper, welche einen Ester katalytisch hydrolysieren. Tramontano und Lerner beschreiben auch die Verwendung von monoklonalen Antikörpern zum Hydrolysieren von Estern in dem US-Patent 4,656,567. Pollack, Jacobs und Schultz [Science, 234,1570 (1986)] berichtete über ein Myelomprotein mit der Bezeichnung MOPC167 [Leon et al., Biochem., 10, 1424 (1971)], welches die Hydrolyse eines Carbonats katalysiert.
In den zwei Offenbarungen von Lerner und Tramontano wurden die Antikörper gegen ein Phosphonat gerichtet, welches synthetisiert wurde, um ein stabiles Analogon des tetraedrischen Übergangszustands der Hydrolyse des Carbonsäureesters oder Carbonatesters darzustellen. Der hauptsächlich erörterte Antikörper von Pollack et al. war ein Myelomprotein, das zufällig eine Bindung an ein Phosphonat einging, welches zu dem hydrolysierten Carbonatanalogon strukturell analog war.
Somit war in der Arbeit von Lerner und Tramontano et al. das zu hydrolysierende Substrat vorgewählt, wobei das immunisierende Analogon und die hydrolytischen Antikörper dem gewünschten Produkt entsprechend synthetisiert wurden. Pollack et al. entwarfen das zu hydrolysierende Substrat, sobald sie die Spezifität des Myelomproteins kannten. Pollack et al. be richteten auch (vorstehend) über das Vorhandensein eines katalytischen Antikörpers, Substrats und analogen Substratsystems für eine Carbonathydrolyse, welches im Aufbau dem von Lemer et al. ähnlich ist. Über Arbeiten, die sich auf dieses System beziehen, wird in Jacobs et al., J. Am. Chem. Soc., 109, 2174 (1987) berichtet.
Die veröffentlichte Patentanmeldung WO 85/02414 erörtert die mögliche Verwendung von Antikörpern als Katalysatoren und liefert Daten, die sich auf die Verwendung eines polyklonalen Serums beim Hydrolysieren von o-Nitrophenyl-beta-D-galactosid beziehen. Die in dieser Anmeldung brauchbaren Antikörper sollen durch einen Reaktanten, ein Zwischenprodukt der Reaktion, oder ein Analogon des Reaktanten, Produkts oder Zwischenprodukts der Reaktion induzierbar sein. Der Begriff "Analogon" ist dabei so definiert, daß er Isomere, Homologe oder andere Verbindungen umfaßt, die im Hinblick auf die chemische Struktur eine ausreichende Ähnlichkeit zu dem Reaktanten aufweisen, so daß ein gegen ein Analogon gerichteter Antikörper an einer immunologischen Reaktion mit dem Reaktanten teilnehmen kann, aber nicht notwendigerweise eine Reaktion des Analogons katalysiert.
Die in dieser Beschreibung angegebenen Daten deuten nur darauf hin, daß eine gewisse Spaltung des Substrats (Reaktanten) Galactosid in einem Zeitraum von 18 Stunden bei Verwendung einer relativ konzentrierten Antikörperzubereitung (1 : 10 und 1 : 20-Verdünnungen) stattfand. Obwohl eine Katalyse geltend gemacht wurde, wurde keine katalytische Aktivität gezeigt, da kein Umsatz des angeblich katalytischen Antikörpers gezeigt wurde, und es gab auch keine Angabe des Prozentsatzes des gespaltenen Substrats Galactosid. Diese Anmeldung gab an, daß Beta-D-Galactosidase ungefähr zehnmal soviel Substrat spaltete wie die polyklonalen Antikörper, wobei eine Linearität der Extinktion bei der nicht angegebenen Konzentration des untersuchten Substrats angenommen wurde.
In Anbetracht der in dieser Anmeldung angegebenen Daten ist es möglich, daß eine nukleophile Ersetzung der o-Nitrophenylgruppe durch eine endständige Aminogruppe eines Lysinrests der verwendeten Antikörperzubereitung stattfand. Somit könnte die beobachtete Extinktion durch die Bildung von Epsilon-amino-lysinyl-o-nitrophenylanilin oder durch die Bildung eines Epsilon-amino-lysinylgalactosids und o-Nitrophenol bedingt sein, wobei keiner dieser Vorgänge katalytisch wäre, da der Antikörper keinen Umsatz bewirkte, sondern verbraucht wurde. Das US-Patent Nr. 4,792,446 von Kim et al. lehrt die Herstellung von Antikörperkatalysatoren. Diese Katalysatoren reagieren mit einem Substrat und werden durch ein Haptenmolekül hervorgebracht, wobei die Substrat- und Haptenmoleküle eine wesentliche strukturelle Ähnlichkeit in Teilen aufweisen, die von dem Atom oder der Gruppe, an welcher die katalytische Reaktion stattfindet; d. h. der Reaktionsstelle verschieden sind. An der Reaktionsstelle unterscheiden sich das Substrat und das Hapten dadurch, daß die Reaktionsstelle oder die katalytisch akti ven Kerne des Haptens eine oder mehrere Bindungen und eine höhere Wertigkeit als die analoge Struktur des Substrats enthalten.
Außerdem enthält das Hapten eine Gruppe, die an den katalytisch aktiven Teil des Moleküls; d. h., an den strukturell analogen Teil der reaktiven Stelle des Substrats, gebunden ist. Es heißt, daß diese zusätzliche Gruppe zum Einführen einer Plusionenladung, wie etwa mit einer -CO&sub2;&supmin;-Gruppe, oder einer Minusionenladung, wie mit einem Ammoniumion, in den katalytischen Antikörper brauchbar ist. Diese zusätzliche Gruppe soll auch das -OH des Substrats ersetzen, polare Umgebungen schaffen, nicht-polare Umgebungen schaffen oder einen Hohlraum für Wasser bereitstellen.
Lemer et al., BioAssays, 9 : 107-112 (1988) lehren auch die Verwendung einer ionisch geladenen Gruppe eines immunisierenden Haptens, um das Vorhandensein einer entgegengesetzt geladenen Gruppe in der Antikörperbindungsstelle zu induzieren, so daß eine Säure-Base- Katalyse unter Verwendung eines ungeladenen Substrats erleichtert werden kann. Diese Strategie zum Induzieren von katalytischen Antikörpern wird darin als "Köder und Austausch" bezeichnet, insofern als der katalytische Antikörper mit einem geladenen Hapten induziert oder geködert wird, und das Substrat für den induzierten Antikörper gegen ein neutrales Molekül ausgetauscht wird, so daß die gegen die Ionenladung des Haptens in dem Antikörper induzierte komplementäre Ionenladung verwendet werden kann, um eine Säure-Base-Katalyse einer Reaktion des neutralen Substrats zu ergeben. Es werden jedoch keine spezifischen Haptenstrukturen zur Durchführung der "Köder und Austausch"-Strategie gelehrt.

Kurze Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung zieht ein Antikörpermolekül oder ein Molekül, das einen Teil mit Antikörperbindungsstellen enthält (katalytisches Molekül), welches eine vorgewählte Carbonsäureamid- oder Esterbindung eines Reaktant-Liganden katalytisch hydrolysiert, Verfahren zur Herstellung und Verwendung eines solchen Moleküls und Zellen, welche das Katalysatormolekül erzeugen, in Betracht.
Die katalytisch aktiven Moleküle sind vorzugsweise monoklonale Antikörpermoleküle oder Moleküle, welche Teile mit monoklonalen Antikörperbindungsstellen enthalten. Die Antikörperbindungsstelle dieser Moleküle geht eine Immunreaktion mit mindestens zwei Ligandenmolekülen ein bzw. bindet an diese. Ein erstes Ligandenmolekül ist ein Reaktant-Ligand, welcher die vorgewählte Carbonsäureamid- oder Esterbindung, welche hydrolysiert wird, sowie einen kohlenstoffhaltigen chemischen Rest, der jeweils an die Carbonsäure- und Amin- oder Alkoholteile der Bindung gebunden ist, welche hydrolysiert wird, enthält.
Ein zweiter Ligand ist ein Hapten-Ligand, der direkt oder indirekt verwendet wird, um die katalytischen Moleküle zu induzieren. Der Hapten-Ligand ist zu dem Reaktant-Ligand strukturell analog und enthält ein tetraedrisches Kohlenstoffatom, welches an eine Hydroxylgruppe und an ein gesättigtes Kohlenstoffatom gebunden ist, an einer Position in dem Hapten-Liganden, die der Position der Carbonylgruppe bzw. dem an das Carbonyl gebundenen Heteroatom des vorgewählten Carbonsäureamids oder -esters des Reaktant-Liganden, der hydrolysiert werden soll, entspricht.
Wenn z. B. eine
Ester oder
Bindung in dem Reaktant-Liganden
hydrolysiert werden soll, enthält der Hapten-Ligand eine
Gruppe an einer Position, die der Gruppe, welche die Ester- oder Amidbindung enthält, analog ist. Kohlenstoffhaltige chemische Reste, die an das tetraedrische Kohlenstoffatom und an das gesättigte Kohlenstoffatom des Haptens gebunden sind, sind den chemischen Resten, welche an den Carboxylteil bzw. den Amin- oder Alkoholteil des Reaktant-Liganden gebunden sind, strukturell analog (ähnlich).
Ein Hapten-Ligand enthält auch eine Gruppe, die eine Ionenladung in wäßriger Lösung bei physiologischen pH-Werten trägt. Diese Gruppe, die die Ionenladung trägt, ist an einer entsprechenden Position des Reaktant-Liganden nicht vorhanden und liegt innerhalb eines kugelförmigen Raums, der durch einen Radius von ca. 0,7, und mehr bevorzugt ca. 0,2 bis ca. 0,5 nm (ca. 7 und mehr bevorzugt ca. 2 bis ca. 5 Ångström) ausgehend von dem vorstehend erwähnten, an eine Hydroxylgruppe gebundenen tetraedrischen Kohlenstoffatom definiert ist. Die Gruppe, die die Ionenladung trägt, stellt vorzugsweise ein Carboxylat- oder Ammoniumion in wäßriger Lösung bei physiologischen pH-Werten bereit.
Ein Reaktant-Ligand kann durch die Struktur
dargestellt werden,
wobei R¹ und R² für kohlenstoffatomhaltige chemische Reste des Reaktanten stehen, und -X-, -O- oder -NR³- bedeutet, wobei R³ Wasserstoff oder ein dritter kohlenstoffhaltiger chemischer Rest ist. Ein Hapten-Ligand kann durch die Struktur
dargestellt werden, wobei R¹ und R² für kohlenstoffatomhaltige Reste stehen, welche zu R¹ bzw. R² strukturell analog sind. Mindestens einer der Reste R1, und R2, enthält eine Gruppe, die eine Ionenladung in wäßriger Lösung bei physiologischen pH-Werten enthält, und diese ionisch geladene Gruppe liegt innerhalb eines kugelförmigen Raums, der durch einen Radius von ca. 0,7 und vorzugsweise ca. 0,2 bis ca. 0,5 nm (ca. 7 und vorzugsweise ca. 2 bis ca. 5 Ångström), ausgehend von der
Gruppe dieser Struktur definiert ist. R3, ist H, wenn -X- -O- ist, oder R3, ist strukturell analog zu R³, wenn -X- -NR³- ist.
Zellen, welche die vorstehend erörterten katalytischen Moleküle produzieren, wenn sie in einem geeigneten in vivo oder in vitro Medium kultiviert werden, werden ebenfalls in Betracht gezogen. Diese Zellen produzieren vorzugsweise nicht nur die katalytischen Moleküle, sondern scheiden diese katalytischen Moleküle auch in das Kulturmedium aus. Ein solcher bevorzugter Zelltyp ist eine Hybridomzelle.
Ein Verfahren zum Herstellen der vorstehenden Zellen wird ebenfalls in Betracht gezogen. Dabei wird ein Tier mit einem Immunogen immunisiert, das einen vorstehend beschriebenen Hapten-Liganden enthält, der in einer Menge vorhanden ist, die ausreichend ist, um Antikörper gegen das Hapten in dem Tier zu induzieren. Das Tier wird für einen Zeitraum erhalten, der dafür ausreicht, daß das Tier Antikörper ausscheidet, welche mit dem Hapten-Liganden eine Immunreaktion eingehen.
Gene, welche für Antikörpermoleküle oder Moleküle, welche Teile mit Antikörperbindungsstellen enthalten, codieren, werden von antikörperproduzierenden Zellen des immunisierten und erhaltenen Tiers in Wirtszellen transferiert, um Hybridzellen zu bilden. Diese Hybridzellen enthalten Gene aus mindestens zwei Quellen. Wenn sie kultiviert werden, produzieren die Hybridzellen Antikörpermoleküle oder Moleküle, welche Teile mit Antikörperbindungsstellen enthalten, von den transferierten Genen, und diese Zellen können im Vergleich zu den gentransferierenden antikörperproduzierenden Zellen im wesentlichen unbegrenzt kultiviert werden.
Die Hybridzellen werden in einem geeigneten Medium und unter geeigneten Kulturbedingungen während eines Zeitraums kultiviert, der dafür ausreichend ist, daß diese Hybridzellen Antikörpermoleküle oder Moleküle, welche Teile mit Antikörperbindungsstellen enthalten, produzieren, welche gewonnen werden und anschließend durchmustert werden, um eine Hybridzelle zu identifizieren, die Antikörpermoleküle oder Moleküle, die Teile mit Antikörperbindungsstellen enthalten, produziert, welche die vorgegebene Carbonsäureamid- oder Esterbindung des Reaktant-Liganden katalytisch hydrolysieren. Anschließend werden Klone der identifizierten Hybridzelle kultiviert.
Ein Verfahren zum katalytischen Hydrolysieren einer vorgewählten Ester- oder Amidbindung in einem reaktiven Liganden wird ebenfalls in Betracht gezogen. Hierbei wird eine katalytisch wirksame Menge der vorstehend erörterten katalytischen Moleküle mit Molekülen des Reaktant-Liganden in einem wäßrigen Medium vermischt, um ein Reaktionsgemisch zu bilden. Das Reaktionsgemisch wird während eines Zeitraums erhalten, der dafür ausreichend ist, daß die Moleküle des Reaktant-Liganden sich an die katalytischen Moleküle binden, und daß die katalytischen Moleküle die vorgewählte Bindung katalytisch hydrolysieren und Hydrolyseprodukte bilden. Ein oder mehrere gebildete Produkte können anschließend gewonnen werden.

Kurze Beschreibung der Abbildungen

In den Abbildungen, welche einen Teil dieser Offenbarung darstellen, erläutert die Fig. 1 in den Fig. 1A und 1B die Strukturformeln von spezifischen Hapten-Liganden (Verbindungen 1a, 2, 5a, 6 und 7), einen Inhibitor (Verbindung 1b), Substrat oder Reaktant-Liganden (Verbindung 3) und die Reaktionsverbindung 4, die hierin erörtert und verwendet wird. Fig. 2 ist eine graphische Darstellung, die zwei pH gegen 10 g K-Werte zeigt. Der obere Teil (Fig. 2A) erläutert ein Diagramm von log Kappcat gegen pH für 10 g-Werte zwischen -3 und -2 (ausgefüllte Kreise) für die Reaktion der durch den monoklonalen Antikörper 30C6 katalysierten Reaktion des Reaktant-Liganden Verbindung 3. Die Linie durch die Punkte wurde unter Verwendung der Gleichung
berechnet.
Der untere Teil (Fig. 2B) zeigt ein Diagramm von logcobs k gegen pH für log-Werte zwischen -9,5 und -7,0 (ausgefüllte Dreiecke) für die Reaktion von Verbindung 3, die auf eine Pufferkonzentration Null extrapoliert ist. Die berechnete Linie wurde unter Verwendung der Gleichung
Kcobs = Ko + HOH - [OH&supmin;].
erhalten.
Die pH-Werte für beide Diagramme liegen zwischen 5,5 und 8,5. Die Werte für kcat, Ka (pKa), ko und kOH- sind im Abschnitt Ergebnisse nachstehend angegeben.
Fig. 3 ist eine zweiteilige graphische Darstellung, die derjenigen von Fig. 2 ähnlich ist. Der obere Teil (Fig. 3A) erläutert ein Diagramm von log kappcat gegen pH für 10 g-Werte zwischen ca. -3 und ca. -1 (ausgefüllte Kreise) für die Reaktion der durch den monoklonalen Antikörper 27A6 katalysierten Reaktion des Reaktant-Liganden Verbindung 3.
Der untere Teil von Fig. 3 (Fig. 3B) zeigt Diagramme von log Kobsd (die beobachtete Geschwindigkeitskonstante) gegen pH für 10 g-Werte von ca. -8 bis ca. -6 (ausgefüllte Dreiecke) für die Hydrolysereaktion der Verbindung 3, die durch den monoklonalen Antikörper 27A6 katalysiert ist. Die ausgefüllten Quadrate beziehen sich auf 10 g Kobsd gegen pH für die gleiche Reaktion, die auf eine Pufferkonzentration Null extrapoliert ist. Die berechnete Linie wurde unter Verwendung der Gleichung
kobsd = kOH- [OH]
erhalten.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

I. Einleitung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Antikörpermoleküle oder Moleküle, die Teile mit Antikörperbindungsstellen enthalten, welche insgesamt als Rezeptoren oder katalytische Moleküle bezeichnet werden können, welche durch einen Hapten-Liganden induziert werden, der im Hinblick auf die Struktur zu einem Reaktant-Liganden analog ist. Der Hapten-Ligand ahmt sterisch die Konformation, aber nicht die Ionenladung eines Übergangszustands in der Reaktionsabfolge für die Hydrolyse einer Ester- oder einer Amidbindung des Reaktant-Liganden nach. Die katalytischen Moleküle [Antikörpermoleküle oder Moleküle, die (paratopische)Teile mit Antikörperbindungsstellen enthalten], binden an den Hapten-Liganden und an den Reaktant-Liganden. Man nimmt an, daß die katalytischen Moleküle den hydrolytischen Übergangszustand eines vorgewählten Teils des Reaktant-Ligariden stabilisieren und einen ionisch geladenen Aminosäurerest bereitstellen, welcher eine Säure-Base- oder nukleophile Katalyse für die katalysierte Hydrolysereaktion ergibt. Diese Moleküle hydrolysieren den Reaktant- Liganden katalytisch.
Antikörper und Enzyme sind beides Proteine, deren Funktion von ihrer Fähigkeit zur Bindung spezifischer Zielmoleküle abhängt. Enzymreaktionen unterscheiden sich von immunologischen Reaktionen dadurch, daß in einer Enzymreaktion die Bindung des Enzyms an sein Substrat typischerweise zu einer chemischen Katalyse führt, wogegen ein nicht katalytischer Komplex das übliche Ergebnis einer Antikörper-Antigen-Bindung ist.
Man nimmt an, daß Enzyme die Hydrolyse von Proteinen katalysieren, indem sie an das Protein binden, wobei der Übergangszustand der Hydrolysereaktion stabilisiert wird. Es wird im allgemeinen angenommen, daß die Geschwindigkeit einer Enzymreaktion bezogen auf die Geschwindigkeit einer nichtenzymatischen Reaktion aufgrund der Fähigkeit des Enzyms zur Stabilisierung des Übergangszustands der Reaktion, d. h. zur Verringerung der freien Energie des Übergangszustands und somit der freien Energie der Aktivierung der Reaktion erhöht ist [Jencks, W.P., Adv. Enzymology, 43, 219 (1975) und Pauling, L., Amer. Scientist, 36, 58 (1948)]. Gestützt wird diese Theorie durch die Beobachtung, daß Substanzen, von denen man annimmt, daß sie die mutmaßlichen Übergangszustände nachbilden, häufig stark an die Enzyme als konkurrierende Inhibitoren gebunden werden. Leinhard, G., Science, 180, 149 (1973) und Wolfenden, R., Acc. Chem. Res., 5, 10 (1972). Man nimmt ferner an, daß das Enzym diese Herabsetzung der freien Energie der Reaktion dadurch erreicht, daß es die Geome trie des Übergangszustands des Reaktanten stärker bindet als es an das bzw. die entsprechende(n) Substrat(e) oder Produkt(e) bindet.
Dies bedeutet, daß die innere Bindungsenergie des Enzyms viel größer ist als durch die Bindung von Substraten oder Produkten gemessen werden kann. Im wesentlichen wird die Bindungsenergie des Enzyms eingesetzt, um die chemische Reaktion durchzuführen [Jencks, W. P., XVII International Solvay Conference (November 1983)].
Die umgekehrte Annahme ist, daß ein Antikörper, welcher so hergestellt wurde, daß er optimal eine geeignete Imitation eines Übergangszustandes bindet, als Katalysator wirken würde. Die Demonstration dieses Ergebnisses vervollständigt die Korrelation der Enzymfunktion und der Antikörperstruktur und ergibt eine brauchbare Vorgehensweise zur Planung künstlicher Enzyme.
Die der hier beschriebenen immunologischen Hydrolyse zugrunde liegende Idee bezieht sich auf die Verwendung eines Hapten-Liganden bei der Induktion von Antikörpern mit vorgegebener Spezifität, welche (a) vorzugsweise an den Übergangszustand der Amid- oder Esterbindungshydrolyse binden und ihn dadurch stabilisieren, wenn sie an den angegebenen Reaktant-Liganden binden, und (b) vermutlich einen ionisch geladenen Aminosäurerest, der eine Säure-Base- oder nukleophile Reaktion katalysiert, in der induzierten Bindungsstelle bereitstellen. Ein dabei brauchbarer Hapten-Ligand simuliert die Konformation, aber nicht die Ionenladung eines hochenergetischen Übergangszustandes der Amid- oder Esterhydrolyse, um die Erzeugung von Antikörpern zu induzieren, welche die Fähigkeit aufweisen, verwandte Substrate (Reaktant-Liganden) zu binden und ihre Hydrolysen zu stabilisieren. Der Hapten- Ligand enthält auch eine Gruppe, welche eine Ionenladung in wäßriger Lösung bei physiologischen pH-Werten bereitstellt, um einen entgegengesetzt geladenen Aminosäurerest in der Antikörperbindungsstelle zu induzieren. Man nimmt an, daß dieser entgegengesetzt geladene Aminosäurerest die katalytische Wirkung auf die Säure-Base- oder nukleophile Reaktion ergibt.
Eine solche bevorzugte Bindung und Stabilisierung führt zu einer Verringerung der Aktivierungsenergie für die Hydrolysereaktion, wodurch ein Kriterium für eine Katalyse erfüllt ist. Das Vorhandensein eines geladenen Aminosäurerests in der Bindungsstelle kann die geladenen Reste nachahmen, die an den Wirkstellen von proteolytischen Enzymen wie etwa den Serinproteasen vorhanden sind. Antikörper, welche diese Eigenschaft aufweisen, können durch Immunisierung mit synthetischen Haptenen erhalten werden, welche chemisch modifiziert sind, um einen geladenen Rest zu induzieren, sowie um den Bindungseigenschaften eines Substrat-Reaktant-Liganden zu ähneln, dessen Bindung hydrolysiert wird; d. h. durch Immunisierung mit einem sterischen Imitat des Übergangszustands der bestimmten Reaktion.
Es ist gezeigt worden, daß monoklonale Antikörper eine Vielzahl von Acyltransferreaktionen katalysieren [(a) Tramontano et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83 : 6736 (1986); (b) Tramontano et al. Science, 234 : 1566 (1986); (c) Jacobs et al., J. Am. Chem. Soc., 109 : 2174 (1987); (d) Napper et al., Science, 237 : 1041 (1987); (e) Janda et al., Am. Chem. Soc., 110 : 4835 (1988); (f) Janda et al., Science, 241 : 1199 (1988); (g) Janda et al., Science, 244 : 437 (1989)], indem sie Hapten-Übergangszustands-Modelle verwenden [(Lemer et al., BioAssays, 9 : 107-122 (1988)].
Um den Umfang und die Fähigkeiten dieser hydrolytischen Antikörper oder Rezeptoren auszuweiten, welche auch als Abzyme bezeichnet werden, müssen neue Strategien zum Hervorbringen einer katalytischen Aktivität in den Bindungsstellen von Antikörpern entwickelt werden. Kürzlich erschienene Berichte haben die Aufmerksamkeit auf die Abwandlung der Bindungstasche oder der Bindungsstelle eines Antikörpers entweder durch halbsynthetische Verfahren [(a) Pollack et al., Science, 242 : 1038 (1988), (b) Pollack et al., J. Am. Chem. Soc., 111 : 1929 (1989)] oder durch ortsgerichtete Mutagenese [Baldwin et al., Science, 245 : 1104 (1989)] gelenkt. Die allgemeine Anwendbarkeit solcher Strategien kann jedoch aufgrund fehlender Strukturdaten für katalytische Antikörper vermindert sein.
Es bestand der Eindruck, daß ein Verfahren, welches katalytisch aktive Gruppen de novo von einem Haptenantigen induzieren könnte, sich als vorteilhafter erweisen würde, da man die große Variabilität der Immunantwort über das somatische Mutationsverfahren nutzbar machen kann, um eine "in vivo"-Mutagenese durchzuführen. Die nachstehend erörterten Ergebnisse berichten über eine Taktik, welche einen Aminosäurerest bzw. Aminosäurereste innerhalb der Bindungsstelle des induzierten Antikörpermoleküls hervorbringt, um bei einer beliebigen Acyltransferreaktion behilflich zu sein, durch eine Methodik, die zuvor als "Köder und Austausch"- Katalyse bezeichnet wurde.
Der Plan umfaßte hierbei die Anbringung einer Ionenladung in dem Antigen oder Hapten- Ligand Verbindung 1a (Fig. 1) in enger Nachbarschaft zu dem zu hydrolysierenden Acylbestandteil. Die gegen dieses Hapten gerichteten Antikörper besitzen vermutlich einen Aminosäurerest bzw. Aminosäurereste an der Bindungsstelle, die eine zu dieser Haptenladung komplementäre Ladung aufweisen [(a) Pressman et al., J. Am. Chem. Soc., 68 : 250 (1946); (b) Pressman et al., J. Am. Chem. Soc., 75 : 686 (1953); (c) Grossberg et al., J. Am. Chem. Soc., 82 : 5470 (1960); (d) Shokat et al., Nature (London), 338 : 269 (1989)].
Außerdem präsentiert die Verbindung 1a dem Antikörper eine Hydroxylgruppe mit einer tetraedrischen Geometrie, welche als sterisches Imitat oder sterische Wiedergabe des Acyltransfer-Übergangszustandes dient. Diese Position wurde ungeladen gelassen, so daß keine zusätzlichen elektrostatischen Effekte auftreten.
Das Benzoatsubstrat oder Reaktant-Ligand Verbindung 3 (Fig. 1), welche der Haptenverbindung 1a entspricht, hat ähnliche sterische Abmessungen (bestimmt durch MM2- Berechnungen), ihm fehlte jedoch die positive Ladung. Folglich weist der ionisch geladene Aminosäurerest, von dem vermutet wird, daß er sich an der induzierten katalytischen Antikörperbindungsstelle befindet, keine Ionenpaarbildung auf und dient als möglicher allgemeiner Säure-Base- oder nukleophiler Katalysator.
Der Pyridin-Hapten-Ligand Verbindung 2 (Fig. 1) dient als Kontrolle, da er strukturell identisch mit Verbindung 1a ist, aber keine Methylgruppe und keine Ladung bei physiologischen pH-Werten aufweist. Das Vorhandensein einer komplementären Ladung ist zuvor bereits eingesetzt worden, um ein Substratproton in einer antikörperkatalysierten ß-Eliminierungsreaktion abzuspalten, wenngleich kein Vergleich mit einem neutralen Hapten angestellt wurde. Shokat et al., Nature (London). 338 : 269 (1989).
Der Begriff "Rezeptor" wird hier so verwendet, daß er ein biologisch aktives Molekül bedeutet, welches an einen Reaktant-Liganden, Inhibitor-Liganden oder Hapten-Liganden bindet. Die Rezeptormoleküle (katalytischen Moleküle) der vorliegenden Erfindung sind Antikörper, im wesentlichen intakte Antikörper oder idiotyphaltige Polyamidteile (paratophaltige Teile) eines Antikörpers.
Die biologische Aktivität eines Rezeptormoleküls wird durch die Bindung des Rezeptors an seinen antigenen Reaktant-Liganden, Inhibitor-Liganden oder Hapten-Liganden beim Zusammenmischen dieser in einem wäßrigen Medium, zumindest bei physiologischen pH- Werten und Ionenstärken nachgewiesen. Vorzugsweise binden die Rezeptoren auch an einen Antigen-Liganden innerhalb eines pH-Wertbereichs von ca. 5 bis ca. 9, und bei Ionenstärken wie der Ionenstärke von destilliertem Wasser bis zu der Ionenstärke von ca. einmolarem Natriumchlorid.
Idiotyphaltige Polyamidteile (Antikörperbindungsstellen oder Paratope) von Antikörpern sind die Teile von Antikörpermolekülen, welche den Idiotyp einschließen und binden an den Reaktant-Liganden oder Hapten-Liganden. Zu solchen Teilen gehören die Fab, Fab' und F(ab')&sub2;- Fragmente, die aus Antikörpern durch bekannte enzymatische Spaltungsmethoden hergestellt werden. Siehe z. B. das US-Patent Nr. 4,342,566 von Theofilopoulos und Dixon, im allgemeinen, und im einzelnen Pollack et al. [Science, 234,1570 (1987)], welche berichteten, daß erhöhte Hydrolysegeschwindigkeiten für Fab-Fragmente die gleichen waren wie die des nativen Ig. Insofern die Antikörper, aus denen idiotyphaltige Polyamide erhalten werden, als gegen Immunogene gerichtet oder durch diese induziert beschrieben werden, werden idiotyphaltige Polyamidrezeptoren als "gerichtet" oder "induziert" bezeichnet, wobei es sich versteht, daß typischerweise ein Spaltungsschritt erforderlich ist, um ein idiotyphaltiges Polyamid aus einem Antikörper zu erhalten. Intakte Antikörper sind jedoch bevorzugt und werden zur Veranschaulichung der Rezeptormoleküle dieser Erfindung verwendet.
Die Rezeptoren (katalytische Moleküle), die in der vorliegenden Erfindung brauchbar sind, sind vorzugsweise monoklonale Antikörper oder Teile davon. Ein "monoklonaler Antikörper" ist ein Rezeptor, der durch Klone einer einzelnen Zelle erzeugt wird, welche nur eine Art von Rezeptormolekül erzeugt und häufig ausscheidet. Die Hybridomzelle ist ein Beispiel für eine solche Zelle und ist aus einer antikörpererzeugenden Zelle und einer Myelomzelle oder einer anderen immortalisierten Zellinie durch Fusion erzeugt.
Methoden zur Herstellung der monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung unter Verwendung der Hybridomtechnologie sind bekannt. Solche Rezeptoren wurden zuerst von Kohler und Milstein, Nature, 256, 495 (1975) beschrieben. Monoklonale Antikörper werden typischerweise aus Hybridomgewebekulturen oder aus Ascitesflüssigkeit, die von Säugetieren erhalten wurde, in die das Hybridomgewebe eingeführt wurde, erhalten. Beide Verfahren sind in dieser Anmeldung beschrieben.
Monoklonale katalytische Moleküle sind in dieser Anmeldung bevorzugt aufgrund ihrer einzigartigen Spezifität bei der Bindung an ein bestimmtes Epitop wie etwa einen bestimmten immunisierenden Hapten-Liganden und Reaktant-Liganden, sowie ihrer relativ höheren spezifischen katalytischen Aktivität, verglichen mit polyklonalen Antikörpern. Polyklonale Antikörperzubereitungen können ebenfalls in dieser Anmeldung verwendet werden, müssen aber typischerweise in Fraktionen, welche an den immunisierenden Hapten-Liganden binden, und Fraktionen, welche an fremde Epitope wie etwa Epitope des Antigenträgers binden, aufgetrennt werden.
Polyklonale Antikörper, welche an den Hapten-Liganden binden, können durch Affinitätstrennung unter Verwendung eines Hapten-Liganden als Affinitätssorbens getrennt werden. Nach dem Vermischen und Erhalten einer Antikörperzubereitung mit dem Affinitätssorbens während eines Zeitraums, der dafür ausreicht, daß eine geeignete Immunreaktion stattfindet, wird das Affinitätssorbens von dem übrigen Teil der Antikörperzubereitung abgetrennt.
Der abgetrennte, verbleibende Antikörperteil, der an das Affinitätssorbens gebunden ist, enthält die Antikörper, welche an den Hapten-Liganden binden, wogegen Antikörper in dem abgetrennten übrigen Teil der Antikörperzubereitung an fremde Epitope binden. Diese affinitätsgebundenen Antikörper können danach durch übliche Methoden zum Abtrennen von gebundenen Einheiten von Affinitätssorbentien, wie etwa durch Waschen des Sorbens mit Glycin- Hydrochlorid bei pH 2, isoliert werden.
Ein "Ligand" ist in dieser Anmeldung definiert als Molekül oder Komplex, welcher mit einer Antikörperbindungsstelle eines Rezeptormoleküls eine Immunreaktion eingeht oder daran bindet. Es werden zwei hauptsächliche Arten von Ligand in Betracht gezogen. Der erste wird als Hapten-Ligand bezeichnet und als Immunogen zum Induzieren einer Zubereitung von Rezeptormolekülen, als Inhibitor der durch das Rezeptormolekül katalysierten Reaktion und als Antigen in ELISA oder anderen Tests verwendet. Der zweite wird als Reaktant-Ligand oder Substrat bezeichnet und ist das Molekül, welches die katalysierte Reaktion eingeht. Der Hapten-Ligand ist im Hinblick auf die katalysierte Reaktion im wesentlichen inert.
Wie in dieser Anmeldung beschrieben ist, sind chemische Analoga von Amid- oder Esterreaktant-Liganden als Haptene synthetisiert worden, welche ein tetraedrisches Kohlenstoffatom enthalten, das direkt an eine Hydroxylgruppe gebunden ist und auch direkt an ein gesättigtes Kohlenstoffatom an einer spezifischen vorgegebenen Stelle gebunden ist, um die Konformation, aber nicht die Ionenladung des Übergangszustands bei der Hydrolyse einer Amid- oder Esterbindung eines strukturell ähnlichen oder analogen Reaktant-Liganden nachzuahmen. Die Hydrolyse der Amidbindung von Polypeptiden oder Proteinen erfordert Hapten-Liganden, bei denen im wesentlichen keine Hydrolyse auftritt, wenn sie als Hapten-Immunogen verwendet werden. Somit tritt bei einem Hapten-Liganden, welcher den tetraedrischen Kohlenstoff, seine Hydroxylgruppe und ein benachbartes, direkt gebundenes gesättigtes Kohlenstoffatom einschließt, keine solche mögliche Hydrolyse auf.
Kurze Polypeptidketten können die Produktion von Antikörpern induzieren, welche ein homologes Protein an einer vorbestimmten spezifischen Stelle erkennen und daran binden. Die vorliegende Erfindung bringt die früheren Arbeiten mit Polypeptiden einen großen Schritt voran. Hierbei werden die Antikörper (Rezeptoren) durch ein immunisierendes, eine Ionenladung tragendes erstes Haptenmolekül (den Hapten-Liganden) induziert und erkennen und binden nicht nur an dieses erste Molekül, sondern auch an ein zweites verwandtes Molekül (den Reaktant-Liganden), der an einer analogen Position keine Ionenladung aufweist. Indem er dieses zweite Molekül bindet, verursacht der Rezeptor die Hydrolyse (welche, wie in dieser Anmeldung gezeigt wird, katalytisch ist) einer vorgewählten Ester- oder Amidbindung, welche im Hinblick auf die Topologie der Topologie des immunisierenden ersten Haptenmoleküls entspricht. Die Entsprechung im Hinblick auf die Topologie, d. h. die Größe und Gestalt, aber nicht die Ionenladung, ergibt ein Mittel zur Vorauswahl der Stelle, an der die Hydrolyse des Liganden erfolgt. Inhibitor-Liganden, welche der Struktur eines Hapten-Liganden oder eines Reaktant-Liganden ähneln, werden ebenfalls durch Rezeptormoleküle gebunden. Folglich kann man durch die Synthese eines relativ kleinen immunisierenden Hapten- Liganden die Erzeugung von Rezeptormolekülen induzieren, welche eine Ester oder Amidbindung in einem anderen Molekül, welches eine Mehrzahl von Amid- oder Esterbindungen enthält, kennen, daran binden und katalytisch Spalten. Somit können Rezeptormoleküle hergestellt werden, welche eine ausgewählte vorgegebene Amidbindung eines Proteins oder Po lypeptids, wie etwa eines genetisch manipulierten Fusionsproteins, oder eine Esterbindung eines vorgewählten Esters in einem Polyester katalytisch hydrolysieren. Die eigentliche Bedeutung dieses Ergebnisses ist, daß man die Aktivität von bisher unbekannten Proteasen und Esterasen auf Immunglobuline übertragen kann.

II. Übergangszustand der Esterolyse und Konstruktion des Hapten-Liganden

Die Konstruktion des Hapten-Liganden geht zurück von der Struktur der zu bildenden Hydrolyseprodukte über den Übergangszustand zum Brechen der Bindung, welcher nachgeahmt werden soll, und anschließend zu dem Hapten-Liganden. Reaktionen, an denen eine Amid- oder Esterhydrolyse beteiligt ist, ergeben anschauliche Beispiele für das allgemeine Konzept und werden in dieser Anmeldung als beispielhaft für eine Ester- oder Amidhydrolysereaktion verwendet.
Transacylierungsverfahren sind durch Carbonyl-Additions-Eliminations-Mechanismen gekennzeichnet. Die Acylgruppe kann deshalb in diesem Übergangszustand verschiedene Grade eines tetraedrischen Charakters aufweisen. W.P. Jencks, Catalysis in Chemistry and Enzymology, Ch. 10, (McGraw-Hill, New York, 1969). Man könnte erwarten, daß die Enzyme, welche Transacylierungsreaktionen katalysieren, solche Analoga des Reaktant-Liganden gut binden, die eine tetraedrische Konfiguration in der Umgebung des Acylzentrums aufweisen. Dies ist der Fall bei Serinproteasen, wo zeitweilig eine kovalente Bindung zwischen dem Liganden (Substrat) und dem Enzym gebildet wird [Westerik et al., J. Biol. Chem., 247, 8195 (1972); R. C. Thompson, Biochemistry. 12, 47 (1973) und Imperali et al., Biochemistry. 25. 3760 (1986), sowie bei Enzymen, welche die direkte Wasseranlagerung an Amide oder Ester katalysieren. Die zuletzt genannte Kategorie wird durch Verbindungen mit einer tetraedrischen Konfiguration gehemmt, welche eine Phosphat-, Phosphonat- oder Phosphonamidatgruppe anstelle der spaltbaren Amideinheit enthalten [Weaver et a., J. Mol. Biol., 114, 119 (1977) und Jacobsen et al., J. Am. Chem. Soc., 103, 654 (1981)].
Die Hydrolyse von Carbonsäureestern ist ein einfacheres Beispiel für eine Transacylierung, welche durch die sterische Nachahmung des Übergangszustands durch das Hapten angenähert wird. Esterhydrolysereaktionen laufen im allgemeinen mit zweckmäßigen spontanen Geschwindigkeiten unter Umgebungsbedingungen ab, die für Antikörper geeignet sind. Deshalb kann jegliche kleine Erhöhung der Geschwindigkeit ohne weiteres nachgewiesen werden. Ein brauchbarer Hapten-Ligand enthält ein tetraedrisches Kohlenstoffatom, welches an eine Hydroxylgruppe gebunden ist und auch direkt an ein gesättigtes Kohlenstoffatom gebunden ist. Diese Atome ahmen das tetraedrische Kohlenstoffatom und das damit verbundene Sauerstoffatom oder Stickstoffatom (Heteroatom) des Übergangszustands der Hydrolyse einer Carbonsäureester- oder Amidbindung sterisch nach, ahmen jedoch die Ionenladung des Übergangszustands nicht nach. Somit sind das tetraedrische Kohlenstoffatom, seine Hydroxylgruppe und das direkt gebundene gesättigte Kohlenstoffatom in einer Position in dem Hapten-Liganden, welche der Position der Carbonylgruppe als auch dem carbonylgebundenen Heteroatom (Sauerstoff oder Stickstoff) der vorgewählten Carbonsäureamid- oder Esterbindung, die hydrolysiert werden soll, in dem Reaktant-Liganden entspricht. Kohlenstoffatomhaltige chemische Reste, welche kohfenstoffatomhaltigen Resten des Reaktant-Liganden strukturell analog sind, sind an das tetraedrische Kohlenstoffatom und an das gesättigte Kohlenstoffatom gebunden, so daß die Hapten- und Reaktant-Liganden außer an den Atomen, an denen die Hydrolyse stattfindet, strukturell ähnlich oder analog sind.
Diese strukturelle sterische Nachahmung des reaktiven Carbonyls und des Sauerstoff- oder Stickstoffatoms unterscheidet sich somit von den Phosphonat- oder Phosphonamidatgruppen oder der Carbonatgruppe, die von früheren Arbeitsgruppen als analog zu dem Übergangszustand der Hydrolyse verwendet wurden. Die vorliegende sterische Nachahmung unterscheidet sich auch von den Gruppen, die in dem Patent von Kim et al. erörtert wurden, dadurch, daß die Struktur in einem Hapten der vorliegenden Erfindung eine niedrigere Wertigkeit als die analoge Struktur in dem Substrat enthält und die gleiche Anzahl von Bindungen, nicht eine oder mehrere, wie die analoge Struktur des Substrats enthält.
Ein Hapten, das hierbei brauchbar ist, schließt des weiteren eine Gruppe ein, die in einer wäßrigen Lösung bei physiologischen pH-Werten eine Ionenladung trägt. Diese Gruppe, die die Ionenladung trägt, kann direkt an das vorstehend erwähnte tetraedrische Kohlenstoffatom gebunden sein. Vorzugsweise ist die Gruppe, die die Ionenladung trägt, jedoch indirekt an das tetraedrische Kohlenstoffatom gebunden und liegt innerhalb eines kugelförmigen Raums, der durch einen Radius von ca. 0,7 nm (ca. 7 Ångström (Å)), ausgehend von dem tetraedrischen Kohlenstoffatom definiert ist. Mehr bevorzugt beträgt der Radius ca. 0,2 bis 0,5 nm (ca. 2 bis ca. 5 Ångström).
Die Gruppe, die eine Ionenladung trägt, ist an einer entsprechenden Position in dem Reaktant-Liganden oder Substrat nicht vorhanden und kann aus einer Anzahl von bekannten Gruppen ausgewählt werden
Zum Beispiel gehören zu Gruppen, die zum Induzieren einer komplementären positiven Ladung in der Antikörperbindungsstelle bei physiologischen pH-Werten eine negative Ladung tragen, Carboxyl (-CO&sub2;H), Phosphono [-P(OH)&sub2;O], Sulfo (-SO&sub3;H), Phosphoro [-OP(OH)O], Sulfato (-OSO&sub3;H) und dergleichen. Zu beispielhaften Gruppen, die zum Induzieren einer komplementären negativen Ladung in der Antikörperbindungsstelle eine positive Ionenladung bei physiologischen pH-Werten tragen, gehören Amino (-NH&sub2;), Guanidin [-HNC(N)NH&sub2;], mono- und disubstituiertes Amino, wobei jeder Substituent bis zu ca. 10 Kohlenstoffatome enthält, wie etwa C&sub1;-C&sub6;-niederes Alkyl, Benzyl, Phenyl und Naphthyl, oder wobei zwei Substituenten einen 5- oder 6-gliedrigen Ring bilden wie in Morpholin, Piperidin, Pyrrolidin, substituierte Guanidin verbindungen mit den vorstehenden Substituenten und quaternäre stickstoffhaltige Gruppen wie trisubstituierte Ammoniumverbindungen, wie die Tnethylammoniumgruppe oder ein quaternisierter aromatischer Ring, wie etwa ein substituierter Chinolinium- oder Pyridiniumring. Jede der vorstehenden neutral geladenen Gruppen existiert als negativ oder positiv geladene Ionengruppe in wäßriger Lösung bei physiologischen pH-Werten.
Carboxylgruppen und quaternäre Amine, wie sie in heteroaromatischen Ringen vorkommen, welche Carboxylat- und Ammoniumionen bereitstellen, sind bevorzugt. Quaternäre Amine werden allesamt zu der Klasse von Ammoniumgruppen gerechnet, wenn Gruppen, die eine Ionenladung tragen, erörtert werden, ganz gleich, ob sie durch vier Substituentengruppen oder durch Protonierung quaternisiert sind, und ob sie in acyclischer Form oder in cyclischer Form als Teil eines Rings, wie etwa in einem N-Methyl-pyridinium-Rest vorliegen.
Wenn die Gruppe, die eine Ionenladung bei physiologischen pH-Werten trägt, ein Teil einer anderen Gruppe ist, die an das vorstehend erwähnte tetraedrische Kohlenstoffatom gebunden ist, wie es der Fall bei dem quaternären Stickstoffatom der N-Methyl-pyridinium-Verbindung ist, die zur Veranschaulichung hier in Verbindung 1a verwendet wird, wird das quaternäre Stickstoffatom des Pyridiniumrings als die Gruppe, die die Ionenladung trägt, angesehen. Die Gruppe, die die Ionenladung trägt, ist in einer solchen Struktur somit indirekt an das tetraedrische Kohlenstoffatom gebunden, und das Atom dieser eine Ionenladung tragenden Gruppe, welches die Ionenladung trägt, d. h. ein quaternäres Stickstoffatom, ist von diesem tetraedrischen Kohlenstoffatom durch mindestens ein Atom, vorzugsweise ein Kohlenstoffatom, getrennt. Ein Molekül wie etwa ein Glycolsäurederivat enthält die Ionengruppe direkt an das tetraedrische Kohlenstoffatom und seine Hydroxylgruppe gebunden.
Der Reaktant-Ligand ist dem Hapten-Liganden strukturell analog (ähnlich) und umgekehrt, aber ein Reaktant-Ligand weist die vorstehend erörterte Gruppe, die in wäßriger Lösung bei physiologischen pH-Werten eine Ionenladung trägt, welche in einer Position liegt, die der Lage dieser Gruppe in dem Hapten-Liganden strukturell analog ist, nicht auf. Somit enthält der zur Veranschaulichung angegebene Hapten-Ligand Verbindung 1a einen quaternären N-Methylpyridiniumstickstoff, wogegen der zur Veranschaulichung angegebene Substrat-Ligand Verbindung 3 einen neutral geladenen Phenylring und seine Kohlenstoff- und Wasserstoffatome an der entsprechenden Position enthält.
Der Hapten-Ligand und/oder der Reaktant-Ligand (Substrat) kann auch eine oder mehrere zusätzliche Gruppen enthalten, die in wäßriger Lösung bei physiologischen pH-Werten eine Ionenladung tragen. Diese Gruppen, die eine Ionenladung tragen, können in entsprechender oder nicht entsprechender Lage in den zwei Arten von Ligandmolekülen enthalten sein. Außerdem kann eine solche zusätzliche ionisch geladene Gruppe innerhalb des gleichen kugel förmigen Raums vorkommen, welcher für die vorstehend beschriebene Gruppe, die eine Ionenladung trägt, definiert ist.
Das Vorhandensein von einer oder mehreren ionisch geladenen Gruppen in dem Hapten- Liganden oder in dem Reaktant-Liganden oder in beiden zusätzlich zu der mindestens einen solchen ionisch geladenen Gruppe, die vorstehend erörtert wurde, kann auch nützlich sein, um die Bindung eines Haptens an die Bindungsstelle des Katalysatormoleküls zu erleichtern. Dies ist besonders dann der Fall, wenn ein relativ kleines Hapten, wie etwa die in dieser Anmeldung zur Veranschaulichung verwendeten Haptene, verwendet wird.
Zum Beispiel haben Studien mit Dextranen gezeigt, daß die maximale Bindung von Anti- Dextran-Antikörpern mit Dextranen erfolgt, die sechs oder sieben Glucosereste enthalten. Studien mit Polyalaninoligomeren haben eine maximale Bindung bei einer Größe von vier bis sechs Aminosäureresten gezeigt. Chapman et al., Microbiology. 2 Auflage, Kapitel 16, Seiten 444-447. Kleinere Oligomere wurden weniger gut gebunden, wobei Glucose keinerlei Bindung aufwies.
Somit kann die Ausstattung von einem oder beiden Liganden mit einer oder mehreren zusätzlichen Ionenladungen die Bindung durch die katalytische Antikörperbindungsstelle mit Hilfe von komplementären Ladungen sowie durch eine strukturelle Einpassung unterstützen, wenn ein Ligand kleiner als die volle Größe ist, welche von der Bindungsstelle untergebracht werden kann.
Somit enthält der Hapten-Ligand mindestens eine Gruppe, die eine Ionenladung in wäßriger Lösung bei physiologischen pH-Werten bereitstellt, wie etwa ein Amin, ein quaternäres Stickstoffatom oder eine Carboxylgruppe, welche eine Ammoniumgruppe oder eine Carboxylatgruppe ergeben. Diese geladene Gruppe liegt innerhalb des definierten kugelförmigen Raums und ist an einer entsprechenden Position in dem Reaktant-Liganden nicht vorhanden.
Wie bereits festgestellt wurde, ist der kugelförmige Raum, in dem die mindestens eine Gruppe, die die Ionenladung trägt, in dem Hapten-Liganden liegt, durch einen Radius von ca. 7Å, ausgehend von dem tetraedrischen Kohlenstoffatom, definiert, und liegt mehr bevorzugt innerhalb eines Raums, der durch einen Radius von ca. 2 bis ca. 5Å, ausgehend von dem tetraedrischen Kohlenstoffatom, definiert ist. Solche kugelförmigen Räume und Radien können unter Verwendung von im Fachgebiet bekannten Computerprogrammen oder durch Verwendung von Molekülmodellen berechnet werden.
Es versteht sich, daß die Anordnung der mindestens einen Gruppe, die eine Ionenladung trägt, in dem Hapten-Liganden so ist, daß der mutmaßlich induzierte komplementäre geladene Aminosäurerest der Antikörperbindungsstelle Zugang zu der Carbonylgruppe und den gebundenen Sauerstoff- oder Stickstoffatomen des zu hydrolysierenden Esters oder Amids hat. Anders ausgedrückt, wird die die Ionenladung tragende Gruppe des Hapten-Liganden von dem tetraedrischen Kohlenstoffatom, seiner Hydroxylgruppe und dem angrenzenden gesättigten Kohlenstoffatom nicht sterisch gehindert.
Ein brauchbarer Reaktant-Ligand weist die Struktur
auf, wobei R¹ und R² für kohlenstoffatomhaltige chemische Reste stehen, und -X- -O- oder -NR³- ist, wobei R³ Wasserstoff oder ein dritter kohlenstoffhaltiger chemischer Rest ist. R¹ und R² können gleich oder verschieden sein. Jede Gruppe kann ein Aminosäurerest, ein Polypeptid oder Protein sowie ein organischer Rest, wie ein aliphatischer oder substituierter aliphatischer, geradkettiger oder verzweigter, offenkettiger oder cyclischer Rest, sein, wozu ein cyclischer oder offenkettiger heteroatomhaltiger Rest gehört, und kann auch ein aromatischer, substituierter aromatischer, heteroaromatischer oder substituierter heteroaromatischer Rest sein. Sofern der Reaktant-Ligand in einem wäßrigen Medium löslich gemacht werden kann, welches die Wirkung des Katalysatormoleküls im wesentlichen nicht hemmt, und groß genug ist, um durch den Katalysator gebunden zu werden, können die spezifischen Strukturen von R¹ und R² im wesentlichen beliebige kohlenstoffhaltige chemische Reste sein.
Wenn R nicht Wasserstoff (H) bedeutet, kann R³ ebenfalls im wesentlichen ein beliebiger kohlenstoffhaltiger chemischer Rest sein, wie es bei R¹ und R² der Fall ist.
Ein Hapten-Ligand ist dem Reaktant-Liganden strukturell analog (ähnlich). Ein Hapten-Ligand weist die Struktur
auf, wobei R1, und R2, für kohlenstoffatomhaltige Reste stehen, welche zu R¹ bzw. R² strukturell analog (ähnlich) sind, und R3, ist zu R³ strukturell analog (ähnlich), wenn -X- -NR³- bedeutet. Wenn -X- -O- bedeutet, ist R3, Wasserstoff. Mindestens einer der Bestandteile R1, und R2, ergibt auch die Gruppe, die in wäßriger Lösung bei physiologischen pH-Werten eine Ionenladung trägt, welche in dem Reaktant-Liganden nicht vorhanden ist, und diese Gruppe liegt innerhalb des zuvor erörterten kugelförmigen Raums.
In bevorzugten Ausführungsformen sind die Bestandteile der R-Gruppen-Paare R¹ und R1,, R² und R2, und R³ und R3, so strukturell analog, daß R¹ und R1, im wesentlichen identisch sind, R² und R2, im wesentlichen identisch sind und R³ und R3, im wesentlichen identisch sind, ausgenommen, wenn -X- -O- bedeutet. In dieser bevorzugten Situation liegen die Unterschiede zwischen den ähnlich numerierten Paaren von R-Gruppen darin, daß der Hapten-Ligand die Gruppe, die eine Ionenladung trägt, enthält, welche nicht in dem Reaktant-Liganden vorhanden ist, und daß der Hapten-Ligand auch ein Atom oder eine Gruppe enthält, welche verwen det wird, um den Hapten-Liganden an ein antigenes (immunogenes) Trägermolekül unter Bildung eines immunogenen Konjugats anzuknüpfen, wie nachstehend erörtert wird.
Somit weisen, mit Ausnahme der vorstehend genannten Unterschiede, die paarweise auftretenden Gruppen mit ähnlicher Nummer vorzugsweise die gleiche Größe, Gestalt, Ladung und das gleiche Maß an Ungesättigtheit auf. Wenn die Größe der paarweise vorkommenden R- Gruppen mit ähnlicher Nummer unterschiedlich ist, ist es bevorzugt, daß der Hapten-Ligand größer ist als der Reaktant-Ligand, so daß der kleinere Reaktant-Ligand innerhalb der induzierten katalytischen Bindungsstelle untergebracht werden kann.
Die Strukturen der zur Erläuterung dienenden Hapten-Liganden und Reaktant-Liganden, die für diese Untersuchung verwendet werden, wurden gemäß bestimmten Kriterien ausgewählt. Dazu gehörten die Verfügbarkeit und Stabilität der das tetraedrische Kohlenstoffatom enthaltenden Vorstufen, das entsprechende Carbonsäureamid- oder Estersubstrat, die Leichtigkeit der chemischen Synthese zu ihrer Herstellung und die Eignung für verschiedene Arten der immunologischen Präsentation. Durch Aufnahme von Aminosubstituenten in die aromatischen Ringe kann z. B. entweder die Benzylgruppe oder Phenolgruppe mit einem funktionellen Anhang zum Kuppeln an immunogene Trägerproteine zur Haptenpräsentation versehen werden.

III. Katalytische Antikörper produzierende Zellen und Verfahren

Zellen, die, wenn sie in einem geeigneten Medium kultiviert werden, monoklonale Katalysatormoleküle (Antikörpermoleküle oder Moleküle, die Teile mit Antikörperbindungsstellen enthalten) produzieren, welche eine vorgewählte Carbonsäureamid- oder -esterbindung eines Reaktant-Liganden katalytisch hydrolysieren, werden in dieser Anmeldung ebenfalls in Betracht gezogen. Diese Zellen scheiden vorzugsweise die vorstehenden Molekühle auch in ihre Kulturmediumumgebung aus, ganz gleich, ob diese Kulturmediumumgebung in vitro oder in vivo ist. In einer bevorzugten Ausführungsform sind diese Zellen Hybridomzellen, wie das Hybridom 30C6.
Im allgemeinen werden solche ein Katalysatormolekül produzierenden Zellen durch Immunisieren eines Versuchstiers wie einer Maus, einer Ratte, einer Ziege oder eines Pferds mit einem Immunogen hergestellt, das eine antikörperinduzierende Menge eines vorstehend beschriebenen Hapten-Liganden enthält. Typischerweise ist das Immunogen ein Konjugat aus dem Hapten-Liganden und einem antigenen (immunogenen) Träger, wie nachstehend erörtert wird.
Das so immunisierte Tier wird während eines Zeitraums erhalten, der dafür ausreichend ist, daß das Tier Antikörper ausscheidet, die mit dem Hapten-Liganden eine Immunreaktion eingehen. Der nachstehend erörterte ELISA-Test ist brauchbar, um das Vorhandensein einer erforderlichen Immunreaktion nachzuweisen.
Gene, welche Antikörpermoleküle oder Moleküle, die Teile mit einer Antikörperbindungsstelle davon enthalten, codieren, werden aus antikörperproduzierenden Zellen des vorstehend erhaltenen Tieres wie etwa Splenocyten in Wirtszellen überführt. Durch diesen Gentransfer werden Hybridzellen gebildet, die Gene aus mindestens zwei Quellen enthalten. Die Hybridzellen produzieren die Antikörpermoleküle oder Teile mit Antikörperbindungsstellen aus den transferierten Genen, wenn sie in geeigneter Weise kultiviert werden, und können praktisch unbegrenzt kultiviert werden, verglichen mit den antikörperproduzierenden Zellen, aus denen die Gene transferiert wurden. Zu beispielhaften Zellen, die, verglichen mit den gentransferierenden Zellen, praktisch unbegrenzt kultiviert werden können, gehören Hybridomzellen, E. coli Zellen, Hefezellen wie S. cerevisiae, transformierte Säugerzellen wie CHO-Zellen und dergleichen.
Die so produzierten Hybridzellen werden in einem geeigneten Kulturmedium, z. B. in vivo oder in vitro während eines Zeitraums kultiviert, der dafür ausreichend ist, daß diese kultivierten Hybridzellen Antikörpermoleküle oder Moleküle, die Teile mit Antikörperbindungsstellen enthalten, produzieren, wobei diese Moleküle anschließend gewonnen werden. Beispielhafte in vivo- und in vitro-Kulturbedingungen für Hybridomzellen werden in dieser Anmeldung erörtert und sind bekannt, das gleiche gilt für Kulturbedingungen für Zellen wie E. coli, S. cerevisiae, CHO und dergleichen.
Die gewonnenen Moleküle werden anschließend durchsucht, um eine Hybridzelle zu identifizieren, die Moleküle produziert, welche die vorgegebene Carbonsäureamid- oder esterbindung des Reaktant-Liganden katalytisch hydrolysieren. Wenn eine solche Hybridzelle identifiziert worden ist, werden mehrere Klone von dieser Hybridzelle wachsen gelassen.
Das vorstehende Verfahren umfaßt die Hybridomherstellung, ein im Fachgebiet gut bekanntes Verfahren, welches in dieser Anmeldung ausführlich erörtert wird. Es ist auch im Fachgebiet bekannt, daß Gene, welche im wesentlichen nur den Teil mit Antikörperbindungsstellen eines Antikörpermoleküls codieren, aus einer Säugerzelle in eine andere transferiert werden können, und das vorstehend beschriebene Verfahren soll auch solche Verfahren einschließen. Das vorstehend beschriebene Verfahren soll auch das Verfahren von Shastry et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86 : 5728 (1989) und Huse et al., Science, 246 : 1275 (1989) umfassen, in dem Moleküle, die Teile mit Antikörperbindungsstellen enthalten, in Nichtsäugerorganismen wie E. coli durch Verwendung von Genmanipulationsmethoden produziert werden. Die in diesen Druckschriften genannten transferierten Gene waren das Ergebnis der Verwendung von mRNA aus Hybridomen oder den Milzen von immunisierten Tieren zur Herstellung von Genen, die für VH oder Fab-Antikörperteile codieren, welche in E. coli-Zellen exprimiert wurden. In einem weiteren Verfahrensaspekt dieser Erfindung wird eine katalytische Menge der monoklonalen Antikörpermoleküle oder der Moleküle, die Teile mit Antikörperbindungsstellen davon enthalten (katalytische Moleküle), die von solchen Zellen produziert wurden, mit Reaktant- Ligandenmolekülen in einem wäßrigen Medium vermischt, um ein Reaktionsgemisch zu bilden. Das so gebildete Reaktionsgemisch wird während eines Zeitraums erhalten, der dafür ausreicht, daß die Reaktant-Ligandenmoleküle an die katalytischen Moleküle binden, und daß die katalytischen Moleküle die vorgewählte Bindung katalytisch hydrolysieren. Ein Produkt der Hydrolysereaktion kann gewonnen werden, wenn dies gewünscht wird.
Dieses hydrolytische Verfahren dieser Erfindung verwendet ein wäßriges Medium als einen Teil des Reaktionsgemisches. Dieses Medium enthält typischerweise Wasser und Puffersalze. Außerdem kann das Medium weitere Salze wie Natriumchlorid sowie wasserlösliche Calcium- und Magnesiumsalze enthalten, welche häufig in proteinhaltigen Medien vorkommen. Organische Lösungsmittel wie Methanol, Ethanol, Acetonitril, Dimethylsulfoxid, Dioxan, Hexamethylphosphoramid und N,N-Dimethylformamid können ebenfalls vorhanden sein. Oberflächenaktive Mittel, welche den Reaktant-Liganden und das Rezeptormolekül emulgieren, können ebenfalls vorhanden sein. Das kritische Merkmal der in dem wäßrigen Medium vorhandenen Bestandteile ist, daß diese Bestandteile die katalytische Reaktion im wesentlichen nicht stören oder hemmen, wie etwa durch Denaturierung des katalytischen Moleküls. Außerdem ist das wäßrige Medium im wesentlichen frei von Salz, Proteinen im allgemeinen und Enzymen im besonderen, welche die durch das katalytische Molekül katalysierte bindungslösende Reaktion hemmen.
Das wäßrige Medium hat typischerweise einen pH-Wert von ca. 5 bis ca. 9 und vorzugsweise ca. pH 6,0 bis ca. 8,0. pH-Werte, die größer oder kleiner sind als die angegebenen Werte, können ebenfalls verwendet werden, sofern die katalysierte Reaktion wiederum nicht wesentlich gestört oder gehemmt wird.
Die katalytischen Reaktionen werden typischerweise bei Umgebungs- bzw. Raumtemperatur durchgeführt; d. h. bei ca. 20 bis ca. 25ºC oder bei 37ºC und bei atmosphärischem Umgebungsdruck; d. h. bei ca. einer Atmosphäre. Es können jedoch auch Temperaturen ungefähr bis herab zum Gefrierpunkt des wäßrigen Mediums und ungefähr bis herauf zum Siedepunkt des Mediums bei atmosphärischem Druck verwendet werden. Bekanntlich neigen Proteine wie die vorliegenden katalytischen Moleküle dazu, bei erhöhten Temperaturen wie etwa den Temperaturen, bei denen ein wäßriges Medium siedet, z. B. bei ca. 100ºC, zu denaturieren, und folglich sind Temperaturen unterhalb von ca. 40ºC bevorzugt.
Der Reaktant-Ligand ist in einem Reaktionsgemisch in einer Menge bis zu seiner Löslichkeit in dem wäßrigen Medium vorhanden. Ein Zwei-Phasen-System, welches einen unlöslichen Reaktant-Ligand enthält, kann ebenfalls verwendet werden, wird aber normalerweise nicht verwendet. Die normalerweise verwendeten Konzentrationen des Reaktant-Liganden betragen ca. 0,1 Mikromolar (uM) bis ca. 10 Millimolar (mM), wobei diese Menge auch eine Funktion der Löslichkeit des Reaktant-Liganden in dem wäßrigen Medium ist. Wenn das Produkt an sich gewünscht wird, werden relativ höhere Konzentrationen verwendet, verglichen mit niedrigeren Konzentrationen, wenn ein Reaktionsmechanismus oder die Reaktionskinetik untersucht werden sollen.
Eine katalytisch wirksame Menge der katalytischen Moleküle ist ebenfalls vorhanden. Somit werden die katalytischen Moleküle typischerweise in einem Molverhältnis zu dem Reaktant- Liganden von ca. 1 : 2 bis ca. 1 : 10.000 verwendet, wobei ein Molverhältnis von ca. 1 : 10 bis ca. 1 : 100 bevorzugt ist.
Das Verhältnis der katalytischen Moleküle zu dem Reaktant-Liganden hängt typischerweise von der spezifischen Aktivität der katalytischen Moleküle gegenüber dem Reaktant-Liganden und den Absichten des Anwenders beim Durchführen der Reaktion ab. Somit wird, wenn das Produkt gewünscht wird, eine relativ höhere Konzentration von katalytischen Molekülen und ein höheres Verhältnis von katalytischen Molekülen zu Reaktant-Liganden verwendet. Wenn der Reaktionsmechanismus oder die Kinetik der Reaktion untersucht werden, werden typischerweise eine niedrigere Konzentration und ein niedrigeres Verhältnis verwendet. Eine stöchiometrische Menge an katalytischen Molekülen oder weniger kann ebenfalls verwendet werden, aber da katalytische Moleküle verwendet werden, kann selbst die Verwendung einer stöchiometrischen Menge eine Verschwendung darstellen.
Die Dauer des Zeitraums, in dem die Reaktion aufrechterhalten wird, ist eine Funktion von verschiedenen Parametern, wozu die ausgewählten katalytischen Moleküle und Reaktant- Liganden, ihre Konzentrationen, der pH-Wert und die Temperatur sowie das, was durch die Reaktion bezweckt wird, gehören. Wenn kinetische Untersuchungen durchgeführt werden, handelt es sich häufig um Aufrechterhaltungszeiten von Minuten bis Stunden. Wenn die Reaktionsprodukte erwünscht sind, sind Aufrechterhaltungszeiten von Stunden bis Tagen üblicher.

IV. Ergebnisse

Die Hapten-Liganden Verbindung 1a und 2 wurden in fünf bzw. vier Schritten synthetisiert, wobei von 4-Nitrophenethylbromid ausgegangen wurde, wie nachstehend beschrieben ist. [Alle neuen Verbindungen wiesen eine zufriedenstellende spektroskopische (NMR, IR) und Verbrennungsanalyse auf (±0,3%)]. Die Hapten-Liganden Verbindung 1a und 2 wurden beide (über den N-Hydroxysuccinimidester) an die Trägerproteine Rinderserumalbumin (BSA) und Keyhole Limpet-Hämocyanin (KLH) gebunden, um immunogene Konjugate zu bilden. 129GIX&spplus;-Mäuse wurden mit dem KHL-Konjugat der Verbindung 1a und 2 immunisiert, und Antikörper wurden wie an anderem Ort in dieser Anmeldung beschrieben erzeugt und durchmustert. [(a) Kohler et al., Nature (London), 256; 495 (1975); (b) Enguall, Method Enzymol, 70 : 419 (1980)].
Die Immunisierung mit dem Hapten-Liganden Verbindung 1a ergab 23 Hybridome, wogegen die Hapten-Liganden Verbindung 2 21 Hybridome lieferte, welche eine Bindung an die entsprechenden Haptene eingingen. Alle monoklonalen Antikörper gehörten zur IgG-Klasse und wurden aus Ascitesflüssigkeit durch Ionenaustauschchromatographie, gefolgt von einer Affinitätschromatographie an einer Protein G-Säule, gereinigt. Die Antikörper wurden aufgrund einer Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese als homogen angesehen.
Die monoklonalen Antikörper wurden bei einer Konzentration von 20 uM ursprünglich gegen den Benzoatester-Reaktant-Liganden Verbindung 3, (500 uM) im Hinblick auf die Herstellung von 5-[[4-(Hydroxy)phenyl]amino]-5-oxopentansäure, Verbindung 4, durchmustert
(Phosphatpuffer 50 mM, pH 7,5,100 mM NaCl, 37ºC). [Die Analyse erfolgte über HPLC an einer RP-C18-Säule, die mit Wasser: Acetonitril (op: 10) bei einem Durchfluß von 1 ml/min eluiert wurde, wobei der UV-Detektor auf 254 nm eingestellt war. Das Hydrolyseprodukt, Verbindung 4 (Fig. 1; Retentionszeit 7 Minuten) wurde gesammelt (gewonnen) und erwies sich durch RP-HPLC-Co-Injektion und massenspektrometrische Analyse als mit einer authentischen Probe identisch.]
Von den gegen den Hapten-Liganden Verbindung 1a erhaltenen 23 monoklonalen Antikörpern erwiesen sich sieben als katalytisch. Keiner der Antikörper gegen den Hapten-Liganden Verbindung 2 wies eine Tendenz zur Beschleunigung der Hydrolysegeschwindigkeit des Reaktant-Ligandenesters, Verbindung 3, auf.
Die sieben Antikörper, die sich als katalytisch erwiesen, wurden durch die Zugabe des freien Haptens Verbindung 1b vollständig gehemmt. Solche Ergebnisse legen nahe, daß die Katalyse auf die Bindung des Substrats in der Antikörperbindungstasche oder der Antikörperbindungsstelle folgt.
Höchst signifikant war die überwältigende Anzahl von katalytischen Antikörpern, die durch den Hapten-Liganden Verbindung 1a gegenüber Verbindung 2 induziert wurden. Einer dieser sieben katalytischen Antikörper, welcher als Hybridom und monoklonaler Antikörper 30C6 bezeichnet wurde, wurde ausführlich charakterisiert.
Die anfängliche Hydrolysegeschwindigkeit des Substrats oder Reaktant-Liganden Verbindung 3 (50 mM Phosphat, 100 mM NaCl, pH 7,2, 37ºC), die durch den monoklonalen Antikörper 30C6 (20 uM) katalysiert wurde, folgte einer Michaelis-Menten Kinetik [die Konzentrationen des Hydrolyseprodukts Verbindung 4 wurden durch HPLC-Messungen seiner Peakhöhe bezogen auf die eines inneren Standards im Lauf von 1-2 Stunden bestimmt (3 oder mehr Bestimmungen).] Eine Eichkurve zeigte eine Linearität mit Konzentrationen des Hydrolyseprodukts Verbindung 4 bis zu 0,5 mM mit Werten von kappcat und km von 5 ± 0,2 · 10&supmin;³ min&supmin;¹ bzw. 1,12 ± 0,05 mM. Die Antikörper-katalysierte Hydrolyse des Benzoat-Reaktant-Liganden Ver bindung 3 wurde durch die Zugabe des Pyridiniumsalzes Verbindung 1b kompetitiv gehemmt (Kf = 83 ± 5 uM).
Die pH-Abhängigkeit der Hydrolyse des Substrats Verbindung 3 wurde in Gegenwart der monoklonalen Antikörper 30C6 (20 uM) zwischen pH 6,0 und 7,2 (Bis-tris) und 7,2-8,0 (Phosphat) jeweils bei 50 mM Puffer und 100 mM NaCl und 37ºC untersucht (Fig. 2). Die pH- Abhängigkeit von kappcat zeigt eine Beteiligung der basischen Form einer dissoziierbaren Gruppe an, deren pKa zu 6,26 ±,05 bestimmt wurde (Fig. 2A). Die Variation der Pufferionenkonzentration (12,5-50 mM) zeigte keine Abhängigkeit von kcat von der Anwesenheit einer Puffersubstanz an.
Für einen direkten Vergleich wurden auch die Hydrolysegeschwindigkeiten (kcobs) des Reaktant- Liganden Verbindung 3 über den identischen pH-Bereich auf eine Pufferkonzentration Null extrapoliert gemessen (Fig. 2B). Das Profil des pH-Werts gegen die Geschwindigkeit deutet an, daß die an der Spaltung beteiligten Spezies (Bruise et al., Bioorganic Chemistry; Benjamin. New York, 1965; Band 1) Wasser im pH-Bereich von 6,0 bis 6,5 (k&sub0; = 0,6 · 10&supmin;&sup9; min&supmin;¹) und Hydroxid von pH 6,6 und darüber sind (kOH&supmin; = 4,2 · 10&supmin;² min&supmin;¹).
Das Verhältnis von Kcat/k&sub0;, ein Vergleich der pH-unabhängigen antikörperkatalysierten Hydrolysegeschwindigkeit des Substrats Verbindung 3 mit der Hydrolyse in Wasser entspricht einer Geschwindigkeitserhöhung durch den Antikörper um mehr als das Millionenfache. Bezeichnenderweise ist das pH-Optimum der antikörperkatalysierten Reaktion durch die Beteiligung eines bislang noch nicht identifizierten Aminosäurerests, welcher vermutlich negativ geladen ist, in den neutralen pH-Bereich verschoben worden.
Die Hapten Verbindungen 5a und 6 wurden ausgehend von 4-Nitrophenethylbromid wie nachstehend erörtert synthetisiert. Das Dimethylanilinium-Antigen Verbindung 7 wurde ausgehend von 4-Aminobenzylalkohol hergestellt, wie ebenfalls nachstehend erörtert ist. Ein Konjugat der Verbindung 5a, 6 und 7 ergab 18, 22 bzw. 26 Hybridome, wobei alle diese monoklonalen Rezeptormoleküle der IgG-Klasse angehörten.
Die Antikörper wurden bei einer Konzentration von 20 uM ursprünglich mittels eines HPLC- Tests gegen den Benzoatester Verbindung 3 (500 uM) im Hinblick auf die Herstellung von 5-[(4-Hydroxyphenyl)amino]-5-oxopentansäure, Verbindung 4, durchmustert (Phosphatpuffer, 50 mM, pH 7,5, 100 mM NaCl, 37ºC). Von den 18 gegen Verbindung 5a erhaltenen monoklonalen Antikörpern erwiesen sich drei als katalytisch. Die durch die Immunisierungen mit den Hapten-Verbindungen 6 und 7 erhaltenen 22 bzw. 26 Antikörper zeigten eine vernachlässigbare oder eine hemmende Wirkung auf die spontane Hydrolysegeschwindigkeit der Verbindung 3. Die drei Antikörper, die sich als katalytisch erwiesen, wurden durch die Anwesenheit von 50 uM des Carboxylats Verbindung 5b vollständig gehemmt.
Die Kinetik des wirksamsten katalytischen Antikörpers, d. h. des monoklonalen Rezeptors, der von Hybridom 27A6 ausgeschieden wurde, das durch Immunisierungen mit dem Hapten Verbindung 5a erhalten wurde, wurde ausführlich charakterisiert. Dieser monoklonale Rezeptor wird auch als Rezeptor oder Antikörper 27A6 bezeichnet. Die Anfangsgeschwindigkeit der Hydrolyse von Verbindung 3 [50 mM 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinpropansulfonsäure (EPPS), 100 mM NaCl, pH 8,5, 37ºC], die durch Rezeptor 27A6 katalysiert wurde, verlief gemäß einer Michaelis-Menten-Kinetik mit Werten von kappcat und Km von 0,01 ± 0,002 min&supmin;¹ bzw. (243 ± 15) · 10&supmin;&sup6;M. Die antikörperkatalysierte Hydrolyse des Benzoats Verbindung 3 wurde durch die Zugabe des Carboxylats Verbindung 5b kompetitiv gehemmt (K&sub1; = 6 ± 2 uM). Die pH-Abhängigkeit der Hydrolyse der Verbindung 3 wurde in Gegenwart des monoklonalen Rezeptors 27A6 (20 uM) zwischen pH 7,2 und 8,4 (EPPS) und bei den pH-Werten 8,4 und 10,0 [2-(Cyclohexylamino)ethansulfonsäure (CHES)], beide mit 50 mM Puffer und 100 uM NaCl, bei 37ºC untersucht (Fig. 3). Die pH-Abhängigkeit von log kappcat (Fig. 3A) war in diesem Bereich linear, wie auch die Hintergrundhydrolysegeschwindigkeit (logKobsd; Fig. 3B, ausgefüllte Dreiecke), und die Hydrolysegeschwindigkeit für Verbindung 3, die auf eine Pufferkonzentration von Null extrapoliert wurde (KOH- = 2,3 · 10&supmin;² min&supmin;¹) (Fig. 3B, ausgefüllte Quadrate). Die Variation der Pufferkonzentration (12,5-50 mM) in Anwesenheit des monoklonalen Rezeptors 27A6 zeigte keine Abhängigkeit von kappcat von der Konzentration der Puffersubstanz an. Es gab keinen Unterschied der beobachteten Geschwindigkeiten mit dem monoklonalen Rezeptor 27A6, wenn bei pH 8,6 in EPPS und CHES getestet wurde (50 mM Puffer, 100 mM NaCl).
Die esterolytische Aktivität des monoklonalen Rezeptors 27A6 wurde durch eine Behandlung mit Diethylpyrocarbonat oder Maleinsäureanhydrid in einem 50-fachen molaren Überschuß gegenüber dem Protein nicht beeinträchtigt. Eine ähnliche Behandlung mit Phenylglyoxal führte zu einer 75%igen Abnahme der katalytischen Aktivität. Die gleiche Antikörperzubereitung wies auch einen vierfachen Abfall des Titers (Bindung an das Hapten Verbindung 5b) auf, der mittels ELISA beobachtet wurde. Eine identische Behandlung des Proteins in Gegenwart des Inhibitors Verbindung 5b (fünffacher molarer Überschuß gegenüber dem Protein) führte nur zu einer 35%igen Abnahme der katalytischen Aktivität und zu keiner merklichen Änderung des Titers.
Aufgrund dieser Befunde wurden andere katalytische und nichtkatalytische Antikörper gegen die Hapten-Verbindungen 5a, 6 und 7 mit Phenylglyoxal auf die genau gleiche Weise wie vorstehend beschrieben chemisch modifiziert. Antikörper gegen die Verbindungen 6 (2G4, 4E3, 6H4, 6A11) und 7 (52D11, 57G12, 70F3, 5G3, 60A4) waren nicht betroffen (ELISA). Im Gegensatz dazu wiesen fünf Antikörper, die unter Verwendung der Verbindung 5a induziert wurden (57G11, 60A4, 52D11 und 5G3) alle eine gewisse Abnahme der Bindung auf (ELISA). Die katalytischen Antikörper 57G11 und 70F3 wiesen eine vierfache Abnahme des Titers auf und die Antikörper 60A4, 52D11 und 5G3 wiesen eine dreifache-, zweifache bzw. einfache Abnahme des Titers auf.
Die vorstehend erörterte Strategie, die auf der Verwendung von Antikörpern beruht, welche von einer homologen Reihe von Haptenen induziert wurden (Fig. 1), von denen jedes eine Punktladung besaß, welche der umzuwandelnden chemischen Gruppe (Ester oder Amid) in dem jeweiligen Substrat (Fig. 1) eng benachbart ist oder diese direkt ersetzt, hat sich als wirksam erwiesen. Es wurde angenommen, daß Antikörper, die gegen diese Haptene gerichtet sind, einen oder mehrere Aminosäurereste an der Antikörperbindungsstelle besitzen sollten, welche eine zu dieser Ladung des Haptens komplementäre Ladung aufweisen. Der Substratester Verbindung 3 besitzt keine solche Ladung, behält aber eine ähnliche Gesamtstruktur bei. Folglich sind bei der Bindung der Verbindung 3 der Aminosäurerest bzw. die Aminosäurereste an der Bindungsstelle von ihrer ursprünglichen Ladungsstabilisierungsrolle befreit und können nun als mögliche allgemeine Säure/Base oder als den Übergangszustand stabilisierendes Element dienen.
Obwohl das Vorliegen komplementärer Ladungen in Antikörper und Hapten als wesentlich für den Gesamterfolg des Projekts angesehen wurde, hielt man zwei weitere Bereiche der Haptenkonstruktion für wichtig. Der erste war die Ersetzung der zu hydrolysierenden Acylfunktionalität, wogegen der zweite die Verwendung von ungeladenen Haptenen erforderte.
Dem ersten Punkt wurde Rechnung getragen durch Verwendung eines geeigneten Acylbestandteil-Isosters. Es wurde eine Hydroxylgruppe mit einer tetraedrischen Geometrie eingesetzt, die als angemessene Darstellung des sich entwickelnden Übergangszustands diente. Diese Position wurde absichtlich ungeladen gelassen, so daß sich keine zusätzlichen elektrostatischen Wirkungen ergeben. Es ist jedoch vorhersehbar, daß "Haptene der 2. Generation" eine geladene Phosphorgruppe in dieser Position umfassen können, wie im U.S. Patent Nr. 4,629,567 und der veröffentlichten europäischen Anmeldung Nr. 0 260 439A2 offenbart ist. Die ungeladenen Haptene [d. h. die Verbindung 2 und 6 (Fig. 1)] wurden als Kontrolle benötigt, um die Stichhaltigkeit der Hypothese zu bestätigen, da sie praktisch mit den Verbindungen 1 und 5 strukturell identisch sind, aber keine Ladung aufweisen.
Die vorstehenden Ergebnisse haben gezeigt, daß die "Köder und Austausch"-Strategie zur Katalyse von Acyltransfer-Reaktionen brauchbar ist, wenn das N-Methylpyridiniumsalz Verbindung 1a zur Induktion von Antikörpern eingesetzt wurde. Mit diesem Hapten waren 30% der erhaltenen monoklonalen Antikörper katalytisch. Obwohl diese Zahl beeindruckend ist, war der Befund, daß einer dieser Rezeptoren die Beteiligung einer basischen Form einer ionisierbaren Gruppe (pKa = 6,26 ± 0,05) in dem katalytischen Verfahren einsetzte, noch interessanter. Außerdem war das pH-Optimum der antikörperkatalysierten Reaktion nahe bei neutralen Werten und die Verwendung des neutralen Haptens Verbindung 2 wies keine Neigung zur Induktion von katalytischen Antikörpern auf.
Das Hapten Verbindung 7 wurde wie nachstehend erörtert hergestellt. Das hervorstechendste Merkmal dieses Moleküls ist die tetraedrische kationische Ladung, welche den Acylkohlenstoff des Substrats direkt ersetzt. Obwohl dieses Hapten als noch radikalere Abweichung von den typischen Phosphonathaptensurrogaten des Standes der Technik angesehen werden könnte, sollte es sich einer Reihe von zuvor unbeantworteten Fragen zuwenden, welche die "Köder und Austausch"-Strategie betreffen. Zwei dieser Fragen sind die Bedeutung der kationischen Ladung, wozu auch ihre Anordnung bezogen auf die spaltbare Bindung des Substrats gehört, und die Bedeutung der vorliegenden Acylkohlenstoffersetzung durch das Hydroxy-isoster. Von den 26 Antikörpern, die gegen das Hapten Verbindung 7 gerichtet waren, beschleunigte keiner die Hydrolyserate in einem nennenswerten Ausmaß über die Hintergrundgeschwindigkeit. Dieses Ergebnis war ziemlich interessant im Hinblick auf die Tatsache, daß ein ähnliches Antigen, das von der Forschungsgruppe von Schultz entworfen wurde, einen starken Hang (66%) zur Induktion von katalytischen Antikörpern für eine Eliminierungsreaktion aufwies [Shokat et al., Nature (London), 338 : 269 (1989)]. Obwohl sich die Reaktionen hier davon ziemlich unterscheiden, fand die Gruppe von Schultz zwingende Beweise dafür, daß ein Carboxylat an dem katalytischen Verfahren beteiligt war, wie es bei Verwendung des Methylpyridiniumhaptens Verbindung 1 zum Induzieren von Antikörpern für die esterolytische Reaktion gefunden wurde. Diese Ergebnisse legen zusammen mit den Befunden für die gegen die Hapten-Verbindungen 1a und 2 erhaltenen Antikörper folgendes nahe: (1) Die Geschwindigkeitserhöhungen, die sich mit monoklonalen Rezeptoren ergeben, die von dem Hapten Verbindung 1a induziert sind, beruhen nicht allein auf dem Vorhandensein eines Carboxylats, das als katalytische Base wirkt. (2) Die Funktionalität in dem Hapten, welche zur Darstellung des Übergangszustands verwendet wird, hat kritische Bedeutung. (3) Die Kombination einer kationischen Ladung und mindestens einer neutralen Darstellung des Übergangszustands sind erforderlich, um hydrolytische Rezeptormoleküle zu induzieren.
Es wurde ein Gesamtverfahren, das dem Verfahren ähnelt, das man erhält, wenn man das kationische Hapten Verbindung 1a verwendet, geplant, wobei ein strukturell ähnliches anionisches Hapten verwendet wurde. Das Benzoesäurehapten Verbindung 5a erfüllte die notwendigen Anforderungen. Das Grundgerüst der Verbindung 5a war homolog zu den Haptenverbindungen 1a und 2, besaß aber eine anionische Punktladung in enger Nachbarschaft zu dem Acylbestandteil, den wir hydrolysieren wollten. Die Auswahl einer Carboxylatgruppe beruhte auf Befunden von Pressmann, welche darauf hindeuteten, das diese Art von Funktionalität in einem Haptenmolekül einen starken Hang zur Induktion einer positiv geladenen Aminosäure (d. h. Lysin oder Arginin) in der Antikörperbindungstasche aufweist [(a) Pressmann et al., J.
Am. Chem. Soc., 68 : 250 (1946); (b) Pressmann et al., J. Am. Chem. Soc., 75 : 686 (1953); (c) Grossberg et al., J. Am. Chem. Soc., 82 : 5470 (1960)]. Es bestand der Eindruck, daß jede Aminosäurerest-Seitenkette das katalytische Verfahren über eine allgemeine saure oder elektrostatische Stabilisierung eines Übergangszustands unterstützen konnte. Das zuletzt genannte Verfahren unter Beteiligung von Argininresten ist bei der Enzymkatalyse eingesetzt worden [(a) Riordan et al., Science. (Washington D.C.) 195 : 884 (1977); (b) Cotton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 76 : 2551 (1979); (c) Springs et al., Tet. Lett., 32 : 3223 (1977)].
Die Hydroxyethylbenzoesäureverbindung 5b wurde synthetisiert. Die Verbindung wurde mit dem N-Hydroxysuccinimidester als Verbindung 5a versehen, um leicht an den Proteinträger zu kuppeln. Immunisierungen gegen das Verbindung 5a-KLH-Konjugat ergaben achtzehn monoklonale Antikörper, von den drei katalytisch waren, und deren Katalyse durch das freie Hapten Verbindung 5b gehemmt wurde. Obwohl die Anzahl der katalytischen Rezeptoren, die durch Verbindung 5a induziert wurden, nicht so groß war wie mit der Verbindung 1a, war es wohltuend festzustellen, daß keiner der zweiundzwanzig monoklonalen Antikörper, die durch das neutrale Homolog (Verbindung 6) der Verbindungen 1a und 5a induziert wurde, katalytisch war. Hier zeigt sich wiederum die Bedeutung der in der Antigenkonstruktion enthaltenen geladenen Funktionalität.
Beobachtungen des pH-Geschwindigkeits-Profils des monoklonalen Rezeptors 30C6 (induziert von Verbindung 1a) deuteten darauf hin, daß die basische Form einer dissoziierbaren Gruppe an der Katalyse beteiligt war. Es wurde auch die Unabhängigkeit von kappcat von der Konzentration der Puffersubstanz festgestellt, die bei dem monoklonalen Rezeptor 27A6 gefunden wurde, welcher durch Verbindung 5a induziert wurde (Fig. 1). Im Gegensatz zu dem Verhalten des Rezeptors 30C6 stand die Entdeckung einer pH-Abhängigkeit von kappcat bei dem Rezeptor 27A6 (Fig. 3a). Obwohl dieser Befund zum wesentlichen Inhalt der "Köder und Austausch"-Theorie in Widerspruch zu stehen scheint, wird angenommen, daß der pKa der Aminosäurerestseitenkette(n) an der Bindungsstelle möglicherweise außerhalb des untersuchten pH-Bereichs liegt, oder daß elektrostatische Protein-Substrat-Wechselwirkungen (elektrostatische Katalyse) das wesentliche Merkmal der Fähigkeit dieses Rezeptors ist, die Reaktion zu beschleunigen [Fersht, Enzyme Structure and Mechanism, Freeman, Hrsg., New York (1985)].
Obwohl keine Beteiligung einer Aminosäure an der hydrolytischen Reaktion des Rezeptors 27A6 über pH-Effekte nachgewiesen werden konnte, wurde eine spezifische Inaktivierung aller drei katalytischen Antikörper (27A6, 57G12, 70F3) durch die Verwendung des argininmodifizierenden Reagenzes Phenylglyoxal beobachtet [Takahashi, J. Biol. Chem., 243 : 6171 (1968)]. Der Rückgang der Aktivität (katalytische Aktivität/Bindungsaktivität) kann auf die Re aktion des Reagenzes mit einer Aminosäurerestseitenkette an der Bindungsstelle zurückgeführt werden; er kann durch das Vorhandensein des Haptens Verbindung 5b signifikant verringert werden.
Eine Konformationsänderung im Anschluß an die Reaktion des Reagenzes an einer anderen Stelle würde jedoch zu einer ähnlichen Schlußfolgerung führen. Somit ist es möglich, daß ein Argininrest irgendwo anders als an der Bindungsstelle chemisch verändert wird, was zur Stabilisierung von Konformationen des Proteins führt, bei denen die Bindungsstelle so verändert ist, daß sie das Substrat Verbindung 3 oder das Hapten Verbindung 5b nicht mehr bindet. Diese Komplikation scheint hier nicht aufzutreten.
Katalytische Tests und ELISA-Tests und vorangegangene Bindungsstudien, die von Freedman et al. Immunochem., 9 : 169 (1972) und Mayers et al., Immunochem., 9 : 169 (1972) angegeben wurden, zeigen, daß die Glyoxalierung von Guanidiniumgruppen die katalytische Aktivität und/oder Bindungsaktivität nur von Antikörpern gegen negativ geladene Haptene und nicht von Antikörpern gegen das neutrale Hapten Verbindung 6 oder das positiv geladene Hapten Verbindung 7 zerstört. Wenn die Glyoxalierung eine Wirkung durch Veränderung eines von der Bindungsstelle entfernten Guanidiniums durch den obengenannten Mechanismus ausüben würde, ist schwer einzusehen, weshalb Antikörper gegen die Haptene Verbindung 6 oder 7 nicht in ähnlicher Weise betroffen wären. Es wird somit angenommen, daß sich ein Arginin, dessen Guanidiniumseitengruppe einen pKa-Wert über dem hier untersuchten Bereich besitzt, an der Bindungsstelle befindet und an der beobachteten Katalyse beteiligt ist. Eine Gesamtheit aus mehreren Ladungen, welche eine Reihe von katalytischen Gruppen ergeben können, ist absehbar, wodurch sich eine additive Geschwindigkeitswirkung ergibt. Diese Wirkung verbessert in Kombination mit der Verfügbarkeit einer viel größeren Auswahl von möglichen katalytischen Antikörpern [Shastry et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86 : 5728 (1989)] die Wahrscheinlichkeit der Entwicklung überlegener Katalysatoren.

V. Herstellung des Liganden

Sofern nicht anders angegeben, wurden die Reaktionen in flammengetrockneten Glasgeräten unter einer Stickstoffatmosphäre durchgeführt. Die Überführung von Reagenzien und Lösungsmitteln erfolgten mit im Ofen getrockneten Spritzen und Nadeln. Dichlormethan und Acetonitril wurden kontinuierlich über Calciumhydrid destilliert. Tetrahydrofuran (THF) wurde über Natriummetall/Benzophenonketyl destilliert. Alle Reagenzien wurden von Aldrich Chemical Company bezogen. Alle Chromatographielösungsmittel wurden käuflich erworben und so verwendet, wie sie erhalten wurden. Die Reaktionen wurden mittels analytischen Dünnschichtchromatographieverfahren (DSC) unter Verwendung von E. Merck Silicagel 60F-Glasplatten (0,25 mm) verfolgt. Die Blitzchromatographie erfolgte unter Verwendung von E. Merck Silicagel 60 (230-400 mesh) wie von Still et al., J. Org. Chem., 43 : 2923 (1978) beschrieben.
Die Schmelzpunkte wurden an einem Fisher-Johns-Schmelzpunktgerät bestimmt und sind nicht korrigiert. Alle Protonen-NMR-Spektren (300 MHz) wurden in CDCl&sub3;, CD&sub3;CN oder DMSO-Lösungen bei Umgebungstemperatur an einem Bruker AM-300 Spektrometer erhalten, chemische Verschiebungen (α) sind in Teilen pro Million bezogen auf den inneren Standard Tetramethylsilan (0,00 ppm) angegeben. Die Elementaranalysen (C, H, N) wurden von Galbraith Laboratories, Knoxville, TN, durchgeführt.

Beispiel 1: p-Nitrophenylacetaldehyd

p-Nitrophenylacetaldehyd wurde durch das von Lethbridge et al., J. Chem. Soc. Perkin I, 35 (1973) beschriebene Verfahren aus p-Nitrophenylethylen hergestellt. Das
p-Nitrophenylethylen wurde durch das von Strassburg et al., J. Am. Chem. Soc. 69 : 2142 (1947) beschriebene Verfahren aus 1-Brom-2-(p-nitrophenyl)ethan (im Handel erhältlich von Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI) hergestellt.

Beispiel 2: Verbindung I

n-Butyl-lithium (3,33 · 10&supmin;² Mol) wurde zu Tetrahydrofuran (THF; 100 ml) zugegeben, das in einem Ether/Stickstoff-Bad bei -100ºC gehalten wurde. 2-Brompyridin (3,64 · 10&supmin;² Mol) wurde zu diesem Gemisch binnen 15 Minuten unter Rühren zugegeben. Die Temperatur des Reaktionsgemisches wurde durch Überführen des Reaktionsgefäßes in ein Aceton/CO&sub2;-Bad auf -78ºC angehoben und das Gemisch wurde eine Stunde lang gerührt.
p-Nitrophenylacetaldehyd (5 Gramm, 3,03 · 10&supmin;² Mol), der in Beispiel 1 erhalten wurde, wurde, gelöst in THF (30 ml), langsam zu dem Reaktionsgemisch zugegeben und das Gemisch wurde 3 Std. lang bei -78ºC gerührt.
Im Anschluß an das Rühren wurde das Gemisch in eine gesättigte Lösung von Ammoniumchlorid (500 ml) und Diethylether gegossen. Das Gemisch wurde zweimal mit Diethylether extrahiert, die kombinierten Etherschichten wurden über Natriumsulfat getrocknet und in 15% CH&sub3;CN in CH&sub2;Cl&sub2; über eine Säule laufen gelassen. Das Produkt, Verbindung I (1-Hydroxy-1- (2-pyridinyl)-2-(p-nitrophenyl)ethan) wurde gesammelt, wobei 648 mg (2,7 · 10&supmin;³ Mol, 9% Ausbeute) erhalten wurden.
¹H-NMR δ 8,55 (d, 1H); 8,10 (d, 2H); 7,65 (m, 1H); 7,3 (d, 2H); 7,2 (m, 2H); 5,05 (dd, 1H); 3,20 (m, 2H). Verbindung I

Beispiel 3: Verbindung II

Trockenes Methanol (12 ml) wurde in ein trockenes 25 ml-Reaktionsgefäß gegeben, das mit Stickstoff gespült worden war.
Die in Beispiel 2 erhaltene Verbindung I (100 mg) wurde in dem Methanol gelöst, wobei eine orangefarbige Lösung entstand. Die Lösung wurde mit Stickstoff gespült und 10% Palladium auf Kohlenstoff (Pd/C, 75 mg) wurde zu der Lösung zugegeben. Die Seiten des Reaktionsgefäßes wurden mit einer kleinen Menge Methanol gewaschen und die Lösung wurde mit Stickstoff gespült und anschließend mit Wasserstoff gespült. Das Reaktionsgemisch wurde ungefähr 1 Stunde fang gerührt und anschließend durch ein Celite-Bett filtriert. Der Filter wurde viermal mit Dichlormethan (CH&sub2;Cl&sub2;) gewaschen und anschließend dreimal mit Methanol gewaschen, bis kein Material, das in der Dünnschichtchromatographie (DSC) einen Fleck ergab, von dem Filter erhalten wurde. Die Filtratwaschlösungen wurden mit Natriumsulfat getrocknet und zur Trockne eingedampft, wobei 85,6 mg (Ausbeute 97,6%) eines gelben kristallinen Feststoffs, Verbindung II (1-Hydroxy-1-(2-pyridinyl)-2-(p-aminophenyl)ethan erhalten wurden. Verbindung (II)

Beispiel 4: Verbindung 2

Die Verbindung II (155 mg, 7,24 · 10&supmin;&sup4; Mol) aus Beispiel 3 wurde mit trockenem CH&sub2;Cl&sub2; (1,5 ml) und Triethylamin [(Et&sub3;N) (1,45 · 10&supmin;³ Mol)] vermischt. Dazu wurde N-Hydroxysuccinimidoylglutaroylchlorid (359 mg, 1,45 · 10&supmin;³ Mol) gegeben und das sich dabei ergebende Reaktionsgemisch wurde ungefähr 40 Minuten lang bei 25ºC gerührt. Das Reaktionsprodukt wurde in einem Rotationsverdampfer zur Trockne eingedampft, wobei 61,5 mg (Ausbeute 20%) 5-[(2,5- Dioxo)-1-pyrrolidinyl)oxy]-N-[4-[2-hydroxy-2-(2-pyridinyl)ethyl]phenyl]-5-oxo-pentanamid, (Verbindung 2) erhalten wurde.
¹H-NMR (DMSO-d&sub6;) δ 9,82 (s, 1H); 8,48 (d, 1H, J = 4,3 Hz); 7,75 (dd, 1H, J = 2 · 7,6 Hz); 7,42 (d, 2H, J = 7,9 Hz); 7,22 (m, 2H); 7,05 (d, 2H, J = 7,9 Hz); 5,38 (d, 1H, J = 5,1 Hz); 4,76 (dd, 1H, J = 4,0; 3,5 Hz); 3,05 (dd, 2H, J = 13,7; 4,0 Hz); 2,80 (s, 4H); 2,76 (t, 2H, J = 8,2 Hz); 2,42 (t, 2H, J = 8,2 Hz) 1,90 (m, 2H).
Analyse: berechnet für C&sub2;&sub2;H&sub2;&sub3;N&sub3;O&sub6;: C, 62,12; H, 5,41; N, 9,88.
Gefunden: C, 62,19; H, 5,37; N, 9,92%. Verbindung 2

Beispiel 5: Verbindung 1a

Die Verbindung 2 (30 mg, 7,06 · 10&supmin;&sup5; Mol) aus Beispiel 4 wurde mit Methyliodid (7,06 · 10&supmin;&sup4; Mol) in Aceton (0,5 ml) vermischt und ungefähr 17 Stunden lang refluxiert. Das Reaktionsgemisch wurde dreimal mit Chloroform gewaschen und anschließend dreimal mit heißem Ethylacetat gewaschen, wobei 20 mg (Ausbeute 50%) des Hapten-Liganden 2-[2-[5-[(2,5- dioxo-1-pyrrolidinyl)oxy]-1,5-dioxopentyl]-4-aminophenyl]-1-hydroxyethyl]-1-methylpyridiniumiodid, (Verbindung 1a) erhalten wurde.
¹H-NMR (DMSO-d&sub6;) δ 9,86 (s, 1H); 8,92 (d, 1H, J = 6,1 Hz); 8,55 (d, 1H, J = 8,0 Hz); 8,08 (t, 1H, J = 6,8 Hz); 8,00 (t, 1H, J = 7,9 Hz); 7,48 (d, 2H, J = 7,9 Hz); 7,12 (d, 2H, J = 7,9 Hz); 6,30 (d, 1H, J = 5,1 Hz); 5,34 (dd, 1H, J = 4,0; 3,5 Hz); 4,35 (s, 3H); 3,02 (dd, 2H, J = 13,6; 4,0 Hz); 2,80 (s, 4H); 2,72 (t, 2H, J = 8,2 Hz); 2,45 (t, 2H, J = 8,2 Hz); 1,90 (m, 2H).
Analyse: berechnet für C&sub2;&sub3;H&sub2;&sub6;N&sub3;O&sub6;I: C, 48,67; H, 4,59; N, 7,41.
Gefunden: C, 48,11; H, 4,51; N, 7,37%. Verbindung 1a

Beispiel 6 : 2-[(4-Nitrophenyl)methyl]-1,3-dioxolan

(Verbindung III)

p-Nitrophenylacetaldehyd (500 mg, 3,0 · 10&supmin;³ Mol) wurde in CH&sub2;Cl (ungefähr 1,5 ml) gelöst. CaSO&sub4; (383 mg) wurde zu dem Gemisch zugegeben, gefolgt von Rexyn 101-Harz (Protonform, Fisher Scientific; 128 mg) und Ethylenglycol (13,8 · 10&supmin;³ Mol). Das Gemisch wurde ungefähr 4 Stunden lang unter Stickstoff gerührt. Vor der Verwendung wurden das Rexyn 101 und das CaSO&sub4; 20 Stunden lang bei ungefähr 120ºC in einem Trockenofen stehengelassen und anschließend in einem Exsikkator abgekühlt.
Eine Probe wurde entnommen und auf eine DSC in reinem CH&sub2;Cl&sub2; aufgetragen. Zusätzliches Rexyn 101 und CaSO&sub4; wurden zugegeben und das Gemisch wurde über Nacht (ungefähr 16 bis 18 Stunden lang) gerührt. Zu dem gerührten Gemisch wurde CH&sub2;Cl&sub2; (10 ml) zugegeben. Eine Probe wurde auf TLC aufgetragen und ergab kein fleckenbildendes Material.
Wasser (10 ml) wurde zugegeben, das Gemisch wurde gerührt und die organische Schicht wurde abgetrennt, mit Natriumsulfat getrocknet und durch Blitzchromatographie unter Verwendung von Hexan : Ethylacetat (2 : 1) gereinigt, wobei 435,8 mg (Ausbeute 70%) der Verbindung III erhalten wurde.
¹H-NMR: δ 8,10 (d, 2H); 7,4 (d, 2H); 5,10 (t, 1H); 3,8 (s, 4H); 3,0 (d, 2H).
Bei einer zweiten Zubereitung wurde Ethylenglycol (5,4 ml, 97 mmol) zu einer gerührten Lösung von p-Nitrophenylacetaldehyd (3,0 g, 18,2 mmol) in 10,0 ml Methylenchlorid zugegeben. Dazu wurden 1,0 g Kationenaustauscherharz Rexyn 101(H) (Fisher Scientific) und 3,0 g pulverisiertes Calciumsulfat zugegeben, welches über Nacht im Ofen getrocknet worden war (120ºC). Das Gemisch wurde 24 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt und das Reaktionsgemisch wurde anschließend in 100 ml H&sub2;O gegossen und dreimal mit 50 ml Portionen Methylenchlorid extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit Natriumsulfat getrocknet und durch Blitzchromatographie mit 2 : 1 Hexane : Ethylacetat gereinigt, wobei 2,28 g, 60% der theoretischen Menge, erhalten wurden.
¹H-NMR (CDCl&sub3;) δ 8,18 (d, J = 8,6 Hz, 2H); 7,42 (d, J = 8,6 Hz, 2H); 5,08 (t, J = 4,3 Hz, 1H); 3,8- 4,0 (m, 4H); 3,06 (d, J = 4,3 Hz, 2H).
Analyse: berechnet für C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub1;NO&sub4;: C, 57,42; H, 5,26; N, 6,70.
Gefunden: C, 57,51; H, 5,19; N, 6,65.

Beispiel 7: 4-(1,3-Dioxolan-2-ylmethyl)-benzolamin

(Verbindung IV)

Die Verbindung III (231 mg) aus Beispiel 6 wurde in Methanol (ungefähr 3 ml) gelöst und das Gemisch mit Stickstoff gespült. Zu dem Gemisch wurde Pd/C (120 mg) zugegeben und die Seiten des Reaktionsgefäßes wurden mit Methanol (ungefähr 2 ml) gewaschen. Das Gemisch wurde mit Stickstoff gespült und anschließend mit Wasserstoff gespült. Das Reaktionsgemisch wurde 45 Minuten lang gerührt und anschließend durch Celite filtriert. Das Celite wurde mehrere Male mit Methanol gewaschen und das Filtrat und die Waschlösungen wurden in einem Rotationsverdampfer abgedampft, wobei 184,4 mg (Ausbeute 90,6%) der Verbindung IV erhalten wurden.
In einer weiteren Zubereitung wurde die Verbindung III (2,0 g, 9,6 mmol) zu 20 ml Methanol zugegeben. Zu dieser Suspension wurden 10% Palladium auf Aktivkohle (200 mg) zugege ben, und der Kolben wurde an einen Ballon mit Wasserstoff angeschlossen und bei Raumtemperatur 6 Stunden lang schnell gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde durch Celite filtriert und konzentriert, wobei 1,63 g, 95% der theoretischen Menge, erhalten wurde. Dieses Material wurde ohne weitere Reinigung bei der Wiederholung des folgenden Beispiels verwendet. DSC Rf=0,3, 1 : 1 Ethylacetat : Hexane.

Beispiel 8: N-[4-(1,3-Dioxolan-2-ylmethyl)phenyl-N-(phenylmethyl)-benzolmethanamin

(Verbindung V)

Die Verbindung IV (1,91 g, 1,07 · 10&supmin;² Mol) aus Beispiel 7 wurde mit CH&sub2;Cl&sub2; (10 ml) und Et&sub3;N (4,45 ml, 3,2 · 10&supmin;² Mol) vermischt und gerührt. Benzylbromid (1,07 · 10&supmin;¹ Mol) wurde tropfenweise zu dem gerührten Gemisch zugegeben, nachdem ungefähr die Hälfte der Verbindung IV in der Lösung gelöst war. Daraufhin löste sich das gesamte Amin. Die Reaktion wurde nach ungefähr einer Stunde angehalten. Die Lösung wurde über eine Säufe in CH&sub2;Cl&sub2; : HCl (9 : 1) laufengelassen und 3,048 mg (79% Ausbeute) des gewünschten Produkts wurde gesammelt.
(Verbindung V):
¹H-NMR: δ 7,25 (s, 10H); 7,05 (d, 2H); 6,85 (d, 2H); 5,00 (t, 1H); 4,60 (s, 4H); 3,9 (m, 4H); 2,8 (d, 2H).
Bei der Wiederholung der vorstehenden Synthese wurde zu einer gerührten Suspension der Verbindung IV (2 g, 11,2 mmol) in 10 ml Methylenchlorid Triethylamin (4,5 ml, 32 mmol) zugegeben. Die Zugabe von Benzylbromid (6,4 ml, 107 mmol) erfolgte tropfenweise während 30 Minuten mit schnellem Rühren, wobei das sich dabei ergebende Gemisch zusätzliche 60 Minuten lang gerührt wurde. Das Reaktionsgemisch wurde mit Methylenchlorid (50 ml) verdünnt und mit (2 · 25 ml) 0,5 M HCl extrahiert. Die kombinierten organischen Extrakte wurden mit Natriumsulfat getrocknet und durch Blitzchromatographie in 4 : 1 Methylenchlorid : Hexane gereinigt, wobei 3,2 g, 80% der theoretischen Menge, erhalten wurde.
¹H-NMR (CDCl&sub3;): δ 7,35-7,23 (m, 10H); 7,06 (d, J = 8,6 Hz, 2H); 6,66 (d, J = 8,6 Hz, 2H); 5,50 (5, J = 4,3 Hz, 1H); 4,62 (s, 4H); 3,8-4,00 (m, 4H); 2,82 (d, J = 4,3 Hz, 2H).
Analyse: berechnet für C&sub2;&sub4;H&sub2;&sub5;NO&sub2;: C, 80,22 H, 6,96; N, 3,90.
Gefunden: C, 80,35; H, 7,11; N, 3,86.

Beispiel 9 : 4-[Bis(phenylmethyl)amino-benzolacetaldehyd

(Verbindung VI)

Die Verbindung V (2 g, 5,6 · 10&supmin;³ Mol) aus Beispiel 8 wurde in Aceton (6 ml) gelöst und unter Stickstoff gerührt. 4M HCl (6 ml) wurde zu dem Gemisch zugegeben und das Rühren wurde fortgesetzt, bis das Reaktionsgemisch leicht gelb war. Das Reaktionsgemisch wurde in einen Scheidetrichter überführt, der CH&sub2;Cl&sub2; enthielt und mit wäßrigem NaCl gewaschen. Die organische Schicht wurde mit Natriumsulfat getrocknet und über Nacht (16 bis 18 Stunden) unter Vakuum aufbewahrt.
Eine Probe wurde auf DSC laufengelassen und die Anfärbung mit Ninhydrin ergab 5 Flecken in CH&sub2;Cl&sub2; : Hexan (4 : 1). Das Reaktionsprodukt wurde auf eine vorabsorbierte Siliciumdioxidsäule (50 mm) aufgegeben und 500 mg (29% Ausbeute) des dem gewünschten Produkt (Verbindung VI) entsprechenden Flecks wurde gesammelt.
¹H-NMR: δ 9,5 (t, 1H); 7,1 (s, 10H); 6,8 (d, 2H); 4,5 (s, 4H); 3, 4 (d, 2H).
In einer weiteren Zubereitung wurden zu einer Lösung von 2,0 g (5,6 mmol) der Verbindung V in 15 ml Aceton 2 ml 4M HCl zugegeben. Diese Lösung wurde 24 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Siliciumdioxid (10 g) wurde zu dem Reaktionsgemisch zugegeben und das Gemisch wurde zur Trockne konzentriert. Eine Blitzchromatographie wurde in 4 : 1 Methylenchlorid : Hexane mit dem vorabsorbierten rohen Reaktionsprodukt durchgeführt, wobei 0,7 g, 40% der theoretischen Menge, erhalten wurde. ¹H-NMR (CDCl&sub3;): δ 9,7 (t, J = 2,9 Hz, 1H); 7,40-7,20 (m, 10H); 7,00 (d, J = 8,6 Hz, 2H); 6, 7 (d, J = 8,6 Hz, 2H); 4,66 (s, 4H); 3,54 (d, J = 2,9 Hz, 2H).
Analyse: berechnet für C&sub2;&sub2;H&sub2;&sub1;NO: C, 83,81; H, 6,67; N, 4,44.
Gefunden: C, 84,06; H, 6,58; N, 4,50.

Beispiel 10 : 2-[2-(4-Aminophenyl-1-hydroxyethyl]-benzoesäure

(Verbindung VII)

2-Brombenzoesäure (88 mg, 4,33 · 10&supmin;&sup4; Mol) wurde in THF (2 ml) gelöst und auf -78ºC abgekühlt. n-Butyllithium (n-BuLi) (8,38 · 10&supmin;&sup4; Mol) wurde zugegeben und das Gemisch 2 Stunden lang gerührt.
Die Verbindung VI (91 mg, 2,89 · 10&supmin;&sup4; Mol), die in Beispiel 9 erhalten wurde, wurde, gelöst in THF (1 ml) zu dem Gemisch zugegeben und das Gemisch wurde 4 Stunden lang bei -78ºC gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde in Ethylacetat verdünnt und zweimal mit gesättigtem NH&sub4;Cl gewaschen, gefolgt von einem Waschen mit 1 M HCl. Die organische Fraktion wurde abgetrennt, mit Natriumsulfat getrocknet und über Nacht (ungefähr 16 bis 18 Stunden lang) an einem Rotationsverdampfer eingedampft.
Die DSC des Produkts in CH&sub2;Cl&sub2; : Hexan (4 : 1) ergab 2 Flecken. Beide Flecken wurden von einer Säule gesammelt. Das gewünschte Produkt wurde erhalten und ergab 32 mg (25% Ausbeute) als Verbindung VII.
¹H-NMR: 7,1-7,8 (m, 14H); 6,9 (d, 2H); 6,6 (d, 2H); 5,6 (t, 1H); 4,6 (s, 4H); 3,0 (m, 2H).
In einer weiteren Zubereitung wurde 2-Brombenzoesäure (957 mg, 4,8 mmol) in 20 ml Tetrahydrofuran gelöst und auf -78ºC abgekühlt (CO&sub2;/Aceton), dazu wurde n-Butyllithium (n-BuLi; 5,8 mM, 1,6 M in Hexane, 9,2 mmol) zugegeben und 1 Stunde lang gerührt. Die Aldehydverbindung VI (1,9 g, 3,2 mmol), gelöst in 10 ml auf -78ºC gekühltem Tetrahydrofuran, wurde über eine Kanüle zugegeben und danach 4 Stunden lang bei -78ºC gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde in gesättigtes Ammoniumchlorid gegossen, gefolgt von einer Extraktion mit (2 · 50 ml) Ethylacetat. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Natriumsulfat getrocknet und durch Blitzchromatographie unter Verwendung von reinem Methylenchlorid gereinigt, wobei 860 mg, 62% der theoretischen Menge, erhalten wurden.
¹H-NMR (CDCl&sub3;): δ 7,90-7,80 (m, 1H); 7,68-7,40 (m, 2H); 7,40-7,05 (m, 11H); 7,0 (d, J = 8,6 Hz, 2H); 6,64 (d, J = 8,6 Hz, 2H); 5,62 (t, J = 7,1 Hz, 2H); 3,64 (br s, 2H); 3,4-2,8 (m, 2H).
Analyse: berechnet für C&sub2;&sub9;H&sub2;&sub7;NO&sub3;: C, 80,37 H, 6,24; N, 3,23.
Gefunden: C, 80,44; H, 6,29; N, 3,19.

Beispiel 11 : 2-[2-[4-[Bis(phenylmethyl)amino]phenyl]-1-hydroxyethyl]-benzoesäure

(Verbindung 5b)

Die in Beispiel 10 erhaltene Verbindung VII (32 mg) wurde in Methanol (2 ml) gelöst. Pd/C (10 mg) wurde zugegeben und das Reaktionsgemisch mit Wasserstoff gespült und ungefähr 1,5 Stunden lang gerührt, bis das gesamte fleckenbildende Material fort war, was durch DSC in CH&sub2;Cl&sub2; : Ethylacetat (1 : 1) nachgewiesen wurde, wobei 16,2 mg (86% Ausbeute) der Verbindung 5b erhalten wurde.
Bei einer Wiederholungssynthese wurde die Carboxylatverbindung VII (320 mg, 7,3 · 10&supmin;&sup4; Mol) in 20 ml Methanol gelöst. Darauf folgte die Zugabe von 10% Paladium auf Aktivkohle (32 mg), das Befüllen des Kolbens mit Wasserstoff und ein schnelles Rühren während 90 Minuten. Die Filtration durch Celite, gefolgt von einer Konzentrierung, ergab 179 mg, 95% der theoretischen Menge. Dieses Material wurde ohne weitere Reinigung bei der Wiederholung des folgenden Beispiels eingesetzt. DSC Rf=0,6, 1 : 1 Methylenchlorid : Ethylacetat.

Beispiel 12 : 2-[2-[4-[[5-[(2,5-Dioxo-1-pyrrolidinyl)oxy]-1,5-dioxopentyl]amino]phenyl]-1- hydroxyethyl-benzoesäure (Verbindung 5a)

Die in Beispiel 11 erhaltene Verbindung 5b (16,2 mg, 6,3 · 10&supmin;&sup5; Mol) wurde in CH&sub2;Cl&sub2; (70 ul) gelöst und Et&sub3;N (1,26 · 10&supmin;&sup4; Mol) wurde unter Rühren zugegeben.
Dazu wurde N-Hydroxysuccinimidoylglutaroylchlorid (19,1 mg, 8,19 · 10&supmin;&sup5; Mol) zugegeben und das Reaktionsgemisch wurde unter Stickstoff gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde anschließend direkt auf eine präparative DSC-Platte gegeben und mit CH&sub2;Cl&sub2; : Ethylacetat (1 : 1) eluiert, wobei 14,3 mg (50% Ausbeute) des gewünschten Hapten-Liganden Verbindung 5a erhalten wurden.
¹H NMR: δ 9,2 (s, 1H); 7,2-6,8 (m, 6H); 6, 6 (d, 2H); 5,2 (t, 1H); 2,6 (m, 2H); 2,1 (s, 4H); 2,0 (t, 2H); 1,8 (t, 2H); 1,4 (m, 2H).
Bei einer Wiederholungssynthese wurde das Carboxylat VIII (100 mg, 3,9 · 10&supmin;&sup4; Mol) in 800 ul Methylenchlorid und Triethylamin (109 ul, 7, 8 · 10&supmin;&sup4; Mol) gelöst. Auf diese Auflösung folgte die Zugabe von (5-[(2,5-Dioxo-1-pyrrolidinyl)oxy]-5-oxo-pentanoylchlorid (118 mg, 5,1 · 10&supmin;&sup4; Mol) und 20 Minuten langes Rühren. Die Reinigung erfolgte durch Aufgeben des rohen Reaktionsgemisches auf eine Blitzchromatobraphiesäure und Eluieren mit 1 : 1 Methylenchlorid : Ethylacetat, wobei 159 mg, 90% der theoretischen Menge, erhalten wurde.
¹H-NMR (CDCl&sub3;): δ 9,24 (s, 1H); 7,36-6,8 (m, 6H); 6,42 (d, J = 8,6 Hz, 2H); 5,20(t, J = 7,1 Hz, 1 H); 2,66-2,36 (m, 2H); 2,15 (5, 4H); 2,1-1,96 (m, 2H); 1,96-1,7 (m, 2H), 1,5-1,16 (m, 2H).
Analyse: berechnet für C&sub2;&sub4;H&sub2;&sub4;N&sub2;O&sub8;: C, 61,54 H, 5,13; N, 5,98.
Gefunden: C, 61,62; H, 5,10; N, 5,89.

Beispiel 13: Verbindung IX

Die Verbindung II aus Beispiel 3 (262 mg, 1,22 · 10&supmin;³ Mol) und Glutarsäureanhydrid (140 mg) wurden in CH&sub2;Cl&sub2; (10 ml) gelöst und 16 bis 18 Stunden lang gerührt. Weiteres Glutarsäureanhydrid (40 mg) wurde zu der Lösung zugegeben und das Reaktionsgemisch wurde 3 Stunden lang gerührt und anschließend in eine wäßrige Lösung von Et&sub3;N (1,47 · 10&supmin;³ Mol) gegossen. Die Lösung wurde anschließend mit Ethylacetat verdünnt und die wäßrige Schicht entfernt und mit Trifluoressigsäure (TFA) angesäuert. Die wäßrige Schicht wurde mit Ethylacetat extrahiert, durch HPLC gereinigt, wobei ein standardmäßiger 10 : 90 bis 90 : 10 CH&sub3;CN : H&sub2;O-Gradient verwendet wurde, und es wurden 240 mg (60% Ausbeute) der gewünschten Verbindung (Verbindung IX) erhalten.
¹H-NMR: δ 8,3 (m, 3H); 7,6 (t, 2H); 6,9 (d, 2H); 6,7 (d, 2H); 5,1 (t, 1H); 2,8 (m, 2H); 2,0 (m, 4H); 1,5 (m, 2H). Verbindung IX

Beispiel 14: Verbindung 1b

Die Verbindung IX (58 mg, 1,77 · 10&supmin;&sup4; Mol) aus Beispiel 13 wurde mit Methyliodid (8,84 · 10&supmin;&sup4; Mol) vermischt und in einem Einschlußrohr in Aceton (ungefähr 5 ml) gelöst und ungefähr 16 bis 18 Stunden lang auf 80ºC erwärmt. Der Niederschlag wurde filtriert und mit CHCl&sub3; gewaschen, wobei 56 mg (67% Ausbeute) der Verbindung 1b erhalten wurden.
¹H-NMR: δ8,5-7,5 (m, 4H); 7,2-6,8 (m, 4H); 5,2 (t, 1H); 3,2 (m, 2H); 2, 2 (t, 2H); 1,8 (t, 2H); 1,2 (m, 2H). Verbindung 1b

Beispiel 15: Verbindung X

p-Nitrophenol (1 g, 7,19 · 10&supmin;³ Mol) wurde in CH&sub2;Cl&sub2; (3 ml) gelöst und Et&sub3;N (7,19 · 10&supmin;³ Mol) wurde zugegeben, um eine gelbgefärbte Lösung herzustellen.
Benzylchlorid (8,63 · 10&supmin;³ Mol) wurde tropfenweise zu der Lösung zugegeben, was zu einem leichten Sieden führte. Die gelbe Farbe verschwand nach ungefähr 5 Minuten und es bildete sich ein Niederschlag. CH&sub2;Cl&sub2; (2 ml) wurde zu der den Niederschlag enthaltenden Lösung zugegeben, gefolgt von der Zugabe von Ethylacetat (3 ml), welches den Niederschlag auflöste. Die Lösung wurde 1 Stunde lang gerührt.
Die Lösung wurde mit Wasser vermischt und ungefähr 45 Minuten lang gerührt, gefolgt von einem Waschen in 1 M HCl, und anschließend zwei Waschungen mit 10% NaHCO&sub3;, zwei Waschungen mit 1 M HCl und zwei Waschungen mit gesättigtem NaCl. Die organische Schicht wurde mit Natriumsulfat getrocknet, an einem Rotationsverdampfer abgedampft, unter Vakuum aufbewahrt und an einer Säule in CH&sub2;Cl&sub2;: Hexan (2 : 1) aufgetrennt. Der untere Rf -Fleck bei der DSC wurde gesammelt, wobei 1,2613 g (72% Ausbeute) der Verbindung X (p-Nitrophenylbenzoat) erhalten wurde.
¹H-NMR: δ 8,4-8,0 (m, 4H); 7,7-7,3 (m, 5H). Verbindung X

Beispiel 16: Verbindung XI

Verbindung X (530 mg, 2,18 · 10&supmin;³ Mol) aus Beispiel 15, 12 M HCl (200 ul), Pd/C (275 mg) und Wasserstoffgas wurden in Methanol (ungefähr 15 ml) vermischt und 2,5 Stunden lang unter Stickstoff gerührt, bis das gesamte fleckenbildende Material, bestimmt durch DSC in CH&sub2;Cl&sub2; : MeOH (9 : 1) fort war. Die Lösung wurde filtriert und getrocknet, wobei 518 mg (95% Ausbeute) der Verbindung XI anhalten wurde. Verbindung XI

Beispiel 17: Verbindung 3

Die Verbindung XI (518 mg; 2,08 · 10&supmin;³ Mol) aus Beispiel 16 wurde mit CH&sub2;Cl&sub2; (10 ml) und Glutarsäureanhydrid (260 mg, 2,28 · 10&supmin;³ Mol) vermischt. Et&sub3;N (4,58 · 10&supmin;³ Mol) wurde in der Lösung gelöst und das Reaktionsgemisch wurde 16 bis 18 Stunden lang gerührt.
Die DSC zeigte ein fleckenbildendes Material in CH&sub2;Cl&sub2; : Ethylacetat (9 : 1). Weiteres Glutarsäureanhydrid (0,25 mg) wurde zu der Lösung zugegeben und das Reaktionsgemisch wurde weitere 3 Stunden lang gerührt, bis das gesamte fleckenbildende Material fort war. Die Lösung wurde mit Ethylacetat verdünnt, zweimal mit 1 M HCl gewaschen. Die organische Phase wurde mit Natriumsulfat getrocknet und eingedampft, wobei 655 mg Rohprodukt erhalten wurden. Das Rohprodukt wurde durch FPLC in CH&sub3;CN : CH&sub3;OH : H&sub2;O (4 : 1 : 4) gereinigt, wobei 397 mg der Verbindung 3 erhalten wurde.
¹H-NMR: δ 9,9 (s, 1H); 8,1 (d, 2H); 7,7-7,4 (m, 5H); 7,1 (d, 2H); 2,3 (t, 4H); 1,8 (m, 2H). Verbindung 3

Beispiel 18: Verbindung 4

Glutarsäureanhydrid (1,34 g, 1,17 · 10&supmin;² Mol) und p-Aminophenol (1,6 g, 1,47 · 10&supmin;² Mol) wurde in CH&sub2;Cl&sub2; (5 ml) gelöst und bei 35ºC 1 Stunde lang gerührt. Das Gemisch wurde in Ethylacetat verdünnt und zweimal mit 1 M HCl gewaschen. Die organische Schicht wurde mit Natriumsulfat getrocknet und in einem Rotationsverdampfer abgedampft. Die HPLC zeigte das aufzulösende Produkt in der wäßrigen Schicht, welche lyophilisiert wurde, wobei 214 mg des Rohprodukts erhalten wurden.
Das Rohprodukt wurde in H&sub2;O (16 ml), Methanol (5 ml) und CH&sub3;CN (5 ml) gelöst und durch FPLC gereinigt, wobei 89 mg der Verbindung 4 erhalten wurden.
¹H-NMR: δ 9,6 (s, 1H); 7,3 (d, 2H); 6,6 (d, 2H); 2,2 (m, 4H); 1,7 (m, 2H). Verbindung 4

Beispiel 19 : 2-[2-(4-Aminophenyl)-1-hydroxyethyl]-1-methylbenzol (Verbindung XII)

n-BuLi (2,8 ml, 2,6 M in Hexanen, 4,4 mmol) wurde zu 30 ml THF gegeben und auf -78ºC abgekühlt (CO&sub2;/Aceton). Zu dieser Lösung wurde 2-Bromtoluol (0,573 ml, 4,8 mmol) zugegeben und 30 Minuten lang rühren gelassen. Die Aldehydverbindung VI (1,9 g, 3,2 mmol), gelöst in 15 ml THF und abgekühlt auf -78ºC, wurde als nächstes zugegeben, und das sich dabei ergebende Gemisch wurde 2 Stunden lang gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde in eine gesättigte Ammoniumchloridlösung gegossen und mit 2 · 25 ml Methylenchlorid extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit Natriumsulfat getrocknet und durch Blitzchromatographie in 6 : 1 : 1,5 Hexane : Methylenchlorid : Ethylacetat gereinigt, wobei 900 mg Verbindung XII, 69% der theoretischen Menge, erhalten wurde.
¹H-NMR (CDCl&sub3;): δ 7,9-7,8 (m, 1H); 7,68-7,40 (m, 2H); 7,40-7,15 (m, 12H); 7,05 (d, J = 8,6 Hz, 2H); 6,70 (d, J = 8,6 Hz, 2H); 5,3 (t, J = 7,1 Hz, 1H); 4,62 (s, 4H); 3,0-2,7 (m, 2H); 2, 3 (s, 3H).
Analyse: berechnet für C&sub2;&sub9;H&sub2;&sub9;NO: C, 85,50 H, 7,13; N, 3,44.
Gefunden: C, 85,58; H, 7,08; N, 3,41.

Beispiel 20 : 2-[2-[4-[Bis(phenylmethyl)amino]phenyl]-1-hydroxyethyl]-1-methylbenzol

(Verbindung XIII)

Zu einer Lösung der Verbindung XII (900 mg, 2,2 mmol) in 50 ml Ethylacetat wurden 10% Palladium auf Aktivkohle (100 mg) zugegeben. Das Reaktionsgefäß wurde in einem PARR- Hydrierapparat mit Wasserstoff unter einen Druck von 50 psi gesetzt. Die Reaktion war nach 4 Stunden beendet und es wurde anschließend durch Celite filtriert und im Vakuum konzentriert, wobei 476 mg der Verbindung XIII, 95% der theoretischen Menge, erhalten wurde. Dieses Material wurde ohne weitere Reinigung im nächsten Beispiel verwendet. DSC Rf = 0,05, 4 : 1 Methylenchlorid : Hexane.

Beispiel 21 : 2-[2-[4-Carboxy-1-oxobutyl)amino]phenyl]-1-hydroxyethyl]-1-methylbenzol

(Verbindung 6)

Zu einer Lösung von Verbindung V (476 mg, 2,1 mmol) in 10 ml Methylenchlorid, das Tri ethylamin (351 ul, 2,5 mmol) enthielt, wurde (5-[(2,5-Dioxo-1-pyrrolidinyl)oxyl]-5-oxopentanoylchlorid (572 mg, 2,3 mmol) zugegeben. Die Lösung wurde 30 Minuten lang gerührt, woraufhin sie mit Ethylacetat (25 ml) verdünnt, mit 1 M HCl (2 · 15 ml) gewaschen und mit Natriumsulfat getrocknet wurde. Das Rohmaterial wurde durch Blitzchromatographie, 1 : 1 Methylenchlorid : Ethylacetat, gereinigt, wobei 780 mg der Verbindung 6, 85% der theoretischen Menge, erhalten wurde. ¹H-NMR (CDCl&sub3;) δ 9,24 (s, 1H); 7,4-6,85 (m, 6H); 6,45 (d, J = 8,6 Hz, 2H); 5,20 (t, J = 7,1 Hz, 1H); 2,65-2,4 (m, 2H); 2,3 (s, 3H), 2,15 (s, 4H); 2,1-1,96 (m, 2H); 1,96- 1,72 (m, 2H), 1,5-1,20 (m, 2H).
Analyse: berechnet für C&sub2;&sub4;H&sub2;&sub6;N&sub2;O&sub6;: C, 65,75; H, 5,94; N, 6,39.
Gefunden: C, 65,79; H, 5,91; N, 6,41.

Beispiel 22 : 5-[(2,5-Dioxo-1-pyrrolidinyl)oxy]-N-[4-(hydroxymethyl)phenyl]-5-oxopentanamid

(Verbindung XIV)

In einer Lösung von Triethylamin (1,13 ml, 8,2 mmol) in 10 ml Methylenchlorid wurde p- Aminobenzylalkohol (1,9 g, 8,1 mmol) gelöst. Zu dieser Lösung wurde (5-[(2,5-Dioxo-1- pyrrolidinyl)oxy]-5-pentanoylchlorid (2,21 g, 8,9 mmol) zugegeben und eine Stunde lang gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit Methylenchlorid (25 ml) verdünnt und mit 2 · 26 ml einer 2M HCl Lösung extrahiert. Die sich dabei ergebende organische Schicht wurde mit Natriumsulfat getrocknet und durch Blitzchromatographie in 9 : 1 Methylenchlorid : Methanol gereinigt, wobei 2,43 g der Verbindung XIV, 90% der theoretischen Menge, erhalten wurde.
¹H-NMR (CDCl&sub3;) δ 8,0 (br x, 2H); 7,52 (d, J = 8,6 Hz, 2H); 7,30 (d, J = 8,6 Hz, 2H); 4,62 (s, 2H); 3,45 (s, 2H), 2,9 (s, 4H); 2,75 (t, J = 10 Hz, 2H); 2,5 (t, J = 10 Hz, 2H); 2,38-2,10 (m, 2H).
Analyse: berechnet für C&sub1;&sub6;H&sub1;&sub8;N&sub2;O&sub6;: C, 57,49; H, 5,39; N, 8,38.
Gefunden: C, 57,42; H, 5,44; N, 8,29.

Beispiel 23: N-[4-(Brommethyl)phenyl]-5-[(2,5-dioxo-1-pyrrolidinyl)oxyl-5-oxopentanamid

(Verbindung XV)

Zu einer Lösung von Verbindung XIV (2,9 g, 6 mmol) in 20 ml Dimethylformamid wurde Dibromtriphenylphosphoran (3,04 g, 7,2 mmol) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde anschließend auf 50ºC erwärmt und 4 Stunden lang gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde anschließend mit einem Liter Ethylacetat verdünnt, mit Salzlösung (4 · 200 ml) extrahiert und über Natriumsulfat getrocknet. Die Reinigung mittels Blitzchromatographie, 1 : 1 Ethylacetat : Methylenchlorid ergab 1,20 g der Verbindung XV, 50% der theoretischen Menge.
¹H-NMR (CDCl&sub3;) δ 8,0 (br s, 1H); 7,50 (d, J = 8,6 Hz, 2H); 7,39 (d, J = 8,6 Hz, 2H); 4, 5 (s, 2H); 2,9 (s, 4H), 2,75 (t, J = 10 Hz, 2H); 2,5 (t, J = 20 Hz, 2H); 2,38-2,10 (m, 2H);
Analyse: berechnet für C&sub1;&sub6;H&sub1;&sub7;N&sub2;O&sub5;: C, 58,72; H, 5,20; N, 8,56.
Gefunden: C, 58,66; H, 5,24; N, 8,50.

Beispiel 24 : 4-[[5-[(2,5-Dioxo-1-pyrrolidinyl)oxyl]-1,5-dioxopentyl]amino]-N,N-dimethyl- N-bromidbenzolmethanaminiumbromid

(Verbindung 7)

Die Bromidverbindung XV (1,9 g, 2,5 mmol) wurde in 60 ml Methylenchlorid gelöst, gefolgt von der Zugabe von Dimethylanilin (1,6 ml, 12,5 mmol). Die Lösung wurde 30 Minuten lang gerührt, wonach sich ein Niederschlag bildete; das Rühren wurde 4 Stunden lang fortgesetzt. Die gebildete Suspension wurde in einen Scheidetrichter überführt und mit 3 · 30 ml destilliertem Wasser extrahiert. Die vereinigten wäßrigen Waschlösungen wurden lyophilisiert, um 1,17 g des Produkts Verbindung 7, 90% der theoretischen Menge, zu erhalten.
¹H-NMR (D&sub2;O) δ 7,60 (s, 5H); 7,38 (d, J = 8,6 Hz, 2H); 7,9 (d, J = 8,6 Hz, 2H); 4,95 (s, 2H); 3,62 (s, 6H), 2,9 (s, 4H); 2,75 (t, J = 10 Hz, 2H); 2,5 (t, J = 10 Hz, 2H); 2,38-2,10 (m, 2H).
Analyse: berechnet für C&sub2;&sub4;H&sub2;&sub8;N&sub3;O&sub5;Br: C, 55,60; H, 5,41; N, 8,11.
Gefunden: C, 55,67; H, 5,39; N, 8,07.

Beispiel 25: Herstellung von Succinimidyladipoyl- und -glutaroylchloriden (Kupplungsmittel)

Eine Lösung von Adipinsäuremonomethylester (5,4 g, 33,3 mmol) in Thionylchlorid (15 ml) wurde 2 Stunden lang auf 40ºC erwärmt. Das Gemisch wurde anschließend konzentriert und im Vakuum destilliert (Siedepunkt 119ºC bei 20 mm Hg),wobei 3,58 g (60% Ausbeute, bezogen auf das Gewicht) des Säurechloridmethylesters erhalten wurde. Dieser wurde in 20 ml Dichlormethan gelöst und es wurde N-Hydroxysuccinimid (2,75 g, 24,0 mmol) zugegeben, gefolgt von Triethylamin (4,2 ml, 30 mmol). Das Gemisch wurde 10 Minuten lang gerührt, anschließend mit Ethylacetat verdünnt und mit 0,5 M HCl und Salzlösung gewaschen. Die Lösung wurde über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und konzentriert, wobei 4,5 g (87,5% Ausbeute, bezogen auf das Gewicht) Methylsuccinimidyladipat als farbloses Öl erhalten wurde.
Protonen-NMR in CDCl&sub3; bei 100 MHz (bezogen auf TMS als internen Standard): delta 3,73 (Singulett, 3H), delta 2,90 (Singulett 4H), 2,70 (Multiplett, 2H), 2,37 (Multiplett, 2H) und 1,79 (Multiplett, 4H).
Eine Lösung von Methylsuccinimidyladipat (4,5 g, 17, 5 mmol), Chlortrimethylsilan (11,1 ml, 87,5 mmol) und Natriumiodid (13,1 g, 87,5 mmol) in 10 ml Acetonitril wurde 12 Stunden lang zum Rückfluß erhitzt. Das Gemisch wurde anschließend auf Raumtemperatur abgekühlt und mit Ethylacetat verdünnt. Das Reaktionsgemisch wurde wiederholt mit 5%-igem wäßrigem Natriumbisulfit gewaschen, bis die organische Lösung farblos war. Anschließend wurde sie mit Salzlösung gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und konzentriert, wobei 3,2 g (71% Ausbeute, bezogen auf das Gewicht) Adipinsäuremonosuccinimidylester als weißer Feststoff erhalten wurde.
Protonen-NMR in CDCl&sub3; bei 100 MHz (bezogen auf TMS als interen Standard): delta 3,90 (Singulett, 4H), 2,70 (Multiplett, 2H), 2,4 (Multiplett, 2H), 1,80 (Multiplett, 4H).
Ein Gemisch aus Adipinsäuresuccinimidylester (1,00 g, 3,80 mmol) und Thionylchlorid (5 ml) wurde 3 Stunden lang auf 40ºC erwärmt, anschließend auf Raumtemperatur abgekühlt und im Vakuum konzentriert. Der Rückstand wurde mehrmals mit trockenem Hexan verrührt, das Öl wurde abgetrennt und im Vakuum getrocknet, wobei 0,97 g (90% Ausbeute, bezogen auf das Gewicht) Succinimidyladipoylchlorid erhalten wurde. Dieses wurde in trockenem Tetrahydrofuran aufgelöst, so daß eine 5-molare Lösung erhalten wurde, welche als solche bei der Herstellung von Verbindungen verwendet wurde, die sich zum Kuppeln an Proteinträger eignen. Protonen-NMR in CDCl&sub3; bei 100 MHz (bezogen auf TMS als internen Standard): 3,00 (Multiplett, 2H), 2,90 (Singulett, 4H), 2,70 (Multiplett, 2H), 1,80 (Multiplett, 4H). Succinimidylglutaroylchlorid [5-[(2,5-Dioxo-1-pyrrolidinyl)oxy]-5-oxo-pentanoylchlorid] wurde auf ähnliche Weise hergestellt und wird wie nachstehend erläutert verwendet.

VI. Herstellung von Konjugaten und Inocula

Konjugate von Hapten-Ligand-Molekülen mit Proteinträgern wie Keyhole Limpet Hämocyanin (KLH) oder Rinderserumalbumin (BSA) können z. B. durch Aktivierung des Trägers mit einem Kupplungsmittel wie MBS (m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester) und Kuppeln an die Thiol-Gruppe des Hapten-Liganden hergestellt werden. Siehe z. B. Liu et al. Biochem., 80, 690 (1979). Oftmals ist es von Nutzen, eine Verbindung mittels einer Zwischenverbindung, einer Verknüpfungsgruppe an ihren Träger zu binden, was im Fachgebiet ebenfalls wohlbekannt ist.
Brauchbare Träger sind im Fachgebiet bekannt und sind im allgemeinen selbst Proteine. Beispiele für solche Träger sind Keyhole Limpet-Hämocyanin (KLH), Edestin, Thyroglobulin, Albumine wie Rinderserumalbumin oder Humanserumalbumin (BSA oder HSA), rote Blutkörperchen wie Schaferythrocyten (SRBC), Tetanustoxoid, Choleratoxoid sowie Polyaminosäuren wie Poly(D-Lysin : D-Glutaminsäure) und dergleichen.
Die Wahl des Trägers hängt mehr von dem letztendlichen Verwendungszweck des Antigens ab als von dem determinierenden Teil des Antigens und beruht auf Kriterien, die in der vorliegenden Erfindung keine besondere Rolle spielen. Wenn z. B. das Konjugat in Labortieren verwendet werden soll, sollte ein Träger ausgewählt werden, der keine ungünstige Reaktion in dem jeweiligen Tier hervorruft.
Das Träger-Hapten-Konjugat wird in einer wäßrigen Zusammensetzung aus einem physiologisch tolerierbaren Verdünnungsmittel wie normaler Kochsalzlösung, PBS oder sterilem Was ser gelöst oder dispergiert, um ein Inokulum zu bilden. Ein Adjuvans wie komplettes oder unkomplettes Freundsches Adjuvans oder Alaun kann ebenfalls in dem Inokulum enthalten sein. Das Inokulum wird bekanntermaßen z. B. durch Injektion in das zur Erzeugung der Antikörper verwendete Tier in einer Menge eingeführt, die ausreicht, um Antikörper zu induzieren.
Beispielhafte immunogene Konjugate wurden aus einem Hapten-Liganden hergestellt durch Abwandeln ihrer Synthese derart, daß eine gerade Kohlenstoffatomkette an der Benzylgruppe des Hapten-Liganden (entsprechend dem Phenolteil des Reaktant-Lligandenesters) als Abstandshalter eingebaut wird, wie vorstehend angegeben wurde. Andere beispielhafte immunogene Konjugate können als Abstandshalter/Verbindungs-Element aus einem Hapten- Liganden hergestellt werden, indem diese Synthesen so abgewandelt werden, daß die gerade Kohlenstoffatomkette an dem Teil des Hapten-Liganden eingebaut wird, welcher dem Säureteil des Reaktant-Liganden entspricht.
Es wurde die Schlußfolgerung gezogen, daß die flexible Kohlenstoffkette eines Adipat- oder Glutaratanhangs jegliche Neigung zu einer Immunreaktivität aufgrund der konformationellen Beschränkung, die durch die kovalente Bindung an das Trägerprotein zustande kommt, verringern würde. Das für diesen Zweck hergestellte bifunktionelle Reagens stellt auch die voraktivierte Carboxylgruppe zur Anknüpfung mittels Ausbildung einer Amidbindung mit den Lysin- Resten des Trägers bereit. Das in dieser Studie verwendete spezielle Kupplungsverfahren ist hier weiter beschrieben. Die Hapten-Liganden wurden über eine Aminogruppe des Phenolteils der Struktur an Keyhole Limpet-Hämocyanin (KLH) gekuppelt.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist das Zwischenverknüpfungsmittel vorzugsweise Succinimidyladipoyl- oder glutaroylchlorid, welches wie vorstehend erörtert hergestellt wurde. Ein antigenes (immunogenes) Konjugat wird wie folgt hergestellt.
In einem beispielhaften Verfahren wurden 2,5 mg eines vorstehenden Reaktionsprodukts aus einem Hapten und Succinimidyladipoylchlorid oder Succinimidylglutaroylchlorid in 250 ul Dimethylformamid langsam unter Rühren zu 2 mg KLH in 750 ul 0,01 M Natriumphosphatpuffer bei einem pH-Wert von 7,2 zugegeben. Es wird eine Temperatur von 4ºC eingesetzt und das sich dabei ergebende Gemisch wird ungefähr 1 Stunde lang gerührt, um das Konjugat aus dem Hapten und dem damit verknüpften KLH zu bilden. Das so gebildete Konjugat- Reaktionsprodukt wird anschließend durch übliche Mittei gereinigt.

VII. Herstellung von monoklonalen Rezeptoren

Die vorstehenden KLH-Konjugate (ungefähr 100 ug) wurden verwendet, um Gruppen von vier 8 Wochen alten Mäusen (Stamm 129G1X&spplus;) durch intraperitoneale (IP) Injektion in kompletten Freund'schen Adjuvans zu immunisieren. Eine weitere IP-Injektion von 50 ug eines Konjugats in Alaun wurde 2 Wochen später verabreicht. Einen Monat später wurde der Maus mit dem höchsten Antikörpertiter gegen das Hapten intravenös 50 ug des KLH-Konjugats injiziiert. Die Milzen wurden 3 Tage danach zur Herstellung von Hybridomen und monoklonalen Antikörpern entnommen.
Monoklonale Antikörper wurden wie von Niman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4524 (1980) und Niman et al., in Monoclonal Antibodies and T-Cell Products, Hrsg. Katz, D.H., 23- 51 (CRC Press, Boca Raton, FL 1982) beschrieben erhalten. Kurz gesagt wurden Milzzellen (1 · 10&sup8;) mit 2,0 · 10&sup7; Sp2/O- Myelomzellen fusioniert. Die Zellen wurden in 45 Platten mit je 96 Vertiefungen ausplattiert; jede Vertiefung enthielt 150 ul HAT-DMEM-Medium, das zusätzlich 1% Nutridoma und 2% BSA enthielt. Die zur Bildung der Hybridome der vorliegenden Erfindung eingesetzten Lymphozyten können von einem beliebigen Säugetier wie etwa einem Primaten, einem Nagetier (z. B. Maus oder Ratte), einem Kaninchen, einem Meerschweinchen, einer Kuh, einem Hund, einem Schaf, einem Schwein oder dergleichen gewonnen werden. Zweckmäßigerweise kann der Wirt durch Injektion des Immunogens, in diesem Fall eines Hapten-Liganden, sensibilisiert werden, gefolgt von einer Auffrischungsinjektion und anschließender Isolierung der Milz.
Es ist bevorzugt, daß die Myelomzellinie der gleichen Art angehört wie die Lymphozyten. Deshalb werden typischerweise fusionierte Hybride wie Maus-Maus-Hybride [Shulman et al., Nature, 276, 269 (1978)] oder Ratte-Ratte-Hybride [Galfre et al., Nature, 277,131(1979)] verwendet. Es sind jedoch auch einige Ratte-Maus-Hybride erfolgreich zur Bildung von Hybridomen eingesetzt worden [Goding, "Procuction of Monoclonal Antibodies by Cell Fusion" in Antibody as a Tool, Marchalonis et al., Hrsg. John Wiley & Sons Ltd., S. 273 (1982)]. Zu geeigneten Myelomlinien zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung gehören MPC-11 (ATCC CRL 167), P3X63-Ag8.653 (ATCC CRL 1580) Sp2/O-Ag14 (ATCC CRL 1581), P3XAg8U.1 (ATCC CRL 1597), Y3-Ag1.2.3. (hinterlegt bei der Collection Nationale de Cultures de Microorganisms, Paris, France, Nummer I-078) und P3X63Ag8 (ATCC TIB 9). Die nicht ausscheidende Mausmyelomlinie Sp2/0 oder 5p2/0-Ag14 ist zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung bevorzugt.
Die Hybridomzellen, die letztlich erzeugt werden, können unter Befolgung von üblichen bekannten in vitro Gewebskulturmethoden für solche Zellen kultiviert werden. Mehr bevorzugt werden die Hybridomzellen in Tieren unter Verwendung ähnlich bekannter Methoden kultiviert, wobei die monoklonalen Rezeptoren aus den so erzeugten Ascitesflüssigkeiten gewonnen werden. Die zur Erzeugung der Ascitesflüssigkeit verwendeten Tiere waren Balb/c x 129G1X&spplus; Mäuse, die in der Mäusezuchtgruppe der Scripps Clinic and Research Foundation, La Jolla, California, gezüchtet wurden, wenn jedoch andere Tiere als Mäuse zur Herstellung der Hybridome verwendet werden, können Mäuse oder die jeweilige Tierart zur Herstellung von Ascitesflüssigkeit verwendet werden.
Insbesondere wurde ein beispielhafter monoklonaler Rezeptor durch die Standardhybridomtechnik von Kohler et al., Nature, 256, 495 (1975) erzeugt. Im einzelnen wurden 129G1X&spplus;&supmin; Mäuse durch intraperitoneale Injektion mit einem Inokulum aus 100 ug Konjugat
(z. B. Verbindung 1a, 2 oder 5a, gebunden an KLH) in 300 ul eines 1 : 1-Gemisches aus phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) pH 7,4 und komplettem Freund'schen Adjuvans immunisiert. 2 Wochen später erhielten die Mäuse erneut eine Injektion auf ähnliche Weise mit 50 ug des vorstehenden Konjugats in 300 ul eines 1 : 1-Gemisches aus PBS (pH 7,4) und 10 mg/ml Alaun. Nach weiteren 8 Wochen wurden die Mäuse intravenös mit 50 ug des Konjugats in 200 ul PBS (pH 7,4) immunisiert. Die Milzen wurden 4 Tage später aus den Mäusen entnommen und die Milzzellen mit Myelomzellen fusioniert.
Die Milzzellen wurden zusammengeführt und es wurde eine Einzelzellsuspension hergestellt. Kernhaltige Milzzellen (1,4 · 10&sup8;) wurden anschließend mit 3 · 10&sup7; nicht ausscheidenden Sp2/O-Myelomzellen in Gegenwart eines Zellfusionsbeschleunigungsmittels (Polyethylenglycol 2000) fusioniert. Das Hybridom, welches einen bestimmten monoklonalen Antikörper produziert, wurde durch Aussäen der Hybridomzellen in Platten mit 96 Vertiefungen und durch Wachstum in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), welches 4500 mg/l Glucose (10%), 10% fötales Kälberserum (FCS), Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin enthielt (d. h. HAT-Medium), welches das Wachstum von nichtfusionierten Myelomzellen nicht ermöglicht, selektiert.
Nach 2 bis 3 Wochen wurde von dem Überstand über dem Zellklon in jeder Vertiefung eine Probe genommen und durch einen ELISA-Assay (Festphasen-Enzymimmunoassay wie nachstehend beschrieben) auf das Vorhandensein von Antikörpern gegen Verbindung 1a, 2 oder 5 als Antigene getestet. Jeder Hapten-Ligand wurde für die ELISA-Assays mit BSA konjugiert. Positive Vertiefungen wurden zweimal durch limitierende Verdünnung kloniert. Diejenigen Klone, die weiterhin Verbindung 1a- oder 2-spezifische Antikörper nach 2 Klonierungen erzeugten, wurden vermehrt, um größere Volumina der Überstandsflüssigkeit herzustellen. 7 der 23 monoklonalen Rezeptoren (ungefähr 30%), die mit Verbindung 1a eine Immunreaktion eingingen, hydrolysierten die Reaktant-Ligandenester Verbindung 3 katalytisch. Jede dieser Katalysen konnte durch einen geeigneten Hapten-Liganden wie Verbindung 1b gehemmt werden. Somit war ein relativ hoher Prozentsatz von induzierten monoklonalen Rezeptoren in der Lage, eine esterolytische Reaktion zu katalysieren. Keiner der durch Haptenverbindung 2 induzierten 21 Antikörper wies eine katalytische Aktivität gegenüber Reaktant-Ligand Verbindung 3 auf. In ähnlicher Weise wurden Kolonien, die ursprünglich Antikörper erzeugten, welche die Verbindung 5a, 6 oder 7 banden, zweimal subkloniert, wonach 18 für die Verbindung 5a, 22 für die Verbindung 6 und 26 für die Verbindung 7 aktiv blieben. Diese Antikörper gehörten der IgG-Klasse an.
Monoklonale, katalytische Moleküle wurden aus den in mit Pristan behandelten Balb/c x 129GIX&spplus;-Mäusen erhaltenen Ascitesflüssigkeiten mit Salz ausgefällt, durch Anionenaustauschchromatographie (DEAE), gefolgt von Affinitätschromatographie (Protein G) gereinigt und in 50 mM Phosphat (100 mM NaCl, pH 7,5) dialysiert. Die Antikörper wurden aufgrund einer Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese als homogen (95%) angesehen. Eines dieser Hybridome mit der Bezeichnung 30C6 wurde weiter untersucht und ist bei der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD. hinterlegt worden. Dieses Hybridom wurde am 24. Januar 1990 hinterlegt und erhielt die Hinterlegungsnummer HB 10341. Zwei weitere Hybridome 27A6 und 57611 wurden in ähnlicher Weise bei der ATCC am 11. Dezember 1990 hinterlegt und erhielten die Hinterlegungsnummern HB 10621 bzw. HB 10622.
Die genannten Hinterlegungen erfolgten in Übereinstimmung mit den Bestimmungen des Budapester Vertrags, daß die Dauer der Hinterlegungen 30 Jahre nach der Hinterlegung oder 5 Jahre nach dem letzten Antrag auf Abgabe einer Probe bei der Hinterlegungsstelle oder solange wie die Geltungsdauer eines aus dieser Anmeldung hervorgehenden US-Patents beträgt, je nachdem welcher Zeitraum am längsten ist. Die Hybridome werden erneut hinterlegt, falls sie bei der Hinterlegungsstelle nicht mehr lebensfähig sein sollten.
Ein monoklonaler Rezeptor der vorliegenden Erfindung kann auch durch Einführen des Hybridoms in die Bauchhöhle eines Säugetiers wie beispielsweise einer Maus, beispielsweise durch Injektion, erzeugt werden. Vorzugsweise werden syngene oder semisyngene Säugetiere verwendet, wie im US-Patent 4,361,549. Die Einführung des Hybridoms führt nach einem geeigneten Wachstumszeitraum, z. B. 1 bis 2 Wochen, zur Bildung von antikörperproduzierenden Hybridomen und führt dazu, daß eine hohe Konzentration des Rezeptors produziert wird, welcher aus dem Blutstrom und der Bauchhöhlenflüssigkeit (Ascites) der Wirtsmaus gewonnen werden kann. Obwohl die Wirtsmäuse auch normale Rezeptoren in ihrem Blut und in ihren Ascites aufweisen, beträgt die Konzentration der normalen Rezeptoren typischerweise nur ungefähr 5% von der Konzentration des monoklonalen Rezeptors.
Der in dem Hybridomüberstand vorhandene monoklonale Rezeptor kann ohne Reinigung verwendet werden, oder der Rezeptor kann aus den Ascites oder dem Serum der Maus unter Verwendung von Standardmethoden wie Affinitätschromatographie unter Verwendung von AD169-infizierten Zellen, die an ein Immunosorbens wie Sepharose 6B oder 4B (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ) gebunden sind, gefolgt von einer Elution von dem Immunosorbens unter Verwendung eines sauren Puffers wie Glycinhydrochlorld bei einem pH-Wert von ungefähr 2,5 gewonnen werden.
In den vorliegenden Studien wurden IgG-Fraktionen typischerweise aus Mausascites durch Ausfällung mit 45% gesättigtem Ammoniumsulfat gefolgt von einer Chromatographie an DEAE-Sephacel mit einer Elution mit Natriumchlorid wie vorstehend angegeben erhalten. Die Fraktion, welche mit 100 mM Salz eluiert wurde, wurde dialysiert und konzentriert.

VIII. Festphasen-Enzymimmunoassay (ELISA)

Die Bindung von Liganden und die Wirkung der chemischen Modifizierung wurden bestimmt mittels ELISA mit einer festgelegten Konzentration des Antikörpers im Bereich seines Titers und variierenden Konzentrationen von Reagenz oder Ligand. Eine Hemmung liegt vor, wenn der Titer bei einem Verhältnis von Reagenz zu Hapten von weniger als 1000 : 1 um 50% verringert ist.
Die Assays erfolgten in Polyvinylmikrotiterplatten mit flachem Boden (Dynatech, Alexandria, VA). Beispielsweise wurden die Vertiefungen mit einer Lösung beschichtet, die Verbindung 1a. gebunden an BSA, als Antigenligand in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) umfaßte, wobei 50 ul Lösung pro Vertiefung verwendet wurden. Die Liganden wurden in einer Menge von 1 ug pro ml aufgetragen. Die Platten wurden dann über Nacht bei 37ºC in einem Trockenofen inkubiert. Die getrockneten Platten wurden bis zur Verwendung bei 4ºC aufbewahrt. Vor dem ELISA-Assay wurden die getrockneten Platten durch zwei jeweils 2 Minuten dauernde Waschungen mit 10 millimolarem (mM) PBS, pH 7,4, welches 0,1% Polyoxalkylen(20)- sorbitan-monolaurat (Tween 20) und 0,02% Thimerosal (Natriumethylmercurithiosalicylat), (Sigma, St. Louis, MO) enthielt, wieder befeuchtet.
Um eine nichtspezifische Bindung zu verringern, wurden die Hybridomüberstände 1 : 2 in Waschpuffer, der 0,1% BSA, enthielt, als Verdünnungsmittel verdünnt. 50 ul der verdünnten Hybridomüberstände wurden danach zu jeder Vertiefung zugegeben und 1 Stunde lang bei 4ºC an einem Kreiselschüttler inkubiert, um den Überstand, welcher den monoklonalen Antikörper enthielt, mit der gebundenen Verbindung 4 zusammenzubringen. Im Anschluß an zwei Waschungen von jeweils 2 Minuten wurden 50 ul peroxidase-markierter Ziegen-Antimaus- IgG+IgM (Tago, Burlingame, CA), verdünnt 1 : 1000, zu jeder Vertiefung zugegeben und das Reaktionsgemisch wurde bei 4ºC 1 Stunde lang inkubiert, um den markierten Antikörper an den gebundenen monoklonalen Antikörper zu binden.
Das Substrat, das verwendet wurde, um die Aktivität der gebunden Peroxidase zu bestimmen, wurde unmittelbar vor der Verwendung hergestellt und bestand aus 400 ug/ml o-Phenylendiamin (Sigma, St. Louis, MO) in 80 mM Citrat-Phosphat-Puffer, pH 6,0, der 0,12% H&sub2;O&sub2; enthielt. Nach zwei abschließenden Waschungen wurden 50 ul Substratlösung in jede Vertiefung zugegeben und die Farbe wurde 15 Minuten lang im Dunkeln entwickeln gelassen. Die Farbentwicklung wurde durch Zugabe von 25 ul 4-molare (M) H&sub2;SO&sub4; zu jeder Vertiefung angehalten und die optische Dichte bei 492 Nanometern (nm) wurde mit einem Multiscan ELISA-Plattenauswertungsgerät bestimmt.

IX. Kinetische Messungen

Gereinigte monoklonale Antikörper wurden gegen EPPS-Puffer (1 mM, pH 8,0,100 mM NaCl) oder CHES-Puffer (1 mM, pH 8,0,100 mM NaCl) dialysiert. Ihre Proteinkonzentration wurde durch das BCA-Verfahren (Pierce) bestimmt. Assays erfolgten durch HPLC
(Umkehrphasensäule, C&sub1;&sub8;, VYDAC 201TP54) mit CH&sub3;CN/H&sub2;O (0,1% TFA) mit einem isokratischen Programm von 10/90. Ein interner Standard von o-Acetamidophenol wurde zur Berechnung der Menge des gebildeten Produkts [4-(Carboxybutyramido)phenol] verwendet. Antikörperstammlösungen wurden in 1 ml des geeigneten Puffers [50 mM, EPPS (pH 7,2-8,6); CHES (pH 8,6-10,0), 100 mM NaCl] verdünnt, um eine Protein-Endkonzentration von 20 um zu ergeben. Die Reaktionsansätze enthielten 5% Dioxan als Verschnittmittel und die Temperatur wurde bei 37 ± 0,1ºC gehalten. Lineare Anfangsgeschwindigkeiten wurden bei < 5% Hydrolyse des Gesamtsubstrats gemessen. Es zeigte sich, daß die untersuchten Antikörper mindestens 48 Stunden lang unter den Reaktionsbedingungen stabil waren, wie durch ELISA- Bindungsassays bestimmt wurde. Die beobachteten Geschwindigkeiten wurden bezüglich der nichtkatalysierten Hydrolysegeschwindigkeit in Abwesenheit des Antikörpers korrigiert. Die kinetischen Parameter Vmax Km wurden durch eine nichtlineare Anpassung der Anfangsgeschwindigkeit gegen die Substratkonzentration an eine hyperbolische Kurve, die durch die Michaelis-Menten Gleichung beschrieben wird, gemäß der Methode der kleinsten Quadrate bestimmt.
Die Variation der Anfangsgeschwindigkeiten als Funktion des pH-Werts wurde in CHES (50 mM) (100 mM NaCl) bei einem pH-Wert über 8,6 und ansonsten in EPPS (50 mM) (100 mM NaCl) gemessen. Es gab keinen Unterschied der beobachteten Geschwindigkeiten mit dem Antikörper 27A6, wenn er bei pH 8,6 in EPPS und CHES (50 mM)) (100 mM NaCl) getestet wurde. Die Variation der Pufferionenkonzentration (12,5-50 mM) zeigte keine Abhängigkeit von Kcat, (Antikörper 27A6) von dem Vorhandensein der Puffersubstanz.
Die Gleichung 1 beschreibt das pH-Geschwindigkeits-Profil, das für die Hydrolysegeschwindigkeit (Kobsd) von Verbindung 3, extrapoliert auf eine Pufferkonzentration Null, erhalten wurde. Bruice et al. Bioorganic Chemistrv, Band 1; Benjamin: New York (1965).
Kobsd = KOH [OH&supmin;]
Die Linie der ausgefüllten Quadrate (Fig. 3b) wurde durch Variieren der Pufferkonzentration (12,5 mM-50 mM) bei einer festen Konzentration der Verbindung 3 (400 uM) über den pH- Bereich 7,2-10,0 erhalten. Die eingesetzten Puffer und ihr untersuchter pH-Wertbereich waren genau die gleichen wie vorstehend beschrieben. Der Wert von KOH- kann aus der Steigung einer Auftragung von Kobs gegen Kw/aH berechnet werden.

X. Chemische Modifizierung von Antikörpern

(a) Phenylglyoxal; ein 50 ul Aliquot einer Phenylglyoxallösung (6 mM) (125 mM NaHCO&sub3;, pH 7,5) wurde zu 195 ul Puffer, (125 mM, pH 7,5 NaHCO&sub3;), welcher den Antikörper (20 uM) enthielt, zugegeben. Das Gemisch wurde mit einem Vortexmischer durchmischt und 1 Stunde lang bei Raumtemperatur stehengelassen. Dieses Reaktionsgemisch wurde anschließend in ein Mikrodialysegerät (Pierce) überführt und mit 125 mM, pH 7,5 NaHCO&sub3; bei einem Durchfluß von ungefähr 150 ml/h zwei Stunden lang dialysiert. Das Mikrodialysegerät wurde anschließend mit 4 · 60 ml-Portionen von pH 8,4, 50 mM CHES, 100 mM NaCl gespült und in diesem Puffer über Nacht (ungefähr 15 bis 18 Stunden lang) stehengelassen. Das Mikrodialysegerät wurde am nächsten Morgen erneut mit 3 · 50 ml Portionen von pH 8,4, 50 mM CHES, 100 mM NaCl gespült. Die Proben wurden entnommen, die Proteinkonzentrationen erneut berechnet (BCA) und Assays im Hinblick auf die katalytische Aktivität (HPLC) oder die Bindung (ELISA) durchgeführt. Ein ähnliches Verfahren wurde mit dem vorhandenen Hapten (200 uM) eingesetzt.
(b) Maleinsäureanhydrid; ein 5 ml-Aliquot einer Maleinsäureanhydridlösung (0,06 M, Dioxan) wurde zu 299 ul von 20 mM, pH 8,9 Borat, 100 mM NaCl, enthaltend 20 uM Antikörper, hinzugegeben. Die Lösung mit einem Vortexmischer gemischt und bei Raumtemperatur 1 Stunde lang stehengelassen. Dieses Reaktionsgemisch wurde anschließend in ein Mikrodialysegerät überführt und wie vorstehend beschrieben mit 50 mM CHES, pH 8,4, 100 mM NaCl dialysiert. Die Proben wurden entnommen, die Proteinkonzentrationen berechnet (BCA) und Assays im Hinblick auf die katalytische Aktivität oder Bindung durchgeführt.
(c) Diethylpyrocarbonat; 10 ul einer 0,6 M Diethylpyrocarbonatlösung in Ethanol wurden in 1 ml Natriumacetat (NaOAc) (150 mM, pH 6, 100 mM NaCl) verdünnt. 5 ul dieser Lösung wurden zu 299 ul NaOAc (150 mM, pH 6,0, 100 mM NaCl), enthaltend 20 uM Antikörper, hinzugegeben. Das Gemisch wurde mit einem Vortexmischer gemischt und bei 4ºC über Nacht (ungefähr 15 bis 18 Stunden lang) stehengelassen. Dieses Reaktionsgemisch wurde dann in ein Mikrodialysegerät überführt und wie vorstehend beschrieben mit CHES (50 mM, pH 8,4, 100 mM NaCl) dialysiert. Proben wurden entnommen, Proteinkonzentrationen bestimmt (BCA) und Assays im Hinblick auf die katalytische Aktivität und die Bindung durchgeführt. Die vorstehenden Ausführungen sollen die vorliegende Erfindung erläutern, aber nicht beschränken. Zahlreiche Abwandlungen und Modifikationen können vorgenommen werden, ohne von dem Umfang der Erfindung, wie er in den Ansprüchen definiert ist, abzuweichen.

Claims

1. Antikörpermoleküle oder Moleküle, die Teile mit Antikörperbindungsstellen enthalten, welche eine vorgewählte Carbonsäureamid oder -esterbindung eines Reaktant-Liganden katalytisch hydrolysieren, wobei sich die Antikörperbindungsstelle dieser Moleküle an folgende Liganden bindet:

a) Einen Reaktant-Liganden, der die vorgewählte Carbonsäureamid oder -esterbindung enthält, die hydrolysiert wird, und

b) einen zu dem Reaktant-Liganden strukturell analogen Hapten-Liganden, der ein tetraedrisches Kohlenstoffatom, welches an eine Hydroxylgruppe sowie an ein gesättigtes Kohlenstoffatom gebunden ist, an einer Position in dem Hapten-Liganden enthält, die der Position der Carbonylgruppe bzw. dem an das Carbonyl gebundenen Heteroatom der zu hydrolysierenden Carbonsäureamid- bzw. esterbindung entspricht, wobei der Hapten-Ligand außerdem eine Gruppe enthält, die in wäßriger Lösung bei physiologischen pH-Werten eine Ionenladung trägt und die nicht an einer korrespondierenden Position des Reaktant- Liganden vorhanden ist und die innerhalb eines kugelförmigen Raums liegt, der durch einen Radius von ca. 0,7 nm (ca. 7 Ångström) ausgehend von dem tetraedrischen Kohlenstoffatom definiert ist.

2. Moleküle gemäß Anspruch 1, wobei die Gruppe, die die Ionenladung trägt, indirekt an das tetraedrische Kohlenstoffatom gebunden ist und mindestens ein Atom das tetraedrische Kohlenstoffatom von dem Atom der Gruppe mit der Ionenladung, das die Ionenladung trägt, trennt.

3. Moleküle gemäß Anspruch 1, bei denen es sich um monoklonale Antikörper handelt.

4. Moleküle gemäß Anspruch 1, wobei der Hapten-Ligand bei physiologischen pH-Werten als Gruppe mit Ionenladung ein Ammoniumion oder ein Carboxylation enthält.

5. Moleküle gemäß Anspruch 1, bei denen es sich um monoklonale Antikörpermoleküle oder Moleküle, die Teile mit Antikörperbindungsstellen enthalten, handelt und der Reaktant-Ligand die Struktur

aufweist, wobei R1' und R2' für kohlenstoffatomhaltige chemische Rückstände des Reaktanten stehen und -X- -O- oder NR&sub3;- ist, wobei R³ Wasserstoff oder ein dritter kohlenstoffhaltiger chemischer Rückstand ist und der Hapten-Ligand die Struktur

aufweist, wobei R¹ und R² für kohlenstoffatomhaltige chemische Rückstände stehen, die strukturell analog zu R¹ bzw. R² sind, und mindestens einer der Bestandteile R1' und R2' in wäßriger Lösung bei physiologischen pH-Werten eine Gruppe mit Ionenladung enthält und mindestens eine solche Gruppe, die bei physiologischen pH-Werten eine Ionenladung trägt, innerhalb eines kugelförmigen Raums liegt, der durch einen Radius von ca. 0,7 nm (ca. 7 Ångström) ausgehend von der

-Gruppe dieser Struktur definiert ist, und R3' H ist, wenn -X- -O- ist oder R3' strukturell analog zu R³ ist, wenn -X- -NR³- ist.

6. Moleküle gemäß Anspruch 5, wobei -X- -O- ist.

7. Moleküle gemäß Anspruch 6, wobei die Gruppe, die bei physiologischen pH-Werten eine Ionenladung trägt, ein Ammoniumion oder ein Carboxylation ist.

8. Moleküle gemäß Anspruch 7, die von der Hybridomzelle 30C6 mit der ATCC-Zugangsnummer HB 10341 ausgeschieden werden.

9. Moleküle gemäß Anspruch 7, die von der Hybridomzelle 27A6 mit der ATCC-Zugangsnummer HB 10621 ausgeschieden werden.

10. Moleküle gemäß Anspruch 5, wobei die Gruppe mit der Ionenladung indirekt an das tetraedrische Kohlenstoffatom gebunden ist und mindestens ein Atom das tetraedrische Kohlenstoffatom von dem Atom der Gruppe mit der Ionenladung, das die Ionenladung trägt, trennt, und wobei die Gruppe mit der Ionenladung innerhalb eines kugelförmigen Raums liegt, der durch is einen Radius von ca. 0,2 bis 0,5 nm (ca. 2 bis 5 Ångström) ausgehend von dem tetraedrischen Kohlenstoffatom definiert ist.

11. Zellen, die, wenn sie in einem Medium kultiviert werden, monoklonale Antikörpermoleküle oder Moleküle, die Teile mit Antikörperbindungsstellen enthalten, produzieren, welche eine vorgewählte Carbonsäureamid oder -esterbindung eines Reaktant-Liganden katalytisch hydrolysieren, wobei sich die Antikörperbindungsstelle dieser Moleküle an folgende Liganden bindet:

b) einen zu dem Reaktant-Liganden strukturell analogen Hapten-Liganden, der ein tetraedrisches Kohlenstoffatom, welches an eine Hydroxylgruppe sowie an ein gesättigtes Kohlenstoffatom gebunden ist, an einer Position in dem Hapten-Liganden enthält, die der Position der Carbonylgruppe bzw. dem an das Carbonyl gebundenen Heteroatom der zu hydrolysierenden Carbonsäureamid- bzw. -esterbindung entspricht, wobei der Hapten-Ligand außerdem eine Gruppe enthält, die in wäßriger Lösung bei physiologischen pH-Werten eine Ionenladung trägt und die bei dem Reaktant-Liganden nicht vorhanden ist und die innerhalb eines kugelförmigen Raums liegt, der durch einen Radius von ca. 0,7 nm (ca. 7 Ångström) ausgehend von dem tetraedrischen Kohlenstoffatom definiert ist.

12. Zellen gemäß Anspruch 11, bei denen es sich um Hybridomzellen handelt, die außerdem die monoklonalen Antikörpermoleküle oder Moleküle, die Teile mit Antikörperbindungsstellen enthalten, welche die vorgewählte Carbonsäureamid oder -esterbindung katalytisch hydrolysieren, in das Kulturmedium ausscheiden.

13. Hybridomzellen gemäß Anspruch 12, bei denen es sich um Zellen des Hybridoms 30C6 mit der ATCC-Zugangsnummer HB 10341 handelt.

14. Hybridomzellen gemäß Anspruch 12, bei denen es sich um Zellen des Hybridoms 27A6 mit der ATCC-Zugangsnummer HB 10621 handelt.

15. Methode zur katalytischen Hydrolysierung einer vorgewählten Ester- oder Amidbindung in einem Molekül eines reaktiven Liganden, die folgende Schritte umfaßt:

a) Mischung einer katalytisch wirkenden Menge der monoklonalen Antikörpermoleküle oder der Moleküle, die Teile mit Antikörperbindungsstellen enthalten, gemäß Anspruch 1 mit den Molekülen des Reaktant-Liganden in einem wäßrigen Medium, so daß eine Reaktionsmischung entsteht, und

b) Erhaltung dieser Reaktionsmischung für einen ausreichend langen Zeitraum, so daß die Moleküle des Reaktant-Liganden sich an die Antikörpermoleküle oder die Moleküle, die Teile mit Antikörperbindungsstellen enthalten, binden können und die Antikörpermoleküle oder die Moleküle, die Teile mit Antikörperbindungsstellen davon enthalten, diese vorgewählte Bindung katalytisch hydrolysieren und Produkte bilden können.

16. Methode gemäß Anspruch 15, wobei die Antikörpermoleküle oder die Moleküle, die Teile mit Antikörperbindungsstellen davon enthalten, durch die Hybridomzelle 30C6 mit der ATCC-Zugangsnummer HB 10341 oder die Hybridomzelle 27A6 mit der ATCC-Zugangsnummer HB 10621 ausgeschieden werden.

17. Methode zur Herstellung von Zellen, die, wenn sie in einem Medium kultiviert werden, Antikörpermoleküle oder Moleküle, die Teile mit Antikörperbindungsstellen enthalten, produzieren, welche eine vorgewählte Carbonsäureamid oder -esterbindung eines Reaktant-Liganden katalytisch hydrolysieren, wobei die Methode folgende Schritte umfaßt:

a) Immunisierung eines Tiers mit einem Immunogen, das einen Hapten- Liganden enthält, welcher ein tetraedrisches Kohlenstoffatom, das an eine Hydroxylgruppe sowie an ein gesättigtes Kohlenstoffatom gebunden ist, an einer Position in dem Hapten-Liganden enthält, die der Position der Carbonylgruppe bzw. dem an das Carbonyl gebundenen Heteroatom der vorgewählten zu hydrolysierenden Carbonsäureamid- bzw. esterbindung entspricht, wobei der Hapten-Ligand außerdem eine Gruppe enthält, die in wäßriger Lösung bei physiologischen pH- Werten eine Ionenladung trägt und die nicht an einer korrespondierenden Position des Reaktant-Liganden vorhanden ist und die innerhalb eines kugelförmigen Raums liegt, der durch einen Radius von ca. 0,7 nm (ca. 7 Ångström) ausgehend von dem tetraedrischen Kohlenstoffatom definiert ist;

b) Erhaltung dieses Tieres für einen Zeitraum, der für das Tier ausreicht, um Antikörper auszuscheiden, die mit dem Hapten-Liganden eine Immunreaktion eingehen;

c) Transfer von Genen, die Antikörpermoleküle oder Moleküle, die Teile mit Antikörperbindungsstellen enthalten, codieren, von den antikörperproduzierenden Zellen des immunisierten und erhaltenen Tieres aus Schritt b) in Wirtszellen, so daß Hybridzellen entstehen, die Gene aus mindestens zwei Quellen enthalten und die, (i) wenn sie kultiviert werden, Antikörpermoleküle oder Moleküle, die Teile mit Antikörperbindungsstellen enthalten, aus den transferierten Genen herstellen und die (ii) praktisch unbegrenzt kultiviert werden können;

d) Kultivierung der Hybridzellen in einem geeigneten Kulturmedium für einen Zeitraum, der für diese Hybridzellen ausreicht, um Antikörpermoleküle oder Moleküle, die Teile mit Antikörperbindungsstellen enthalten, zu produzieren;

e) Gewinnung von Antikörpermolekülen oder Molekülen, die Teile mit Antikörperbindungsstellen enthalten, aus den kultivierten Hybridzellen;

f) Screening der gewonnenen Antikörpermoleküle oder Moleküle, die Teile mit Antikörperbindungsstellen enthalten, zur Identifizierung einer Hybridzelle, die Antikörpermoleküle oder Moleküle, die Teile mit Antikörperbindungsstellen enthalten, produziert, welche die vorgewählte Carbonsäureamid oder -esterbindung katalytisch hydrolysieren; und

g) Heranwachsenlassen von Klonen der identifizierten Hybridzelle, die Antikörpermoleküle oder Moleküle, die Teile mit Antikörperbindungsstellen enthalten, produziert, welche die vorgewählte Carbonsäureamid oder -esterbindung katalytisch hydrolysieren.

18. Methode gemäß Anspruch 17, wobei die in Schritt c) gebildeten Zellen Hybridomzellen sind.

19. Methode zur Herstellung von Antikörpermolekülen oder Molekülen, die Teile mit Antikörperbindungsstellen enthalten, gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei diese Methode folgende Schritte umfaßt:

a) Kultivierung von Zellen, die nach der Methode gemäß Anspruch 17 oder 18 hergestellt wurden, in einem geeigneten Medium und unter geeigneten Kulturbedingungen für einen Zeitraum, der für die Zellen ausreicht, um die Antikörpermoleküle oder Moleküle, die Teile mit Antikörperbindungsstellen enthalten, zu produzieren, und

b) Trennung dieser Antikörpermoleküle oder Moleküle, die Teile mit Antikörperbindungsstellen enthalten, von den Zellen.

20. Methode gemäß Anspruch 19, wobei die Antikörpermoleküle oder Moleküle, die Teile mit Antikörperbindungsstellen enthalten, den Angaben in den Ansprüchen 2 bis 10 entsprechen.